Summary
Det här protokollet beskriver användningen av en kropp sammansättning analyzer och metabola djur övervakningssystem att karaktärisera kroppssammansättning och metabola parametrar hos möss. En fetma modell induceras av fettrik utfodring används som exempel för tillämpningen av dessa tekniker.
Abstract
Förändringar i kroppssammansättning (fett eller magert massa), metaboliska parametrar såsom hela kroppen syreförbrukning, energiförbrukning, och substratutnyttjande och beteenden såsom matintag och fysisk aktivitet kan ge viktig information angående de bakomliggande mekanismerna av sjukdom. Med tanke på vikten av kroppssammansättning och metabolism till utvecklingen av fetma och dess efterföljande följdtillstånd, är det nödvändigt att göra korrekta åtgärder av dessa parametrar i inställningen för preklinisk forskning. Tekniska framsteg under de senaste decennierna har gjort det möjligt att härleda dessa åtgärder i gnagare modeller i en icke-invasiv och längsgående mode. Därför dessa metabola åtgärder har visat sig användbara vid bedömningen av genetiska manipulationer (till exempel knockout eller transgena möss, viral knock-down eller överuttryck av gener), experimentell drog/förening screening och kosttillskott, svar beteendemässiga eller fysisk aktivitet interventioner. Häri, beskriver vi de protokoll som används för att mäta kroppssammansättning och metabola parametrar med hjälp av ett djur som övervakningssystem i chow matad och hög fett diet-matade möss.
Introduction
Metabolism utgör grunden för många aspekter av normal cellulär, orgel och hela kroppen fysiologi. Följaktligen i inställningen av olika patologier, förändringar i ämnesomsättningen kan bidra direkt till det bakomliggande tillståndet eller kan påverkas negativt som en bieffekt av patologin. Traditionellt, har metabolisk forskning och studier i energibalansen koncentrerats på fältet av fetma och relaterade tillstånd såsom insulinresistens, pre-diabetes, glukosintolerans, hjärt-kärlsjukdom och diabetes. Denna forskning är befogad ges eskalerande förekomsten av sådana villkor världen över och individen, samhället, och ekonomiska kostnader dessa villkor tillfoga. Som sådan, utveckling av strategier för förebyggande och nya therapeutics till målet fetma är fortsatta mål i forskningslaboratorier runt om i världen och prekliniska musmodeller är kraftigt åberopas för dessa studier.
Samtidigt väger möss ger en tillförlitlig bedömning av viktökning eller viktminskning, ger den inte en uppdelning av de olika komponenterna som utgör hela kroppen sammansättning (fettmassa, muskelmassa, gratis vatten samt andra komponenter såsom päls och klor). Vägning av fett kuddar vid slutförandet av studier när musen är död ger ett riktigt mått på olika fett depåer men kan endast ge data för en enda tidpunkt. Följaktligen är det ofta nödvändigt att registrera flera kohorter för att undersöka utvecklingen av fetma över tid, betydligt ökande antalet djur, tid och kostnader. Användning av dual-energy X-ray röntgenabsorptiometri (DEXA) innehåller en metod för att bedöma kroppen fett och magert vävnad innehållet och gör att forskaren att erhålla uppgifterna i ett längsgående mode. Men förfarandet kräver möss vara sövda1och upprepade anfall av anestesi kan påverka ansamling av fettvävnad eller påverka andra aspekter av metabola reglering. EchoMRI använder tredjeparts kärnmagnetisk resonans relaxometry för att mäta fett och lean mass, gratis vatten och total vattenhalt. Detta är möjligt tack vare skapandet av kontrasten mellan de olika vävnad komponenterna, med skillnader i varaktighet, amplitud och rumslig distribution av genererade radiofrekvenser som tillåter avgränsning och kvantifiering av varje vävnadstyp. Denna teknik är fördelaktigt eftersom den är icke-invasiv, snabb, enkel, kräver ingen anestesi eller strålning och, ännu viktigare, har verifierats positivt mot kemisk analys2.
En nyckelfråga för fetma och relaterade forskning är ekvationen energi balans. Ansamling av fett är mer komplicerat än rent energi i (födointag) kontra energi ut (energiförbrukning), är de viktiga faktorer för att kunna mäta. Dagliga energiförbrukning är summan av fyra olika komponenter: (1) basal energiförbrukning (vilande ämnesomsättning); (2) energi utgifter på grund av den termiska effekten av livsmedelskonsumtion; (3) den energi som krävs för värmereglering; och (4) energi spenderas på fysisk aktivitet. Som energiförbrukning genererar värme, kan mäta värmeproduktion av ett djur (känd som direkt calorimetry) användas för att bedöma energiförbrukning. Alternativt, mätning av inspirerad och gått ut koncentrationer av O2 och CO2, vilket möjliggör bestämning av hela kroppen O2 konsumtion och CO2 produktion, kan utnyttjas som ett sätt att indirekt mäta (indirekt calorimetry) Värm produktion och följaktligen beräkna energiförbrukning. En ökning av födointag eller en minskning av energiförbrukning kommer predisponera möss till viktökning och observationer av ändringar i dessa parametrar kan ge användbar information av sannolikt verkningsmekanismer i särskilda modeller av fetma. En relaterade metabola parameter av intresse är den respiratoriska utbytesrelation (RER), en indikator på andelen av substrat/bränsle (dvs kolhydrater eller fett) som genomgår metabolism och utnyttjas för att producera energi. Mätning av födointag (energi som förbrukas) i kombination med fysisk aktivitetsnivå, O2 konsumtion, RER och energiförbrukning kan följaktligen ge en bred förståelse för en organisms metabola profilen. En metod att samla in sådana data är att använda ett omfattande laboratorium djur övervakningssystem (musslor), som är baserad på den indirekta kalorimetri metoden att mäta energiförbrukning och har de extra kapacitet för att fastställa nivåer för fysisk aktivitet (balk raster) och matintag via skalor införlivas med mätning kammaren.
I detta protokoll ger vi en rättfram Beskrivning av användningen av en kropp sammansättning analyzer att bedöma kroppssammansättning hos möss och en metabolisk djur övervakningssystem att mäta aspekter av metabolism. Överväganden och begränsningar för dessa tekniker kommer att diskuteras liksom föreslagna metoder för analys, tolkning och datarepresentation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment beskrivs godkändes av Alfred medicinsk forskning utbildning Precinct djur etikkommittén (AMREP AEC) och möss tillhandahölls mänsklig omsorg i linje med den nationella hälso- och medicinsk forskning rådet (NHMRC) i Australien riktlinjer för Djurförsök. Djuren var administrerat sin föreskrivna kost och vatten ad libitum och inrymt i en temperatur-kontrollerad miljö (~ 21-22 ° C) med en 12 timmar ljus och 12 h-dark cykel. Sju vecka gamla hanmöss (på C57Bl/6J bakgrund) matades antingen vanlig normal chow kost (energi innehåll 14,3 MJ/kg, består av 76% av kJ från kolhydrater, 5% fett, 19% protein; se tabell för material) eller för hög fett-utfodring gruppen en hög fett diet () (HFD) energi innehåll 19 MJ/kg, bestående av 36% av kJ från kolhydrater, fett 43%, 21% protein, specialitet Feeds) i 3 veckor. Kroppsvikt och kroppssammansättning med hjälp av en EchoMRI maskin gjordes varje vecka medan metabolisk övervakning analysen ägde rum i en musslor efter 3 veckor av kosten.
1. kroppen sammansättning Analyzer förfarande
Obs: För att fungera optimalt, bör EchoMRI 4-i-1 används i detta protokoll finnas i ett rum där lufttemperaturen är stabil och inte varierar. Helst övervakas detta ständigt. Förflyttning av maskinen och avbrott till makten bör också undvikas om möjligt. Om strömförsörjningen avbrutits och systemet måste startas om, låt minst 2-3 h för maskinen att värma upp innan du använder den igen. Innan du börjar, kontrollera att du bär rätt personlig skyddsutrustning.
- Innan du börjar skanna möss, utför du ett systemtest på kroppen sammansättning analyzer maskinen. Detta innebär att man använder en kalibrering standard (kallad en raps olja systemet provet (kostnader)) att testa precisionen av instrumentet och för att säkerställa har ingen drift i dess riktighet.
- Öppna systemprogramvaran, sedan klicka på knappen System Test eller att trycka ”Alt + Y” samtidigt.
- Innan systemtest utförs av datorn, vänta för en påminnelse om att kontrollera att de rätta kostnaderna (i detta fall mus-specifika kostnader) har placerats inuti utlastningsanordningen av systemet ( figur 1). När du har bekräftat att detta verkligen är fallet, acceptera för att fortsätta med test, som tar några minuter att slutföra.
- När systemet testet har passerats, fortsätta framåt med scanning.
- Om systemet testet misslyckas upprepa systemstarten.
- Om enheten fortsätter att vara utom räckhåll (indikerar en avvikelse har uppstått), kan kalibrering vara nödvändiga för att rätta till situationen. Slutföra detta genom att följa instruktionerna eller som beskrivs i användarhandboken som tillhandahålls vid köptillfället. Om problemet kvarstår, kontrollera de manuella3 eller rapportera problemet till tillverkarens supportteam och söka ytterligare instruktioner.
- Placera mössen i en liten djur preparathållaren (lång cylinder) att hålla dem medan i maskinen. Att göra detta, placera innehavaren horisontellt, plocka upp musen och infoga det i öppnandet av topplocket först. Långsamt och försiktigt föra innehavaren till vertikalt läge så att musen är på botten av cylindern och redo för analys.
- En gång inom innehavaren, infoga en avgränsare om du vill begränsa förflyttning av musen under mätperioden. I vissa fall med extremt aktiva möss, kan det vara nödvändigt att hålla avgränsaren på plats med fingertoppen.
Observera: Bekanta möss med placering i de preparathållare före deras första analys att minska stress. Användning av en röd färgade djur preparathållaren kan också minska den potentiella stress svaren, som mössen känner att de är i mörkret. - I programmet, Välj en mapp (mappen verktygsfältet) för att spara data till och skapa ett filnamn.
- Om nödvändigt, minska mängden slumpmässigt brus i fett och magert mätningar genom att öka antalet primära ansamlingar av genomsökningen. När programvaran är inlett, de primära ansamlingar är inställd på en rekommenderade standardvärdet för allmänna vardags; om det inte finns särskilda skäl att ändra dessa parametrar, ger standardinställningarna den nödvändiga nivån av precision till användare.
- Om inte intresserad av att erhålla data för gratis vatten och totala vatten, stänga av vatten scenen genom att välja fliken att säga nej. Därigenom kommer att avsevärt minska scan varaktighet och förbättra genomströmningen.
- Starta sökningen genom att välja ”Starta scan” eller genom att trycka på F5 på tangentbordet. Ange alla relevanta uppgifter om djuret (t.ex. djur ID, kroppsmassa, osv.) och tryck på ”ok” eller F5 för att starta genomsökningen, som tar ca 1 min.
- När uppgifterna har samlats in, ta bort animaliska korthållaren som innehåller musen från maskinen och placerar animaliska baksidan i sin bur. När alla djur har scannats, exportera data för vidare analys och sortering.
- Före och efter användning, ren noggrant djurhållare enligt anvisningarna från tillverkaren. Som dessa innehavare är tillverkade av akrylplast, bör isopropylalkohol och etylalkohol undvikas eftersom de kan orsaka sprickbildning i innehavare eller snabb försämring av innehavaren, vilket ökar sannolikheten för brott. I stället antingen använda varmt diskvatten lösning eller, om det krävs ytterligare desinfektionsmedel, använda F10 (vid en 1:125 spädning) eller andra desinfektionsmedel eller rengöring sprayer (se Tabell av material) och sedan torka av.
2. metaboliska djur övervakningsförfarandet System
Obs: Systemet kräver ~ 2 h att värma upp och stabilisera. Om maskinen har varit avstängd, måste det vara påslagen för att tillåta cellen Zirconia värmas till 725 ° C. Också placera vi generellt möss i kroppen sammansättning analysatorn en dag innan in djuret övervakningssystem att undvika problem med återhållsamhet stress.
- Se till att den dator som är ansluten till djur övervakningssystemet är påslagen och öppna kontrollprogrammet. Välj alternativet ”Oxymax Utility” från menyn verktyg att initiera pumparna.
- Fylla vattenflaskor med lämpliga vatten, väga och inspektera hälsan hos möss och organisera mat. Om mäta matintag i systemet, överväga pudring maten. Fyll matartrattar av deprimerande den fjäderbelastade plattform och tip mat i uppsamlaren. Se till att mat hopper och vattenflaska är helt full att säkerställa att det finns tillräckligt med mat och vatten för att hålla den tilldelade experimentella tiden.
- Kontrollera status för drierite/torkmedlet; Om du använder en färgindikator, det bör vara blå och därför torkar, men om det är rosa/lila, det har haft betydande fukt absorbans och bör bytas ut eller kompletteras.
- Kontrollera skick av ammoniak fällan och soda lime och Byt ut vid behov. Om ammoniak fällan ansluts ersätta två åt gången, när den andra fällan visar tecken på en färgförändring, den första. En ökning av CO2 offset kan också betyda att behöva ersätta soda lime.
Obs: Torkmedel kan torkas i ugn och återanvändas, men vi följer rekommendationerna från tillverkaren av systemet att använda färska varje gång. - Montera kamrarna. Att göra detta, placera mat tratten på balansen, sedan placera kammaren ovanpå med perforerade plattform som blir golvet i kammaren införas. Noggrant placera musen i kammaren och fäst locket av systemet med framsidan och tillbaka klipp och säkra innan positionering vattenflaskan och infästning. Som en försiktighetsåtgärd kontrollera igen alla kammare lock, möss och vatten (figur 2A-D).
Obs: Beroende på storleken på möss som undersöks, kan det vara nödvändigt att justera höjden på utrymmena ovanför mat tratten så att mössen har tillgång till maten men inte tillräckligt utrymme som de kan sova direkt ovanpå mataren. - Eftersom det är rekommenderat att gas sensorer kalibreras innan varje experiment, kalibrera systemet.
- Använda en gas med känd sammansättning (0,5% CO2, 20,5% O2, balans kväve). Anslut kalibrering bensintanken till systemet via en regulator och slang. Slå på och säkerställa produktionen tanktrycket läser 5-10 psi.
Obs: Vissa system kommer att ha en andra tank, slang och regulator för användning av rent kväve som en ”offset” gas. Systemet vi använder istället soda lime för att generera CO2 fri luft. - Följ rutiner för att kalibrera både den O2 och CO2 sensorer. Välj ”calibration” från verktygsmenyn och sekventiellt kalibrera både den O2 och CO2. Innan kalibrering se till att 1) prov och referens flöden är 0.400 LPM, 2) Zirconia O2 sensor temperatur är 725 ° C (± 1 ° C), 3) provet och referens torrare och luftpumpar är på, och 4) kalibreringsgas är ansluten och påslagen.
- Om nödvändigt, vid kalibrering O2 sensorn, något justera kontrollen offset på framsidan av zirconia syresensorn att uppnå en O2 baserat på värdet av 1,0000 (± 0,0002). Detta är att det är inom acceptabla gränser (markerade i grönt teckensnitt i programvaran visas på datorskärmen).
- Efter framgångsrika O2 och CO2 kalibrering, stänga av kalibrering gascylindern och koppla slangen från regulatorn. Efter kalibrering, bör O2 för referens luft (atmosfären) läsa 20,92 (± 00.02). Om kalibrering är tolerans, upprepa och hänvisa till felsökning guider från tillverkaren. I annat fall kontakta tillverkaren för vidare instruktioner.
- Använda en gas med känd sammansättning (0,5% CO2, 20,5% O2, balans kväve). Anslut kalibrering bensintanken till systemet via en regulator och slang. Slå på och säkerställa produktionen tanktrycket läser 5-10 psi.
- Fortsätt med experimental set-up. Välj ”Öppna experimentella fil” från menyn experiment. Välj lämplig mall (t.ex. mus). Under ”Inställningar” i menyn experiment Definiera parametrarna för experimentet som bör registreras (t.ex. mus ID, vikt, grupp, etc.) avmarkera någon kammare inte är i bruk och välj plats för experimentet ska sparas.
- Säkerställa skalorna har varit tarerats om mäta matintag och börja fånga data genom att välja ”kör” i menyn experiment. Data fångas för olika lång tid beroende på fenotypen, institutionella riktlinjer om djurs isolering och systemanvändning.
Obs: I våra händer, experimentet rutinmässigt kör för 48 h, med första 24 h används som acklimatisering till den nya miljön och andra 24 h används för dataanalys. Uppgiftsinsamlingsperioden baseras på hur länge utredaren vill hålla sina möss ensamma inhysta och beroende av djuretik godkännande. Alternativt, om det finns bestämmelser, möss kan vara acklimatiseras i kamrarna innan släpps in i systemet och ansluten. Varje kammare mäts ungefär en gång varje 13 min när en 12 kammaresystem används. - Regelbundet kontrollera och övervaka de resultat som erhålls medan mössen är i systemet för att säkerställa djurens välbefinnande och att lämpliga data som samlas in. Eventuella problem kan kunna identifieras i detta skede och åtgärdas. Kolla på varje mus varje morgon och kväll när de är i systemet.
- Kontrollera fliken metabola överst på sidan fil för de data som samlas in i realtid för varje mus i hänsynen till syre förbrukning, RER och energi förbrukningen. Under tiden halvljus raster och uppgifter livsmedels konsumtion kan vara placerad i flikarna verksamhet och utfodring respektive. Kontrollera att ”O2 i” läser runt 20,90-20,94, ”CO2 i” är runt 0,040 - 0,050, RER är mellan 0,7 och 1, och flödet är konstant på 0,5 - 0,6 L/min.
- Med jämna mellanrum kontrollera att mössen har tillgång till mat och vatten och att de konsumerar varje. Se till att de inte visar några tecken på ångest som gräva på det perforerade golvet. Också, övervaka de resultat som visas.
- Vid slutförandet av den tilldelade experimentella tiden, Välj ”stop” från menyn experiment och exportera resultatet (som CSV-filer, fil > Exportera > generera ämne CSV) för analys.
- Inspektera hälsan hos möss, väger dem och sedan återvända till sina hem burar.
- Möss kan vara fientliga mot varandra efter separation, så övervaka när de är inrymt tillsammans igen.
- Demontera burar, ta bort överskott mat från trattar och spets ut någon avföring, urin och mat från burarna. Dränka flaskor och sippers i utspädda T-bac lösningen, blöt, och rengör de övriga komponenterna i utspätt blekmedel lösning. Skölj med rent vatten och låt luften torr.
- Beräkna metabola parametrar med programvaran. Programvaran använder ett antal ekvationer för att ge de slutliga uppgifter utgång4.
För beräkning av syre och koldioxidutsläppen produktion: syreförbrukning: VO2 (LPM)= VjagO2i - VoO2o; Koldioxid produktion: VCO2 (LPM)= VoCO2o-VjagCO2i
Var: Vjag = ingående ventilation kurs (LPM), Vo = den output ventilation ränta (LPM), O2i = O2 koncentration på ingång, O2o = O2 koncentration på output, CO2i = CO2 koncentration på ingång, CO2o = CO2 koncentration vid utgång.
För beräkning av RER: RER = VCO2 / VO2. Observera att protein oxidation mättes inte och RER justerades därför inte för detta.
För beräkning av energiförbrukning: energiförbrukning: CV = 3.815 + 1.232* RER
Värme (Kcal/h)) = CV * VO2. Var: CV är värmevärdet (förhållandet mellan värme och volymen av syreförbrukning). Detta härrör från ”The element av the Science of Nutrition” avses som tabellen Lusk, består av Graham Lusk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatet ses i figur 3 visas en typisk förändring i kroppen sammansättning parametrar vid hög fett utfodring, mätt via EchoMRI. Vid baseline sågs ingen skillnad i någon parameter mätt (figur 3A-F). Dock efter bara 1 vecka av hög fett utfodring, fanns det en betydande ökning i kroppsvikt, fettmassa och massa fettprocent i gruppen HFD (figur 3A,B,D). Omfattningen av skillnaderna mellan de två grupperna för dessa åtgärder fortsatte att öka under 3 veckors dietary intervention. Muskelmassa, gratis vatten och totala vattenhalten (figur 3 c,E,F) skilde sig inte mellan grupperna vid någon tidpunkt. Det kan också ses som chow matade möss fortsatte att lägga på vikt över studieperioden (figur 3A) och att detta berodde på en ökning i muskelmassa (figur 3 c) i stället för en fettmassa ökar (figur 3B).
Som kan ses i figur 4, ledde tre veckor av hög fett utfodring till ett antal förändringar som upptäcks i metabola djuret övervakningssystem. VO2 när inte justerat för kroppsvikt var signifikant högre i den tyngre hög fett matade möss (figur 4A). Särskilt, resulterade normalisering av VO2 via två olika faktorer i två olika utfall. Normalisering till total kroppsvikt ledde till ingen skillnad i VO2 mellan den standard chow matas och hög fett matade möss, medan normalisering till muskelmassa som en signifikant skillnad (figur 4B,C). Dessa resultat visar att normalisering av VO2 data genom att dividera med massa variabler avsevärt påverkas resultaten, och försiktighet bör iakttas vid tolkning VO2 data när det uttrycks på ett sådant sätt. En detaljerad diskussion om hur man ska uttrycka VO2 data och effekterna av normalisera olika parametrar finns utmärkta diskussionen i Tschop, o.a. 5 i sin guide till analysen av mus energimetabolism, Tschop och kollegor föreslår användningen av analys av samtidig varians (ANCOVA) statistiskt förhöra effekterna av kroppsvikt eller kroppssammansättning på energiförbrukning och mat intag data . I det här fallet avslöjar utför en ANCOVA på de data som visas i figur 4A, med kroppsvikt som kovariat, att det finns ingen statistiskt signifikant skillnad mellan normala chow och HFD, vilket indikerar att när redovisning för kroppsvikt, det finns ingen skillnad i syreförbrukning mellan grupperna. Detta resultat kan enkelt visualiseras när plottning VO2 mot kroppsvikt som ett spridningsdiagram som visas i figur 4 d. Plottning VO2 mot kroppsvikt (figur 4 d) visar att VO2 data ligga på en gemensam linje i förhållande till kroppsvikt, med tyngre djur konsumerar mer syre. Notera visar plottning VO2 mot muskelmassa att VO2 data ligga på två distinkta linjer i förhållande till muskelmassa (figur 4E).
RER var signifikant lägre i hög fett matade möss, som anger fett utnyttjande över kolhydrater utnyttjande när fed high fat diet (figur 5A). Energiförbrukning (värme) utan normalisering ökades i de tyngre djur, sannolikt på grund av djuren har mer metaboliskt aktiva vävnader (figur 5B), med den skillnaden att försvinna en gång normaliserade till kroppsvikt (figur 5 c). Observera också utgiftsökningar VO2, RER och energi i den mörka cykeln jämfört med lätta cykeln när möss är mer aktiv. Dessa skillnader utgör de klassiska dagliga förändringar i ämnesomsättningen som uppstår hos möss. Medan i det här exemplet har vi delat in data i 12 h block, uppdelning av data ytterligare i mindre tidsepoker kan också vara användbart. Fysisk aktivitet är också en faktor som bidrar till energiförbrukning. Dessa skilde sig inte mellan grupperna, vilket tyder på att en minskning av rörelsen inte var föraren av den feta fenotypen i hög fett matade möss (figur 5 d).
Andra sidan av ekvationen energi balans är mängden energi som förbrukas och kommer in i kroppen. För att titta på denna aspekt av metabolism analyserade vi mängden mat som mössen förbrukas medan i metabola djuret övervakningssystem. Som kan observeras i figur 6A, åt mössen samma mängd mat mätt i vikt eller när normaliserade till kroppsvikt (figur 6B). (ANCOVA kan igen användas för att bedöma inverkan av kroppsvikt på matintag.) Normalisering av födointag till kroppsvikt kan vara ett viktigt steg att överväga om energiförbrukning också har varit normaliserad till vikt, därmed hålla varje sida av den energi ekvationen i balans. Medan mössen åt samma mängd mat, är det viktigt att ta hänsyn till energitäthet av var och en av de dieter som används. När hänsyn till denna faktor, vi observerar mössen på den HFD konsumerar mer energi (figur 6 c) och från dessa experiment är det troligt att detta driver den feta fenotypen. Det är, eftersom mössen tar i mer energi, men de inte proportionellt spilla mer energi, deras fetma kan hänföras till energilagring.
Statistik
Alla data i denna uppsats presenteras som medelvärdet ± standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). Statistisk signifikans var inställd på p < 0,05. * indikerar p < 0,05, ** anger p < 0,01, *** indikerar p < 0,001, och n = 6 per grupp om anges. Utredarna kunde inte förblindas till kosten gruppen ingripande på grund av en skillnad i färg av Dieter. Mössen valdes slumpmässigt om vilken diet de fick.
Figur 1 : Korrekt placering av mus kostnader och små djur preparathållaren innehållande möss inom kroppen sammansättning analysatorn. Att utföra en systemtest med en kalibrering standard (kostnader) eller för skanning av möss inom små djur preparathållaren, placera varje inuti utlastningsanordningen av systemet. De röda pilarna visar cylindern där mössen kommer att finnas att ange utlastningsanordningen av maskinen.
Figur 2 : Montering av enskilda avdelningar. (A) placera mat tratten i mitten av balans. B) infoga plattformen i varje kammare och plats kammare över tratten. C) placera möss i kamrarna individuellt och secure lock. D) placera vatten flaskan och fäst.
Figur 3 : Kroppen sammansättning analys över 3 veckor av en high fat diet. (A) kroppsvikt, B) fett massa, (C) lean mass, D) kroppsfett massa procent, E) gratis vatteninnehåll, och (F) totala vattenhalten. Cirklar representerar normala chow kost, rutor representerar HFD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Metabola parametrar erhålls från metabolisk övervakning system djurförsök efter 3 veckor av de respektiva Dieter. Möss var inrymt i kamrarna för 48 h med första 24 h egenskap förtrogenhet. De uppgifter som erhållits från andra 24 h var analyseras och presenteras i dessa siffror. (A) Raw VO2 priser, B) VO2 normaliserade till kroppsvikt C) VO2 normaliserade till muskelmassa, (D) spridningsdiagram för ojusterade VO2 (totalt 24 h period) att kroppen väger, t och E) ojusterade VO2 till muskelmassa. A-C Vita staplarna representerar normala chow kost, svarta staplarna representerar hög fettsnål diet. D-E Cirklar representerar normala chow kost, rutor representerar HFD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : A) respiratoriska utbytesrelation (RER), (B) värme (energiförbrukning), och (C) värme normaliserade till kroppsvikt. D) aktivitetsnivåer beräknas som summan av ambulatorisk X och Y helljus raster och Z balken raster. Vita staplarna representerar normala chow kost; svarta staplarna representerar HFD.
Figur 6 : Mat intag uppgifter i systemet för slutliga 24 h. (A) födointag i gram (B) födointag normaliserade till kroppsvikt och (C) beräknade energiintag. n = 4-5 (3 möss uteslöts på grund av att göra en stor röra med deras mat). Vita staplarna representerar normala chow kost; svarta staplarna representerar HFD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg
De protokoll som beskrivs häri ger ett exempel på sätt att mäta kroppens sammansättning och olika metabola parametrar hos möss med en kropp sammansättning analyzer och en metabolisk djur övervakningssystem. För båda teknikerna är det kritiskt viktigt att säkerställa att maskinerna arbetar optimalt och för att göra detta, är det nödvändigt att forskaren utför ett systemtest för kroppen sammansättning analysatorn och kalibrerar till en känd gassammansättning för den metabola djur övervakning system före användning av utrustningen. Detta kommer att säkerställa större enhetlighet av resultat och möjlighet att upptäcka eventuella problem med maskiner.
Det sättet där data är normaliserat för de metabola övervakning djurförsök är också oerhört viktigt att garantera giltigheten av resultat från tekniken. Som anges i våra representativa resultat (figur 4A-E) VO2 kan rapporteras i ett antal olika sätt: dess absoluta klassar (L/min), i förhållande till kroppsmassa musen (mL/kg * min), eller i förhållande till kroppsmassa (mL/kgLBM * min) om att data är tillgängliga (till exempel erhålls från en kropp sammansättning analyzer). Beroende på fenotypen, kan det vara lämpligare att normalisera värdena ett visst sätt att utesluta någon potentiella bias. Till exempel om ett djur har ökat kroppsmassa, de har mer vävnad som är tillgänglig och kan förbruka syre och deras energiförbrukning är givetvis högre. Normalisera till kroppens totala massa kan inte vara det bästa alternativet som det kommer bias mot observationen av en minskad syreförbrukning per enhet av massa, trots att syreförbrukningen i vävnaderna inte kan vara annorlunda. Som ett alternativ till normalisering till kroppsvikt, kan en normalisera till magra kroppsmassa musen. Som muskelmassa massa är primärt ansvarig för syreförbrukning och muskelmassa är vanligtvis oförändrat eller bara blygsamt olika mellan experimentella grupper, normalisering på detta sätt kan ett mer representativt sätt att uttrycka VO2 data. Det bör noteras att lean mass kupén består av många olika vävnader, alla med olika ämnesomsättning priser, och följaktligen normalisering på detta sätt kan inte vara lämpligt eller ge någon insikt i vilka lean mass komponent driver den ändra. Dessutom utesluter det bidraget från komponenten för fett samlas på ämnesomsättningen.
Med tanke på dessa frågor, har en alternativ statistiskt-baserade metod också föreslagna5,6. Kovariansanalys () ANCOVA) är ett statistiskt begrepp som tillåter jämförelse av en variabel (t.ex. energi utgifter) över flera grupper samtidigt korrigera för andra faktorer eller variabler kallas kovariater. I detta sätt faktorer såsom kroppsvikt, fettmassa och muskelmassa kan ingå som variabler som påverkar energiförbrukningen, men även denna metod har sina egna specifika antaganden6, inklusive det faktum att använda flera variabler i ANCOVA sannolikt ogiltigförklara det om variablerna är oberoende av varandra. Det verkar finnas något perfekt eller universellt överenskomna enda sätt att normalisera och presentera VO2 eller energi utgifter data, kan det vara lämpligt att visa och presentera data i ett antal sätt att ge den tydligaste bilden av fenotypen till läsaren. Fysisk aktivitet kan öka syreförbrukningen, och så i djur som har aktivitet fenotyper (en ökning eller minskning), kan det också vara nödvändigt att konto/normalisera för förändringar i rörelse för att avgöra om detta kan stå helt eller delvis konto för någon förändring i VO2.
Modifieringar och felsökning
De representativa resultat visas i detta protokoll erhölls från experiment som utförs vid en rumstemperatur på 21-22 ° C. Den thermoneutral zonen av en mus är cirka 30 ° C, så i ett traditionellt djurens hus med dess temperatur inställd på 20-22 ° C för mänsklig komfort, sätts en mus under termisk stress. För att motverka detta, aktiveras icke-shivering thermogenesis vid dessa kallare temperaturer, vilket resulterar i upp till en 2-faldig ökning i energiförbrukning mellan möss inrymt vid 20 ° C jämfört med de inrymt på 30 ° C7. Den miljömässiga bostäder av möss är en viktig faktor för dessa experiment som det har visats att inhysa av möss vid thermoneutrality kan potentiera utvecklingen av vissa villkor såsom åderförkalkning8 och hög fett diet-inducerad alkoholfria fettlever (NAFLD) patogenes9. Omgivningstemperatur är därför också en viktig faktor när genomföra experiment i en metabolisk djur övervakningssystem, som en fenotyp kan vara närvarande vid vissa temperaturer men inte på andra, som skulle kunna peka på en potentiell mekanism för åtgärd. Ett sådant scenario skulle kunna vara en fenotyp som involverar aktivering av rekryterade beige fett whereby en större kvantitet av denna vävnad möjliggör en större ökning av thermogenesis under kallare förhållanden10. Således kan det nödvändigt att ändra de miljömässiga Ställ som beskrevs i dessa nuvarande experiment och att utföra experiment under flera miljömässiga temperaturer att få en exakt skildring av verkliga metaboliska status av modellen. För felsökning på grund av tekniska fel, kan man behöva kontakta tillverkarna direkt för instruktioner. Om det finns problem med denna typ av kroppen sammansättning analyzer rekommenderas att utföra en upprepa Analysis test, som kör 25 scannar mot kostnaden. Företaget behöver denna information för diagnostik. Likaså med metabola djur övervakningssystemet, om problem uppstår, samla in de data från den senaste systemet fungerat bra och filerna från när problemen uppstod så att stöd kan göra en sannolik diagnos.
Begränsningar
Medan kroppen sammansättning analyzer ger utmärkt datan på hela kroppen fettansamling, tillåter det inte för bestämning av regionala fett depåer. Detta är viktigt i fetma forskningsområdet, som inte alla fett är den samma, med den plats där fettet har ansamlats och dess funktionella egenskaper som särskilt viktig. De skyddande effekterna av subkutant fett depåer (eller metaboliskt hälsosamt fett) har verkligen varit beskrivs11. Micro-datortomografi (mikro-CT) kan diskriminera mellan underhudsfett och visceralt fett12, som kan magnetisk resonanstomografi (MRT) analys13. Användning av dessa tekniker kan ge ytterligare information om platsen för fett ackumulering. Metaboliska djuret övervakningssystem också har sina begränsningar. Medan totala dagliga energiförbrukningen kan mätas, kan systemet inte skilja mellan de olika komponenterna som utgör energiförbrukning. En ytterligare begränsning av systemet är att det är möjligt att fetma kan utveckla utan att en mätbar minskning av energiförbrukning som upptäckts via dessa typer av system, även oberoende av mat/energi intag förändringar. Studier har visat att små sänkningar av energiförbrukning, vilket är tillräckligt betydande för att orsaka betydande vikt vinna på lång sikt, kraftfullt kan inte upptäckas i sådana metaboliska system över kort sikt14,15, 16. Medan i den aktuella studien har vi använt ett n på 6 per grupp för att demonstrera denna metod som en exempel studie, kräver för att upptäcka små skillnader i energiförbrukningen som kan bidra till fetma sannolikt många fler möss5. Framsteg i resolutionen av detektion i dessa system och förmåga att utföra dessa typer av studier över en längre tidsperiod kommer stödet att förmågan att upptäcka dessa mindre men betydande förändringar. När det gäller mätning av födointag, har vi normalt sett att 24 h födointaget hos möss inrymt i metabola djuret övervakningssystem är lägre än skulle observeras i buren, sannolikt på grund av skäl som diskuterats ovan. Därför, utöver att övervaka födointag i detta system, vi dessutom bedöma matintag i hem burar av möss. Medan detta kan endast göras i en situation där möss från särskilt experimentella grupper är inhysta separat, har det fördelen att nära kontinuerlig daglig bedömning. Prövaren bara väger mängden mat i behållaren vid en angiven tidpunkt på dagen, alltid redovisning av mat utspridda i buren, och dividerar sedan denna totala mängden mat som konsumeras av antalet möss i buren.
Framtida tillämpningar
Medan inom denna översyn har vi använt fetma förvärvat via hög fett utfodring som ett exempel på ett sjukdomstillstånd där mäta kroppssammansättning och metabola parametrar är användbar, användningen av denna utrustning är långt ifrån begränsat till detta forskningsområde. Användningen av dessa tekniker är också värdefull när man studerar sjukdomar som diabetes, hjärt-kärlsjukdom, åldersrelaterade sarcopeni, skröplighet, cancer-kakexi, muskeldystrofier och lipodystrofi. Medan de initiala kostnaderna för inköp av sådan infrastruktur är betydlig, möjligheten att använda utrustningen på flera och olika områden av medicinsk forskning mildrar denna initiala kostnaden. Dessutom är pågående reagens och förbrukningsmaterial kostnader minimal för dessa maskiner; dock måste förebyggande underhåll och service vara ansedd och Budgeterat för.
Precis som muskelmassa som erhållits via kroppen sammansättning analys kan vara en viktig normalisering faktor för syreförbrukning som härrör från metabola djuret övervakningssystem, kan lean mass bestämning också användas att normalisera drogtest/doseringar. Exempelvis i metabola studier är det vanligt att utföra en intraperitoneal eller oral glukostoleranstest (GTT), eller en intraperitoneal insulin tolerans test (ITT). Dessa tester undersöka möjligheten för en mus att avyttra en glukos belastning eller svara på insulin. Förändringar i blodsockernivåerna svar på dessa tester ger information om nivån på hela kroppen glukos och insulin tolerans i modellen. Traditionellt, är glukos och insulin bolus ges i dessa tester doseras enligt kroppsvikt av musen. Dock som modeller av fetma ackumuleras fettmassa över muskelmassa, kunde dosering per kroppsvikt förflytta tyngre modellen mot glukosintolerans i en GTT som de får mer glukos. Detta är på grund av att de lever, skelettmuskel och hjärnan, organ som avyttra majoriteten av glukos i postprandiellt staten17, är delar av lean mass mätningen och sällan eller milt ändra i de flesta modeller. Omvänt, i en ITT när doserades till kroppsvikt, en tyngre modell som skulle få mer insulin kan visas mer känsliga för den glukossänkande effekten av insulin rent eftersom det har fått en större kvantitet. Om Utredaren har tillgång till uppgifter om kroppen sammansättning, kan muskelmassa därför den mest lämpliga åtgärden, i motsats till hela kroppen massan, för sådan dosering beräkningar18. Ta detta vidare, skulle lean massa uppgifter som erhållits från kroppen sammansättning analys också kunna användas att dosera experimentella läkemedel om behovet uppstod till konto för muskelmassa mot uteslutandet av fettmassa. En annan tillämpning av metabola djuret övervakningssystem som inte har diskuterats eller visat i detta manuskript är fästa en medföljande motordrivet löpband till systemet så att de metabola parametrarna diskuteras häri kan också mätas under utöva.
Procedurerna som beskrivs i denna översyn kan användas för att karaktärisera kroppssammansättning och olika metabola parametrar hos möss. Dessa åtgärder är tillämpliga på ett brett utbud av forskningsområden och kan ge viktig information för karakterisering av en fenotyp. Data från dessa metoder kan också ge bevis mot underliggande drivkrafterna bakom en viss metabolisk fenotyp. Ytterligare utveckling och förfining av dessa tekniker kommer att ge forskarna möjlighet att avancera deras resultat mot terapeutiska resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar personalen från Alfred medicinsk forskning och utbildning Precinct Animal Services (AMREP AS) team för deras hjälp och vård av de möss som används i denna studie och för att stödja det operativa infrastrukturen stöder systemet Victorian statens Regeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 in 1 system | EchoMRI | 4 in 1 system | Whole body composition analyser |
| Canola oil test sample (COSTS) | EchoMRI | Mouse-specific (contact company for cat number) | |
| Animal specimen holder | EchoMRI | 103-E56100R | |
| Delimiter | EchoMRI | 600-E56100D | |
| 12 chamber system | Columbus Instruments | Custom built | Metabolic Caging System; includes control program |
| Drierite | Fisher Scientific | 238988 | CLAMS consumable |
| Calibration gas tank | Air Liquide | Mixed to order | Gas calibration (0.5% CO2, 20.5% O2, balance nitrogen). |
| Normal chow diet | Specialty Feeds | Irradiated mouse and rat diet | |
| High fat diet | Specialty Feeds | SF04-001 | |
| Balance | Mettler Toledo | PL202-S | Balance for weighing mice |
| TexQ Disinfectant spray | TexWipe | ||
| Hydrogen Peroxide cleaning solution | TexWipe | TX684 |
References
- Chen, W., Wilson, J. L., Khaksari, M., Cowley, M. A., Enriori, P. J. Abdominal fat analyzed by DEXA scan reflects visceral body fat and improves the phenotype description and the assessment of metabolic risk in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 303 (5), E635-E643 (2012).
- Kovner, I., Taicher, G. Z., Mitchell, A. D. Calibration and validation of EchoMRI whole body composition analysis based on chemical analysis of piglets, in comparison with the same for DXA. Int J Body Compos Res. 8 (1), 17-29 (2010).
- EchoMRI. Software User Manual: Whole body composition analyzer. , (2016).
- Columbus Instruments. Oxymax for Windows User Manual. , September (2014).
- Tschop, M. H., et al. A guide to analysis of mouse energy metabolism. Nat Methods. 9 (1), 57-63 (2011).
- Speakman, J. R. Measuring energy metabolism in the mouse - theoretical, practical, and analytical considerations. Front Physiol. 4, (2013).
- Swoap, S. J., et al. Vagal tone dominates autonomic control of mouse heart rate at thermoneutrality. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (4), H1581-H1588 (2008).
- Tian, X. Y., et al. Thermoneutral housing accelerates metabolic inflammation to potentiate atherosclerosis but not insulin resistance. Cell Metab. 23 (1), 165-178 (2016).
- Giles, D. A., et al. Thermoneutral housing exacerbates nonalcoholic fatty liver disease in mice and allows for sex-independent disease modeling. Nat Med. 23 (7), 829-838 (2017).
- Lee, M. W., et al. Activated type 2 innate lymphoid cells regulate beige fat biogenesis. Cell. 160 (1-2), 74-87 (2015).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity. Nat Med. 18 (10), 1539-1549 (2012).
- Judex, S., et al. Quantification of adiposity in small rodents using micro-CT. Methods. 50 (1), 14-19 (2010).
- Chaurasia, B., et al. Adipocyte ceramides regulate subcutaneous adipose browning, inflammation, and metabolism. Cell Metab. 24 (6), 820-834 (2016).
- Matthews, V. B., et al. Interleukin-6-deficient mice develop hepatic inflammation and systemic insulin resistance. Diabetologia. 53 (11), 2431-2441 (2010).
- Tschop, M., Smiley, D. L., Heiman, M. L. Ghrelin induces adiposity in rodents. Nature. 407 (6806), 908-913 (2000).
- Garcia, M. C., et al. Mature-onset obesity in interleukin-1 receptor I knockout mice. Diabetes. 55 (5), 1205-1213 (2006).
- Kowalski, G. M., Bruce, C. R. The regulation of glucose metabolism: Implications and considerations for the assessment of glucose homeostasis in rodents. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (10), E859-E871 (2014).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297 (4), E849-E855 (2009).
