Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Определение липидов индекс путем восстановления жидкого флуоресценции в грибкового патогена Пузырчатая Maydis

Published: April 3, 2018 doi: 10.3791/57279
Automatic Translation
*1,2, *3, 2, 1
1Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, 2Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, 3Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Universidade Federal do Rio de Janeiro
* These authors contributed equally

Summary

Здесь мы описываем протокол для получения липидного капель индекс (LD) для изучения динамики триацилглицеролов в клетки культивировали в высок объём экспериментов. Assay индекс LD-это простой и надежный метод, который использует BODIPY 493/503. Этот assay не нужно dispendious экстракции липидов или анализа в микроскопии.

Abstract

В статье показано как реализовать пробирного LD индекс, который является чувствительной Гонав пробирного определить накопление триацилглицеролов (Теги) в капельках липидов (LDs). LD индекс получается без экстракции липидов. Это позволяет измерения содержания LDs в высок объём экспериментов в различных условиях, таких как рост в богатых или азота в исчерпаны средства массовой информации. Хотя этот метод был описан в первый раз для изучения капелька метаболизма липидов в Saccharomyces cerevisiae, он был успешно применен к базидиомицета пузырчатая maydis. Интересно и потому, что LDs являются органеллы, филогенетически сохраняется в эукариотических клетках, метод может быть применен к большое количество клеток, от дрожжевых клеток млекопитающих. LD индекс основан на пробу восстановления жидкого флуоресценции (LFR) BODIPY 493/503 тушения условиях путем добавления ячеек фиксированной с формальдегидом. Калий йод используется как флуоресценции утоления. Соотношение между флуоресценции и склонах оптической плотности называется LD индекс. Склоны вычисляются из прямых линий, полученных при BODIPY флуоресценции и оптическая плотность 600 Нм (600OD) заговор против добавления образца. Оптимального качества отражается коэффициенты корреляции равной или выше 0,9 (r ≥ 0.9). Несколько образцов можно читать одновременно, как он может быть реализован в микроплиты. Поскольку BODIPY 493/503 липофильных флуоресцентных красителей что разделы в капелек липидов, она может использоваться во многих типах клеток, которые аккумулируют LDs.

Introduction

Липидного капель (LDs) являются повсеместно внутриклеточного жира тела состоит из ядра нейтральные липиды, главным образом Теги и эфиры стеринов (SE). Ядро окружен монослоя фосфолипидов, который взаимодействует с белками, как perilipin и ферментов, участвующих в синтезе нейтральные липиды, например диацилглицерол ацил трансферазы, ацетил-КоА carboxylase и дефицит ацил CoA синтазы1. Из-за его динамическое поведение фосфолипидный монослоя также содержит триацилглицеринов липазы которые гидролизуют Теги и SE2. В зависимости от типа клеток и организм хранимые нейтральные липиды могут использоваться для получения энергии, или синтезировать фосфолипидов и сигнальных молекул. Дрожжи и другие грибки, содержание LDs изменения в ответ на изменения в коэффициент азота/углерода в культуре средств массовой информации, указав, что наличие снижение азота может быть ключом к увеличению липидный нейтральными производства3,4 ,5. Производство большое количество тегов в дрожжи имеет потенциального использования в биотехнологии как источника биотоплива и в пищевой промышленности. Некоторые хранимые липиды содержат высокие пропорции полиненасыщенных жирных кислот, как Омега 3 и Омега 6, с питания и диетических значение 6,,78,9,10 , 11. LDs mammalian клеток, включая клетки человека, также содержат теги и эфиры холестерина. Фосфолипидный монослоя взаимодействует с млекопитающих гомологичных белков, описанных в дрожжи LDs и с дополнительного белка, perilipin, который отсутствует в S. cerevisiae12. Один предложил, что роль для его связанного белков и фосфолипидов монослоя стабилизации структуры LDs и разрешить взаимодействие LDs с органеллы митохондрии, эндоплазматический ретикулум, пероксисомы и вакуоли, главным образом для липидного обмена 13,14. Интересно, что в организме человека, LDs, как представляется, быть вовлечены в патологии как тип 2 диабета, атеросклероза, стеатогепатит и ишемической болезни сердца, в котором есть увеличение их числа в 15,16,17 . Некоторые типы вирусов использовать LDs как платформы для сборки вирионы 2,18,19.

Из-за последствий LDs в человеческой патологии и их потенциального использования биотехнологических точного экспериментального определения формирования LDs является важной задачей. Эта статья описывает надежного анализа на основе восстановления флюоресценция (LFR) BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-бора 3А, 4а диазафенантрена s-indacene), чтобы получить значение относительного содержания нейтральные липиды в клетках. С этот assay можно проследить динамику накопления нейтральные липиды в грибы как U. maydis и S. cerevisiae, а также в клетках млекопитающих, без необходимости извлечения липидов в 20. Метод был применен для в первый раз в S. cerevisiae для идентификации белковых фосфатаз и киназы, участвующих в регуляции жирового обмена. Это стало возможным без экстракции липидов и белков очистки21,22. LFR также использовался для создания динамики формирования LDs в перитонеальных макрофагов23. Использование BODIPY 493/503 имеет некоторые преимущества над другими красителями нейтральных липидов как красный Нила. BODIPY 493/503 весьма специфичен для нейтральные липиды и имеет узкий спектр излучения, облегчения одновременного обнаружения сигналов от краски как красный флуоресцирующий белок или Mito трекер, когда анализируются образцы confocal микроскопии. К сожалению BODIPY 493/503 чувствителен к Фотообесцвечивание, но этот процесс можно избежать с помощью antiquenching реагента при воздействии света24.

Для проведения пробирного LFR в дрожжевых клеток, они культивировали в желаемый питания условиях, и аликвоты снимаются в разное время. Далее клетки фиксируются с формальдегидом, который сохраняет целостность LDs для месяцев, когда клетки хранятся при 4 ° C. Другие методы фиксации следует избегать, особенно те, с использованием метанола или холодной ацетона, поскольку они ведут к деградации LDs внутри клетки24. Для измерения индекса LD, формальдегида Исправлена клетки подвешены в воде для получения определенной концентрации. Затем они добавляются в раствор, содержащий Флюорофор BODIPY 493/503 закаленном KI, и когда Флюорофор входит в ячейку и связывает с LDs, является восстановление ее флуоресценции. Сопутствующих измерений флуоресценции (485 Нм/510 нм), концентрация клеток количественно измеряя оптическую плотность 600 Нм. Каждый образец читается в четыре раза, добавив последующие 5 мкл аликвоты формальдегида Исправлена клеток подвески к тому же хорошо. Бланки флуоресценции и поглощения приобретаются перед добавлением клеток. Качество флуоресценции и поглощения данные оцениваются путем определения линейность измерений: если r < 0.9, данные отбрасываются. Значение r имеет важное значение, потому что в основном интенсивность флуоресценции должен производить линейным откликом на увеличение концентрации клеток. Если клетки концентрация слишком высока, линейность теряется. LFR assay обеспечивает быстрый, простой и экономичный метод для выбора желаемого фенотип LD в высок объём экспериментов. После выбора желаемых условий, LD содержание отдельных ячеек может быть изучен конфокальная микроскопия, используя те же формальдегида Исправлена клетки окрашивали BODIPY, обеспечивая образ LDs в ячейке. Теги и их SE содержания могут теперь далее анализироваться хромотографией тонким слоем.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка буферов и решения

  1. Подготовить 1 Л фосфата буфер солевой раствор (PBS, pH 7), растворяют 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na2HPO4, 0,24 г х2PO4 800 мл дистиллированной воды. Отрегулируйте пэ-аш до 7.0 с HCl, а затем добавьте воды для окончательного объемом 1 л PBS могут быть сделаны как 10 x Стоковый раствор и хранятся при комнатной температуре.
  2. Подготовить 10 мл фиксации решение, добавьте 1 mL 37% формальдегида в 9 мл PBS до конечной концентрации 3,7%. Готовить это решение непосредственно перед использованием.
    Предупреждение: Используйте перчатки для обработки раствора формальдегида.
  3. Подготовить закалки раствор (500 мм), растворяют 8.3 g ки в 100 мл дистиллированной воды. Готовить это решение перед использованием и хранить его при комнатной температуре.
  4. Подготовить раствор BODIPY 10 мм, Растворите 10 мг BODIPY 493/503 3.8 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Держите 100 мкл аликвоты в темноте-70 ° c.
  5. Подготовить BODIPY 5 мкм тушение раствора, 1 мкл 10 мм BODIPY мл 493/503 до 2 500 мм, закалки решения. Для assay НОСЛЛ конечная концентрация 5 мкм BODIPY не требуется.
  6. Для подготовки минеральных решение, добавьте 0,06 g H3Бо3, 0,14 г НКД2-4 H2O, 0,4 г ZnCl2, 0,04 г Na2MoO4-2 H2O, 0,1 г FeCl3-6 H2O и 0,4 г CuSO 4-5 H2O в 1 Л дистиллированной воды.
  7. Подготовить раствор соли, добавьте 16 g KH2PO4, 4 g Na2,4, 8 г хлористого калия, 2 г MgSO4, 1 g CaCl2и 8 мл раствора минеральных в 1 Л дистиллированной воды.
  8. Подготовить минимальный средний без источника азота для U. maydis FB2 (a2b2), добавить в 1 Л дистиллированной воды, 10 г глюкозы и 62,5 мл солевого раствора согласно Холлидей, et al. 31. Отрегулируйте пэ-аш до 7.0 и затем распределять 100 мл СМИ в 250 мл флакон и стерилизовать их. Автоклав для 20 мин при давлении 15 psi (1,05 кг/см2) на жидком цикла или фильтр стерилизовать.
  9. Чтобы подготовить дрожжи Пептон Декстроза среднего (YPD), добавьте 5 г дрожжей экстракт, 2.5 g Пептон, и 5 г глюкозы в 1 Л дистиллированной воды. Отказаться от 100 мл раствора в 250 мл флакон и стерилизовать их. Автоклав для 20 мин при давлении 15 psi (1,05 кг/см2) на жидком цикла или фильтр стерилизовать.

2. Культура состояния и фиксации ячейки

Примечание: Сохранить структуру LDs, фиксируя клетки как можно скорее. Фиксация может быть сделано в microcentrifuge трубы. Фиксированные клетки могут храниться при температуре 4 ° C до одного месяца, если избежать обезвоживания оставляя тонкий слой воды.

  1. Растут U. maydis клетки в условиях культуры соответствующие исследования. Запустите культуры с первоначального ОД600 0,05 (1,15 × 106 клеток / мл). Инкубируйте клетки на 28 ° C, 180 об/мин за 24 ч. ОД600 1 соответствует 2,37 × 10 клеток / мл.
  2. В выбранной раз, снять Алиготе клеток. Для U. maydis, снять 5 мл каждые 2 ч в течение первых 8 ч. После 8 h роста аликвоты 2 мл достаточны.
  3. Измеряют оптическую плотность на 600 Нм каждого Алиготе.
  4. Центрифуга суспензию клеток в 14.000 x g 1 мин на 4 ° C, с помощью настольной центрифуги. Выбросите супернатант.
  5. Приостановите Пелле клеток в 1 мл буфера PBS-формальдегид 3,7%. Инкубируйте клетки для 15 мин при комнатной температуре.
  6. После инкубации центрифуга суспензию клеток в 14.000 x г за 1 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
  7. Помойте лепешка клетки дважды с же объем дистиллированной воды (1 мл). Центрифуга суспензию клеток в 14.000 x г за 1 мин при 4 ° C. Выбросите надосадке после каждой стирки шага.
  8. Отрегулируйте Пелле ячейки до 5 ОД600 (1.15 x 108 клеток / мл) с дистиллированной воды (уравнение 1).
    Equation 1    Уравнение 1.
  9. Держите образца при температуре 4 ° C до его использования.

3. Жидкие флуоресценции восстановления Assay (LFR)

  1. Включите спектрофотометра и откройте программное обеспечение Skanlt. Нажмите на новой сессиии выберите Пуск , а затем Varioskan Lux. Выберите протокол из дерева сессии, введите параметры для флуоресценции длин волн (возбуждения 485 Нм/выбросов 510 нм; оптическая плотность 600 Нм) и выбрать автоматическое фотоэлектронный умножитель выгоды. Для возбуждения пропускной способности, выберите 12 Нм. В оптике, выбрать лучшие (возбуждения образца-от верхней части колодца).
  2. Введите нежный и непрерывное агитации (300 об/мин). Выберите запустить пластиныи Пауза до действий пользователя (время используется для добавления образца к скважинам). Повторите пять раз протокол. Нажмите кнопку сохранить и записать имя для сессии в Поле имя сеанса. Протокол теперь готов для анализа проб.
  3. Добавьте 200 мкл BODIPY 5 мкм - закалка решение каждой скважины 96 хорошо черно снимите нижнюю крышку.
  4. Поместите пластины в камере спектрофотометром и инкубировать 5 мин при 30 ° C. С этого момента защищают пластину от света как можно больше.
  5. Нажмите кнопку Пуск и читать флюоресценция (возбуждения 485/выбросов 510) и ОД600 соответствующие пробелы.
  6. Добавьте 5 мкл суспензии клеток формальдегида Исправлена скважин во время паузы. Тщательно перемешать образцы с пипеткой. Положите пластину внутри спектрофотометра и нажмите кнопку продолжить. Затем образцы будут обрабатываться согласно протокол, разработанный выше.
  7. Повторите три последовательных добавлений 5 мкл суспензии клеток. Убедитесь, что клетки не осадок. (Рис. 1).

4. Расчет индекса LD

  1. Для каждого образца в микроплиты график флуоресценции и поглощения против объем каждого последовательных сложения (5 очков, включая пустые). В этом исследовании использование программного обеспечения Microsoft Excel для вычислений. Печать данных, введите объем, флуоресценции и оптической плотности данных в первой, второй и третьей колонках таблицы, соответственно. Затем, выберите все данные с помощью курсора, нажмите кнопку Вставить и выберите ТОЧЕЧНАЯ (XY).
  2. Выберите точки для каждой строки в графе и вставьте соответствующие Линии ТРЕНДА с флажок Показать уравнение . Запишите значения на склонах двух прямых линий, согласно уравнению 2:
    Equation 2    Уравнение 2
    Где y = флуоресценции или оптической плотности, x = объем образца (0, 5, 10, 15, 20 мкл), m = наклон флуоресценции или линии оптической плотности, и b = y пересечение.
  3. Разделите наклон линии флуоресценции, наклон линии оптической плотности для получения индекса LD, уравнение 3.
    Equation 3    Уравнение 3
    LD индекс соответствует частное флуоресценции и оптической плотности трасс.

5. качество анализ данных

  1. Вычислить коэффициент корреляции каждой прямой линии: нажмите на Мастера функции (fx) и выберите КОРРЕЛ. Если r < 0.9, отменить данные и повторите чтения. Если r ≥ 0.9, показания являются надежными.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

НОСЛЛ, с BODIPY 493/503 как флуоресцентный зонд является надежной и простой метод для изучения динамических накопление LDs в U. maydis, независимо от условий роста. Когда клетки были культивировали в YPD-средний, было увеличение индекса LD на этапе экспоненциального последующим снижением в стационарной фазе (рисунок 2A). В противоположность этому в клетках, выращенных под азота голод, был неуклонный рост индекса LD поэтапно как экспоненциальная и стационарные (рис. 2B). Поскольку обе культуры были начаты с же оптической плотности (аналогичные количество клеток), результаты показывают LFR assay высокая способность обнаружить небольшие изменения в содержание липидов (рис. 2). Чувствительность метода был подкреплен confocal микроскопии: YPD-клетки содержат множество мелких LDs на протяжении всей ячейки, в то время как под азота голода было важным производство больших LDs, обычно 4-5 LDs на клетки, (рис. 2, правой панели A и B, соответственно). Поскольку индекс LD не абсолютное значение содержания нейтральных липидов, касающиеся LD индекс с количеством триацилглицеролов калибровочной кривой должны быть построены. Этот подход был использован для изучения динамики Теги синтеза в S. cerevisiae20. Основываясь на каждой стандартной кривой, LFR assay может быть использованы для определенный уровень накопления липидов в клетках.

LD индекс может следовать в присутствии soraphen A, конкретные ингибитор carboxylase ацетил-КоА, фермент, который необходим для синтеза жирных кислот, содержащихся в тегах, хранящиеся в LDs25. Ингибитор был добавлен в питательной среды после 2 h роста в отсутствие источника азота, условие, в котором клетки показали более высокие темпы накопления липидов (рис. 2B). В соответствии с предыдущих докладов в S. cerevisiae, Добавление soraphen-A привело к полной ингибирование накопления (Рисунок 2B, светло-голубой) LD 20,21.

Для дальнейшего расследования мобилизации LDs в U. maydis, клетки, выращенных под азота голода за 72 ч были переданы YPD-средний (рис. 3). LD индекс снизился после экспоненциальной функции. После 24 часов LD индекс достиг аналогичного значения, наблюдается в клетки культивировали в YPD средних без стресса отсутствие азота (рисунок 2A). Поскольку клетки смогли мобилизовать LDs, накопленных во время голодания азота, результат предполагает сокращение содержания Теги. Подобный ответ было сообщено для S. cerevisiae во время изучения фосфатаз, участвует в регуляции липидного метаболизма21.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое представление этапов LFR. Шаги культуры условий являются репрезентативными для U. maydis дрожжи, но могут быть адаптированы к другим микроорганизмам или тип клеток. ЕФД, единиц восстановления флуоресценции; BD, бидистиллированной воды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: динамика накопления капелек липидов в U. maydis. Дрожжевые клетки были выросли за 24 ч в YPD-средний, собирают и приостановлено в (A) свежие YPD-средний (верхняя левая панель) или (B) минимальный средний без источника азота (нижней левой панели-синий). Под голода азота увеличение индекса LD был тормозится, добавив 192 Нм soraphen A в культуре средств массовой информации после 2 h роста (B, светло-голубой). n = 3, данные являются среднее ± SEM. Правая панель: confocal микроскопии LDs в ячейке собирают на 24 ч () Верхняя панель: YPD-клетки. (B) Нижняя панель: клетки без источника азота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: мобилизация LDs. Дрожжевые клетки были выросли за 24 ч в YPD-средний, собирают и выросших в свежие YPD за 24 ч (управления) или в минимальных средних без источника азота за 72 ч, затем перевели в свежие YPD среднего и инкубируют для дополнительных 24 h. аликвоты были выведены на указанный раз для обеих культур для измерения мобилизации LDs по LFR. Данные оснащался уравнением экспоненциального распада (y = A·e-КТ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LFR это новый метод, который был применен в первый раз для изучения жирового обмена в S. cerevisiae и позднее было успешно реализовано в U. maydis20,21. Хотя индекс LD не абсолютное значение тэгов, накапливается в клетках, он обеспечивает быстрый идея содержания липидов клеток, и интерпретация данных проста при сравнении LD индекс из двух или более экспериментальных условиях. BODIPY 493/503 весьма специфичен для нейтральные липиды, основной компонент LDs, и она имеет узкий спектр излучения, облегчения одновременного обнаружения других сигналов, поступающих от краски как Mito-tracker или КЦР синий, когда клетки изучаются конфокальный микроскопия26. Как многие флуоресцентных молекул BODIPY 493/503 чувствителен к Фотообесцвечивание во время экспериментов микроскопии флуоресцирования, но этот процесс может быть уменьшена путем добавления анти Фотообесцвечивание реагентов при воздействии света27. В целом BODIPY 493/503 может использоваться в широком диапазоне ячеек для изучения накопление и мобилизация нейтральные липиды21,,2223,,2829.

Для метода для правильной работы необходимо учитывать некоторые точки. Так как ОД600 используется для расчета индекса LD, морфологию клеток не должен иметь радикальные изменения в ходе эксперимента. Сохранение внутриклеточных компонентов во время фиксации клетки также является важным шагом, и это сохранение должно включать LDs, которые являются главной целью настоящего Протокола. Фиксация клетки с соответствующей соединения очень важно для применения этого метода для многих типов клеток без каких-либо проблем. Здесь мы использовали формальдегида для исправления структуры клеток; альдегид реагирует с аминогруппами белков. Сообщалось, что другие альдегиды также сохранить структуры широкий диапазон ячеек и кажется, что есть не значительные изменения в24,структура белка26. Недостатком формальдегида является, что он вызывает повреждения малых мембраны и формирования вакуоль вблизи митохондриальных и ядерной мембраны, но, эти негативные эффекты являются общими для всех альдегид фиксации методы26. Органические растворители, как ацетон или метанола следует избегать, поскольку они деградируют LDs в клетках. Фиксация с органическими растворителями на основе и обезвоживания осадков белков, которые могут считаться негативный эффект. Кроме того использование органических растворителей ассоциируется с неспецифичный пятнать.

Как любой другой метод LD индекс assay может иметь ограничения при реализации других систем. Проблемы в распространении BODIPY через грибковой клеточной стенки, зависимость флуоресценции жирнокислотный состав, тип липидов и содержание белка в внутриклеточного липидов органы30, исключает сравнение количество тегов между разными видами или даже с тех же ячейках вырос в различных условиях питания. Кроме того большие морфологические изменения, как переход к мицелия или флокуляции клеток являются некоторые из проблем, которые могут быть найдены.

LD индекс пробирного — высокопроизводительный метод, который требует короткое время и небольшое количество биомассы и реактивы. Assay является надежным, и полученные данные точные и воспроизводимые. Кроме того он обеспечивает руководящие принципы для исследований по динамике метаболизма липидов в медицине, и он может стать инструментом в области биотехнологии для высокопроизводительного скрининга масленичных организма для производства биотоплива или подачи масла.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрытие

Acknowledgments

Эта работа была поддержана от грантов Instituto Nacional-Secretaria политехнического де инвестигасьон и Posgrado (IPN-SIP-20170864), Programa de Apoyo де инвестигасьон Proyectos e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-(Universidad Nacional Autónoma de México ЮНАМ) и Consejo Nacional de науки y Tecnología (КОНАСИТ 254904-JPP и 256520-GGS). Фонд-де-ампаро Pesquisa делать Рио-де-Жанейро (FAPERJ-Cientistas делать Nosso Estado: E 26/103.353/2011). Мы благодаря QFB. Оскар Иван Лукеньо Bocardo Схематический обзор. Мы благодарим д-р Мигель Родригес Тапиа за ценную помощь в конфокальной микроскопии LDs. Мы хотели бы поблагодарить д-р Бруно Bozaquel Morais за его новаторскую работу по разработке технику в S. cerevisiae , что мы адаптировали для U. maydis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrophotometer Varioskan Lux multimode microplate reade D5879 Filter 493/503 or monochromator detector
Plate costar Corning Inc. 3615 96 well black-wall/clear bottom
Plate costar Corning Inc 3598 96 well cell culture plate costar
BODIPY 493/503 Invitrogen/ Thermofisher D3922 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene
Formaldehyde solution Sigma Aldrich 252549 ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization
Potassium iodide Sigma Aldrich 60399 BioUltra, ≥ 99.5% (AT)
FB2 Ustilago maydis ATCC 201384 Basidiomycete-Yeast
Sodium chloride Sigma Aldrich 746398 ACS reagent, inorganic salt
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662 ACS reagent
Select Yeast Extract Sigma Aldrich Y100 Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media
N-Z case plus Sigma aldrich N4642 Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk
Glucose Sigma Aldrich G-8270 D (+) glucose
Skaker flask Pirex CLS4450250-6EA Borosiicate glass
Shaker SEV México INO650V-7 Orbital shaker
Centrifuge table Eppendorf 5415C Centrifuge
Microtubes Sigma Aldrich Z606340 Eppendorf
Pipet tips Axygen scientific T-200-Y Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile
mLine pipette Biohit 725130 8 channels, volume range 5-100 uL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).
  2. Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).
  3. Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions. Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).
  4. Raimondi, S., et al. Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii. Microbial Cell Factories. 13, 83 (2014).
  5. Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation. Biotechnology for Biofuels. 7, 164 (2014).
  6. Galafassi, S., et al. Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis. Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).
  7. Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (14), 6103-6117 (2016).
  8. Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions. Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).
  9. Zhu, Z. W., et al. Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides. Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).
  10. Kolouchova, I., Mat'atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass. International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).
  11. Radulovic, M., et al. The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches. Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).
  12. Takahashi, Y., et al. Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation. Plos One. 8 (5), e64605 (2013).
  13. Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 775-786 (2013).
  14. Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. Phospholipids and lipid droplets. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 589-594 (2013).
  15. Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. Oily yeasts as oleaginous cell factories. Applied Microbiology and Biotechnology. 90 (4), 1219-1227 (2011).
  16. Athenstaedt, K., Daum, G. The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1355-1369 (2006).
  17. Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy. Journal of Biological Chemistry. 7 (2), 67-76 (2014).
  18. Filipe, A., McLauchlan, J. Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche. Trends in Molecular Medicine. 21 (1), 34-42 (2015).
  19. Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
  20. Aguilar, L. R., et al. Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation. Archives of Microbiology. , (2017).
  21. Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PLoS One. 5 (10), e13692 (2010).
  22. Madeira, J. B., et al. TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast. Molecular and Cellular Biology. 35 (4), 737-746 (2015).
  23. Maya-Monteiro, C. M., et al. Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 283 (4), 2203-2210 (2008).
  24. Listenberger, L. L., Brown, D. A. Current Protocols in Cell Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  25. Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation. Biochemical Pharmacology. 81 (5), 649-660 (2011).
  26. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  27. Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration. Photochemical & Photobiological Sciences. 10 (6), 1030-1038 (2011).
  28. Pagac, M., et al. SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase. Cell Reports. 17 (6), 1546-1559 (2016).
  29. Qiu, B., Simon, M. C. BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry. Bio-protocol. 6 (17), (2016).
  30. Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
  31. Holliday, R. Ustilago maydis. Handbook of genetics. King, R. , Plenum. New York. 575-595 (1974).

Tags

Биохимия выпуск 134 индекс липидов липидного капель базидиомицета флуоресценции восстановления BODIPY 493/503 пузырчатая maydis
Определение липидов индекс путем восстановления жидкого флуоресценции в грибкового патогена <em>Пузырчатая Maydis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli,… More

Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter