Summary
核内構造の可塑性は、非コード Rna、DNA メチル化、ヌクレオソーム再配置と同様ヒストン組成および変更を含む動的なエピジェネティックな機構によって制御されます。ここで再現可能な安価で、簡単な方法でクロマチン接近性の定量を可能にする Formaldehyde-Assisted の分離の規制要素 (放任) プロトコルについて述べる。
Abstract
適切な遺伝子発現細胞外のキューには、組織や系統特異遺伝子の転写、クロマチン組織の非常に定義された状態に強く依存します。核の動的なアーキテクチャは複数のメカニズムによって制御され、形状転写出力プログラム。したがって、できれば抗体実験的変動の潜在的交絡の源であることから独立した信頼性の高いファッションの軌跡固有クロマチン アクセシビリティを判断することが重要です。クロマチンのアクセシビリティは、細胞数が比較的低いの一般的なクロマチン アクセシビリティを決定できます Formaldehyde-Assisted 分離の規制要素 (放任) アッセイを含む様々 な方法で測定できます。ここで低蛋白占有とゲノム領域の単純な信頼性、および高速識別できます放任プロトコルについて述べる。この方法では DNA が共有結合架橋剤としてホルムアルデヒドを使用してクロマチン蛋白質にバインドされ、小さな断片に。無料の DNA はその後豊かに: クロロホルム抽出法を用いたします。自由な DNA の比率は、量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) または DNA シーケンス (seq DNA) 総 DNA を表すコントロールのサンプルと比較してによって決まります。緩いクロマチン構造を持つ地域は、低いクロマチン圧縮のゲノム領域の同定ができるように無料の DNA サンプルで濃縮されています。
Introduction
真核細胞のゲノム DNA は、ヌクレオソームは、削除または、DNA と他の蛋白質の相互作用を許可するために改造する必要がありますにしっかりと詰め込まれます。遺伝子の転写活性化は一般的、RNA ポリメラーゼによる転写を促進する1+1 ヌクレオソームで特にそのヌクレオソーム構造のより開かれた構成に します。また、プロモーターやエンハンサーなどの調節領域はクロマチン修飾子またはトランスクリプション要因2との相互作用を許可するように、クロマチンのアクセシビリティのダイナミックな変化を受けます。いくつかのアプローチは、これらの無料のヌクレオソームの領域を識別するために開発されています。DNase など核酸分解酵素に対する感受性が含まれます私3ミクロコッカスヌクレアーゼ4ヌクレオソームをしっかりと包んだはないときのみ、DNA をアクセスできます。クロマチンや DNA の同定の他の方法があります retrotransposable 要素 (トランスポザーゼ アクセス クロマチン、ATAC の試金) のトランスポザーゼ仲介統合5、またはクロマチン免疫沈降 (チップ) を使用してヒストン抗体。放任メソッドは DNA に到達する酵素の容量または特定の蛋白質への抗体の結合に基づいていないが、代わりにフェノール: クロロホルム抽出6,7ヌクレオソーム フリー領域の浄化に依存しています。この方法で DNA 架橋剤ホルムアルデヒドによるクロマチン蛋白質に共有結合は、超音波処理によって小さな断片にその後剪断します。ぎっしりと詰まったクロマチン領域は、ないまたは少ないヌクレオソーム DNA 領域がほとんどまたはまったく架橋 DNA/タンパク質複合体を持っている豊富な DNA/タンパク質クロスリンクを持ちます。フェノール: クロロホルム抽出により蛋白質 DNA 架橋中の水相で自由な DNA は有機フェノール相または蛋白質と共に水-有機溶媒の界面でキャプチャ非架橋の浄化です。総 DNA のサンプルの参照と比較してこの自由な DNA の定量化は、クロマチン領域の識別を許します。放任メソッドは、前述のように、個々 のゲノム領域の特性評価に使用できるが、ディープ シーケンスに結合する別のモデル8に示すゲノム クロマチン アクセシビリティの同定にも最適です。,9,10,11,12,13。 放任 seq と ATAC seq など他の方法によって得られた結果が14を重なっている主。放任メソッドは非常に堅牢、安価で、簡単無料のヌクレオソームの領域を識別するメソッドを実行します。他のメソッドとは異なり、それは核酸 (DNase seq、MNase seq) またはトランスポサーゼ (ATAC seq) に必要な消化力の適切なレベルを決定するためのパイロット実験を必要としない、最近レビュー15で詳しく説明。調整する唯一のパラメーターは、超音波照射条件し、いくつかのケースでは固定時間です。本稿では、模式図 1に表示されると、超音波発生装置以外の特別な装置を必要としない、簡単なプロトコルについて説明します。プロトコルは、合理的に短時間で実行することができます、放任異なったセルタイプに至る肺細胞11マウス肝臓16から得られた細胞の数でクロマチンのアクセシビリティをテストする簡単で信頼性の高い方法になります。
Protocol
1. 1 日目: 細胞培養
- 希望の金額を分析対象とする細胞を培養します。培養条件とメディアは、調査の下で細胞の種類によって異なります。
注: 原則として、すべての真核細胞は放任でクロマチン接近性の分析に従う義務があります。この実験のため 4 × 106 HEK 293 t 細胞は 10% (v/v) FBS と 1% (w/v) ペニシリン/ストレプトマイシン、補われ、5% CO2と 24 h、電池が 70-80% の合流点に達するまでの 37 ° C で培養した DMEM 培地で 1 つの 10 cm 皿に播かれる (~ 8 x 106セル一皿とする)。
2. 2 日目: 架橋結合するホルムアルデヒドとセルを収穫
注意: ホルムアルデヒドは非常に有毒、ヒューム フードの下で常に使用する必要があります。(手袋、白衣) 防護服を着用します。廃棄物を適切に破棄します。
- 発煙のフード 1% (v/v) (細胞培養培地 10 mL に 37% (v/v) ホルムアルデヒドの 270 μ L) の最終濃度に到達する細胞培養液に直接ホルムアルデヒドを追加します。室温 (20-25 ° C) で 10 分間インキュベートし、2 分ごと手動でプレートをスルーします。
メモ: 架橋時間は、細胞の種類に応じて調整できます。細胞の大半、架橋の 10 分は十分です。組織のすべてのセルの固定できるように長い孵化を必要があります。 - ホルムアルデヒドをクエンチする 0.125 M の最終的な集中にグリシンを追加 (培地 10 mL に 2.5 M グリシン株式 500 μ L を追加)。室温で 5 分間インキュベートし、2 分ごとをスルーします。
- 洗浄セル 3 x 氷冷 PBS (8 g/L の NaCl、KCl、1.44 g/L の Na2HPO4 · 2 H2O、0.24 g/L KH2PO4、0.2 g/L は、7.4 塩酸または水酸化ナトリウムで pH を調整する)。培地を吸引し、10 mL の PBS を追加することによって細胞培養ディッシュやフラスコで直接洗ってください。2 回 HEK 293 t など緩く付着細胞の場合非常に注意してこの手順を繰り返します。細胞の剥離を避けるために、お皿の横に慎重に PBS を追加します。
- 第 3 洗浄後氷冷 PBS と氷の上の 1.5 mL の反応管への転送の 1 mL の細胞を再懸濁します。必要に応じてセルをデタッチするのに細胞スクレーパーを使用します。
注: 限られた材料とを開始するときは、処理中にサンプルの損失を避けるために低の DNA 結合管を使用します。 - 4 ° c 冷却卓上遠心機で 300 × g で 5 分間遠心します。上清を破棄するには、慎重にそれを吸引します。
3. 細胞換散およびクロマチンの断片化
- 1 mL FAIRE 換散バッファー (1% (w/v)、10 ミリメートルの EDTA、50 mM トリス塩酸 pH 8.1 10 μ G/ml leupeptin、10 μ G/ml アプロチニン、2 mM PMSF) で細胞ペレットを再懸濁します、慎重を上下に数回ピペッティングにより細胞を再懸濁します。氷の上に 20 分間インキュベートします。必要な場合は、この手順で-80 ° C でサンプルを格納します。
- 超音波照射架橋 200 300 bp の平均サイズにせん断する DNAサンプルと使用される超音波デバイスの各ソースに対して、超音波発生装置の特定の設定を決定する必要があります。いずれの場合も、DNA、効率的に剪断するを確認します。DNA のせん断の最適化手順については [ステップ 5.14 説明します。サンプルの加熱を避けるために超音波処理中に氷のサンプルを冷却します。
- 15 分と 4 ° C で 13,000 x g のサンプルを遠心分離します。
- 新しい反応チューブに上清を転送します。100 μ L の因数でサンプルを分割します。必要な場合は、-80 ° c のサンプルを格納します。
注: プロトコルをこの時点で中断できます。
4. デ架橋コントロール DNA の
- 100 μ L を分注ステップ 3.4 クロスリンクを逆にして総 DNA のための参照として使用するから取る。RNase A (10 mg/mL) の 10 μ L を追加し、37 ° C で 1 時間インキュベート
- プロティナーゼ K の 10 μ L (20 mg/mL) を追加します。37 ° C で 4 時間放置、蛋白質を切断し、逆にクロスリンク 65 ° C で 6 h をインキュベートするプログラム可能なサーモ ブロックを使用します。最後に、プロトコルが再開されるまで、4 ° C でサンプルを保持し、ステップ 5 に進みます。
注: 他のフェア プロトコルは、参照、したがってデ架橋11の必要性を廃止として架橋されていない細胞からクロマチン サンプルを使用します。これらのサンプルは架橋は、超音波処理効率や DNA の安定性の違いにつながる可能性という事実、したがってテスト サンプルと同じ手順を受けている合計の DNA 試料の使用はより正確です。
5 日 3:: クロロホルム DNA 精製
- ステップ 3.4 から分注非・ デ ・架橋を取る。RNase A (10 mg/mL) の 10 μ L を追加し、37 ° C で 1 時間インキュベート
- 非・ デ ・架橋因数フォーム ステップ 5.1 と 4.2 のステップからデ架橋サンプルを取るし、平行に進みます。H2O 300 μ L の最終巻に到達するを追加します。
- ヒューム フードと渦に精力的にフェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール (25:24:1) の 300 μ L を追加します。
注意: フェノール腐食性、有毒、ヒューム フードの下で常に使用する必要があります。(手袋、白衣) 防護服を着用、反応管、密閉し、廃棄物の適切なかどうかを確認します。 - 4 ° C で 13,000 x g で 10 分間遠心
- 慎重に上部の水相の 280 μ L を新しい反応管に転送します。また蛋白質を含む中間期からの残骸を取らないことを確認します。有機溶剤廃棄物として残り下相を破棄します。
- 手順 5.5 5.3 し慎重に上層の水相の 270 μ L を新しい反応管に転送します。
- ヒューム フードと渦に精力的に 270 μ L のクロロホルムを追加します。
注: この手順は、サンプルから残りのフェノールを除去するために使用されます。 - 4 ° C で 13,000 x g で 10 分間遠心
- 慎重に上部の水相の 250 μ L を新しい反応管、中間期からの残骸を運ぶように世話に転送します。有機溶剤廃棄物として残りのサンプルを破棄します。
- 5 M の NaCl を 25 μ l 添加し、250 μ L のイソプロパノールを追加します。DNA キャリアとしてグリコーゲン (20 mg/mL) の 5 μ L を追加します。チューブを反転でよく混ぜるし、室温で 20 分間インキュベートします。DNA の沈殿物に 4 ° C で 13,000 x g で 10 分間遠心します。
- 70% (v/v) エタノール 400 μ L で DNA の餌を洗います。4 ° C で 13,000 x g で 10 分間遠心
- 慎重に上清を吸引し、室温で 10 分間乾燥ペレット。100 μ L TE バッファー (10 mM Tris pH 8、1 mM EDTA) に再懸濁します。
- 間 DNA クロスリンクを削除する 65 ° C で 4 時間以外・ デ ・架橋無料 DNA サンプルをインキュベートします。-20 ° C で試料を保存します。
- 分光光度計を用いた DNA の量を定量化し、2% (w/v) agarose のゲルのフラグメント サイズをチェックする因数を実行します。アガロースによる DNA サイズの分析結果に応じたゲルの電気泳動、200-300 bp の平均サイズを求める、剪断の時間と強度を調整します。
6. 量的なリアルタイム PCR (qRT PCR) による無料の対総 DNA の定量
- (次の自由な DNA と呼ばれる) で無料のヌクレオソーム DNA の比率に対して DNA が qRT PCR17,18によって決定されます。マイクロ アレイの交配またはゲノム決定のディープ シーケンスごとに、サンプルを定量的分析もできます。
- 正と負のコントロール、テストする領域の qPCR のプライマーを設計します。
注: 適切な肯定的な制御は、ACTB、GAPDH、TPI1、TUBA1A など活発に転写されるハウスキーピング遺伝子のプロモーターであるプライマー (β-アクチン、GAPDH、TPI など α-チューブリンのエンコーディング)。適切なネガティブ コントロールは、ヘテロクロマチン領域または遺伝子砂漠で発見されます。その他の適切な負の制御はローカル コピー番号違い (表 1) を制御するための調査の下で動的に調整された軌跡に隣接するゲノム領域で設計できます。 - TE バッファーと 10 ng/μ L の最終的な集中に DNA のサンプルを希釈し、最終的な計算の希釈倍率を考慮 (6.5 の手順を参照してください)。
- 96 ウェルのプレートは、ウェルあたり次の反作用の組合せでトリプリケートの qPCR 反応を設定: テンプレート DNA: 20 ng (2 μ L) があり、前方プライマー 200 nM (5 μ M 証券の 0.4 μ L)、逆プライマー 200 nM (5 μ M 証券の 0.4 μ L)、緑の染料 (2 x の在庫から 5 μ L)、および H2O 10 μ L を含む反応混合物を使用する商業準備。
- 絶対定量モードを使用して実質の時間の qPCR のデバイスで実行し、異なるプライマー対を持つサンプルの Ct を決定します。自由な DNA の回復ステップ 6.3 から希釈倍率を考慮して次の数式を使用して各プライマーの総 DNA の比率を計算します。
表 2に代表的な結果と、計算の例を与えられています。 - サンプル間の違いを補うために肯定的な制御の回収率に正常化します。
Representative Results
公開された19として HEK293T 細胞の MHC クラス II 遺伝子のクロマチン接近性の違いを測定するため放任メソッドを使いました。MHC クラス II 遺伝子は、抗原提示細胞 (APCs) 恒常または20をシグナルへの応答のいずれかで表現されます。MHCII 遺伝子の発現は、プロモーターやエンハンサーこれら遺伝子21,22に位置する XY ボックスと呼ばれる DNA の特定の要素にバインドする活性複合体によって駆動されます。これは、MHC クラス II 遺伝子 HLA DPB1 と HLA DMA の選択した地域の我々 の FAIRE の分析によって明らかにされた、クロマチンのレベルに反映されます。これらの実験は、クロマチンは遺伝子体 (図 2) ではよりコンパクトですが、XY ボックスを取り囲む領域を示した。
この特定の実験では、計算のための例として我々 は合計を希釈した DNA サンプル 10 倍 (希釈倍率 10)、および無料の DNA サンプルは希薄化 (希釈率 1) qRT PCR のため。Cts テストさまざまな地域の取得し、最終的な回復率と回復率を取得するための計算を示す表 2.肯定的な制御として ACTB プロモーターを使用してこれらの回復率が得られました。なお、これらの計算は、図 2に示す結果を生成するために使用複製の 1 つ。
別のコンテキストでクロマチン アクセシビリティは誘引可能な遺伝子発現のモデルでテストされました。この場合は、賛成して炎症性の刺激の腫瘍壊死因子 (TNF) への応答でのクロマチン圧縮の急速な変化を測定しました。HeLa 細胞は、未処理または TNF 応答サイトカイン インターロイキン 8 (IL8) をコードしている遺伝子のプロモーター領域制御式でクロマチン圧縮を測定するフェアに続いて、1 時間で TNF 刺激に残っていた。これらの結果は、TNF 刺激による細胞 (図 3) の IL8 プロモーターで強く高められたクロマチン接近性を示した。TNF 刺激後 IL 8 プロモーターでアクセシビリティはこの規制地域の劇的なクロマチン改造を示す ACTB プロモーターは、それよりも高いです。ここで得られた回収率は肯定的な制御 (ACTB プロモーター) として使用される領域で得られたより高い相対的な回収率は 1 より高い。
図 1: ワークフロー、放任します。セルは、ホルムアルデヒド (A) を追加することによって、細胞培養用フラスコまたは皿で直接架橋です。ホルムアルデヒドの焼入後セルを氷冷 PBS (B)、3 回洗浄して反応管、放任の換散バッファーで再停止される、(C) DNA をせん断する超音波処理に転送。抽出されたクロマチンの 1 つの因数は、総 DNA 参照 (D) を取得する 65 ° C で加熱・ デ ・架橋とフェノール: クロロホルム架橋とデ架橋因数 (E) の両方を使用して無料の DNA を抽出後。最後に、DNA の定量化し、DNA は合計対自由の比率計算 (F)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: HEK293T 細胞の MHC のクラス II 遺伝子のクロマチンをユーザー補助機能の決定クラスターします。HEK293T 細胞は、放任によって分析されました。全 DNA と無料の間の比率 (すなわち、相対比) 肯定的な制御、ネガティブ コントロールとしてクローム 12 上のヘテロクロマチン領域・規制地域と MHC の遺伝子体として ACTB 遺伝子のプロモーターの決定された。クラス II 遺伝子 HLA DMA と HLA DPB1。上の部分は、軌跡の概略とプライマーの位置を示しています。誤差範囲は、トリプリケートで測定される 2 つの生物学的複製から標準偏差を表しています。図は、パブリッシュされたレポート19から変更されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: TNF 治療への応答の IL8 プロモーター DNA アクセシビリティの変更。HeLa 細胞の TNF 刺激を受けました (20 ng/mL) の 1 h および放任によって分析されました。間の比率は合計 ACTB (肯定的な制御) のプロモーター、クローム 12 (マイナス コントロール) の異質染色質領域と IL8 プロモーター DNA を測定した対無料します。誤差範囲は、重複で測定される 3 つの生物学的レプリケートから (SEM) 平均値の標準誤差を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 超音波照射条件の最適化。293 t 細胞から抽出したクロマチンは、集束超音波発生装置を用いた適切な管 (材料表) sonified だった。クロマチンは 30 の繰り返しで示された時間超音波次の設定で s: バースト 500、あたりサイクルのピーク電力 150、デューティー比 15、30 s: ピーク電力 2.5 によって続かれて、デューティー比、15 サイクル バースト 500/。結果のクロマチンはだった: クロロホルム抽出により精製し、2% の agarose のゲルにロード ・ デ ・架橋です。エチジウム ブロマイドのゲルを染色が表示され、bp の分子量のマーカーの位置が示されます。この実験で最適なクロマチン サイズ (200-300 bp) は、超音波照射の 20 分後に得られました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| プライマー | シーケンス |
| ACTB プロモーター F | AAAGGCAACTTTCGGAACGG |
| ACTB プロモーター R | TTCCTCAATCTCGCTCTCGC |
| クリスマス ツリー 12 負コントロール F | ATGGTTGCCACTGGGGATCT |
| クリスマス ツリー 12 負コントロール R | TGCCAAAGCCTAGGGGAAGA |
| HLA DMA XY ボックス F | CATCAGTCACTGGGGAGACG |
| HLA DMA XY ボックス R | GCTTCCCAGCCCAGTTACAT |
| HLA-DMA 5'-F | GGAGAGAACAATCTCCGCTTCA |
| HLA-DMA 5'-R | AGCTGCTATGTGTGGTTGGT |
| HLA-DMA 3'-F | TGGGGACCTAGTTAGGGAGC |
| HLA-DMA 3'-R | AGATCCATGGGAGGAGGCTT |
| HLA DPB1 XY ボックス F | GTCCAATCCCAGGGTCACAG |
| HLA DPB1 XY ボックス R | TGAAAAGAGCTGCAGTCAGGA |
| HLA-DPB1 5'-F | GCGTGTTCATGTCTGCATCC |
| HLA-DPB1 5'-R | TGATCCTCAGAGCCTGGACA |
| HLA-DPB1 3'-F | CCAGCCTAGGGTGAATGTTT |
| HLA-DPB1 3'-R | GCCTGGGTAGAAATCCGTCA |
| IL8 プロモーター-F | GTGATGACTCAGGTTTGCCCT |
| IL8 プロモーター-R | CTTATGGAGTGCTCCGGTGG |
表 1: qPCR 用プライマー。
表 2: FAIRE 相対回復率の計算例.このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
Discussion
フェアは、ヌクレオソーム無料地域の特定できる堅牢で安価な方法です。それはラップされたヌクレオソーム DNA がヒストンに架橋をすることができます簡単に原理に基づいています。フェノール: クロロホルム抽出、蛋白結合 DNA を低いフェノール相と中間期 (図 1) である程度認められることから非架橋と無料の蛋白質 DNA のフラグメントを分離する使用されます。したがって、ヌクレオソーム フリー領域は、水相中に自由な DNA の一部であります。出版物の数は、放任法23,24,25,26、ここで説明している手順を補完するために相談することができます詳細なプロトコルを説明します。
クロマチン構造を決定するために使用する他の方法と同様に、放任メソッドは DNA の最適なせん断にも批判的に依存します。フラグメントが長すぎる場合、ヌクレオソーム フリー領域は隣接するクロマチン結合 DNA によってマスクされます。フラグメントが小さすぎる場合 qPCR またはディープ シーケンスによる検出は非常に困難になります。このため、DNA の超音波処理は重要なパラメーター制御、周りのフラグメントを取得するために最適化する必要があります 1-2 ヌクレオソーム (図 4) を表す 200 300 bp の長さ。
最終的な結果に影響を与えることができる他のパラメーターは、サンプルの架橋です。使用組織、固定時間が長くなるが許可する必要がある場合は特に固定手順のここではほとんどの細胞株に対して有効ですが、研究者が研究の下で特定のサンプルのこの手順を慎重に評価する必要があります、すべての組織のサンプルの細胞に到達するホルムアルデヒド。
他のメソッドとは異なり DNase など類またはミクロコッカスヌクレアーゼ過敏、チップ、または ATAC、放任依存していない酵素活性や特定の抗体に、したがって、滴定や反応条件の最適化は必要ありません。こう放任クロマチン フィールドで経験の少ない所クロマチン接近性を測定する理想的な方法です。さらに、パイロット実験が DNA せん断ステップと架橋時間を最適化するために必要なだけ必要なとき。
メソッドが酵母6、開発された当初、哺乳動物細胞にもなりました。放任メソッドで精製した DNA は、クロマチン状態のゲノム解析を許可するディープ シーケンスに使用できます。これは、既に研究8,9,10、11,12,13,19,27,数が役立っています28。
放任 seq 実験からの結果は、いくつかの違いが生じますが DNase - seq14など他の方法で得られた結果と重なりが大きいを表示します。これは、例えばリラックスしたまたは改造のヌクレオソームが DNase で胸の谷間を妨げる可能性がありますまだ方法論の違いのため、これらの DNA 領域が少ない DNA/タンパク質架橋を生成する傾向があるだろう、したがって、ヌクレオソーム無料決定されるだろう地域フェア9を使用しています。また、RNA ポリメラーゼなど非ヒストン蛋白質やエピゲノムのリーダー蛋白質の存在は DNA/タンパク質クロスリンク可能性があります、従って蛋白質満載フェア実験地域として解釈されるでしょう。これらの制限は、異った方法の組合せを使用して包括的な洞察力を取得する必要性を上げられ、クロマチンの状態の決定に使用されるすべてのメソッドに固有。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者感謝したい Tilman Borggrefe (ギーセン大学) 親切超音波デバイスを共有するため。ドイツ研究振興協会 (コウキヤガラ 1417/8-3)、SFB/TRR81、SFB1021、SFB1213、卓越したクラスター心肺システム (ECCPS、EXC 147/2)、ドイツの Krebshilfe (111447)、IMPRS HLR プログラムからの助成金によって M.L.S. から作業をサポートします。マックス ・ プランク協会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Carl Roth | A156.1 | |
| Glycogen, 20 mg/ml | Thermo Fisher | R0561 | |
| ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, Rox | Thermo Fisher | AB1162B | |
| Proteinase K, 20 mg/ml | Thermo Fisher | EO0491 | |
| RNase A, 10 mg/ml | Thermo Fisher | EN0531 | |
| Leupeptin | Sigma | L8511 | |
| Aprotinin | Sigma | A1603 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | 78830 | |
| milliTUBE 1 ml AFA Fiber | Covaris | 520130 | |
| Holder milliTUBE 1ml | Covaris | 500371 | |
| Covaris S220 Focused-ultrasonicator | Covaris | ||
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosistems | 4376600 |
References
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