Summary
このプロトコルでは、体組成計と体組成とマウスの代謝パラメーターを特徴づける代謝動物監視システムの使用について説明します。高脂肪食摂取による肥満モデルは、これらの技術の適用のための例として使用されます。
Abstract
体組成 (脂肪や無駄のない質量) に変更の全身酸素消費量、エネルギー消費量や基板活用など代謝パラメーターと食品の摂取量、身体活動などの動作に重要な情報を提供することができますについて疾患の基になるメカニズムです。身体組成と肥満とその後の後遺症の発展に代謝の重要性を考えると、それは前臨床研究の設定でこれらのパラメーターの正確な措置をしなければなりません。過去数十年間の技術の進歩は、非侵襲的・縦断的齧歯動物モデルでこれらのメジャーを取得する可能にしました。その結果、これらのメタボリック対策が遺伝子操作 (たとえばノックアウト、トランスジェニック マウス、ウイルス ノックダウンまたは遺伝子の過剰発現)、実験的薬剤/化合物スクリーニング、食習慣の応答を評価するとき有用な証明します。行動や身体活動介入。ここで、身体組成と代謝パラメーター監視システム食事供給、高脂肪食飼育マウスの動物を使用して測定するために使用するプロトコルについて述べる。
Introduction
代謝は、通常の携帯、オルガン、そして全身の生理学の多くの側面を支えています。その結果、様々 な病態の設定、代謝に変化、基になる条件に直接貢献するかもしれないまたは病理学の副作用として悪影響可能性があります。伝統的に、代謝研究、エネルギー バランスに研究に集結してきた肥満とインスリン抵抗性、糖尿など関連する条件のフィールド耐糖能障害、心血管疾患、糖尿病。本研究はこのような状況を世界中の個人、社会、エスカレートの有病率を与えられた保証および経済的コストこれらの条件を与えます。ですから、予防戦略とターゲット肥満させる新しい治療法の開発は、世界中の研究所で継続的目標と重くこれらの研究に依存しているマウスの前臨床モデル。
マウスの重量を量る体重増加または損失の信頼性の評価を提供します、それは全体体組成 (体脂肪量除、無料の水と同様、毛や爪などの他のコンポーネント) を構成するさまざまなコンポーネントの内訳を提供しません。マウスが死亡した後、研究の完了時の脂肪パッドの重さ別の脂肪質のターミナルの正確な測定を提供しますが、単一の時間ポイントのデータを提供することができますのみ。結果として、それは時間、大幅増加の動物数、時間、およびコスト以上の肥満の開発を調査する複数のコホートを登録する必要があります。二重エネルギー x 線吸収測定法 (DEXA) の使用体脂肪と除脂肪組織内容を評価するためにアプローチでき縦断的データを取得する研究者です。ただし、プロシージャに必要な麻酔1マウス、度重なる麻酔が影響の脂肪組織の蓄積または代謝調節の他の側面に影響を与えます。EchoMRI は、脂肪とスリムな大量、無料の水と総水量を測定する核磁気共鳴の relaxometry を利用しています。これは達成可能な期間、振幅、生成されたラジオ周波数描写と各組織の定量化の空間分布の違いで、異なる組織コンポーネント間のコントラストを作成するためです。この手法は、非侵襲、迅速で簡単な放射、または麻酔を必要としない、重要なは、検証されている積極的に化学分析2に対して有利です。
肥満と関連研究の重要な考慮事項は、エネルギーの釣り合いの式です。脂肪の蓄積は、純粋なエネルギー (エネルギー消費) を対 (食物摂取) のエネルギーよりも複雑ですが、重要な要素を測定することができるしています。毎日のエネルギーの支出は 4 種類の要素の合計: (1) 基礎エネルギー消費量 (安静代謝率);(2) 食品消費の熱効果によりエネルギー消費量(3) 体温調節のために必要なエネルギー(4) とエネルギーが身体活動に費やした。エネルギー消費量は、熱を生成するように、エネルギー消費量を評価するために (直接熱として知られている) 動物によって熱産生を測定に使用できます。またの測定に影響を与えたし、期限切れの O2の濃度と直接 (間接測定方法として CO2全身 O2消費量と CO2の生産の決定を可能にすることが出来、熱量測定) は熱発生量とエネルギー消費量の計算結果。食品の摂取量の増加やエネルギー消費量の減少は体重増加にマウスを素因し、これらのパラメーターの変化の観察可能性が高い肥満の特定モデルの作用機序の有用な情報を提供できます。興味の関連代謝パラメーターは呼吸交換比率 (RER) 基板/燃料の (すなわち、炭水化物または脂肪) は代謝とエネルギーを作り出すために生かされることを受けている割合を示すインジケーターです。その結果、身体活動レベル、O2消費、RER、エネルギー消費量と食品摂取量 (エネルギー消費) の測定は生物の代謝プロファイルに関する幅広い知識を提供できます。このようなデータを収集する 1 つの方法は監視システム (アサリ)、エネルギー消費量を測定する間接熱量測定法に基づいており、身体活動量 (ビームを決定する機能が追加された包括的な実験動物を使用するには改) スケールを介して食物摂取量が測定室に組み込まれています。
このプロトコルでは、マウス、代謝の側面を測定する代謝動物監視システムにおける身体組成を評価する体組成計の使用のストレートな説明を提供します。これらの技術に関すると制限事項は、解析、解釈、およびデータ表現の方法についての提案と共に説明されます。
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Protocol
説明すべての実験は、アルフレッド ・医療研究教育地区動物倫理委員会 (AMREP AEC) によって承認された、マウスは、国民の厚生に関するガイドラインをオーストラリアの医学研究評議会 (NHMRC) に沿ったケアを提供されました。動物実験。動物がその所定の食事と水自由を投与し、12 h ライト ・ 12 h 暗い循環温度制御環境 (~ 21-22 ° C) で収容します。7 週 (c57bl/6 j 背景) の古い男性マウス飼育していずれかの正規通常食事ダイエット (コンテンツ 14.3 MJ/kg のエネルギー、炭水化物、脂肪 5%、19% のタンパク質から kJ の 76% から成る材料の表を参照してください) や高脂肪食摂取群の高脂肪ダイエット (HFD) (エネルギー内容 19 MJ/kg、炭水化物、43% の脂肪、21% のタンパク質、専門のフィードから kJ の 36% から成る) の 3 週間。代謝のモニタリング分析、食事療法の 3 週間後、アサリで行われていた間、体重と身体組成計測値 EchoMRI マシンを使用してが毎週行われました。
1. 体組成アナライザーの手順
注:最適に機能するには、EchoMRI 4-1 でこのプロトコルで使用する必要があります空気の温度が安定し、変動しない部屋の中で含まれています。理想的にはこれは常に監視する必要があります。電源をマシンと中断の移動も避けなければならない可能な場合。電源供給が中断されました、システムの再起動するが、それを再度使用する前にウォーム アップするマシンの少なくとも 2-3 h を許可します。始める前に、正しい個人用保護具を身に着けていることを確認します。
- マウスをスキャンする前に体組成アナライザー コンピューターのシステム テストを実行します。これは (呼ばれるキャノーラ油システム テスト サンプル (コスト)) 計測器の精度をテストし、その精度のドリフトがなかったことを確認する校正標準を使用して含まれます。
- オープン システム ソフトウェア、システム テストのツールバー ボタンをクリックしてまたは、「alt キー + Y」を同時に押すこと。
- コンピューターでシステム テストが実施前にアラーム システム (図 1) のガントリー内 (この場合マウス固有のコスト) で正確な人件費が配置されていることを確認するを待ちます。これは確かにケースであることを確認、完了に数分を取るテストを続行する受け入れます。
- システムのテストが渡されると、スキャンと転送を続行します。
- システム テストが失敗した場合は、システムのテストを繰り返します。
- マシンは引き続き (偏差が発生しましたを示す) 範囲外場合、校正状況を是正するために必要があります。この完了画面の指示をに従って、または購入時に指定されたユーザー マニュアルに記載されています。問題が解決しない場合チェック マニュアル3製造元のサポート チームに問題を報告や命令をさらに追求。
- マシンの中に含まれているそれらを保つために小さな動物試料ホルダー (円柱) にマウスを配置します。これを行うには、ホルダーを水平方向に配置、マウスを拾う、まずシリンダー ヘッドの開口部にそれを挿入します。ゆっくりと慎重にマウスがシリンダーと分析のための準備の下にくるように縦位置にホルダーをもたらします。
- 一度、ホルダー内で測定期間中にマウスの動きを制限する区切り記号を挿入します。状況によっては、非常にアクティブなマウスを指先で場所で区切り記号を保持する必要がある場合があります。
注: は、ストレスを軽減する、初期分析の前に標本のホールダーの配置をマウスを理解します。赤着色された動物試料ホルダーの使用マウスを感じる彼らは暗闇の中で、潜在的なストレス反応を削減できます。 - ソフトウェアでは、データを保存するフォルダー (フォルダーのツールバー) を選択してファイル名を作成します。
- 必要に応じて、プライマリ蓄積スキャンの数を増やすことによって脂肪や無駄のないランダムなノイズの量を減らします。ソフトウェアを開始すると、プライマリの蓄積は、一般的な日常使用するための推奨される既定値に設定されます。これらのパラメーターを変更する特別な理由がない限り、既定の設定はユーザーに精度の必要なレベルを与えます。
- 無料の飲料水と全体の水のためのデータを得ることに興味がないは、ノーと言うタブを選択して水ステージをオフします。そうと、スキャン時間を大幅に削減、スループットが向上します。
- 「スキャンを開始」を選択するか、キーボードの f5 キーを押して、スキャンを開始します。動物についてのすべての関連データを入力 (例えば、動物 ID、ボディ固まりなど。)"ok"を押しますまたは約 1 分かかります、スキャンを開始する f5 キー。
- データを取得すると、コンピューターからマウスを含む動物ホルダーをはずし、そのケージの裏では動物を配置します。すべての動物がスキャンされ、一度は、さらなる分析と照合順序のデータをエクスポートします。
- 前に、と使用後、メーカーの指示に従って動物のホルダーを徹底的に掃除します。これらの者は、アクリル樹脂から構成されますと、イソプロピル アルコール、エチル ・ アルコールがホルダーの割れや破損の可能性が高まる、ホルダーの急速な悪化を起こすに避けてください。代わりに、いずれか食器洗浄温水ソリューションを使用または、さらに消毒が必要な場合 (1: 125 希釈) で f10 キーまたは他の消毒または洗浄スプレー (材料の表を参照) を使用してを拭き取ってください。
2. 代謝動物監視システム ・ プロシージャ
注: ~ 2 h、ウォーム アップと安定化が必要です。725 の ° C に熱されるジルコニア携帯を許可する切り替える必要がありますマシンがオフになっている場合また我々 は一般的に体組成計拘束ストレスで発生する問題を避けるために動物の監視システムを入力する日の前日にマウスを配置します。
- 動物の監視システムに接続されているコンピューターがオン、制御プログラムを開くことを確認します。ポンプを開始する [ツール] メニューから「Oxymax ユーティリティ」オプションを選択します。
- 適切な水で水のボトルを埋めるの重量を量るとマウスの健康の検査、食品を整理します。システムを食品の摂取量を計測する場合は、食品を粉砕することを検討してください。ホッパーにバネ付きのプラットフォームとヒントの食品を押すことによって食品のホッパーを記入してください。食品のホッパーと水のボトルは完全に完全に十分な食料と割り当てられた実験時間を最後に水があることを確認を確認します。
- Drierite/乾燥剤; のステータスを確認それを青し、したがって乾燥、色の表示器を使用している場合が、ピンク/紫の場合それがあった重要な水分の吸光度とする交換か補充。
- アンモニア トラップとソーダ石灰の状態をチェックし、必要な場合は、交換します。アンモニア トラップが接続されている場合、時に、2 つ目のトラップの色変化の兆しが表示されたら、2 つは最初の 1 つを置き換えます。CO2オフセットの増加は、ソーダ石灰を交換する必要性を意味することも。
注: 乾燥剤することができますオーブンで乾燥し、新鮮なたびを使用して、システムの製造元の推奨事項に従う私たちただし再利用します。 - 部屋を組み立てます。これを行うには、するには、バランスで、食品のホッパーを配置挿入室床となり穿孔プラットフォーム上に商工会議所を配置します。慎重に商工会議所にマウスを置き、システムの前面のふたを添付しクリップをバックアップ、水ボトルの位置を決め、固定する前にセキュリティで保護されました。念のため、すべての室蓋、マウス、および水 (図 2 a-d) を再確認します。
注: 検討されているマウスのサイズに応じて必要がありますマウスの食品が、彼らは送り装置の上に直接寝ることができる十分なスペースにアクセスできるように食品ホッパー上スペースの高さを調整します。 - ガス センサーが各実験の前に校正することをお勧めします、システムを調整します。
- (0.5% CO220.5% O2、バランス窒素) 知られている組成のガスを使用します。校正ガスのタンクをレギュレーターとホース経由でシステムに接続します。オンにし、タンクの出力圧力が 5-10 psi を読んでいることを確認します。
注: 2 番目のタンク、ホースとレギュレータ「オフセット」ガスとして純粋な窒素の使用のため、いくつかシステムがあります。当社システムは代わりに CO2自由な空気を生成するソーダ石灰を利用しています。 - O2 ・ CO2センサーを校正する手順に従います。[ツール] メニューから「校正」を選択し、O2と CO2の両方を順番に調整します。キャリブレーションする前に、その 1) サンプルとリファレンス フロー 0.400 LPM、2) ジルコニア O2センサーの温度は 725 ° C (± 1 ° C)、3) サンプルとリファレンスの乾燥空気ポンプについていると 4) 校正用ガスが接続されオンになって。
- O2センサーのキャリブレーションを行う際に、必要に応じて少し 1.0000 (± 0.0002) の O2の比率値を達成するためにジルコニア酸素センサーの前面にオフセットのコントロールを調整します。これは、(コンピューター画面上でソフトウェア表示緑色のフォントで強調) 許容範囲内であることを確認するためです。
- 成功の O2 ・ CO2センサー較正後、オフに校正ガス シリンダー、レギュレータからホースを外します。キャリブレーション後、O2参照空気 (大気) は 20.92 (± 00.02) をお読みください。校正が許容範囲外の場合を繰り返し、トラブル ・ シューティング ・製造元のガイドを参照してください。失敗は、詳細について製造元に問い合わせてください。
- (0.5% CO220.5% O2、バランス窒素) 知られている組成のガスを使用します。校正ガスのタンクをレギュレーターとホース経由でシステムに接続します。オンにし、タンクの出力圧力が 5-10 psi を読んでいることを確認します。
- 実験のセットアップを続行します。実験メニューから「実験ファイルを開く」を選択します。適切なテンプレート (たとえばマウス) を選択します。実験メニューの「セットアップ」の下で記録する必要があります実験のパラメーターを定義(例えば、マウス ID 重量グループなど)使用しない、任意部屋選択を解除し保存する実験場所を選択します。
- スケールは食品の摂取量を測定する場合 tared されたいるし、実験メニューで「実行」を選択してデータのキャプチャを開始を確認します。表現型、動物の隔離、およびシステムの使用状況に関する制度ガイドラインによって時間の長さが異なるため、データがキャプチャされます。
注: 私たちの手で実験は日常的に実行 48 h の新しい環境やデータ解析のために使用される 2 番目の 24 時間に順化として使用される最初の 24 h。データ収集期間は、どのくらい調査官が単独で収容された動物の倫理の承認に依存して、彼らのマウスを維持する希望に基づいています。また、規定が存在する場合、マウスをシステムに配置されている前室で慣らされてし、接続されている可能性があります。12 室のシステムを使用しているとき、各商工会議所は 13 分に一度程度を測定します。 - 定期的にチェックし、マウスは、動物の福祉を確保するためのシステムは、適切なデータが収集されているときに得られる結果を監視します。任意の問題は、この段階で特定し、修正することがあります。各マウスのシステムがすべての朝と夕方にチェックします。
- 各マウスの酸素消費量、RER、およびエネルギー支出に関してリアルタイムで収集されたデータのデータ ファイル ページの上部に代謝] タブを確認します。一方、改をビームし、食品の消費データをそれぞれ活動と餌のタブに配置できます。周り「O2で」を読んでチェック 20.90 20.94、"CO2で"は 0.040 - 約 0.050、rer 線は 0.7 と 1 の間、流量 0.5 ・ 0.6 L/分で一定。
- 定期的に食料と水へのアクセスがあるマウスとそれぞれを消費していることを確認します。彼らはないに穴あき床掘りなど苦痛の兆候を示していることを確認します。また、表示される結果を監視します。
- 完了時に割り当てられた実験時間の実験メニューから「停止」を選択し、結果をエクスポート (CSV ファイルとしてファイル > エクスポート > 生成件名 CSV) 分析のため。
- マウスの健康の検査、それらの重量を量る、自分のホームケージに戻ります。
- マウスは分離後お互いに向かって敵対的である、従って彼らは再び一緒に収容されて一度を監視します。
- ケージを分解、ホッパーから余分な食品を削除し、糞便、尿、生け簀から食べ物をヒントします。ボトルと薄めた T bac で sippers の水没、浸漬し、薄めた漂白剤溶液でその他のコンポーネントをきれい。きれいな水で洗い、空気に残して乾燥。
- ソフトウェアと代謝パラメーターを計算します。ソフトウェアは、最終的なデータ出力4を提供する方程式の数を利用しています。
酸素消費量と二酸化炭素産生の計算:酸素消費量: VO2 (LPM)= V私O2i - VoO2 o;二酸化炭素の生産: VCO2 (LPM)V =oCO2 oV私CO2i
場所: V は私= 入力換気量 (LPM), Vo = 出力換気量 (LPM) O2i = 入力、O2 oに O2濃度出力、CO2 i O2濃度を = = CO2入力、CO2 o濃度出力 CO2濃度を =。
RER の計算: RER = VCO2 /VO2。タンパク質の酸化は計測していません、したがって、RER は、これの調整されていないことに注意してください。
エネルギー消費量の計算: エネルギー消費量: CV = 3.815 + 1.232* RER
熱 (Kcal/h)) = CV * VO2.場所: CV が熱量 (熱と酸素消費量の関係) であります。これは「の要素の科学の栄養」グラハム ラスクによって構成され、ラスク テーブルと呼ばれるから派生されます。
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Representative Results
図 3に結果は、EchoMRI を介して測定した高脂肪食に体組成のパラメターの典型的な変更を表示します。ベースラインで任意のパラメーターを測定 (図 3 a-f) の違いはありませんでした。ただし、高脂肪の餌のちょうど 1 週間後の体重、体脂肪量、HFD グループ (図 3 aBD) の脂肪の量の割合が大幅に増加があった。これらの対策の 2 つのグループ間の相違の大きさは、3 週間の食餌療法の介入で増加し続けた。無駄のない質量、無料水、総水量 (図 3EF) は、任意の時点でグループ間差はなかった。(図 3 a) 研究期間にわたって体重をかける続けたマウスを食事に供給され、体脂肪量増加 (図 3 b) よりこれは除脂肪量 (図 3) の増加によるものも見ることができます。
図 4に見られる、高脂肪食の 3 週間は代謝動物監視システムで検出された変更の数につながった。VO2体重調整されないときは対照マウス (図 4 a) 重い高脂肪で有意に高値だった。特に、VO2を介して 2 つの異なる要因の正常化は、2 つの異なる結果で起因しました。標準食事間 VO2差につながった総体重の正規化が与えられ、高脂肪対照マウス、除脂肪量の正規化を生産しながら有意差 (図 4 b、C)。これらの結果を示す大量の変数かなり割って VO2データの正規化に結果が影響を受けるし、このような方法で表現されるときに VO2データを解釈するときに注意が必要があります。VO2データを表現する方法の詳細については、異なるパラメーターの正規化の影響を Tschop、らの優秀な議論」を参照してください。5マウスのエネルギー代謝の解析をし、そのガイドの情報の Tschop および同僚共変性 (ANCOVA) 体重やエネルギー消費量の身体組成の影響を統計的に調査して食品摂取データの分析の使用を提案します。.この場合、通常の食事と HFD、従ってあることを示す体重会計したら間に統計的に有意な違いが存在しない明らかに図 4 a、共変量として体重を使用してに表示されるデータに ANCOVA の実行グループ間の酸素消費量に違いはありません。図 4に示すように、散布図として体重に対する VO2を印刷するときは、この結果を簡単に視覚化できます。体重 (図 4) に対する VO2をプロット VO2データがより多くの酸素を消費して重い動物と体重に関連して一般的なラインであるを示しています。注記のうち、無駄のない質量に対して VO2のプロットは VO2データ (図 4E) 赤身の固まりに関連して 2 つの異なる路線にうそをつくことについて説明します。
RER でかなり低かった対照マウス、高脂肪炭水化物の利用 (図 5 a) 高脂肪食を与えたときに脂肪率を示します。正規化することがなくエネルギー消費量 (熱) は、動物の代謝活性組織 (図 5 b)、失われつつあるこの違い一度体重 (図 5) に正規化を持つ可能性が高いため、重い動物で増加しました。また、マウスがよりアクティブなとき、ライト ・ サイクルと比較して暗いサイクルの VO2RER、およびエネルギー支出の増加に注意してください。これらの違いは、マウスで発生する代謝の古典的な毎日の変化を表しています。この例では、我々 は 12 h ブロックにデータを分割が、さらにデータのより小さい時間の新紀元への分割もできます。身体活動レベルは、エネルギー消費量に寄与する因子であるも。これらは動きの減少が、対照マウス (図 5) 高脂肪肥満表現型のドライバーでなかったことを示唆しているグループ間で異なるでした。
エネルギー釣合式の反対側は、消費され、体内に入るエネルギーの量です。代謝のこの側面を見てするには、マウス代謝動物監視システムで消費される食糧の量を分析しました。図 6Aで観察することができます、マウスは体重 (図 6 b) に正規化するとき、重量を測定した食品の同じ量を食べた。(食品の摂取量を体重の影響を評価する ANCOVA を使用するもう一度ことができます)。食品の摂取量を体重の正常化エネルギー消費量は重量、バランスのエネルギー同等化の各側面をこのように維持する正規化されてもかどうかを考慮する重要なステップがあります。マウスは、同じ量の食糧を食べている間、アカウント使用のダイエットのそれぞれのエネルギー密度のために重要です。この要因を考慮すると、我々 は消費するより多くのエネルギー (図 6) HFD のマウスを観察し、これらの実験からは、これは肥満の表現型を運転しているそうです。,は、エネルギー貯蔵にマウスがより多くのエネルギーで取っているが、彼らは比例してより多くのエネルギーを費やすことないが、その肥満を帰することができるのでそれは。
統計情報
この論文ではすべてのデータは、平均 (SEM) の平均 ± 標準誤差を掲載されています。統計的有意性はpで設定された < 0.05。* pを示します < 0.05 * * pを示します < 0.01、* * * pを示します < 0.001、および n = グループあたり 6 示されています。捜査官は飼料の色の違いによる食事グループ介入に目がくらむことができませんでした。マウスは、どの食事として与えられたランダムに選ばれました。
図 1: マウス コストと体組成アナライザー内でマウスを含む小動物試料ホルダーの正しい配置します。小動物標本ホルダー内でマウスのスキャン、システムのガントリー内に各場所または校正標準 (コスト) を使用してシステムのテストを実行します。赤い矢印は、マシンのガントリーを入力、マウスが含まれるシリンダーを示します。
図 2: 個々 の室のアセンブリ。A)バランスの中心に食品ホッパーを置き。B)ホッパー上各商工会議所と場所の商工会議所にプラットフォームを挿入します。C)室で個別にマウスを置き、蓋を固定します。D)水のボトルを置き、固定します。
図 3: 体組成分析高脂肪の食事療法の 3 週間以上。A)本体重量、 B)脂肪、 C)無駄のない質量、 D)脂肪の量の割合、E)無料の含水率とF)水分を合計します。円を表す通常の食事ダイエット、正方形は、HFD を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: それぞれの食事の 3 週間後に代謝のモニタリング システム実験動物から得られる代謝パラメーター 。マウスに習熟として最初の 24 h 48 h 用チャンバーに収容されました。2 番目の 24 h から得られたデータを分析し、これらの数字で。A)生 VO2レート、 B) VO2正規化体重C)無駄のない質量に正規化された VO2 D)未調整 VO2 (合計 24 時間) の体に散布図の重量を量る、t とE)未調整VO2除。A ~ C白いバーを表す通常の食事ダイエット、黒いバーは、高脂肪食を表しています。D E円を表す通常の食事ダイエット、正方形は、HFD を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: A)呼吸交換比率 (RER)、 B)熱 (エネルギー消費) とC)熱が体重に正規化します。D)活動レベルは、X と Y ビーム区切りと Z ビーム区切り外来の合計として計算します。白いバーを表す通常の食事ダイエット黒いバーは、HFD を表しています。
図 6: 最終的に 24 h システムで食品摂取量のデータが得られました。A)グラム、食物摂取B)食品の摂取量は体重に正規化およびC)計算されるエネルギー摂取量。n = 4-5 (3 のマウスは彼らの食糧と大混乱を作るため除外された)。白いバーを表す通常の食事ダイエット黒いバーは、HFD を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
重要なステップ
ここ記載されているプロトコルは、体組成を測定する方法とマウスの体組成計と代謝動物監視システムを使用しての様々 な代謝パラメーターの例を提供します。どちらの方法マシンが理想的には、作業していることを確認これを行うには、研究者は体組成計のシステム テストを実行し、新陳代謝のための知られているガスの組成を調整が不可欠だに極めて重要です。機器の使用する動物の監視システムの前。これは、結果と機械に任意の潜在的な問題を検出する機会のより大きい一貫性が保証されます。
メタボリック動物監視実験でデータを正規化方法も手法から得られた結果の妥当性を確保するため極めて重要です。VO2をいくつかの異なる方法で報告できる当社の代表的な結果 (図 4 aE) に記載されている: の絶対率 (L/分)、マウスの体の質量を基準にして (mL/kg * 分)、または除脂肪体重 (mL/kgLBMを基準にして* 分) そのデータが利用できる (たとえば、体組成計から得られた)。表現によっては、任意の潜在的なバイアスを排除するための特定の方法の値を正規化するより適切な場合があります。たとえば、動物が体の質量を増加している場合は利用でき、酸素を消費することができるより多くの組織があるし、自然にエネルギー消費量が高い。全身に正規化質量ないかもしれない最良の選択肢偏りが固まりの単位あたりの酸素消費量の減少の観察に向けて、組織の酸素消費量が異なるかもしれないにもかかわらず。体重を正常化する代わりに、1 つはマウスの除脂肪体重を正規化できます。無駄のない組織として質量は酸素消費量を主に担当、除脂肪量は通常変更されていないかだけ控えめなこの方法で正規化, 実験群間で異なる可能性があります VO2データを表現する代表的な方法。無駄のない大量のコンパートメントがすべて異なる代謝率と多くの異なる組織で構成されていて、その結果この方法で正規化可能性があります適切なまたはできません任意の洞察力を提供する、それは注意してくださいする無駄のない大量のコンポーネントには、運転、変更します。また、それは脂肪代謝質量コンポーネントの貢献をルールします。
これらの問題を考えると、統計的方法も提案されている5,6をされています。(ANCOVA 共分散分析)検定変数 (例えば、エネルギー消費量) を比較できるよう複数のグループ中の他の要因を補正または変数は、共変量と呼ぶ。この方法は体重など要因、脂肪と除脂肪部分はエネルギー消費量に影響を与える変数として含めることができるが、この方法もは自身の特定の仮定6ANCOVA で複数の変数を使用する可能性があるという事実を含む変数がそれぞれ独立でない限りは、それを無効にします。与えられた正規化する完璧なまたは普遍的に合意した 1 つの方法はないように思われるが、現在 VO の2またはエネルギー支出・ データを表示し、多くの読者に表現型の明確な映像を与える方法でデータを表示する適切な可能性があります。身体活動レベルは、酸素消費量を増やすことができます、だから活動表現型 (増加あるいは減少) を持つ動物でも必要があります完全にまたは部分的にこのアカウントすることができるかどうかは、動きの変化のアカウント/正規化するにはVO2の変更をアカウントします。
変更とトラブルシューティング
このプロトコルで表示される代表的な結果は、21 から 22 ° C の室温で実施した実験から得られました。マウスの曝露ゾーンは約 30 ° C では、動物と人間の快適さのために 20-22 ° C 設定温度民家、マウスは熱ストレス下に置かれるので。このカウンターは、非ふるえ熱はマウスに比べ 30 ° C7収容 20 の ° c 間のエネルギー消費量の 2 倍増加の結果、これらの寒い温度でアクティブになります。マウスの環境住宅はこれらの実験のための重要な考慮事項など動脈硬化症の8および高脂肪食餌による thermoneutrality マウスの住宅がいくつかの条件の開発を増強できることが示されています。非アルコール性脂肪性肝疾患 (NAFLD) 病態9。したがって、環境温度が重要な考慮事項にも監視システム、一定温度で表現型が存在することができますの潜在的なメカニズムに指すことが他の人にない代謝動物の実験を行うときアクション。このようなシナリオの 1 つは、募集ベージュ脂肪というこの組織の大きい量は、クーラーの条件10下熱産生がより一層の活性化を含む表現かもしれない。したがって、必要があります、環境を変更することを設定したこれらの現在の実験では、モデルの真の代謝状態の正確な描写を得るための複数の環境温下で実験を行うこと。トラブルシューティングの技術的なエラーのため、命令の直接メーカーに連絡する必要がある場合があります。体組成計のこのタイプの問題がある場合は、コストに対して 25 スキャンを実行スキャンを繰り返しテストを実行することをお勧めします。会社は、診断のため、この情報を必要があります。同様に代謝動物監視システムで問題が発生した場合収集前回うまくいったシステムからデータ ファイルとファイルのサポートは、おそらく診断を行うことができますので、問題が生まれてから。
制限
体組成計、優れたデータが全部体脂肪蓄積、地域脂肪デポの定量を許可していません。これはすべて脂肪は脂肪が蓄積してきた場所と同じで、特に重要な機能的特性肥満研究の分野で重要です。確かに、皮下の脂肪質のターミナル (または健全な代謝脂肪) の保護効果は説明11をされています。マイクロ コンピューター断層撮影 (マイクロ CT) は磁気共鳴画像 (MRI) 分析13はできるだけ皮下脂肪および内臓脂肪12を区別できます。これらのテクニックの使用は脂肪蓄積のサイトで詳細の情報を提供できます。監視システムはまた代謝の動物には、限界があります。エネルギー消費量を測定することができます、システムは肥えたエネルギー支出を構成するさまざまなコンポーネント間の対応ではありません。システムの他の制限事項は、肥満が食糧・ エネルギー摂取量変化とは独立しても、システムのこれらのタイプを介して検出されたエネルギー消費量の測定可能な減少することがなく開発することが可能であることです。ある重要な重量が発生する十分なエネルギー消費量のわずかな減少が長期的に得るため、短期14,15、上このような代謝系に確実検出できない研究が示されています。 16。研究事例としてこの方法を実証する現在の研究ではグループごとの 6 n を使用しており、肥満の可能性が高いに貢献できるエネルギー消費量のわずかな違いを検出する多くより多くマウス5が必要です。これらのシステムと長い期間にわたって研究のこれらのタイプを実行する能力の検出の解像度の進歩は、これらの小さいが重要な変更を検出する機能に役立ちます。食物摂取の測定に関しては、通常、代謝動物監視システムの内で収容されるマウスの 24 時間食事摂取はホームのケージで観察するとより低い、上述の理由により可能性を観察しています。したがって、このシステムで食品の摂取量の監視に加え我々 はまたマウスの家のケージで食品の摂取量を評価します。これは、特定の実験群からマウスが別に収容される状況でのみ行うことができます、毎日の継続的な評価に近いことの利点があります。調査官は単に常にケージ全体に散在して食糧のため会計の日の指定された時間にホッパーの食糧の量の重量を量るし、この合計マウスをケージ内に存在の数によって消費される食べ物の量を割っています。
将来のアプリケーション
一方、このレビュー内で高脂肪測定体組成と代謝パラメーターが役に立つ、この装置の使用はこの研究分野に限定されて遠くから病気の状態の例として供給を通じて取得される肥満を使いました。これらの技術の使用は、糖尿病などの疾患、心血管疾患やサルコペニアの加齢に伴う、もろさ、がん悪液質、筋ジストロフィー リポジス トロフィーを勉強にも貴重なです。購入の初期コストがこのようなインフラストラクチャは、複数の機器を使用する能力と医学研究の多様な分野にはこの初期のコストが軽減されます。また、継続的な試薬や消耗品コストが最小限のです。ただし、予防保守およびサービス検討および必要が予算します。
除脂肪体重体組成分析を通して得られた監視システム代謝動物由来の酸素消費量の重要な正規化係数をされる場合も、無駄のない質量測定は薬/テスト投与量を正常化するも使用できます。例えば、代謝の研究で、腹腔内投与または経口ブドウ糖負荷試験 (GTT)、または腹腔内インスリン負荷試験 (ITT) を実行するの一般的です。これらのテストは、ブドウ糖負荷の処分またはインシュリンに答えるには、マウスの機能を確認します。これらのテストの応答の血糖値の変化では、全身のブドウ糖とインスリン耐性モデルのレベルについて説明します。伝統的に、これらのテストで投与されるグルコースとインスリンのボーラスを投与マウスの体重ごと。ただし、肥満のモデル除脂肪体重を体脂肪量が増すにつれて、体重当たりの投与がバイアス、GTT で耐糖能異常の方重いモデル多くのブドウ糖を受ける。これは食後状態17グルコースのほとんどを処分肝臓、骨格筋、脳、臓器赤身質量測定の部品でほとんど軽度のほとんどのモデルに変更にという原因が。逆に、一 ITT 体重に投与するときより多くのインスリンを受け取る重いモデルが表示されますより大きい量受けた純粋なのでインスリンの効果を下げる血糖に敏感。したがって、捜査官に体組成データへのアクセスがある場合、除脂肪量は全身の質量は、このような投与量計算18ではなく、最も適切な措置にあります。これを取ってさらに、体組成分析から得られた無駄のない大量のデータも使える除脂肪量の除外でのアカウントする必要がある場合、実験薬剤を投与します。メタボリック動物監視システムの他のアプリケーション議論されていないまたはシステムに囲まれたモーターを備えられたトレッドミル代謝パラメーターが記載しても測定できます中にアタッチは本稿で示した行使します。
このレビューで説明する手順は、マウスにおける各種代謝パラメーターと身体組成の特性評価に使用できます。これらの対策は、幅広い研究分野に適用され、表現型の特性のための重要な情報を提供することができます。これらのメソッドから派生したデータも特定代謝表現型を運転する根本的なメカニズムへの証拠を提供できます。それ以上の開発およびこれらの技術の改良は、治療の成果に向けて彼らの調査結果を事前に研究者を有効になります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 はアルフレッド ・医学研究と教育地区動物サービス (AMREP として) チームの支援と本研究で使用されるマウスの世話とビクトリア州のインフラストラクチャをサポートして運用スキームのサポートのためのスタッフに感謝します。政府は。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 in 1 system | EchoMRI | 4 in 1 system | Whole body composition analyser |
| Canola oil test sample (COSTS) | EchoMRI | Mouse-specific (contact company for cat number) | |
| Animal specimen holder | EchoMRI | 103-E56100R | |
| Delimiter | EchoMRI | 600-E56100D | |
| 12 chamber system | Columbus Instruments | Custom built | Metabolic Caging System; includes control program |
| Drierite | Fisher Scientific | 238988 | CLAMS consumable |
| Calibration gas tank | Air Liquide | Mixed to order | Gas calibration (0.5% CO2, 20.5% O2, balance nitrogen). |
| Normal chow diet | Specialty Feeds | Irradiated mouse and rat diet | |
| High fat diet | Specialty Feeds | SF04-001 | |
| Balance | Mettler Toledo | PL202-S | Balance for weighing mice |
| TexQ Disinfectant spray | TexWipe | ||
| Hydrogen Peroxide cleaning solution | TexWipe | TX684 |
References
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