Summary
ここでは、高スループット実験の培養細胞におけるトリアシルグリセ ロールのダイナミクスを調べるため脂質液滴 (LD インデックス) を取得するためのプロトコルについて述べる。LD インデックス アッセイは、BODIPY 493/503 を使用する簡単で信頼性の高い方法です。このアッセイでは、dispendious の脂質の抽出または顕微鏡による解析を必要はありません。
Abstract
記事は、トリアシルグリセ ロール (タグ) 脂肪滴 (LDs) での蓄積を決定する機密性の高いマイクロ プレート法は、LD のインデックス アッセイを実装する方法を示します。脂質の抽出なし LD のインデックスを取得します。豊富な成長または枯渇窒素メディアといったさまざまな条件下で高スループット実験で LDs 量を測定できます。メソッドは、出芽酵母の脂質液滴代謝を勉強する最初の時間の記述されていたとはいえ、それは正常に担子菌の経路に適用されました。興味深いことに、細胞の大規模な様々 な哺乳類細胞には、酵母からメソッドを適用ことができます LDs は真核細胞の系統保存されている細胞内小器官であるので。LD インデックスに基づいて液体蛍光回復アッセイ (LFR) 焼入条件の下で BODIPY 493/503 のホルムアルデヒド.と固定細胞の添加によるヨウ化カリウムは、蛍光クェンチャーとして使用されます。蛍光と光学密度斜面間の比率は、LD インデックスという名前です。斜面は、時に取得した直線から算出 BODIPY 600 の光学密度と蛍光サンプル添加に対する nm (外径600) のプロットします。最適なデータ品質は、相関係数の等しいまたは 0.9 (r ≥ 0.9) の上に反映されます。マイクロ プレートに実装できるよう、複数のサンプルを同時に読むことができます。BODIPY 493/503 は脂質液滴に脂溶性蛍光染料のパーティションなので、LDs を蓄積する細胞の多くの種類で使用できます。
Introduction
脂肪滴 (LDs) は、ユビキタス細胞内脂肪体中性脂質、主にタグとステロールのエステル (SE) のコアで構成されます。コアは、perilipin とジアシルグリセ ロール アシル転移酵素、アセチル coa カルボキシラーゼ アシル-CoA 合成酵素1などの中性脂質の合成に関与する酵素のようなタンパク質と相互作用するリン脂質の膜によって囲まれています。その挙動によるリン脂質膜にはも加水分解のタグと SE2トリアシルグリセ ロール リパーゼが含まれています。細胞型、生物によってストアド中性脂質はエネルギーを生成に使用することができます。 またはリン脂質とシグナル分子を合成します。酵母、他のカビ、LDs 変更減らされた窒素のアベイラビリティを中性脂質生産3,4 を増加するキーことを示す培地の窒素/炭素比の変化に対する応答の内容の ,5。酵母におけるタグの大量生産食品産業、バイオ燃料のソースとしてバイオ テクノロジーに潜在的な使用しています。いくつかのストアドの脂質にはオメガ 3 とオメガ 6、栄養と食事の重要性6,7,8,9,10のような多価不飽和脂肪酸の比率が高いが含まれています。,11. 哺乳動物細胞、ひと細胞を含むの LDs はタグとコレステロールをエステルにも含まれています。リン脂質単層対話酵母、LDs で説明されている蛋白質の相同性哺乳類と付加的な蛋白質、不在である perilipin酵母12で。1 つのリン脂質単分子膜とその関連付けられているタンパク質の役割は LDs の構造を安定させるために、細胞内小器官とミトコンドリア、小胞体、ペルオキシソームと脂質交換のために主に、空胞として LDs の対話を許可する提案1314,。興味深いことに、ヒトでは、LDs は、2 型糖尿病、動脈硬化、肝炎、冠状心臓病、その数15,16,17 に増加があるなどの病態に関与すると表示されます。.ウイルスの種類によっては、粒子2,18,19を組み立てるためのプラットフォームとして LDs を使用します。
人間の病理とその潜在的なバイオ テクノロジーの LDs の影響のため LDs 形成の厳密な実験的決定は重要な作業です。この記事は蛍光 (LFR) BODIPY 493/503 の回復に基づく信頼性の高い試金を記述 (4、4 フッ素 1、3、5、7、8-pentamethyl-4-ボラ-3 a、4 a diaza-s indacene)、細胞の中性脂質の内容の相対的な値を取得します。このアッセイでは、中性脂質米国アルテリシジンなど酵母、菌、脂質抽出20.を必要とせず、哺乳類細胞の蓄積のダイナミクスに従うこと出芽酵母タンパク質ホスファターゼを識別するために最初に適用したし、に関与するキナーゼの脂質代謝調節。これが脂質の抽出やタンパク質精製21,22なし可能だった。LFR もマクロファージ23LDs 形成の力学を確立に使用されています。BODIPY 493/503 の使用では、ナイルの赤として他の染料は中性脂質いくつかの利点があります。BODIPY 493/503 は中性脂質に非常に特有、発光スペクトルが狭い共焦点顕微鏡によるサンプルを分析するとき、赤の蛍光タンパク質や水戸トラッカーのような染料からの信号の同時検出を促進します。残念ながら、BODIPY 493/503 は退色に敏感が、曝露光24時 antiquenching 試薬を使用して、このプロセスを避けることができます。
酵母細胞の LFR の試金を遂行する目的の栄養条件下で培養するし、因数が異なる時間に撤回されます。ホルムアルデヒド、ヶ月細胞を 4 ° C で保存するときの LDs の整合性を保持するとセルを固定する次に、他の固定方法は避けてください、彼らは LDs の24セル内の劣化につながるので、メタノールまたは冷アセトンを使用して特にそれら。LD インデックスを測定するには、ホルムアルデヒド固定セルは、定義された濃度の水で中断されます。BODIPY 493/503 KI、により蛍光体を含むソリューションに追加し、その蛍光の回復がある蛍光体がセルに入るし、Ld に関連付けます。細胞の濃度は 600 の光学濃度を測定することによって定量化の蛍光測定 (485 nm/510 nm) に付随、nm。各サンプルは同じにもホルムアルデヒド固定細胞懸濁液の後の 5 μ 因数を追加することによって 4 回を読み取られます。蛍光・吸光度の空白セルの加算の前に取得されます。測定の直線性を決定することにより、蛍光や吸光度データの品質評価: 場合 r < 0.9、データは破棄されます。R 値は、基本的に蛍光の強度は細胞濃度を上げるに線形応答を生成する必要がありますので重要です。細胞濃度が高すぎる場合は、直線性が失われます。LFR アッセイは、高スループット実験で所望の LD 表現型を選択する高速、シンプルで経済的メソッドを提供します。希望の条件を選択すると、BODIPY、セルに LDs のイメージを提供することで染色同じホルムアルデヒド固定セルを用いた共焦点顕微鏡による個々 のセルの LD の内容を学ぶことができます。自分のタグや SE のコンテンツ今さらに分析できる薄層クロマトグラフィーによる。
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Protocol
1 バッファーおよび解決の準備
- リン酸の 1 L を準備する緩衝生理食塩水 (PBS、pH 7)、8 g の NaCl、KCl、Na2HPO4、0.24 g の KH2PO4芳醇水 800 mL に 1.44 g 0.2 g を溶かします。HCl で 7.0 に pH を調整し、1 l. PBS の最終巻の水を原液 x 10 を作ったし、室温で保存することができますを追加します。
- ソリューションを修正の 10 mL を準備するには、9 mL の PBS 3.7% の最終濃度に到達するために 37% ホルムアルデヒドの 1 mL を追加します。ちょうど使用する前にこのソリューションを準備します。
注意: は、ホルムアルデヒド溶液を処理するのに手袋を使用します。 - 焼入れ-ソリューション (500 mM) を準備するには、100 mL の蒸留水に氣の 8.3 g を溶解します。使用する前にこのソリューションを準備し、常温で保存します。
- BODIPY 10 mM 原液を準備、ジメチルスルホキシド (DMSO) の 3.8 mL に 10 mg の BODIPY 493/503 を溶解します。-70 ° C で暗闇の中 100 μ 因数を保持します。
- BODIPY 5 μ M 冷却ソリューションを準備するには、10 mM BODIPY 冷却剤 500 mm 493/503 に 2 mL の 1 μ L を追加します。LFR アッセイ BODIPY の 5 μ M の最終的な集中が必要です。
- ミネラル溶液を準備する追加 H3ボーの 0.06 g3、0.14 g MnCl2-4 H2O、ZnCl2ナ20.04 g の 0.4 g の MoO4-2 H2O、0.1 g した FeCl3-6 H2O と CuSO の 0.4 g4-5 H2O の蒸留水 1 L にします。
- 塩の溶液を準備するには、KH2PO4ナ2、4KCl の 8 g、MgSO4の 2 g、CaCl2、1 g と 1 l のミネラル溶液 8 mL 蒸留水の 4 g の 16 g を追加します。
- (A2b2)米国アルテリシジン FB2 の窒素ソースなし最小媒体を準備するホリデーらによると、蒸留水を 1 L に 10 g のブドウ糖、食塩の 62.5 mL を追加31. 7.0 に pH を調整し 250 mL フラスコにメディアの 100 mL を分注、それらを殺菌します。液体のサイクルまたはフィルター 15 psi (1.05 kg/cm2) で 20 分間オートクレーブ滅菌します。
- 酵母ペプトン ポテトデキスト ロース培地 (YPD) を準備するには、5 グラム酵母エキス、ペプトン、2.5 g と 5 g の 1 L にブドウ糖の蒸留水を追加します。250 mL フラスコの溶液 100 mL を省略し、それらを殺菌します。液体のサイクルまたはフィルター 15 psi (1.05 kg/cm2) で 20 分間オートクレーブ滅菌します。
2. 培養条件とセル固定
注: は、細胞をできるだけ早く固定することによって、LDs の構造を維持します。マイクロ遠心チューブ用の固定を行うことができます。固定セルは 4 ° C で水の薄層を残す脱水を避ける場合まで 1 ヶ月保存できます。
- 培養条件下で米菌細胞を成長研究に関連します。0.05 の初期の OD600文化を開始 (1.15 × 106セル/mL)。28 ° c、24 h の 180 rpm セルを孵化させなさい。2.3 × 107セルに対応する 1 の外径600 /mL。
- 選択した回、セルの因数を撤回します。米国アルテリシジンの最初の 8 時間の間に 5 mL ごとの 2 h を撤回します。成長の 8 h は後、2 mL の因数は十分です。
- 600 の光学濃度を測定各因数の nm。
- 卓上型遠心分離機を使用して 4 ° C で 1 分 14,000 x g で細胞懸濁液を遠心します。上清を捨てます。
- 1 mL の PBS ホルムアルデヒド 3.7% のバッファーのセルのペレットを中断します。室温で 15 分間細胞を孵化させなさい。
- 、孵化後、4 ° C で 1 分 14,000 x g で細胞懸濁液を遠心します。上清を捨てます。
- 蒸留水 (1 mL) のようなボリュームで 2 回細胞ペレットを洗浄します。4 ° C で 1 分 14,000 x g で細胞懸濁液を遠心分離します。各洗浄工程後上澄みを廃棄します。
- 5 外径600細胞ペレットを調整 (10 の8セル × 1.15/mL) に蒸留水 (式 1)。
方程式 1。
- 4 ° C での使用まで、サンプルを保ちます。
方程式 1。
3. 液体蛍光回復アッセイ (LFR)
- 分光光度計をオンにし、Skanlt ソフトウェアを開きます。新しいセッション] をクリックし、選択を開始し、 Varioskan ルクス。セッション ツリーからプロトコル、(励起 485 nm/排出量 510 nm; 光学密度 600 nm) の蛍光波長の設定を入力し、自動光電子増倍管の利得を選択します。励起帯域幅、選択 12 nm。光学系でトップを選択 (サンプルの励起は井戸のトップから)。
- 優しくて連続攪拌 (300 の rpm) を入力します。プレートを実行、および一時停止するまで、ユーザー アクション(時間の井戸にサンプルの添加) を選択します。プロトコルを 5 回繰り返します。保存をクリックし、セッション名] フィールドにセッションの名前を書きます。プロトコルは、サンプル分析の準備が整いました。
- BODIPY 5 μ M ・ 200 μ 急冷 96 もブラック クリア下部プレートの各ウェルにソリューションを追加します。
- 分光光度計室内プレートを置き、30 ° C で 5 分間加温この時点から、可能な限り光から板を保護します。
- [スタート] ボタンをクリックし、蛍光 (励起 485/排出 510) と空白に対応する外径600を読みます。
- 一時停止時に井戸にホルムアルデヒド固定細胞懸濁液 5 μ L を追加します。ピペットでサンプルを慎重に混ぜます。分光光度計の中皿を置くし、[続行] をクリックします。その後、サンプルは、上記設計されたプロトコルに従って処理されます。
- 細胞懸濁液 5 μ L の 3 連続する追加を繰り返します。セルが沈殿しないことを確認します。(図 1)。
4. LD インデックスの計算
- マイクロ プレートの各サンプルは、蛍光と各連続添加 (5 ポイントの空白を含む) のボリュームに対して吸光度のグラフをプロットします。本研究では計算の Excel ソフトウェアを使用します。最初に、ボリューム、蛍光、吸光度データを入力データをプロットするデータシートの 2 番目と 3 番目の列それぞれ。その後、カーソルで全体のデータ、[挿入] をクリックし、(散布) を選択します。
- グラフの各ラインのポイントを選択し、表示式] ボックスを選択それぞれの傾向線を挿入します。式 2 によると、2 本の直線の斜面の値を書き留めておきます。
方程式 2
どこ y = 蛍光または光学濃度、 x = サンプルのボリューム (0, 5, 10, 15, 20 μ L)、 m蛍光または光学密度線 b の斜面を = = y 切片。 - LD インデックス、式 3 を取得する光学濃度直線の傾きによる蛍光ラインの斜面を分割します。
式 3
LD インデックス蛍光の商に対応しており光密度のゲレンデです。
方程式 2
式 35. データ品質分析
- 各直線の相関係数を計算する:関数ウィザード([fx]) をクリックし、 CORRELを選択。もし r < 0.9、データを破棄し、測定値を繰り返します。R ≥ 0.9、測定値は信頼性の高い場合。
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Representative Results
LFR と BODIPY 493/503 蛍光プローブとしては、米国アルテリシジン関係なくで LDs の動的蓄積成長条件を検討する信頼性と簡単な方法です。Ypd 培地で細胞を培養、静止した段階 (図 2 a) の減少が続く指数段階で LD インデックスの増加があった。対照的に、細胞は窒素飢餓の下で成長して、両方指数と静止した段階で (図 2 b) LD インデックスに着実な増加があった。両方の文化は、同じ光学濃度 (セルの同じような数) で開始された、ために、結果は脂質含量 (図 2) の小さな変化を検出する LFR アッセイの高容量を表示します。方法の感度は共焦点顕微鏡によって確証された: YPD - セルのセル全体を通して多くの小さい LDs 窒素飢餓下 (図 2、セルあたり 4-5 LDs 通常大規模な LDs の重要な生産はあったものの右パネル A と B、それぞれ)。LD インデックスは中性脂質含量の絶対的な値ではないためトリアシルグリセ ロール量を持つ LD インデックスに関する標準曲線を構築する必要があります。このアプローチは、出芽酵母20でタグ合成の動力学を研究に使用されました。各標準曲線に基づき、LFR 試金することができる細胞における脂質蓄積率の確定に使用します。
LD インデックスは、ソラフェン A、アセチル coa カルボキシラーゼ、LDs25に格納されているタグに含まれている脂肪酸の合成に不可欠な酵素の特異的阻害剤の存在下で続くことができます。阻害剤は、窒素源、細胞が脂質蓄積 (図 2 b) のより高い率を示した条件の不在の成長の 2 h 後培養液に追加されました。出芽酵母は、の以前のレポートに従ってソラフェンの添加は LD 蓄積 (図 2 b, 水色) 20,21の完全抑制で起因しました。
米国アルテリシジンの LDs の動員をさらに調査するには、72 h の窒素飢餓下で栽培した細胞は ypd 培地 (図 3) に移されました。LD 指数は指数関数に続いて減少。24 h 後 LD インデックスは窒素がない場合 (図 2 a) のストレスなく ypd 培地で培養した細胞で観察された同様の値に達した。セル窒素飢餓の中に蓄積された LDs を動員することができるので、タグのコンテンツの削減を示唆します。同様の応答酵母ホスファターゼ21脂質代謝の調節に関与の調査の間に報告されました。
図 1: LFR に関連する手順の概略図。培養条件の手順は米菌酵母の代表ですが、他の微生物や細胞の種類に適応することができます。ウルフは、回復蛍光; の単位bd、bidistilled 水。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:米国アルテリシジンにおける脂質蓄積の液滴のダイナミクス。酵母細胞を ypd 培地で 24 h のために栽培、収穫し、(A) 新鮮な ypd 培地に懸 (左上のパネル) または窒素源 (下部左パネル暗いブルー) なし (B) 最小媒体。窒素飢餓下で LD インデックスの増加が成長 (B, 水色) 2 h 後文化メディアで 192 nM ソラフェン A を追加することによって抑制されました。n = 3、データが平均 ± SEM.右側のパネル: 24 h でセルに LDs の共焦点顕微鏡の収穫 (、) の上部パネル: YPD 細胞。(B) 底板: 窒素源なし細胞。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: LDs 動員。最小限の 72 h の窒素ソースなし中新鮮な ypd 培地に転送し追加 24 h. 因数の培養で示された撤回されたまたは酵母 ypd 培地で 24 h のために栽培、収穫、24 h (コントロール) の新鮮な YPD で栽培LFR で LDs の動員を測定する両方の文化の時間。データは指数関数的減衰式で装着した (y = A·e-kt)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
LFR はそれが正常に脂質代謝酵母およびそれ以降の勉強に初めて適用された法米国アルテリシジン20,21で実装されています。LD インデックスは、細胞に蓄積されたタグの絶対値を与えない、細胞の脂質含量の高速なアイデアを提供しています、2 つまたは複数の実験条件から LD インデックスを比較すると、データの解釈は簡単です。BODIPY 493/503 は中性脂質、LDs の主成分に非常に特有であり共焦点細胞を調べたとき水戸トラッカーや CMAC ブルーのような色素から来る他の信号の同時検出を促進する狭い発光スペクトル顕微鏡26。多くの蛍光分子のような BODIPY 493/503 は蛍光顕微鏡実験中に退色しやすいが、光27に露光中に抗退色試薬追加することによってこのプロセスを減らすことができます。要約すると、BODIPY 493/503 は蓄積と中性脂質21,22,23,28,29の動員の細胞の広い範囲で使用できます。
正常に動作する方法、いくつかの点を考慮に取られなければなりません。細胞の形態で必要外径600は LD インデックスの計算に使用されるため、実験中に根本的な変更はありません。固定細胞の中に細胞内の構成要素の保全も重要なステップは、この保存はこのプロトコルの主な目的である LDs を含める必要があります。適切な化合物で細胞を固定、問題なくセルの多くの種類にこのメソッドのアプリケーションにとって非常に重要です。ここで、ホルムアルデヒドは、細胞の構造を修正するのに使用アルデヒドは、タンパク質のアミノ基と反応します。他のアルデヒドも幅広い細胞の構造を維持し、タンパク質構造24,26で大幅な変更がないことだ、それを報告されています。ホルムアルデヒドの欠点は、それは小さな膜の損傷を誘発して、ミトコンドリアと核膜が、これらのマイナスの効果に近い液胞形成、すべてアルデヒド固定方法26に共通です。彼らはセルに LDs を低下させるため、メタノールやアセトンのような有機溶剤を避けてください。有機溶剤による固定は、脱水と負の効果を考えることができる蛋白質の沈殿物に基づいています。さらに、有機溶剤の使用は、非特定の染色に関連付けられます。
他の手法として LD インデックス分析他のシステムに実装されている場合の制限があります。真菌細胞壁、蛍光性の脂肪酸組成、脂質と細胞内脂質体30たんぱくの種類依存性を越える BODIPY の拡散の問題を排除タグの量の比較異種間または同じセル異なる栄養条件下で栽培。また、菌糸体または細胞の凝集への移行などの大型の形態学的変化は、見つけることができる問題の一部です。
LD インデックス アッセイは、短い時間とバイオマスと反応物質の少量を必要とする高スループット方法です。試金は信頼性が高く、得られたデータが正確かつ再現性のある.さらに、医学、脂質代謝の動態に関する研究のガイドラインを提供し、油糧微生物バイオ燃料の生産のための高スループット スクリーニング用バイオ テクノロジーのツールになるかはオイルをフィードします。
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Disclosures
著者がある何も開示する
Acknowledgments
この作品が助成金によって支えられたセルバンテス Politécnico ナシオナル事務局・ デ ・危惧 y Posgrado (IPN SIP 20170864) プログラム ・ デ ・ Apoyo Proyectos ・ デ ・危惧 e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-大学国立自治・ デ ・ メヒコ (UNAM) と y Consejo ナシオナル デ サイエンス テクノロジー (256520 GGS と CONACyT 254904 JPP)。カルースト ・ デ ・ アンパロ、Pesquisa はリオ ・ デ ・ ジャネイロ (FAPERJ Cientistas 行う nosso ポルトガル Estado: E 26/103.353/2011)。QFB おかげで我々。オスカー イバン ・ Luqueño Bocardo 図式的な概観のため。LDs の共焦点顕微鏡の貴重なヘルプありがとう博士ミゲル ・ タピア ・ ロドリゲス。我々 は、我々 は米国アルテリシジンの適応出芽酵母における技術の開発に彼の先駆的な仕事のため博士ブルーノ Bozaquel Morais を感謝したいです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spectrophotometer | Varioskan Lux multimode microplate reade | D5879 | Filter 493/503 or monochromator detector |
| Plate costar | Corning Inc. | 3615 | 96 well black-wall/clear bottom |
| Plate costar | Corning Inc | 3598 | 96 well cell culture plate costar |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen/ Thermofisher | D3922 | 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | 252549 | ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization |
| Potassium iodide | Sigma Aldrich | 60399 | BioUltra, ≥ 99.5% (AT) |
| FB2 Ustilago maydis | ATCC | 201384 | Basidiomycete-Yeast |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 746398 | ACS reagent, inorganic salt |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P0662 | ACS reagent |
| Select Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y100 | Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media |
| N-Z case plus | Sigma aldrich | N4642 | Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk |
| Glucose | Sigma Aldrich | G-8270 | D (+) glucose |
| Skaker flask | Pirex | CLS4450250-6EA | Borosiicate glass |
| Shaker | SEV México | INO650V-7 | Orbital shaker |
| Centrifuge table | Eppendorf | 5415C | Centrifuge |
| Microtubes | Sigma Aldrich | Z606340 | Eppendorf |
| Pipet tips | Axygen scientific | T-200-Y | Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile |
| mLine pipette | Biohit | 725130 | 8 channels, volume range 5-100 uL |
References
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