Summary
Plasticitet i nukleära arkitekturen styrs av dynamiska epigenetiska mekanismer, inklusive icke-kodande RNAs, DNA metylering, nukleosomens ompositionering och Histon sammansättning samt modifiering. Här beskriver vi en Formaldehyde-Assisted isolering av reglerande element (FAIRE) protokoll som möjliggör bestämning av kromatin tillgänglighet i en reproducerbar, Billigt och enkelt sätt.
Abstract
Lämpliga genuttryck som svar på extracellulära signaler, det vill säga vävnad - och härstamning-specifika gentranskription, är kritiskt beroende av mycket definierade påstår av kromatin organisation. Den dynamiska arkitekturen av kärnan styrs av flera mekanismer och formar de transkriptionell utdata program. Det är därför viktigt att bestämma locus-specifika kromatin tillgänglighet i en tillförlitlig mode som är helst oberoende av antikroppar, som kan vara en potentiellt störande källa av experimentella variabilitet. Kromatin tillgänglighet kan mätas med olika metoder, inklusive Formaldehyde-Assisted isolering av reglerande element (FAIRE) analysen, som tillåter bestämning av allmänna kromatin tillgänglighet i ett relativt lågt antal celler. Här beskriver vi ett FAIRE protokoll som tillåter enkel, pålitlig och snabb identifiering av genomisk regioner med en låg protein beläggning. I denna metod, är DNA kovalent bunden till kromatin proteinerna med formaldehyd som en crosslinking agent och klippt i små bitar. Gratis DNA är efteråt berikad med fenol: kloroform extraktion. Förhållandet mellan gratis DNA bestäms av kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR) eller DNA-sekvensering (DNA-seq) jämfört med ett urval som representerar totala DNA. Regioner med en lösare kromatinstruktur är berikad med gratis DNA-provet, vilket möjliggör identifiering av genomisk regioner med lägre kromatin packning.
Introduction
Genomiskt DNA eukaryota celler är tätt packade i nucleosomes, som måste tas bort eller ombyggda för att möjliggöra samverkan mellan andra proteiner och DNA. Transkriptionell aktiveringen av en gen leder vanligtvis till en mer öppen konfigurationen av nucleosomal struktur, särskilt i + 1 nukleosomens1, för att underlätta transkription av RNA-polymeras. Regulatoriska regioner som initiativtagare och smakförstärkare genomgår också, dynamiska förändringar i kromatin tillgänglighet till tillåta interaktion med kromatin modifierare eller transkription faktorer2. Flera metoder har utvecklats för att identifiera dessa nukleosomens-fria regioner. Dessa inkluderar känsligheten för nukleaser såsom DNAS jag3 eller micrococcal nuclease4, som kan endast komma åt DNA när det inte är tätt lindade runt nucleosomes. Andra metoder för identifiering av öppna kromatin eller gratis DNA inkluderar transposase-medierad integrationen av retrotransposable element (test för Transposase-tillgänglig kromatin, ATAC)5eller kromatin immunoprecipitation (ChIP) med antikroppar mot histoner. Metoden FAIRE bygger inte på ett enzym kapacitet att nå DNA eller bindningen av en antikropp till ett särskilt protein, utan istället förlitar sig på rening av nukleosomens-fria regioner av en fenol: kloroform utvinning6,7. I denna metod, DNA är kovalent bunden till kromatin proteiner av crosslinking agent formaldehyd och är klippt därefter små bitar av ultraljudsbehandling. Tätt packade kromatin regioner kommer har riklig DNA och protein antipyridinantikropp, medan DNA regioner med inga eller få nucleosomes har liten eller ingen tvärbundna DNA och protein komplex. En fenol: kloroform utvinning möjliggör rening av den icke-tvärbunden gratis DNA i vattenfasen, medan de DNA tvärbunden till proteiner fångas i den organiska fenol fasen eller vattenlösning-ekologiska interphase tillsammans med proteinerna. Kvantifiering av denna gratis DNA jämfört med en referens av totala DNA-prov möjliggör identifiering av Regionkommittén kromatin gratis. FAIRE metoden kan användas för karakterisering av enskilda genomisk regioner som beskrivs här, men är också lämplig för identifiering av genome-wide kromatin tillgänglighet då den kopplas till djupsekvensering som beskrivs i olika modeller8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. resultaten FAIRE-seq och andra metoder såsom ATAC-seq till stor del överlappar14. Metoden FAIRE är en mycket robust, Billigt och enkelt att utföra metod för att identifiera nukleosomens-fria regioner. Till skillnad från andra metoder, det kräver inte pilot experiment för att fastställa den lämpliga nivån för matsmältningen som krävs för nukleaser (DNAS-seq, MNase-seq) eller transposases (ATAC-seq) och diskuteras i detalj i en senare granskning15. De enda parametrarna justeras är ultraljudsbehandling villkor och i vissa fall tidpunkten för fixering. Detta dokument beskriver ett enkelt protokoll som schematiskt visas i figur 1 och som inte kräver någon särskild utrustning än en någon sonikator. Protokollet kan utföras i en rimligt kort tid och gör FAIRE en enkel och pålitlig metod att testa kromatin tillgänglighet i ett antal olika celltyper som sträcker sig från lungan celler11 till primära celler från mus lever16.
Protocol
1. dag 1: Cellkultur
- Kultur cellerna som skall analyseras till önskad mängd. Cell kultur och media är beroende av celltyper under utredning.
Obs: I princip alla eukaryota celler är mottagliga för en analys av kromatin tillgänglighet av FAIRE. För detta experiment, 4 x 106 HEK-293T celler är seedade i en enda 10 cm skålen i DMEM medium kompletteras med 10% (v/v) FBS och 1% (w/v) penicillin/streptomycin, och inkuberas vid 5% CO2 och 37 ° C under 24 h tills cellerna nå 70-80% sammanflödet (~ 8 x 10 6 celler per maträtt).
2. dag 2: Formaldehyd Crosslinking och cellen skörd
FÖRSIKTIGHET: Formaldehyd är mycket giftigt och alltid måste användas under ett dragskåp. Bär skyddande kläder (handskar och labbrock). Kassera avfallet på lämpligt sätt.
- Lägga till formaldehyd direkt i cellodlingsmedium i dragskåp att nå en slutlig koncentration av 1% (v/v) (270 µL av 10 ml av cellodlingsmedium formaldehyd på 37% (v/v)). Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur (20-25 ° C) och dräpte plattorna manuellt varje 2 min.
Obs: Crosslinking tiden kan justeras enligt celltypen. För majoriteten av cellinjer är 10 min av crosslinking tillräcklig. För vävnader behöva längre inkubationer tillåta fixering av alla celler. - Lägg till glycin till en slutlig koncentration av 0,125 M att släcka formaldehyd (Lägg 500 µL av en 2,5 M glycin lager till 10 mL odlingsmedium). Inkubera i 5 min i rumstemperatur och dräpte varje 2 min.
- Tvätta cellerna 3 x med is kallt PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,44 g/L Na2HPO4 · 2 H2O, 0,24 HB KH2PO4, justera pH till 7,4 med HCl eller NaOH). Sug ut mediet och tvätta direkt i cell kultur maträtt eller kolven genom att tillsätta 10 mL PBS. Upprepa detta steg två gånger att vara mycket försiktig när det gäller löst vidhäftande celler såsom HEK-293T. Lägg till PBS försiktigt vid sidan av skålen för att undvika avlossning av cellerna.
- Efter den tredje tvätten, resuspendera cellen i 1 mL av is kallt PBS och överföring till ett 1,5 mL reaktionsröret på is. Använda en cell-skrapa för att lossa cellerna vid behov.
Obs: När du startar med ett begränsat material, använda låg DNA-bindande rören för att undvika prov förlust under förfarandet. - Centrifugera under 5 minuter vid 300 x g vid 4 ° C i en kyld bordsskiva centrifug. Kassera supernatanten genom noggrant aspirera det.
3. cell Lysis och kromatin fragmentering
- Återsuspendera cellpelleten i 1 mL FAIRE lyseringsbuffert (1% (w/v), 10 mM EDTA, 50 mM Tris HCl pH 8,1, 10 µg/mL leupeptin, 10 µg/mL aprotinin, 2 mM PMSF), och resuspendera cellerna av noggrant pipettering upp och ner flera gånger. Inkubera i 20 min på is. Lagra proverna vid-80 ° C i detta steg om det behövs.
- Sonikera tvärbunden DNA att skeva det att en genomsnittlig storlek på 200-300 bp. Specifika inställningar av den någon sonikator måste bestämmas för varje källa för prover och enhetens används ultraljudsbehandling. Se helst till att DNA är effektivt klippt. En optimering steg för DNA klippning beskrivs under steg 5.14. Cool proverna på is under ultraljudsbehandling att undvika uppvärmning av provet.
- Centrifugera provet för 15 min och 13 000 x g vid 4 ° C.
- Överför supernatanten till en ny reaktionsröret. Dela upp proverna i 100 µL portioner. Lagra proverna vid-80 ° C, om det behövs.
Obs: Protokollet kan avbrytas vid denna punkt.
4. de-crosslinking kontroll DNA
- Ta en 100 µL alikvotens från steg 3,4 att vända crosslink och att användas som en referens för totala DNA. Tillsätt 10 µL av RNase-A (10 mg/mL) och inkubera i 1 timme vid 37 ° C.
- Tillsätt 10 µL av proteinas K (20 mg/mL). Använd en programmerbar thermo-block för att ruva för 4 h vid 37 ° C och sedan 6 h vid 65 ° C att klyva proteiner och att vända antipyridinantikropp. Slutligen, håll proverna vid 4 ° C tills protokollet återupptas och fortsätt sedan till steg 5.
Obs: Andra FAIRE-protokoll använder kromatin prover från celler som inte har tvärbundna som referens, således avskaffa behovet av de-crosslinking11. Det faktum att dessa prover inte är tvärbunden kan leda till skillnader i ultraljudsbehandling effektivitet eller DNA stabilitet, därför användningen av totala DNA referensprov som har genomgått samma procedur som proven är mer exakt.
5. dag 3: Fenol: kloroform rening av DNA
- Ta det icke-de-tvärbundet alikvotens från steg 3,4. Tillsätt 10 µL av RNase-A (10 mg/mL) och inkubera i 1 timme vid 37 ° C.
- Ta steget icke-de-tvärbunden alikvotens form 5.1 och de-tvärbunden provet från steg 4,2 och fortsätt parallellt. Lägg till H2O för att nå en slutlig volym av 300 µL.
- Tillsätt 300 µL av fenol: kloroform: isopentanol (25:24:1) i ett dragskåp och vortex kraftigt.
FÖRSIKTIGHET: Fenol är frätande och giftigt och alltid måste användas under ett dragskåp. Bär skyddande kläder (handskar och labbrock), kontrollera reaktionsrören är tillsluten och avyttra avfallet på lämpligt sätt. - Centrifugera i 10 min vid 13 000 x g vid 4 ° C.
- Försiktigt över 280 µL av övre vattenfasen till en ny reaktionsröret. Kontrollera att inte någon skräp från interphasen som också innehåller proteiner. Kassera den återstående lägsta fasen som organiska lösningsmedel avfall.
- Upprepa steg 5,3-5,5 och noggrant överför 270 µL av övre vattenfasen till en ny reaktionsröret.
- Tillsätt 270 µL av kloroform i ett dragskåp och skaka kraftigt.
Obs: Detta steg används för att eliminera eventuella återstående fenol från provet. - Centrifugera i 10 min vid 13 000 x g vid 4 ° C.
- Noggrant över 250 µL av övre vattenfasen till en ny reaktionsröret, noga med att inte bära någon skräp från interphasen. Kassera återstående provet som organiska lösningsmedel avfall.
- Lägg till 25 µL 5 M NaCl och 250 µL av isopropanol. Tillsätt 5 µL av glykogen (20 mg/mL) som DNA bärare. Blanda väl genom att vända rören och inkubera i 20 min i rumstemperatur. Centrifugera i 10 min vid 13 000 x g vid 4 ° C utfällning DNA.
- Tvätta DNA pelleten med 400 µL av 70% (v/v) etanol. Centrifugera i 10 min vid 13 000 x g vid 4 ° C.
- Aspirera supernatanten noggrant och låt pelleten torka i 10 minuter vid rumstemperatur. Återsuspendera i 100 µL TE buffert (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA).
- Inkubera i icke-de-tvärbunden gratis DNA-prov för 4 h vid 65 ° C ta bort Inter DNA antipyridinantikropp. Lagra proverna vid-20 ° C.
- Kvantifiera mängden DNA med en spektrofotometer och kör en alikvot för att kontrollera storleken på fragment på en 2% (w/v) agarosgel. Justera klippning tid och intensitet, beroende på resultaten av de DNA analysen av agaros gel elektrofores, för att få en genomsnittlig storlek på 200-300 bp.
6. bestämning av gratis Versus totala DNA med kvantitativa Real Time PCR (qRT-PCR)
- Förhållandet mellan nukleosomens-free DNA (i det följande kallad gratis DNA) kontra totalt DNA bestäms av qRT-PCR17,18. Prover kan också analyseras kvantitativt av microarray hybridisering eller djupsekvensering genome-wide bestämningar.
- Design qPCR primers för regionerna att testas och positiva och negativa kontroller.
Obs: Lämpliga positiva kontroller är grundfärger ligger i arrangören av aktivt transkriberas städning gener såsom ACTB, GAPDH, TPI1 eller TUBA1A (kodning β-aktin, GAPDH, TPI eller α-Tubulin). Lämpliga negativa kontroller finns i Heterokromatin regioner eller gen öknar. Andra lämpliga negativa kontroller kan utformas i genomisk regioner som gränsar till den dynamiskt reglerade locus under utredning för lokal kopia antalet skillnader (tabell 1). - Späd de DNA-proverna till en slutlig koncentration på 10 ng/µL med TE buffert, och beakta utspädningsfaktorn för slutliga beräkningarna (se steg 6,5).
- Ställa in en qPCR reaktion i exemplar i en plattan med 96 brunnar, med följande reaktion mix per brunn: templat-DNA: 20 ng (2 µL), framåt primer 200 nM (0.4 µL i µM 5 lager), reverse primer 200 nM (0.4 µL i µM 5 lager) , en kommersiell klar att använda Reaktionsblandning innehållande grön dye (5 µL från en 2 x lager) och H2O till 10 µL.
- Kör i en realtid qPCR enhet, använder läget i absolut kvantifiering och bestämma Ct prover med olika primer paren. Beräkna förhållandet mellan återställning av gratis DNA till totala DNA för varje primer som använder följande formel, med hänsyn till utspädningsfaktorer från steg 6.3:
Representativa resultat och ett räkneexempel ges i tabell 2. - För att kompensera för skillnader mellan prover, normalisera positiv kontroll återställning förhållandet:
Representative Results
Vi har använt metoden FAIRE för att mäta skillnader i kromatin tillgängligheten av MHC klass II gener i HEK293T celler som publicerade19. MHC klass II kodning gener uttrycks på antigenpresenterande celler (APC), antingen konstitutivt eller svar på cytokin signalering20. Uttrycket av MHCII gener drivs av en aktivator komplex som binder till specifika DNA-element, så kallade XY lådor, ligger i promotorn och smakförstärkare dessa gener21,22. Detta återspeglas i nivå med kromatin, som framgick av vår FAIRE analys av utvalda regioner i MHC klass II gener HLA-DPB1 och HLA-DMA. Dessa experiment visade att kromatin är öppen på de regioner som omfattar rutorna XY, medan det är mer kompakt i gen organ (figur 2).
Som ett exempel, för beräkningar, i detta särskilda experiment, utspädd vi totalen DNA-prov 10 gånger (spädningsfaktorn 10), och gratis DNA-provet var inte utspädd (utspädningsfaktor 1) för qRT-PCR. Cts erhållits för de olika regionerna som testats och beräkningarna att få slutlig återvinning nyckeltal och relativa återhämtning nyckeltal listas i tabell 2. Dessa relativa återhämtning nyckeltal erhölls med promotorn ACTB som den positiva kontrollen. Observera att dessa beräkningar för en av replikerar används för att generera de resultat som visas i figur 2.
I ett annat sammanhang testades kromatin tillgänglighet i en modell för inducerbara genuttryck. I det här fallet, mättes snabba förändringar av kromatin kompaktering svar på pro-inflammatoriska stimulans tumörnekrosfaktor (TNF). HeLa celler lämnades obehandlad eller stimuleras med TNF för 1 h, följt av FAIRE att mäta kromatin packning på arrangören regionen kontrollerande uttrycket av den gen som kodar den TNF-lyhörd cytokin interleukin 8 (IL8). Dessa resultat visade en starkt ökad kromatin tillgänglighet på IL8 arrangören av TNF-stimulerade celler (figur 3). Tillgängligheten på IL-8 Arrangören efter TNF stimulering är ännu högre än ACTB arrangören visar en dramatisk kromatin remodeling i denna föreskrivande region. Som förhållandet återhämtning erhålls i detta fall är högre än den som erhållits i regionen används som positiv kontroll (ACTB promotorn) är relativ återhämtning förhållandet högre än en.
Figur 1: The FAIRE arbetsflödet. Celler är tvärbundna direkt i cell kultur kolv eller maträtt genom att lägga till formaldehyd (A). Efter kylning av formaldehyd, cellerna tvättas tre gånger med is kallt PBS (B), och överföras till en reaktionsröret där de resuspended i FAIRE lyseringsbuffert och sonicated för att klippa DNA (C). En alikvot av det extraherade kromatinet är de-tvärbunden genom upphettning vid 65 ° C, för att få den totala DNA-referensen (D), och därefter gratis DNA utvinns med hjälp av fenol: kloroform både från tvärbunden och de de-tvärbunden alikvoter (E). Slutligen DNA kvantifieras, och förhållandet mellan gratis vs. totalt DNA är beräknat (F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: bestämning av kromatin tillgänglighet i MHC klass II-genen kluster i HEK293T celler. HEK293T celler analyserades av FAIRE. Förhållandet mellan gratis kontra totala DNA (dvs., relativa återhämtning förhållandet) bestämdes för arrangören av genen ACTB som en positiv kontroll, en Heterokromatin region på Chr. 12 som negativ kontroll, och regulatoriska regioner och gen organ av MHC klass II gener HLA-DMA och HLA-DPB1. Den övre delen visar en schematisk representation av locus och placeringen av primers. Felstaplar representera standardavvikelser från två biologiska replikat mätt i exemplar. Siffran ändrades från en publicerad rapport19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: ändringar av DNA tillgänglighet på IL8 arrangören i TNF behandlingssvaret. HeLa celler stimuleras med TNF (20 ng/mL) för 1 h och analyseras av FAIRE. Förhållandet mellan fri kontra totalt DNA bestämdes för arrangören av ACTB (positiv kontroll), en Heterokromatin region på Chr. 12 (negativ kontroll) och IL8 arrangören. Felstaplar representera standardfel för medelvärdet (SEM) från tre biologiska replikat mätt i dubbletter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: optimering av ultraljudsbehandling villkor. Kromatin som utvinns ur 293T celler var sonified med en fokuserad någon sonikator med lämpliga rör (Tabell för material). Kromatinet var sonicated för den angivna tiden med upprepningar av 30 s med följande inställningar: toppeffekt 150, plikt faktor 15, cykler per burst 500, följt av 30 s: toppeffekt 2.5, plikt faktor 15, cykler per burst 500. Det resulterande kromatinet var de-tvärbunden, renas genom fenol: kloroform extraktion och lastas i en 2% agarosgel. En etidiumbromid som färgade gel är, och visas positionerna för molekylvikt markörerna i bp. I detta experiment erhölls optimal kromatin storlek (200-300 bp) efter 20 min av ultraljudsbehandling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Primer | Sekvens |
| ACTB-arrangören-F | AAAGGCAACTTTCGGAACGG |
| ACTB-arrangören-R | TTCCTCAATCTCGCTCTCGC |
| Chr. 12 negativ kontroll-F | ATGGTTGCCACTGGGGATCT |
| Chr. 12 negativ kontroll-R | TGCCAAAGCCTAGGGGAAGA |
| HLA-DMA-XY-Box-F | CATCAGTCACTGGGGAGACG |
| HLA-DMA-XY-Box-R | GCTTCCCAGCCCAGTTACAT |
| HLA-DMA-5'-F | GGAGAGAACAATCTCCGCTTCA |
| HLA-DMA-5'-R | AGCTGCTATGTGTGGTTGGT |
| HLA-DMA-3'-F | TGGGGACCTAGTTAGGGAGC |
| HLA-DMA-3'-R | AGATCCATGGGAGGAGGCTT |
| HLA-DPB1-XY-Box-F | GTCCAATCCCAGGGTCACAG |
| HLA-DPB1-XY-Box-R | TGAAAAGAGCTGCAGTCAGGA |
| HLA-DPB1-5'-F | GCGTGTTCATGTCTGCATCC |
| HLA-DPB1-5'-R | TGATCCTCAGAGCCTGGACA |
| HLA-DPB1-3'-F | CCAGCCTAGGGTGAATGTTT |
| HLA-DPB1-3'-R | GCCTGGGTAGAAATCCGTCA |
| IL8 Arrangören-F | GTGATGACTCAGGTTTGCCCT |
| IL8 Arrangören-R | CTTATGGAGTGCTCCGGTGG |
Tabell 1: Primers för qPCR.
Tabell 2: exempel beräkningar av FAIRE relativa återhämtning nyckeltal. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Discussion
FAIRE är en robust och billig metod som möjliggör identifiering av nukleosomens-fria regioner. Den är baserad på principen att DNA lindad runt nucleosomes enkelt kan vara tvärbunden att Histonerna. En fenol: kloroform utvinning används för att avgränsa icke-tvärbundna och protein-gratis DNA-fragment från proteinbundet DNA, som finns i den lägsta fenol-fasen och i viss utsträckning i interphasen (figur 1). Därför, de nukleosomens-fria regionerna är överrepresenterade i fraktionen av gratis DNA i vattenfasen. Ett antal publikationer beskriver detaljerat protokoll av FAIRE metod23,24,25,26, som kan konsulteras som komplement till det förfarande som beskrivs här.
Liknar andra metoder som används för att bestämma kromatinstrukturen, FAIRE metoden också kritiskt beror på optimal klippning av DNA. Om fragment är för lång, kommer någon nukleosomens-fri region att maskeras av intilliggande kromatin-bundna DNA. Om fragment är för små, blir detektion av qPCR eller djupsekvensering mycket svårt. Av denna anledning, ultraljudsbehandling av DNA är en avgörande parameter som måste kontrolleras och optimeras för att erhålla fragment runt 200-300 bp längd, som utgör 1-2 nucleosomes (figur 4).
En annan parameter som kan påverka det slutliga resultatet är tvärbindning av provet. Även om fixering proceduren som beskrivs här gäller för de flesta cellinjer, forskaren noggrant måste utvärdera detta steg för det särskilda provet under studien, särskilt när användande vävnader, där längre fixering gånger kan vara nödvändigt att tillåta de formaldehyd att nå cellerna i alla vävnadsprov.
Till skillnad från andra metoder, såsom DNAS jag eller micrococcal nuclease överkänslighet, ChIP eller ATAC, FAIRE förlitar sig inte på en enzymatisk aktivitet eller specifika antikroppar och därför behöver det inte titrering eller optimering av reaktion villkor. Detta gör FAIRE idealisk metod att mäta kromatin tillgänglighet för labs med liten erfarenhet i fältet kromatin. Dessutom pilotförsök krävs endast för att optimera steget DNA klippning och crosslinking tid, när det behövs.
Metoden utvecklades ursprungligen i jäst6, men det har också utvidgats till däggdjursceller. DNA renas med FAIRE-metoden kan användas för djupsekvensering, vilket gör genome-wide karakterisering av kromatin status. Detta har redan visat sig vara användbart i ett antal studier8,9,10,11,12,13,19,27, 28.
Resultat från FAIRE-seq experiment visar en stor överlappning med resultaten av andra metoder såsom DNAS-seq14, även om vissa skillnader uppstå. Detta är på grund av metodologiska skillnader som for example avslappnad eller ombyggda nucleosomes kan fortfarande hindra klyvning av DNAS jag, medan dessa DNA-regioner skulle vara mindre benägna att producera DNA och protein antipyridinantikropp och således skulle fastställas som nukleosomens-gratis regioner med FAIRE9. Även förekomsten av icke-histonglykoprotein proteiner såsom RNA polymeraser eller läsaren proteiner för epigenetiska märken kan resultera i DNA och protein antipyridinantikropp och således skulle tolkas som protein-packade regioner i FAIRE experiment. Dessa begränsningar är förbundna med varje metod som används för bestämning av kromatin staten, vilket gör att behovet av att använda en kombination av olika metoder för att få en fullständig inblick.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Tilman Borggrefe (universitetet i Giessen) vänligen dela enhetens ultraljudsbehandling. Arbetet från M.L.S. stöds med bidrag från den Deutsche Forschungsgemeinschafts (SCHM 1417/8-3), SFB/TRR81, SFB1021, SFB1213, Excellence kluster Cardio-Pulmonary systemet (ECCPS, EXC 147/2), den Deutsche Krebshilfe (111447) och IMPRS-HLR programmet för Maximal-Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Carl Roth | A156.1 | |
| Glycogen, 20 mg/ml | Thermo Fisher | R0561 | |
| ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, Rox | Thermo Fisher | AB1162B | |
| Proteinase K, 20 mg/ml | Thermo Fisher | EO0491 | |
| RNase A, 10 mg/ml | Thermo Fisher | EN0531 | |
| Leupeptin | Sigma | L8511 | |
| Aprotinin | Sigma | A1603 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | 78830 | |
| milliTUBE 1 ml AFA Fiber | Covaris | 520130 | |
| Holder milliTUBE 1ml | Covaris | 500371 | |
| Covaris S220 Focused-ultrasonicator | Covaris | ||
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosistems | 4376600 |
References
- Struhl, K., Segal, E. Determinants of nucleosome positioning. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 267-273 (2013).
- Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol. Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
- Wu, C. The 5' ends of Drosophila heat shock genes in chromatin are hypersensitive to DNase I. Nature. 286 (5776), 854-860 (1980).
- Yuan, G. C., et al. Genome-scale identification of nucleosome positions in S. cerevisiae. Science. 309 (5734), 626-630 (2005).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat. Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Nagy, P. L., Cleary, M. L., Brown, P. O., Lieb, J. D. Genomewide demarcation of RNA polymerase II transcription units revealed by physical fractionation of chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6364-6369 (2003).
- Nagy, P. L., Price, D. H. Formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. , (2009).
- Krinner, S., et al. CpG domains downstream of TSSs promote high levels of gene expression. Nucleic Acids Res. , 1-14 (2014).
- Gomez, N. C., et al. Widespread Chromatin Accessibility at Repetitive Elements Links Stem Cells with Human Cancer. Cell Rep. 17 (6), 1607-1620 (2016).
- Gaulton, K. J., et al. A map of open chromatin in human pancreatic islets. Nat. Genet. 42 (3), 255-259 (2010).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Res. 17 (6), 877-885 (2007).
- Hurtado, A., Holmes, K. A., Ross-Innes, C. S., Schmidt, D., Carroll, J. S. FOXA1 is a key determinant of estrogen receptor function and endocrine response. Nat. Genet. 43 (1), 27-33 (2011).
- Filion, G. J., et al. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
- Davie, K., et al. Discovery of transcription factors and regulatory regions driving in vivo tumor development by ATAC-seq and FAIRE-seq open chromatin profiling. PLoS Genet. 11 (2), e1004994 (2015).
- Meyer, C. A., Liu, X. S. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat. Rev. Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
- Du, J., et al. Chromatin variation associated with liver metabolism is mediated by transposable elements. Epigenetics Chromatin. 9 (1), 28 (2016).
- Skinner, D. Z. Real-Time PCR: Advanced Technologies and Applications. Crop Sci. 54 (1), 455 (2014).
- Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. Good Practice Guide for the Application of Quantitative PCR (qPCR). Natl. Meas. Syst. , 50 (2013).
- Rodríguez-Gil, A., et al. The CCR4-NOT complex contributes to repression of Major Histocompatibility Complex class II transcription. Sci. Rep. 7 (1), 3547 (2017).
- Steimle, V., Siegrist, C. A., Mottet, A., Lisowska-Grospierre, B., Mach, B. Regulation of MHC class II expression by interferon-gamma mediated by the transactivator gene CIITA. Science. 265 (5168), 106-109 (1994).
- Choi, N. M., Majumder, P., Boss, J. M. Regulation of major histocompatibility complex class II genes. Curr. Opin. Immunol. 23 (1), 81-87 (2011).
- Ting, J. P. -Y., Trowsdale, J. Genetic control of MHC class II expression. Cell. 109 Suppl, S21-S33 (2002).
- Nammo, T., Rodríguez-Seguí, S. A., Ferrer, J. Mapping open chromatin with formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Methods Mol. Biol. 791, 287-296 (2011).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. A detailed protocol for formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE). Curr. Protoc. Mol. Biol. , Chapter 21, Unit21.26 (2013).
- Giresi, P. G., Lieb, J. D. Isolation of active regulatory elements from eukaryotic chromatin using FAIRE (Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements). Methods. 48 (3), 233-239 (2009).
- Jung, S., Angarica, V. E., Andrade-Navarro, M. A., Buckley, N. J., Del Sol, A. Prediction of Chromatin Accessibility in Gene-Regulatory Regions from Transcriptomics Data. Sci. Rep. 7 (1), 4660 (2017).
- Pique-Regi, R., et al. Accurate inference of transcription factor binding from DNA sequence and chromatin accessibility data. Genome Res. 21 (3), 447-455 (2011).
