Summary
이 프로토콜 신체 조성 분석기와 신체 구성 및 쥐에서 대사 매개 변수 특성을 대사 동물 모니터링 시스템의 사용을 설명 합니다. 고 지방 먹이로 유도 된 비만 모델은 이러한 기술의 응용 프로그램에 대 한 예제로 사용 됩니다.
Abstract
신체 구성 (지방 또는 마른 질량)에 변경, 전신 산소 소비, 에너지 소비, 고 기판 사용률, 같은 대사 매개 변수 및 동작 음식 섭취, 신체 활동 등 중요 한 정보를 제공할 수에 대해서 질병의 기본 메커니즘입니다. 신체 구성 및 대사 비만 그 이후의 sequelae의 개발의 중요성을 감안할 때, 그것은 전 임상 연구에서 이러한 매개 변수 중 정확 하 게 측정을 만들 필요가 있다. 지난 몇 십년 동안 기술의 진보는 비-침략 적이 고 경도 방식 설치류 모델에서 이러한 측정을 파생 수 만들었습니다. 따라서,이 대사 측정 입증 된 유용 유전자 조작 (예 녹아웃 또는 유전자 변형 쥐, 바이러스 노크 다운 또는 유전자의 overexpression), 실험적인 약물/화합물 검사 및 식이, 응답을 평가할 때 행동 또는 신체적 활동의 개입 여기, 우리는 신체 구성 및 모니터링 시스템 차 먹이 고 지방 다이어트 먹이 쥐에서 동물을 사용 하 여 신진 대사 매개 변수를 측정 하는 데 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다.
Introduction
물질 대사 정상적인 세포, 기관, 그리고 전체-바디 생리학의 많은 측면을 뒷받침. 따라서, 다양 한 병 리의 설정, 신진 대사를 변경 기본 조건에 직접 기여할 수 있습니다 또는 병 리의 부작용으로 부정적인 영향을 받을 수 있습니다. 전통적으로, 대사 연구와 에너지 균형으로 연구 되어 집중 했다 비만 및 관련 사전 당뇨병, 인슐린 저항 등의 분야에 포도 당 옹 졸, 심혈 관 질환 및 당뇨병. 이 연구는 전세계 조건 및 개인, 사회의 확대 보급을 주어진 보증 하 고 경제적 비용 이러한 조건이. 이와 같이, 예방 전략과 대상 비만에 새로운 치료제의 개발은 세계 각국의 연구 실험실에서 지속적인 목표 및 전 임상 마우스 모델은 이러한 연구에 대 한 무 겁 게 의존.
마우스 무게 체중 증가 또는 손실의 신뢰할 수 있는 평가 제공, 전체 신체 구성 (체 지방 량, 근육 량, 무료 물 뿐 아니라 털과 발톱 같은 다른 구성 요소)을 구성 하는 다양 한 구성 요소 분석을 제공 하지 않습니다. 마우스는 죽은 일단 연구의 완료에 지방 패드의 무게 다른 지방 저장소의 정확한 측정을 제공 하지만 한 번 지점에 대 한 데이터를 제공할 수 있습니다. 결과적으로, 그것은 종종 여러 동료, 동물 숫자가 크게 증가, 시간, 시간과 비용 이상 비만 개발 조사를 등록 하는 데 필요한. 이중 에너지 x 선 absorptiometry (DEXA)를 사용 하 여 몸 뚱 뚱 하 고 마른 조직 내용 평가에 대 한 접근을 제공 하 고 경도 방식 데이터를 얻기 위해 연구원 수 있습니다. 그러나, 절차 필요 마우스 마 취1, 그리고 마 취의 반복된 발작 지방 조직의 축적에 영향을 줄 수도 신진 대사 조절의 다른 측면에 영향을. EchoMRI 뚱 뚱 하 고 마른 질량, 무료 물, 그리고 총 수 분 함량을 측정 하 핵 자기 공명 relaxometry를 사용 합니다. 이것은 달성 기간, 진폭 및 묘사와 각 조직의 종류의 정량화를 허용 하는 생성 된 라디오 주파수의 공간 배급의 차이 다른 조직 구성 요소 사이의 대조의 창조 때문 이다. 이 기술은 비-침략 적, 빠르고, 간단한, 아니 마 취 나 방사선, 필요 하 고, 중요 한 것은, 긍정적으로 검증 되었습니다 화학 분석2에 대 한 유리 하다.
비만 관련 된 연구의 주요 고려 사항은 에너지 균형 방정식 이다. 지방 축적 에너지 (에너지 소비) 밖으로 대 (음식 섭취)에 순전히 에너지 보다 더 복잡 하다, 그들은 중요 한 요소를 측정할 수 있습니다. 일일 에너지 지출을 총 4 가지 구성 요소: (1) 기저 에너지 지출 (휴식 신진 대사 속도); (2) 식품 소비;의 thermic 효과의 한 에너지 비용 (3); 체온 조절에 필요한 에너지 (4) 에너지는 신체 활동에 보냈다. 에너지 생성 열, 열 생산 동물 (직접 주사 라고도 함)에 의해 측정 에너지 비용을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또는 측정의 영감과 O2 의 농도 만료 하 고 CO2, 전신 O2 소비와 CO2 생산의 결정에 대 한 수 있도록 직접 (간접 측정 하는 방법으로 이용 될 수 있다 열 량) 생산을 열 고 결과적으로 에너지 비용을 계산 합니다. 음식 섭취 량의 증가 또는 감소 에너지 비용에 체중 증가에 쥐를 predispose 것 이다 하 고 이러한 매개 변수에 변화의 관측 비만의 특정 모델에서 행동의 가능성이 메커니즘의 유용한 정보를 제공할 수 있습니다. 관심의 관련된 대사 매개 변수 호흡 교환 비율 (RER) 기판/연료 (즉, 탄수화물 또는 지방)는 신진 대사와 에너지를 생산 활용 되 고 진행은의 비율의 표시기입니다. 따라서, 신체 활동 수준, O2 소비, RER, 그리고 에너지 소비와 함께 음식 섭취 (에너지 소비)의 측정 생물체의 신진 대사 프로필에 대 한 광범위 한 이해를 제공할 수 있습니다. 이러한 데이터를 수집 하는 방법은 포괄적인 실험실 동물 모니터링 시스템 (조개), 에너지 지출을 측정 하 간접적인 열 량 측정 방법에 따라 고 신체 활동 수준 (빔 결정의 추가 기능을 사용 하는 휴식) 비늘을 통해 음식 섭취 량 측정 챔버에 통합.
이 프로토콜 마우스 및 물질 대사의 측면을 측정 하는 신진 대사 동물 모니터링 시스템에 신체 구성을 평가 하는 신체 구성 분석기를 사용 하 여 직선-앞으로 설명을 제공 합니다. 고려 사항 및 이러한 기술에 대 한 제한 뿐만 아니라, 분석, 해석, 및 데이터의 제안된 방법 논의 것입니다.
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Protocol
설명 하는 모든 실험 알프레드 의료 연구 교육 관할 동물 윤리 위원회 (AMREP AEC)에 의해 승인 및 마우스 국민 건강 및 의료 연구 위원회 (NHMRC)에 호주 지침의 인도적인 치료 제공 동물 실험입니다. 동물 들이 그들의 규정된 식이 요법과 물 광고 libitum 관리와 12 h 라이트와 12 h-어두운 주기 온도 제어 환경 (~ 21-22 ° C)에 보관 되어. 7 주 오래 된 남성 마우스 (C57Bl/6J 배경에) 중 일반 정상적인 차 다이어트 지 루 했다 (에너지 콘텐츠 14.3 MJ/kg, 탄수화물, 지방 5%, 19% 단백질;에서 kJ의 76%의 구성 재료의 표 참조) 또는 고 지방 먹이 그룹에 대 한 높은 지방 다이어트 (HFD) ( 에너지 콘텐츠 19 MJ/kg, 탄수화물, 지방 43%, 21%의 단백질, 전문 피드 kJ의 36%로 구성 된) 3 주 동안. 몸 무게 및 신체 조성 측정 EchoMRI 기계를 사용 하 여 되었다 주간 동안 변화 모니터링 분석 다이어트의 3 주 후에 조개에 자리를 했다.
1. 신체 조성 분석기 절차
참고: 최적의 기능을 EchoMRI 4-에서-1이이 프로토콜에 사용 되는 공기 온도 안정 하 고 변동 하지 않는 객실 내 포함 되어야 합니다. 이상적으로이 한다 지속적으로 모니터링. 전력 시스템 및 중단의 이동 또한 피해 야 한다 만약에 가능 하다. 전원 공급 중단 되었습니다 시스템은 다시 시작 해야 하는 경우에, 다시 그것을 사용 하기 전에 워밍업을 기계에 대 한 적어도 2-3 h 수 있습니다. 시작 하기 전에, 올바른 개인 보호 장비 입고 확인 합니다.
- 마우스를 검색 하기 전에 신체 조성 분석기 컴퓨터에 시스템 테스트를 수행 합니다. (라고 하는 카 놀라 오일 시스템 테스트 샘플 (비용)) 악기의 정밀 테스트 하 고 그것의 정확성에 아무 드리프트 되었습니다 있도록 교정 표준을 사용 하 여 포함 됩니다.
- 오픈 시스템 소프트웨어, 다음 시스템 테스트 도구 모음 단추를 클릭 하거나 동시에 "Alt + Y"를 눌러.
- 시스템 테스트는 컴퓨터에 의해 수행 됩니다, 전에 알림 (이 경우 마우스 관련 비용)에 정확한 비용 갠트리 시스템 ( 그림 1)의 내부 배치 되었습니다 확인 될 때까지 기다립니다. 이 사건이 실제로 확인 완료 하는 데 몇 분 정도 걸릴 것입니다 테스트와 함께 진행을 동의 합니다.
- 시스템 테스트를 통과 되 면 계속 앞으로 검색 합니다.
- 시스템 테스트에 실패 하는 경우 시스템 테스트를 반복 합니다.
- 기계 범위 (편차 발생 했음을 알리는) 계속, 교정 상황을 바로 잡기 위해 필요할 수 있습니다. 프롬프트에 따라 또는 구입 시 제공 된 사용자 설명서에 설명 된 대로 이것을 완료 합니다. 문제가 계속 되 면 수동3 을 확인 또는 제조 업체의 지원 팀에 문제를 보고 하 고 지시를 더 추구.
- 기계에서 포함 된 그들을 유지 하는 작은 동물 표본 홀더 (긴 실린더)에 쥐를 놓습니다. 이렇게 하려면 가로 홀더를 배치 마우스를 선택 하 고 먼저 실린더 헤드의 오프닝에 삽입. 천천히, 그리고 신중 하 게는 마우스 실린더와 분석에 대 한 준비의 밑에 수직 위치에 홀더가지고.
- 일단 소유자에서 측정 기간 동안 마우스의 움직임을 제한 하는 구분 기호를 삽입 합니다. 경우에 따라 매우 활성 마우스, 손가락 장소에 구분 기호를 필요할 수 있습니다.
참고: 스트레스를 줄이기 위해 이전에 그들의 초기 분석 견본 홀더에 배치와 함께 쥐를 확인 합니다. 쥐 들은 어둠 속에서 느낌으로 빨간 색된 동물 견본 홀더를 사용 하 여 잠재적인 스트레스 응답을 줄일 수도 있습니다. - 소프트웨어를 데이터를 저장 하는 폴더 (폴더 도구 모음)을 선택 하 고 파일 이름을 만듭니다.
- 필요한 경우 스캔의 기본 축적의 수를 증가 시켜 뚱 뚱 하 고 마른 측정에서 랜덤 잡음의 양을 줄일. 소프트웨어 시작 되 면 기본 축적 일반 평상시;에 대 한 권장된 기본 값으로 설정 되어 이러한 매개 변수를 변경 하려면 특정 이유가 없다면 기본 설정의 정밀도 필요한 수준을 사용자에 줄 것 이다.
- 무료 물과 총에 대 한 데이터를 취득에 관심이 아니라, 해제 물 무대 ' 아니오 ' 라고 하려면 탭을 선택 하 여. 이렇게 스캔 기간 크게 하는 처리량을 개선 하십시오.
- "검색 시작"을 선택 하거나 키보드에서 f5 키를 눌러 검색을 시작 합니다. 동물에 대 한 모든 관련 데이터를 입력 (예: 동물 ID, 몸 질량, 등.) "ok"를 누릅니다 또는 f5 키를 약 1 분 소요 됩니다 스캔 시작.
- 데이터를 가져온 후 동물 홀더 포함 하는 컴퓨터에서 마우스를 제거 하 고 그것의 감 금에 있는 동물 뒤를 배치. 일단 모든 동물 검색 추가 분석 및 데이터 정렬에 대 한 데이터를 내보냅니다.
- 사용 전후 철저 하 게 제조 업체의 지침에 따라 동물 홀더를 청소 하십시오. 이 홀더는 아크릴 플라스틱에서 생성, 이소프로필 알코올, 에틸 알코올 피해 야 한다 그들은 소유자의 균열 및 파손의 가능성을 증가 하는 소유자의 급격 한 저하를 발생할 수 있습니다. 대신, 온수 주방용 솔루션을 사용 하거나, 추가 소독이 필요한 경우 (1:125 희석)에 F10 또는 다른 살 균 제 또는 청소 스프레이 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 및 다음 닦아 합니다.
2. 신진 대사 동물 모니터링 시스템 절차
참고: 시스템 ~ 2 h 워밍업 및 안정화를 요구 한다. 컴퓨터 해제 되었습니다, 그것은 전환 해야 지 르 코니 아 셀 725 ° c.에가 열 될 수 있도록 또한 우리는 일반적으로 신체 조성 분석기 구속 스트레스 문제를 피하기 위해 동물 모니터링 시스템을 입력 하기 하루 전에 마우스를 놓습니다.
- 동물 모니터링 시스템에 연결 된 컴퓨터 설정 되어 및 제어 프로그램을 확인 합니다. 펌프를 시작 하려면 도구 메뉴에서 "Oxymax 유틸리티" 옵션을 선택 합니다.
- 적절 한 물으로 물병을 채우기, 무게 그리고 쥐, 건강 검사 음식 구성. 시스템에서 음식 섭취 량을 측정 하는 경우에 음식을 강화 하는 것이 좋습니다. 호퍼에 스프링 플랫폼 및 팁 음식 우울 하 여 음식 메뚜기를 입력 합니다. 음식 호퍼와 물병 충분 한 음식과 물을 마지막 할당된 실험 시간에는 되도록 완전히 전체 인지 확인 합니다.
- Drierite/desiccant;의 상태를 확인 색상 표시기를 사용 하는 경우 그것은 해야 블루 되며 따라서 건조 하지만 분홍색/보라색 이면 그것 상당한 수 분 흡수도 했다 고 한다 대체 하거나 올랐다.
- 암모니아 트랩 및 소 다 석 회의 상태를 확인 하 고 필요한 경우 교체. 암모니아 트랩을 연결 하는 경우 두 때 두 번째 트랩 색상 변경의 징후를 표시, 한 번에 첫 번째를 교체 합니다. CO2 오프셋 증가 수 있습니다 또한 소 다 라임을 교체할 필요가 의미 합니다.
그러나 참고: 건조 시키는 오븐에 말린 고 다시, 우리는 신선한 각 시간을 사용 하는 시스템의 제조 업체에서 권장 사항을 따라 될 수 있습니다. - 조립 실. 이렇게 하려면 균형에, 음식 호퍼를 배치 다음 챔버 삽입 챔버의 바닥은 구멍이 플랫폼 위에 놓습니다. 신중 하 게 마우스 챔버에서와 앞으로 시스템의 뚜껑을 연결 및 클립을 다시 놓고 물 병을 배치 하 고 체결 하기 전에 보안. 조치로, 다시 모든 챔버 뚜껑, 마우스 및 물 (그림 2A-D)를 확인 합니다.
참고: 검사 되 고 쥐의 크기에 따라 그것은 해야 쥐가 음식이 있지만 충분 하지 않은 공간을 그들은 피더 위에 직접 자 수 음식 호퍼 위에 공간의 높이 조정 합니다. - 각 실험 전에 가스 센서를 보정 하는 것이 좋습니다, 보정 시스템.
- 알려진된 구성 (0.5% CO2, 20.5% O2균형 질소)의 가스를 사용 합니다. 교정 가스 탱크는 레 귤 레이 터와 호스를 통해 시스템에 연결 합니다. 설정 하 고 탱크 출력 압력은 5-10 psi를 읽고 확인 합니다.
참고: 일부 시스템에는 두 번째 탱크, 호스 및 레 귤 레이 터는 "오프셋된" 가스로 순수한 질소의 사용을 위한 있을 것 이다. 우리 운영 시스템 대신 CO2 무료 공기를 생성 하는 소 다 라임을 사용 합니다. - O2 와 CO2 센서를 보정 하는 절차를 따르십시오. 도구 메뉴에서 "보정"을 선택 하 고 순차적으로 O2 와 CO2를 보정. 보정 하기 전에 1) 샘플을 확인 및 참조 흐름은 0.400 LPM, 2) 지 르 코니 아 O2 센서 온도 725 ° C (± 1 ° C), 3) 샘플 및 참조 건조와 공기 펌프는, 그리고 4) 교정 가스 연결 되 고 켜져.
- O2 센서를 보정 하는 경우에, 필요한 경우 약간 1.0000 (± 0.0002)의 O2 비율 가치를 달성 하기 위해 지 르 코니 아 산소 센서의 전면에 오프셋된 컨트롤을 조정 합니다. 이 내 수용 한계 (컴퓨터 화면에 소프트웨어 디스플레이에 녹색 글꼴로 강조 표시)입니다.
- 성공적인 O2 와 CO2 센서 캘리브레이션 후 교정 가스 실린더를 해제 하 고는 레 귤 레이 터에서 호스를 분리. 교정, 후 참조 공기 (대기)에 대 한 O2 는 20.92 (± 00.02)를 읽어야 한다. 교정이 허용, 경우에, 반복 하 고 문제는 제조 업체에서 가이드를 촬영 합니다. 이 실패에 더 제조업체를 문의 하십시오.
- 알려진된 구성 (0.5% CO2, 20.5% O2균형 질소)의 가스를 사용 합니다. 교정 가스 탱크는 레 귤 레이 터와 호스를 통해 시스템에 연결 합니다. 설정 하 고 탱크 출력 압력은 5-10 psi를 읽고 확인 합니다.
- 실험 설정 진행. 실험 메뉴에서 "실험 파일 열기"를 선택 하십시오. 적절 한 서식 파일 (예: 마우스)를 선택 합니다. 실험 메뉴에서 "설정"에서 기록 되어야 하는 실험의 매개 변수 정의 (예: 마우스 ID, 무게, 그룹, 등등) 드 사용 중인 어떤 챔버를 선택 하 고 저장 하는 실험에 대 한 위치를 선택.
- 비늘 음식 섭취 량을 측정 하는 경우 tared 되었습니다 실험 메뉴에 "실행"을 선택 하 여 데이터를 캡처 시작 확인 합니다. 데이터 형, 동물 격리, 및 시스템 사용 기관 지침에 따라 서로 다른 길이 대 한 캡처됩니다.
참고: 우리 손에서 실험 정기적으로 실행 됩니다 48 h acclimatisation 새로운 환경 및 데이터 분석에 사용 되는 두 번째 24 시간 사용 하는 첫 번째 24 h. 데이터 수집 기간 탐정 홀로 지 내게 하 고 동물 윤리 승인에 따라 그들의 마우스를 계속 하고자 하는 기간 기반으로 합니다. 또는 규정 있으면 마우스 수 수 시스템에 배치 되 고 이전 실에서 acclimatised 그리고 연결. 각 챔버는 12 챔버 시스템 사용 때 13 분에 약 한 번 측정 됩니다. - 정기적으로 확인 하 고 가져온 동안 쥐 동물 복지를 보장 하기 위해 시스템에 적합 한 데이터 수집 되 고 그 결과 모니터링 합니다. 모든 문제는이 단계에서 식별 하 여 정류 수 있습니다. 매일 아침과 저녁 때 그들은 시스템에 있는 각 마우스에 확인 하십시오.
- 산소 소비, RER, 및 에너지 지출에 관해서에서 각 마우스에 대 한 실시간으로 수집 된 데이터에 대 한 데이터 파일 페이지의 상단에 대사 탭을 확인 하십시오. 한편, 빔 휴식 하 고 음식 소비 데이터 각각 활동 및 먹이 탭에서 찾을 수 있습니다. "O2 에" 주위 읽고 확인 "CO2 에서" 20.90 20.94 0.040-주위는 0.050, RER는 0.7 ~ 1, 그리고 흐름 속도 0.5-0.6 L/min에서 일정.
- 정기적으로, 쥐는 음식과 물에 접근이 그들은 각각 소모는 확인 합니다. 그들은 하지 파고 구멍된 바닥에서 같은 고통의 어떤 표시 든 지를 보여 주는 확인 합니다. 또한, 표시 되는 결과 모니터링 합니다.
- 할당된 된 실험 시간 완료에서 실험 메뉴에서 "중지"를 선택 하 고 결과 내보내기 (CSV 파일, 파일 > 내보내기 > 생성 주제 CSV) 분석에 대 한.
- 쥐의 상태를 검사 하 고 그들을 무게 다음 자신의 집 새를 반환 합니다.
- 마우스는 분리 후 서로 향해 적대적인 수 있습니다, 그리고 그래서 그들은 함께 다시 지 내게는 일단 모니터.
- 감 금 소를 분해, 메뚜기에서 초과 식품을 제거 하 고 어떤 배설물, 소변, 및는 연습장에서 음식 팁. 병 및 희석 T bac 솔루션에서 sippers 잠수함 담가, 고 희석된 표백 솔루션의 다른 구성 요소를 청소. 깨끗 한 물으로 헹 구 고 건조 공기를 두고.
- 소프트웨어와 함께 신진 대사 매개 변수를 계산 합니다. 소프트웨어는 최종 데이터 출력4를 제공 하는 방정식의 수를 이용 한다.
산소 소비와 이산화탄소 생산의 계산에 대 한: 산소 소비량: VO2 (LPM)= ViO2i -VoO2o; 이산화탄소 생산: VCO2 (LPM)= VoCO2o-V나공동2i
장소: V나 입력된 환기 율 (LPM), Vo = = 출력 환기 율 (LPM), O2i = 입력된, O2o 에서 O2 농도 출력, CO2i O2 농도 = CO2 = 에서 입력된, CO2o 농도 = 출력에서 CO2 농도.
RER의 계산: RER = VCO2 /2보. Note 단백질 산화는 측정 되지 않습니다 및 따라서 RER 하지이 조정 되었습니다.
에너지 지출의 계산에 대 한: 에너지 비용: CV = 3.815 + 1.232* RER
열 (Kcal/h)) CV = * VO2. 장소: CV 발열량 (열과 산소 소비의 볼륨 사이의 관계)입니다. 이 "의 요소는 과학의 영양의" 그레이엄 Lusk에 의해 구성 Lusk 테이블 이라는에서 파생 됩니다.
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Representative Results
그림 3 에서 본 결과 EchoMRI를 통해 측정 된 고 지방 먹이 시 신체 구성 매개 변수에서 전형적인 변화를 표시 합니다. 초기에 어떤 매개 변수 측정 (그림 3A-F)에 차이가 없었다. 그러나, 단지 1 주일 후 먹이 높은 지방, 체중, 지방 질량, 및 지방 대량 비율 HFD 그룹 (그림 3A,B,D)에서 크게 증가 했다. 이러한 조치에 대 한 두 그룹 간의 차이의 크기 3 주 식이 개입 증가를 계속 했다. 근육 량, 무료 물, 그리고 총 함량 (그림 3C,E,F) 시간 언제 든 지 그룹 사이 다 하지 않았다. 그것은 또한에서 차 우 쥐 연구 기간 (그림 3A) 이상의 무게에 넣어 계속 먹이는 이것이 증가 때문에 근육 량 (그림 3C) 보다는 체 지방 량 증가 (그림 3B) 볼 수 있습니다.
그림 4에서 볼 수 있듯이 3 주 동안 고 지방 먹이 대사 동물 모니터링 시스템에서에서 검색으로 변화의 수에 지도 했다. VO2 몸 무게에 대 한 조정 하지 먹인 쥐 (그림 4A) 무거운 높은 지방에서 크게 높았다. 특히, 두 개의 서로 다른 요소를 통해 VO2 의 두 개의 다른 결과 귀착되는. 총 몸 무게 표준 차 우 사이 VO2 에 차이가 이끌어 정규화 먹이 고 지방 먹이 쥐, 상당한 차이 (그림 4B,C)를 생산 하는 근육 량을 정규화 하는 동안. 이러한 결과 입증 대량 변수에 의해 크게 나누어 VO2 데이터의 영향을 받는 결과 때 그런 방법으로 표현 된 VO2 데이터를 해석할 때 주의 행사 한다. VO2 데이터를 표현 하는 방법에 대 한 자세한 내용 및 다른 매개 변수를 표준화의 효과 대 한 Tschop, 그 외 에 훌륭한 토론을 참조 하십시오. 5 마우스 에너지 대사의 분석 그들의 가이드, Tschop와 동료 제안 공동 분산 (ANCOVA)가 통계적으로 몸 무게 또는 에너지 지출에 신체 구성의 효과 및 음식 섭취 량 데이터의 분석의 사용 . 이 경우에, 정상적인 차 우와 HFD, 따라서 나타내는 몸 무게에 대 한 회계, 일단 거기 사이 통계적으로 유의 한 차이가 존재 밝혀 그림 4A는 covariate로 몸 무게를 사용 하 여에 표시 된 데이터에 대 한 ANCOVA 수행 그룹 사이 산소 소비에 아무런 차이입니다. 이 결과 그림 4D와 같이 scatterplot으로 몸 무게에 대 한 보2 를 플롯할 때 쉽게 구상 될 수 있다. VO2 몸 무게 (그림 4D)에 대 한 계획을 세우고 VO2 데이터 거짓말 체중에 관하여 일반적인 라인에 더 많은 산소를 소모 하는 무거운 동물 들과 함께 하는 방법을 보여 줍니다. 메모의 VO2 근육 량에 대 한 계획을 세우고 VO2 데이터 (4E 그림) 근육 량에 관하여 두 가지 라인에 거짓말을 보여 줍니다.
RER는 탄수화물 이용 (그림 5A) 높은 지방 다이어트를 먹이 하는 때에 지방 사용률을 나타내는 쥐, 먹이 하는 높은 지방에서 훨씬 낮은 했다. 정규화 하지 않고 에너지 지출 (열)는 몸 무게 (그림 5C)으로 정규화 한 번 손실 되 고이 차이가 더 metabolically 활성 조직 (그림 5B), 데 동물 때문에 가능성이 무거운 동물에 증가 되었다. 또한 note 때 생쥐는 보다 적극적인 라이트 사이클에 비해 어두운 사이클에 VO2, RER, 그리고 에너지 비용에 있는 증가. 이러한 차이 마우스에서 발생 하는 대사에 고전 매일 변경을 나타냅니다. 이 예에 (서) 동안 우리 12 h 블록으로 데이터를 나누어가지고, 신 기원 시간 더 작은으로 데이터의 분할도 유용할 수 있습니다. 신체 활동 수준 또한 에너지 비용에 기여 하는 요소 이다. 이들은 그룹, 운동 감소 했다 고 지방 먹이 쥐 (그림 5D)에 표현 하는 비만 형의 드라이버 제안 사이 다른.
에너지 균형 방정식의 다른 측면은 고 본문 입력 에너지의 금액입니다. 물질 대사의이 측면에서 보고 우리 쥐 대사 동물 모니터링 시스템에서에서 소비 하는 음식의 양을 분석 했다. 그림 6A에 관찰 될 수 있다, 마찬가지로 쥐 체중 또는 체중 (그림 6B)으로 정규화 때 측정 된 음식의 동일한 양을 먹었어요. (ANCOVA 다시 사용할 수 있습니다 음식 섭취 량에 몸 무게의 영향을 평가.) 몸 무게에 음식 섭취 량의 에너지 소비 또한 무게, 따라서 에너지 방정식의 각 측면을 유지 하는 균형에 정규화 되었습니다 경우 고려 하는 중요 한 단계를 수 있습니다. 쥐 같은 양의 음식 먹고, 하는 동안 사용 하는 다이어트의 각각의 에너지 밀도 대 한 계정에 중요 하다. 계정에이 인자를 복용 했을 때 우리 HFD (그림 6 c) 더 많은 에너지를 소비에 쥐를 관찰 하 고이 실험에서 높습니다이 비만 형 운전은. 그것은, 이후 쥐에 더 많은 에너지를 하고있다 하지만 그들은 비례적으로 더 많은 에너지를 늘리지 하지는, 그들의 비만 기 인할 수 있다 에너지 저장.
통계
이 문서에서 모든 데이터의 의미 (SEM)으로 평균 ± 표준 오차 표시 됩니다. 통계적 의미는 p 에서 설정 된 < 0.05. p 를 나타냅니다 < 0.05, * * p 를 나타냅니다 < 0.01, * * * p 를 나타냅니다 < 0.001, 그리고 n = 그룹 당 6 표시 하지 않는 한. 수 사관 식이 그룹 개입 다이어트의 색상에서 차이 때문에 눈 멀게 하지 못했습니다. 쥐 무작위로 그들은 주어진 어떤 다이어트로 선택 되었다.
그림 1 : 마우스 비용 및 신체 조성 분석기 내에서 마우스를 포함 하는 작은 동물 견본 홀더의 올바른 배치. 교정 표준 (비용)를 사용 하 여 시스템 테스트를 수행 하거나 작은 동물성 견본 홀더 내에서 마우스의 스캔, 갠트리 시스템의 내부 각 장소. 빨간색 화살표는 쥐 포함 될 컴퓨터의 갠트리 입력 실린더를 나타냅니다.
그림 2 : 개별 챔버의 조립. A) 균형의 센터에서 식품 호퍼를 놓습니다. B) 호퍼에 각 약 실 및 장소 상공에 플랫폼을 삽입. C) 쥐 실에서 개별적으로 놓고 뚜껑을 확보. D) 물 병을 놓고 고정.
그림 3 : 몸 구성 분석 3 주 동안 높은 지방 다이어트. A) 체중, B) 지방 질량, C) 질량, 상체 D) 대량 비율을 지방, E) 무료 물 콘텐츠, 그리고 F) 총 함량. 동그라미 대표 정상 차 다이어트, 사각형 HFD를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 변화 매개 변수는 각 다이어트의 3 주 후 대사 동물 모니터링 시스템 실험에서 얻은. 쥐 팸 역할 첫 번째 24 h 48 h에 대 한 실에 보관 되어 있었다. 두 번째 24 시간에서 얻은 데이터 분석 하 고이 숫자에 제시 했다. A) 원시 VO2 요금, B) VO2 몸 무게를 정규화 C) VO2 근육 량으로 정규화 D) scatterplot 조정 보2 (총 24 시간 기간) 몸 무게, t와 E) 조정 VO 근육 량을2 . A-C 흰색 막대 대표 정상 차 다이어트, 검은 막대 높은 지방 다이어트를 나타냅니다. D-E 동그라미 대표 정상 차 다이어트, 사각형 HFD를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : A) 호흡 교환 비율 (RER), B) 열 (에너지 소비), 및 C) 몸 무게를 정규화 된 열. D) 활동 레벨 X 및 Y 빔 휴식과 Z 빔 나누기는 외래의 합으로 계산. 흰색 막대 대표 정상 차 다이어트; 검은 막대 HFD를 나타냅니다.
그림 6 : 음식 섭취 량 데이터 마지막 24 시간에 대 한 시스템에서 얻은. A) 그램, 음식 섭취 량 B) 음식 섭취 량은 몸 무게를 정규화와 C) 계산 된 에너지 섭취. n = 4-5 (3 마우스는 그들의 음식으로 큰 혼란을 만들기 때문에 제외 됐다). 흰색 막대 대표 정상 차 다이어트; 검은 막대 HFD를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
중요 한 단계
여기에 설명 된 프로토콜 신체 조성 분석기 및 대사 동물 모니터링 시스템을 사용 하 여 마우스에 다양 한 대사 매개 변수 및 측정 신체 구성 하는 방법의 예를 제공 합니다. 두 기술에 대 한 그것은 되도록 컴퓨터 최적화, 작업 하는이 위해 연구원 신체 조성 분석기에 대 한 시스템 테스트를 수행 하 고는 대사에 대 한 알려진된 가스 구성에 보정 필수적입니다 매우 중요 하다 장비 사용 하기 동물 모니터링 시스템 전에. 이렇게 하면 결과 및 기계와 잠재적인 문제를 감지 하는 기회의 더 일관성.
데이터 대사 동물 모니터링 실험에 대 한 정규화 방법 또한 기술에서 얻은 결과의 유효성을 보장 하기 극히 중요 하다. VO2 는 여러 가지 다른 방법으로 보고 될 수 있는 대표적인 결과 (그림 4A-E)에 표시 된 대로: 그것의 절대 속도 (L/min), 마우스의 몸 질량을 기준으로 (mL/kg * 분), 또는 상체를 신체 질량 (mL/kgLBM 를 기준으로 * 분) 경우 해당 데이터를 사용할 수 (예를 들어 신체 조성 분석기에서 얻은). 표현 형, 따라 정규화 값 어떤 잠재적인 편견을 배제 하는 특정 방법에 더 적합 한 수 있습니다. 예를 들어 동물 몸 질량을 증가 하는 경우 그들은 더 많은 조직을 사용 가능 하 고 산소를 소비 수 있고 자연스럽 게 그들의 에너지 소비는 더 높은. 몸 전체를 정상화 질량 되지 않을 수 있습니다 최선의 선택 그것은 질량의 단위 당 산소 소비 감소의 관측으로 바이어스 것입니다 비록 조직의 산소 소비 다른 되지 않을 수 있습니다. 몸 무게를 정상화 하는 대신, 하나는 마우스의 상체를 신체 질량을 정상화 수 있습니다. 마른 조직으로 질량은 산소 소비에 대 한 책임 그리고 근육 량은 일반적으로 변경 된 또는 실험 그룹,이 방식으로 정규화 사이 겸손 하 게 다른 방법이 있을 수 있습니다 한 더 대표 VO2 데이터를 표현. 마른 대량 구획은 많은 다른 조직, 모든 다른 신진 대사 속도, 구성 되어 및 따라서 이러한 방식으로 정규화 하지 적절할 수도 어떤 통찰력을 제공에 주목 해야 한다는 마른 대량 구성 요소에는 운전에 변경 합니다. 또한, 그것은 밖으로 신진 대사에 지방 대량 구성의 공헌 규칙.
이러한 문제를 감안할 때, 다른 통계 기반 방법 또한 되었습니다 제안된5,6. (ANCOVA 공분산 분석) 변수 (예: 에너지 소비)의 비교를 허용 하는 통계 테스트 여러 그룹에 걸쳐 다른 요소에 대 한 수정 하는 동안 또는 변수 covariates 되 나. 이 방식으로 체중 같은 요인, 체 지방 량 및 근육 량은 에너지 소비에 영향을 주는 변수로 포함 될 수 있습니다 하지만이 메서드는 자체 특정 가정6, 사실은 ANCOVA에서 여러 변수를 사용 하 여 것을 포함 하 여 그것은 무효화 하지 않는 한 변수는 서로 독립적입니다. 주어진 정상화 보편적으로 합의 또는 단일 방법이 있을 것이 고 존재 VO2 또는 에너지 비용 데이터를 표시 하는 여러 가지 방법으로 독자에 게는 표현 형의 명확한 그림을 제공 하기 위해 데이터를 제시 수 있습니다. 신체 활동 수준 산소 소비를 증가 시킬 수 있고 그래서 활동 고기 (증가 또는 감소)이 있는 동물, 그것은 수도 있습니다이 완전히 또는 부분적으로 계정 수 경우 결정 하는 운동에 변화에 대 한 계정/정규화 하는 데 필요한 VO2에 어떤 변화 든 지에 대 한 계정.
수정 및 문제 해결
이 프로토콜에 표시 되는 대표적인 결과 21-22 ° C의 실 온에서 실시 한 실험에서 가져온 마우스의 thermoneutral 존은 약 30 ° C, 그래서 인간 안락을 위한 20-22 ° C로 설정 온도와 전통적인 동물 하우스, 마우스는 열 스트레스. 이것을 반대 하기 위하여 비 떨는 thermogenesis 2-fold 쥐 20 ° C에서 30 ° C7에서 지 내게 그 비교에서 지 내게 사이 에너지 비용 증가 최대 인이 추운 온도에서 활성화 됩니다. 롬8 , 높은 지방 다이어트 유발과 같은 thermoneutrality에 마우스의 주택 일부 조건의 개발을 약효 수 표시 되었습니다 쥐의 환경 주택 이러한 실험에 대 한 중요 한 고려 사항입니다. 무알코올 지방 간 질병 (NAFLD) 병 인9. 환경 온도 이므로 또한 중요 한 표현 형 특정 온도에 있을 수 있습니다 하지만, 다른 사람에 있는 수를 가리킨 하지의 잠재적인 메커니즘 모니터링 시스템, 대사 동물에 실험을 실시 하는 때 액션입니다. 이러한 시나리오 중 하나는이 조직의 큰 수량 thermogenesis 쿨러 조건10아래에 큰 증가 대 한 허용 하는 그것에 의하여 모집 베이지색 지방의 활성화를 포함 하는 표현 형 될 수 있습니다. 따라서, 그것은 필요할 수 있습니다 환경 수정 하는 설정 설명이 현재 실험과 모델의 진정한 대사 상태의 정확한 묘사를 여러 환경 온도 따라 실험을 실시 했다. 때문에 기술적인 오류 문제 해결을 위해 직접 명령에 대 한 제조 업체에 문의를 필요할 수 있습니다. 신체 구성 분석기의이 유형으로 문제가 있을 경우 비용 25 검사를 실행 하는 검사를 반복 테스트를 수행 하는 것이 좋습니다. 회사는 진단에 대 한이 정보를 필요 합니다. 마찬가지로 대사 동물 모니터링 시스템 문제가 발생할 경우 시스템 작용에서 데이터 파일과 파일에서 수집 지원 가능성이 진단 할 수 있도록 문제 발생 했을 때.
제한 사항
신체 구성 분석기 전신 지방 축적에 우수한 데이터를 제공, 지역 지방 저장소의 결정에 대 한 허용 하지 않습니다. 이 지방 축적 위치와 같은 모든 지방으로 및 그것의 기능 속성을 특히 중요 하 고 비만 연구의 분야에서 중요 하다. 실제로, 피하 지방 플랫폼 (또는 metabolically 건강 한 지방)의 보호 효과 설명된11되었습니다. 마이크로 계산 된 단층 촬영 (마이크로 CT) 자기 공명 영상 (MRI) 분석13수 피하와 내장 지방12, 차별 수 있습니다. 이러한 방법 사용 지방 축적의 사이트에 정보를 더 제공할 수 있습니다. 신진 대사 동물 모니터링 시스템도 한계가 있다. 총 일일 에너지 지출을 측정 될 수 있다, 하는 동안 시스템 에너지 지출을 구성 하는 다른 구성 요소 간에 분별의 능력이 아니다. 시스템의 추가 제한은 비만 식품/에너지 섭취 량 변경도 별도로 시스템의이 종류를 통해 감지 하는 에너지 비용에서 측정 가능한 감소 없이 개발할 수 있는 가능 하다는 것입니다. 연구는 상당한 무게를 일으킬 정도로 상당한 에너지 비용에 있는 작은 감소 긴 기간 이득, 검출 될 수 없다 튼튼하게 같은 대사 시스템에서 단기14,15, 이상 16. 우리가 그룹 당 6의 n에서에서 사용한 현재 연구 예 연구로 서이 방법론을 설명 하기 위해, 비만 가능성에 기여할 수 있는 에너지 비용에 작은 차이 검출 하기 위하여 많은 더 많은 마우스5합니다. 이러한 시스템 및 더 긴 기간 동안 이러한 종류의 연구를 수행 하는 능력에서 해상도에 발전은 이러한 작은 하지만 중요 한 변화를 감지 하는 능력에 도움이 됩니다. 음식 섭취 량의 측정에 관해서 우리는 일반적으로 관찰 대사 동물 모니터링 시스템 내에서 보관 하는 쥐에 있는 24 시간 음식 섭취 량은 집 안의 관찰 될 것 보다 낮은, 위에서 언급 한 이유로 인해 가능성이. 따라서,이 시스템에서 음식 섭취 량을 모니터링, 뿐만 아니라 우리는 또한 쥐의 집 장에 음식 섭취 량을 평가 합니다. 이 행 해질 수 있다 특정 실험적인 그룹에서 마우스 별도로 보관 하는 상황에서 하는 동안 연속 매일 평가 근처 허용의 이점이 있다. 조사는 단순히 항상 곳곳에 감 금 소, 음식에 대 한 회계, 하루 중 지정된 된 시간에 음식 양을 호퍼에 무게 그리고 쥐 감 금 소에 있는의 수에 의해 소비 하는 식품의 총 금액을 분할 한다.
미래의 응용 프로그램
동안이 평가에서 높은 지방 측정 신체 구성 및 대사 매개 변수는 유용한,이 장비를 사용 하 여 지금까지이 연구 분야에 국한 되는 질병 상태 예를 들어 먹이 통해 획득 하는 비만 사용 해 왔다. 당뇨병과 같은 질환, 심혈 관 질환, 연령 관련 sarcopenia, 나 약함, 암 악, 근육 dystrophies 및 lipodystrophy 공부를 할 때 이러한 방법 사용 가치 이기도 합니다. 구매의 초기 비용 같은 인프라는 상당한, 여러 걸쳐 장비를 사용 하는 능력 및 의료 연구의 다양 한 분야가 초기 비용을 줄입니다. 또한, 지속적인 시 약 및 소모품 비용은이 기계;에 대 한 최소한의 그러나, 예방 유지 보수 및 서비스 고려 고에 대 한 예산 있습니다.
몸 구성 분석을 통해 얻은 근육 량 산소 소비 대사 동물 모니터링 시스템에서에서 파생 된에 대 한 중요 한 정규화 요소가 있을 수 있습니다, 처럼 마른 질량 결정 또한 마약/테스트 복용량을 정상화 하 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 대사 연구, 그것은 복 또는 경구 포도 당 내성 검사 (GTT), 또는 복 인슐린 내성 검사 (ITT)을 수행 하는 일상 이다. 이러한 테스트는 포도 당 부하의 폐기 또는 인슐린에 반응 하는 마우스의 기능을 검사 합니다. 이러한 테스트에 대 한 응답에서 혈액 포도 당 수준 변경 전신 포도 당 및 인슐린 허용 오차 모델에서의 수준에 정보를 제공 합니다. 전통적으로,이 테스트에서 관리 하는 포도 당 및 인슐린 bolus 마우스의 몸 무게에 따라 약을 복용 이다. 그러나, 비만 모델 근육 량 이상의 지방 축적, 체중 당 먹이 지 수 편견는 GTT에 포도 당 편협으로 무거운 모델 그들은 더 많은 포도 당을 받을. 이 후 높은가격순 상태17에 포도의 대부분의 폐기 간, 골격 근, 뇌, 기관 구성 요소와 거의 마른 질량 측정의 또는 대부분의 모델에서 약간 변경는 사실 때문입니다. 반대로, 체중을 복용 하는 ITT에 더 많은 인슐린을 받을 것 이라고 무거운 모델 순수 하기 때문에 큰 수량 받은 인슐린의 효과 낮추는 포도 당에 더 민감한 나타날 수 있습니다. 따라서, 탐정 신체 구성 데이터에 액세스할 수 있으면 근육 량 가장 적합 한 측정, 전체-신체 질량 이러한 노출량 계산18에 대 한 반대 수 있습니다. 이 추가 복용, 신체 조성 분석에서 얻은 마른 대량 데이터 수 필요 근육 량 체 지방 량의 배제에 대 한 계정에 발생 하는 경우 실험 약물 복용량도 사용할 수 있다. 신진 대사 동물 모니터링 시스템의 다른 응용 프로그램을 논의 되지 또는이 원고에서 시스템에는 동봉 된 자동화 된 디딜 방 아 대사 매개 변수는 여기 논의 또한 측정 될 수 있다 동안 연결 운동입니다.
이 리뷰에서 설명 하는 절차는 신체 구성 및 마우스에 다양 한 변화 매개 변수 특성을 사용할 수 있습니다. 이 이러한은 광범위 한 연구 분야에 적용 되며는 표현 형의 특성에 대 한 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다. 이 방법에서 파생 된 데이터는 특정 대사 표현 형을 운전 하는 기본 메커니즘으로 증거를 제공할 수 있습니다. 추가 개발 및 수정 이러한 기술의 그들의 발견으로 치료 결과를 연구자 수 있게 된다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 감사 알프레드 의료 연구와 교육 관할 동물 서비스 (AMREP AS) 팀이이 연구에 사용 된 쥐 및 그들의 지원 및 빅토리아 국가의 운영 인프라 지원 체계의 지원에 대 한 직원 정부입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 in 1 system | EchoMRI | 4 in 1 system | Whole body composition analyser |
| Canola oil test sample (COSTS) | EchoMRI | Mouse-specific (contact company for cat number) | |
| Animal specimen holder | EchoMRI | 103-E56100R | |
| Delimiter | EchoMRI | 600-E56100D | |
| 12 chamber system | Columbus Instruments | Custom built | Metabolic Caging System; includes control program |
| Drierite | Fisher Scientific | 238988 | CLAMS consumable |
| Calibration gas tank | Air Liquide | Mixed to order | Gas calibration (0.5% CO2, 20.5% O2, balance nitrogen). |
| Normal chow diet | Specialty Feeds | Irradiated mouse and rat diet | |
| High fat diet | Specialty Feeds | SF04-001 | |
| Balance | Mettler Toledo | PL202-S | Balance for weighing mice |
| TexQ Disinfectant spray | TexWipe | ||
| Hydrogen Peroxide cleaning solution | TexWipe | TX684 |
References
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