Summary
تقدم هذه الدراسة أرنب تحسين نموذج المصابين المكوّرات العنقودية الذهبية التي تسد نفس الكمية من البكتيريا في نخاع العظام. تستخدم كبريتات الكالسيوم فانكومايسين تحميل والعظام الغازي للعلاج إصلاح المضادات الحيوية والعظام. البروتوكول يمكن أن تكون مفيدة لدراسة عدوى العظام والتجدد.
Abstract
التهاب العظام نتيجة لغزو البكتيريا، وصعبة للغاية لعلاج في الجراحة السريرية، والعظام، والصدمة. قد يؤدي التهاب العظام التهاب مستمر والتهاب العظم والنقي وغير العظام في نهاية المطاف الاتحاد. إنشاء نموذج الحيوان مجدية واستنساخه من المهم أن العظام بحوث العدوى والعلاج بالمضادات الحيوية. كنموذج في المجراة، نموذج أرنب يستخدم على نطاق واسع في بحوث التهاب العظام. ومع ذلك، العظام الدراسات السابقة على أرنب العدوى نماذج تبين أن حالة الإصابة غير متناسقة، كما كانت كمية البكتيريا متغير. تقدم هذه الدراسة طريقة جراحية محسنة لحمل عدوى العظام في أرنب، بحظر هذه البكتيريا في نخاع العظام. ثم، يمكن أن يكون إجراء تقييمات متعددة المستويات للتحقق من أسلوب النمذجة.
وبصفة عامة، النسيج المتنخر ديبريدينج وغرس كبريتات الكالسيوم محملة الفانكوميسين (فكس) الغالبة في العلاج بالمضادات الحيوية. على الرغم من أن فوائد سلفات الكالسيوم في فكس أوستيوسيتي الزحف ونمو العظام الجديدة، تحدث تشوهات العظام الضخمة بعد ديبريدينج. عظم الغازي (AB) استراتيجية جذابة للتغلب على عيوب العظام لعلاج تشوهات العظام الضخمة بعد ديبريدينج العظام نخرية.
في هذه الدراسة، استخدمنا عظم الذيل عظم الغازي مزروع في خلل العظام. إصلاح العظام كانت تقاس باستخدام مايكرو-المحسوبة-التصوير المقطعي (الصغرى-ط) والتحليل النسيجي بعد التضحية بالحيوان. نتيجة لذلك في مجموعة فكس، دأبت حصلت غير العظام الاتحاد. على النقيض من ذلك، كانت المناطق عيب العظام في المجموعة فكس-آب انخفض كثيرا. ووصف أسلوب النمذجة الحالي أسلوب استنساخه، عمليا، مستقرة بإعداد نموذج عدوى العظام. معاملة فكس-آب أدى إلى انخفاض معدلات غير الاتحاد العظام بعد العلاج بالمضادات الحيوية. نموذج عدوى العظام محسنة ومعاملة تركيبة فكس والعظام الغازي يمكن أن تكون مفيدة في دراسة الآليات الكامنة في العظام العدوى والعظام التجدد ذات الصلة بالتطبيقات الكسور العظمية.
Introduction
وعادة ما يؤدي التهاب العظام من البكتيريا أو غزو الكائنات الدقيقة الأخرى بعد الصدمة أو كسور العظام أو أمراض العظام الأخرى1. قد تؤدي الإصابة العظام على مستوى عال من تدمير الأنسجة والتهاب العظام. في العيادة، المكوّرات العنقودية الذهبية (S. aureus) هو المسبّب الرئيسي2،التهاب العظام3. التهاب العظام مؤلمة، المنهكة، وغالباً ما يأخذ دورة مزمنة التي صعبة للغاية لعلاج4. وفي الوقت الحاضر، قد تأكدت debridement أنسجة نخرية وغرس من حبات الكالسيوم محملة الفانكوميسين (فكس) كاستراتيجية فعالة للسيطرة على العدوى المحلية5،6. ومع ذلك، شهدت 10% إلى 15% مرضى عملية إصلاح العظام الطويلة، وتأخر الاتحاد أو غير الاتحاد بعد العلاج المضادة العدوى7. الجزء الكبير من خلل العظام هي المسألة الأكثر صعوبة لجراحي العظام. يعتبر الفساد العظام ذاتي استبدال العظام الأمثل في العظام العلاج غير الاتحاد8،9.
وحتى الآن، معظم الدراسات على العظام أجريت العدوى وغرس العظام ذاتي في أنواع مختلفة من نماذج حيوانية، مثل الفئران، الأرانب والكلاب والخنازير والأغنام10،11. نماذج الأرانب هي الأكثر شيوعاً لدراسات عدوى العظام، كأول يؤديها بلدان الشمال وكنيدي في عام 197012،13. في دراستنا السابقة، قمنا باستخدام نماذج أرنب اتباع الأسلوب في بلدان الشمال، ووجدنا أن الكمية في المذهبة س. حقن نخاع العظام يمكن لا يمكن تحديده كمياً بدقة، كما تسرب الدم من النخاع العظمى أدى إلى تجاوز الحل البكتيريا.
تقدم هذه المقالة طريقة جراحية محسنة لحمل عدوى العظام في الأرانب. في نهاية هذا الإجراء، أجريت اختبار الكيمياء حيوية في دم، وإجراء فحص البكتريولوجية، وإجراء فحص الأنسجة التحقق من نموذج عدوى العظام. ثم، كان مزروع فكس لمنع العدوى، وكان مزروع العظام الغازي لتعزيز تجديد العظام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وعولج الأرانب المستخدمة في هذه الدراسة وفقا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. وأعقب كل الإجراءات التجريبية القواعد "أخلاقيات اللجنة من تشجيانغ أكاديمية للطب الصيني التقليدي".
1-إعداد تعليق البكتيرية
- حل 0.5 ملغ المذهبة س. التجميد مسحوق (ATCC 6538) مع 0.3 مل من لوريا بيرتاني الثقافة المتوسطة. مزيج تعليق تماما.
- متتالية بتعليق البكتيريا على فول الصويا تريبتيك أجار لوحات واحتضان المستعمرات البكتيرية في 37 درجة مئوية ح 16.
- حدد مستعمرة بكتيرية واحدة تشكيل وحدة (زيمبابوي) والثقافة في أنابيب مرق الصويا تريبتيك ل 24 h. تنفيذ ثقافة فرعية لحوالي 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، والحصول على النمو منتصف لوغاريتمي البكتيريا المرحلة بعد 16 إلى 18 ساعة، عندما تكون قيمة الكثافة البصرية (OD) 0.6 في 600 نانومتر 14.
- نقل 1 مل تعليق البكتيريا في أنبوب الطرد مركزي. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 825 x ز و 4 درجات مئوية، وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند وغسل البكتيريا مع 100 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)؛ كرر هذه الخطوة 3 مرات. وأخيراً، ريسوسبيند البكتيريا مع 3 مل من برنامج تلفزيوني.
-
تقدير تركيز البكتيريا تستخدم في مكفارلاند توربيديميتري15.
- نقل 100 إلى 500 ميليلتر من تعليق البكتيريا إلى أنبوب اللونية حتى التعكر ما يعادل 0.5 ماكفارلاند قياسية.
- تقييم التعكر بالمقارنة البصرية إلى 0.5 ماكفارلاند، عندما يصل محتوى البكتيريا إلى ما يقرب من 108 زيمبابوي/مل.
ملاحظة: تأكد من أن حجم تعليق البكتيريا كافية للبروتوكولات التالية. لكل أرنب، حجم تعليق البكتيريا أقل من 1 مل.
- نقل 0.2 مل تعليق البكتيرية لصفيحة أجار وتطبيقه بشكل متساو. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية حاء 16 عدد مستعمرات البكتيريا للتحقق من زيمبابوي لتعليق البكتيريا.
2-إعداد نماذج الإصابة العظام
- تبقى الذكور نيوزيلندا أرانب بيضاء، الذين تتراوح أعمارهم بين 3 أشهر، في أقفاص فردية، في ظل الظروف التي تسيطر على الهواء (20 ± 1 درجة مئوية) ودورات إضاءة الضوء الظلام ح 12/12 ساعة. يوفر النظام الغذائي الروتيني والاستفادة من المياه يوميا.
- تأكد من أن وقت الجراحة أن الأرنب يزن أكثر من 3 كجم.
- تخدير الأرانب عن طريق الحقن داخل مع الصوديوم بينتوباربيتال (3 ملغ في كل 100 غرام وزن الجسم). تأكد من أن يتم تخديره الأرانب تماما بعدم الاستجابة إلى رشة مخلب. إصلاح الأرانب على طاولة العمليات أثناء إجراء العملية.
ملاحظة: تأكد من أن النمذجة مدة الإجراء أقل من 1 ح. - حلق المنطقة الدانية الساق باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية ضد اتجاه نمو الشعر. تطهير الجلد بتطبيق حل بوفيدون.
- علامة نهاية العلوي من الساق وموضع ثقب الحفر للحقن مع S. aureus (المسافة إلى نهاية العلوي من الساق 1.5 سم) مع القلم والمسطرة. تأكد من مواقف ثقب الحفر في وسط هضبة قصبي أفقياً (الشكل 1أ).
- قطع الجلد الساق باستخدام مشرط رقم 11 وجعل شق 1 سم في السمحاق (الشكل 1ب، ج). لكمه في حفرة قطرها 2 ملم في الساق باستخدام وحدة حفر عظم كهربائية (الشكل 1د).
- اضغط ثقوب قطرها 2 مم في هضبة قصبي مع اسطوانة شمع العظام قطرها 2 مم والارتفاع 2 مم (الشكل 1ﻫ). إزالة الشمع العظام قطع الغيار على طول الطائرة الأفقي من هضبة قصبي (الشكل 1و). تحقق من أن ثقب 2 مم كامل عظم الشمع (الشكل 1ز).
ملاحظة: التأكد من وجود الثقوب كاملة من الشمع العظام عن طريق التحقق من الحفرة مع أو بدون تجاوز الدم. - خياطة تصل السمحاق والجلد بخياطة جراحية قابلة للامتصاص في خياطة مفرش رأسية لمنع الحيوان من مضغ خياطة الجروح (الشكل 1ح).
- حقن 1 × 108 زيمبابوي/مل حلول المذهبة س. (30 ميليلتر في كل 100 غرام وزن الجسم) مع نظام حقن أسيبسيس 1 مل (الشكل 1أنا). تأكد من أن تخترق الشمع العظام الإبر وحقن في المذهبة س الحل في نخاع العظام ببطء.
- إبقاء الحيوانات في ظروف دافئة ونظيفة لتجنب فقدان الحرارة بعد وضع النماذج. رصد معدل التنفس ومعدل ضربات القلب. وبعد الاستيقاظ، بيت الأرانب في أقفاص فردية مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء.
3-تقييم نموذج عدوى العظام
- في أيام 7، 14 و 21 و 28 بعد الإصابة، ضع الأرانب إلى المثبت أرنب مع الرأس والإذن خارج المثبت.
-
رسم 2 مل دم من الأوردة إذني في وعاء التخثر دم (يدتا-K2) حمض ديبوتاسيوم الإيثيلين. رسم 1 مل دم من الأوعية الدموية في وعاء دم. الطرد المركزي في المصل لمدة 10 دقيقة مع سرعة من 651 x ز في درجة حرارة الغرفة.
- تحديد عدد خلايا الدم البيضاء (WBC) في استخدام محلل بيوكيميائية دم الدم كله، والاعتداء بروتين سي التفاعلي (CRP) الممتز المرتبط بالانزيم (إليزا) الأسلوب16.
- في أيام 7، 14 و 21 و 28 بعد الإصابة، تخدير الأرنب نموذج واحد مع الصوديوم بينتوباربيتال في جرعة 3 ملغ لكل 100 غرام من وزن الجسم. قطع الجلد الساق باستخدام مشرط رقم 11 وجعل شق 2 سم في السمحاق (الشكل 2أ).
- تنظيف الشمع العظام. ديبريدي نخرية العظام باللكم ثقبين قطر المجاورة 4.8 مم استخدام وحدة حفر عظم كهربائية (الشكل 2ب). ديبريدي نخرية نخاع العظام والأنسجة تحبيب استخدام ملعقة العظام (الشكل 2-ج).
ملاحظة: تنظيف الأنسجة العظام أثناء ديبريديمينت لتجنب النسيج العظمى المتبقية في نخاع العظام. - كشط وتنظيف الأنسجة العظام بين اثنين من الثقوب (الشكل 2د).
- انتشار 1 مل نخاع العظام على لوحات أجار الدم الأغنام. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. حدد لوحات من 30-300 مستعمرة، وحساب عدد المستعمرات.
- في نهاية يوم 28 بعد الإصابة، استخراج العينات الساق على طول حواف مفاصل الركبة والكاحل. إصلاح العينات الساق في بارافورمالدهيد 4% ل 24 h. ديكالسيفي العينات الساق في يدتا 10% لمدة 8 أسابيع.
- يذوي العينات الساق في سلسلة متدرجة من تخفيف الإيثانول، وقم بتضمين في شمع البارافين. قطع المقاطع ميكرومتر 5 4 على التوالي من الطائرات الاكليلية. وصمة عار الأقسام مع الهيماتوكسيلين وويوزين عدة المصبوغة (H & E).
- استخدام مجهر لعرض المقاطع الملون وتسجيل الصور الخفيفة المنقولة مع البرامج القياسية.
4-إعداد حبات فكس
- إضافة 1 غ مسحوق هيدروكلوريد فانكومايسين إلى 9.5 غرام كبريتات الكالسيوم الصف الطبية ومن ثم أضف 3 مل من المحلول الملحي العادي لقوة مختلطة. خلطهما جيدا مع ملعقة ل 30 إلى 45 ثانية.
- ضع المنتج مختلطة في العفن مرن السليكا هلام (اسطوانة قطرها 4.8 مم وارتفاع 4.8 ملم)، وجاف في درجة حرارة الغرفة لإزالة 15 دقيقة الخرز فكس بالثناء العفن.
5-المضادات الحيوية العلاج وغرس العظام الغازي
- تخدير الأرانب النموذجية مع الصوديوم بينتوباربيتال في جرعة 3 ملغ لكل 100 غرام من وزن الجسم في اليومال 28 بعد الإصابة. حلق المنطقة الدانية الساق باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية. تطهير الجلد بتطبيق الحل بوفيدون.
ملاحظة: تأكد من أن الإجراء النمذجة أقل من 1 ح. - منطقة الذيل استخدام ماكينة حلاقة كهربائية للحلاقة وتطهير الذيل بتطبيق الحل بوفيدون.
- قص أسفل الذيل باستخدام مقص جراحي. قطع ذيل الجلد باستخدام مشرط رقم 11، وتكشف عن عظم الذيل. خياطة حتى الجلد في منطقة الذيل مع خيوط جراحية قابلة للامتصاص في خياطة مفرش رأسي لمنع الحيوان من مضغ خياطة الجروح.
- قم بإزالة أي العضلات والأنسجة اللينة والسمحاق. فصل في عظم الذيل في كل مشترك ونقل يفتت العظام إلى طبق بلاستيك 100 ملم التي تحتوي على المحلول الملحي المعقم.
- زرع 4 قطع من حبات فكس (اسطوانة قطرها 4.8 مم والارتفاع 4.8 مم، 1.25 ملغ فانكومايسين كل قطعة من حبة) في تجويف نخاع استخدام الملقط المنحنى (الشكل 2ه).
- ملء عيب العظام مع 8 قطع من عظام الغازي (اسطوانة قطرها 2 مم والارتفاع 4 مم لكل قطعة) باستخدام منحنى ملاقط (الشكل 2ه).
- خياطة تصل السمحاق والجلد بخيوط جراحية قابلة للامتصاص بطريقة خياطة مفرش (الشكل 2و).
ملاحظة: الحفاظ على درجة حرارة 25 درجة مئوية خلال الجراحة. - إبقاء الحيوانات في ظروف دافئة ونظيفة لتجنب فقدان الحرارة بعد الجراحة. رصد معدل التنفس ومعدل ضربات القلب. وبعد الاستيقاظ، بيت الأرانب في أقفاص فردية مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء.
6-تقييم نشاط المضادات الحيوية
- وضعت المثبت أرنب الأرانب، ووضع الرأس والإذن خارج يتدخل في 2، 4 و 6 و 8 أسابيع بعد العلاج.
- سحب الدم من الأوردة إذني مع الأوعية الدموية التخثر أدتا K2. رسم 1 مل دم من الأوعية الدموية في وعاء دم. الطرد المركزي في المصل لمدة 10 دقيقة مع سرعة من 651 x ز في درجة حرارة الغرفة.
- تحديد عدد خلايا الدم البيضاء (WBC) في الدم كله باستخدام محلل البيوكيميائية في الدم، وبروتين سي التفاعلي (CRP) بواسطة طريقة أليسا16.
7-تقييمات لتجديد العظام
- Euthanize الأرانب بالحقن مع أكثر لجرعات صوديوم بينتوباربيتال، في نهاية 8 أو 12 أسبوعا بعد العلاج.
- استخراج العينات الساق، على طول حواف مفاصل الركبة والكاحل. ديبريدي العضلات وطبقات اللفافي.
- تحليل بنية الساق باستخدام التصوير المقطعي المحسوبة الدقيقة (الصغيرة-CT). اختر 4.8 مم منطقة بيضاوية و 9.6 مم طويل كالمنطقة للفائدة (العائد على الاستثمار). إعادة بناء الصور نموذج ثلاثي الأبعاد باستخدام بيانات الصورة النقطية.
- اختر عشرات نسبة حجم وحدة التخزين/الأنسجة العظام (BV/TV)، سمك ترابيكولار (Tb.Th)، ترابيكولا رقم (Tb.N) وفصل ترابيكولار (Tb.Sp)from the3D نماذج لتقييم تجديد العظام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تقييم نموذج عدوى العظام
بعد الإصابة المكوّرات س.، المظاهر المرضية للأرانب كانت مشابهة لأعراض التهاب العظم والنقي المزمن في العيادة الممثل. في دراستنا، الأرانب 30 إصابة، وتعرض كمجموعة نموذجية، وتعرض 10 أرانب كمراقبة الحيوانات. جميع الأرانب النموذجية قد إصابة الجيوب الأنفية موقع محلي الساق، مع صديد الأبيض والأصفر على تدفق من الجيوب الأنفية (الشكل 3أ). نتائج تلطيخ ح & ه تشير إلى أن المجاميع البكتيرية الموجودة حول العظام الميت في المجموعة النموذجية، وأوستيوسيتيس العادي لا يمكن تحديده. مستويات البروتين ومكافحة حرائق آبار النفط، أعلى في المجموعة النموذجية من السيطرة على المجموعة (الشكل 3ب). هي السنة اللهب أثناء ليساتيس نخرية نخاع العظام في لوحات أجار، مما يؤدي إلى زيادة عدد من المستعمرات لمجموعة نموذج بعد الإصابة (الشكل 3ج). في نهاية النمذجة، كانت هناك أرانب 3 قتلى بسبب الإصابة الخطيرة. الأرانب المصابة المتبقية وحددت كنموذج عدوى العظام، وقسمت إلى ثلاث مجموعات: نموذج المجموعة والمجموعة فكس فكس-AB المجموعة.
تقييم نشاط المضادات الحيوية والتجدد العظام
2، 4، 6، و 8 أسابيع بعد العلاج مع فكس أو فكس-AB، تنخفض مستويات البروتين ومكافحة حرائق آبار النفط إلى حد كبير (الشكل 4أ). بعد 12 أسبوعا غرس فكس و allograft العظام، يبدو أن العيوب قصبي الفريق VCS-آب كواليسسينت تماما. الأسطح هضبة قصبي مجموعة AB فكس أبسط من ذلك الفريق فكس. إعادة الإعمار في 2D الصور تشير إلى زيادة مطردة في حجم العظام خلال فترة 12 أسبوع بعد العلاج مع فكس-آب وفكس، بينما فقدان العظام مهم في المجموعة النموذجية (الشكل 4ب). لتحليل الفهارس الكمية التجدد العظام، اختيرت منطقة بيضاوية 4.8 مم وطويلة 9.6 ملم كالمنطقة للفائدة (ROI) (الشكل 4ج)، وأعيد الصور نموذج ثلاثي الأبعاد باستخدام بيانات الصورة النقطية. الفهارس الدقيقة-CT BV والتلفزيون في المجموعة النموذجية كانت أقل بكثير من أن في فكس فكس-آب والمجموعات. عشرات Tb.N و Tb.Th في مجموعة وحدات VC-آب كانت أعلى بكثير من تلك الموجودة في النموذج ومجموعة فكس. وعلاوة على ذلك، عشرات Tb.Sp في مجموعة وحدات VC-AB أدنى بشكل ملحوظ من ذلك في المجموعة النموذجية وفريق فكس (الشكل 4د).
هذه النتائج تشير إلى أن الإصابة المكوّرات س. أسباب زيادة مكافحة حرائق آبار النفط والبروتين في المجموعة النموذجية، التي يمكن تقليلها باستخدام وحدات VC. ويعتبر غرس فكس العلاج الأمثل بالمضادات الحيوية. بيد أن عيب العظام يمكن ملاحظتها في المجموعة فكس. فكس وعلاج العظام الغازي زيادة سمك ترابيكولاي ورقم ترابيكولاي ونقصان فصل ترابيكولار. وأظهرت معاملة فكس-آب القدرة لتعزيز شفاء العظام.
الشكل 1 . إعداد نموذج عدوى العظام الجراحية. (أ) يظهر اللكم موقف على الساق. المسافة بين موضع ثقب الحفر للحقن مع س المذهبة لنهاية العلوي من الساق هو 1.5 سم. (ب) إجراء شق في الجلد لفضح في السمحاق. (ج) يظهر شق عن طريق السمحاق كشف الساق. (د) لكمه حفرة قطرها 2 ملم في الساق. (ﻫ) تعبئة حفرة قطرها 2 مم كاملة من الشمع العظام. (و) قطع الشمع العظام قطع الغيار. (ز) إظهار الشمع العظام سد خلل العظام. (ح) خاط السمحاق والجلد. (أنا) الإدخال مع الحل س المذهبة . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . التحضير لعلاج العظام allograft، والمضادات الحيوية- (أ) شق في الجلد لفضح السمحاق. (ب) لكمه ثقوب قطرها ملم 4.8 المجاورة اثنين. (ج) ديبريدي نخرية العظام والتهاب نخاع العظام. (د) كشط وتنظيف الأنسجة العظام بين اثنين من الثقوب جعل دائرة قطرها 4.8 مم طويل وطويلة 9.6 ملم. (ﻫ) ملء الحفرة مع فكس والعظام allograft. (و) خاط السمحاق والجلد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . تقييم نموذج عدوى العظام. (أ) سمات مظهر الساقين أرنب المصابين في المذهبة س.، وصور الأنسجة نموذجي الساق الأرنب في المجموعات النموذجية والتحكم. السهم الأزرق: أوستيوسيتي؛ السهم الوردي: العظام trabeculae؛ السهم الأصفر: المجاميع البكتيرية؛ السهم الأخضر: الميت العظام. (ب) مكافحة حرائق آبار النفط والبروتين ينتج المصل الأرنب في نقاط زمنية من قبل النمذجة، 7، 14 و 21 و 28 يوما بعد الإصابة. تمثل الأعمدة ±SE يعني، *p < 0.05 مقابل السيطرة على المجموعة. (ج) حساب عدد المستعمرات البكتيرية في نخاع الساق بعد الحضانة بين عشية وضحاها. تمثل الأعمدة ±SE يعني، *p < 0.05 مقابل المستعمرة العد في اليوم 0. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . تقييمات لتجديد النشاط والعظام المضادات الحيوية- (أ) نتائج مكافحة حرائق آبار النفط والبروتين في المصل الأرنب في النقاط الزمنية من 2، 4 و 6 و 8 أسابيع بعد غرس فكس ووحدات VC-AB، والنقاط التي تمثل متوسط ±SE، #ف < 0.05 و *ف < 0.05 مقارنة بالمجموعة النموذجية. الصور (ب) قسم الاكليلية من الساق تحليلها بواسطة الصغرى-قيراط (ج) الموقع من العائد على الاستثمار. حجم وحدة التخزين/الأنسجة (د) رسوم بيانية تظهر العظام (BV والتلفزيون) وسمك ترابيكولار (Tb.Th) وعدد ترابيكولا (Tb.N) وعشرات فصل ترابيكولار (Tb.Sp) من عائد الاستثمار من الأرانب خمسة في كل مجموعة. تمثل الأعمدة ±SE يعني، *p < 0.05 مقابل نموذج أو مجموعة عنصر التحكم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . الجدول الزمني لجميع الإجراءات- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وشيدت في الدراسات السابقة، أنواع مختلفة من نماذج حيوانية لدراسة كلا من عدوى العظام الحادة والمزمنة؛ ومع ذلك، لا تزال قائمة البحث عن النموذج المثالي17،18. وبالإضافة إلى ذلك، يتوقع نموذج عدوى العظام المثالي لمحاكاة الخصائص المرضية للعدوى العظام في الإعداد السريرية، أثناء فترات النمذجة، وتظل منخفضة التكلفة وسهلة للقيام. حتى الآن، هو نموذج عدوى العظام أرنب النموذج الأكثر شيوعاً في بحوث مرض التهاب العظام، كما الأرانب تكون متاحة وممكنة وغير مكلفة. في دراستنا السابقة، يمكننا مقارنة بمعدل الوفيات ومعدل الإصابة من الأرانب بأوزان الجسم متفاوتة. وأظهرت النتائج أن وزن الجسم أكثر من 3 كغ؛ خلاف ذلك، يكون هناك ارتفاع معدل الوفاة أو نسبة عالية من هايماتوسيبسيس وارتفاع معدل وفيات بعد الجراحة.
وخلافا لدراسات سابقة، أرنب العظام نماذج الإصابة والعلاج بالمضادات الحيوية في هذه الدراسة تتسق مع الخصائص المرضية للأمراض البشرية والعلاج الجراحي. في الدراسة السابقة، والحيوانات حقن مورهواتي صوديوم و المذهبة س. لم يكن لدى حالة مرضية أكثر من 60 يوما. وعلاوة على ذلك، كان معدل الوفيات أكثر من 20%12،19. ثبت تجاوز الحل المذهبة س. من عيوب العظام للحث معدل إصابة منخفض. استخدمنا الشمع العظام لملء الحفرة 2 ملم في الساق، بغية عرقلة الحل س المذهبة في نخاع العظام وضمان أن الثقوب كانت مليئة بالشمع العظام عن طريق التحقق من الحفرة مع أو بدون تجاوز الدم. كما كان سمك الساق أرنب 2 مم، يمكننا الضغط على اسطوانة قطرها 2 مم والارتفاع 2 مم العظام الشمع إلى ثقوب قطرها 2 مم، التي كفلت الشمع العظام ملء الحفرة ولا يمكن التسلل إلى نخاع العظام. وعلاوة على ذلك، كما كان الشمع العظام مرنة ومستقرة، أنها مليئة الثقوب ويمكن أن لا تذوب أو تتفاعل مع نخاع العظام. في دراستنا، وفي اليوم الثامن والعشرين بعد الإصابة، الشمع العظام لا تزال كاملة ومليئة الثقوب تماما. كذلك أوزان الأرانب أكثر من 3 كجم وأقل من 3.2 كجم، وكان حجم تعليق البكتيريا ميليلتر 900 إلى 960 ميليلتر. بسبب بطء سرعة الحقن وحظر وظيفة الشمع العظام، يمكن حقن هذا الحجم من تعليق البكتيريا في نخاع العظام دون الضغط العالي. وأظهرت النتائج أن هذا البروتوكول يضمن كمية S. aureus المصابة في نخاع العظام. وكان لكمات حفرة قطرها 2 ملم في الساق التأكد من أن المسافة إلى نهاية العلوي من الساق هو 1.5 سم، الذي يحدد موقع الثقب في هضبة قصبي، ضمان توفير حيز كاف ديبريدي وزرع فكس الخرز والعظم الغازي في المعاملة التالية. وخلال عملية وضع النماذج، توفي الأرانب 3 بسبب الإصابة الخطيرة. الأرانب ما زالت الأرانب عدوى العظام، وأن معدل الإصابة في الأرانب المتبقية كانت 100%. مقارنة مع البروتوكولات الأخرى عدوى العظام، مثل زرع الأسفنج غارقة في المذهبة س أو غرس هذه المسألة الخارجية، لدينا بروتوكولات عن كثب محاكاة عدوى العظام في الإعداد السريرية، ويكون لها أثر يذكر على الإجراءات، مثل ديبريدينج نخرية العظام والعلاج بالمضادات الحيوية.
تشخيص العدوى العظام يمثل تحديا للجراحين. واستخدمت نتائج اختبار المختبر، بما في ذلك الكشف عن علامة التهاب المصل والتحليل الميكروبيولوجي وتحليل الأنسجة لتقييم التهاب العظام في إعدادات السريرية20. أيضا، قد طبقت التصوير التشخيصي، مثل الموجات فوق الصوتية، والأشعة، التصوير المقطعي، التصوير بالرنين المغناطيسي أو رامان الطيفي للكشف عن الإصابة بالعظام21. ولسوء الحظ، تشخيص التهاب العظم والنقي من خلال أساليب التصوير غالباً ما يتأخر سبب نخر العظام difficult للكشف عن طريق التصوير الشعاعي العادي حتى الأسبوع الثالث من العدوى. في دراستنا، استخدمنا مصل التهاب علامة تحليل الكشف والتشريح المرضى لتقييم نماذج عدوى العظام، كما أن هذه الأساليب كانت فعالة، وقابلة للتشغيل، والفهارس كانت حساسة. من أهم خطوات العملية الجراحية لإنشاء نموذج عدوى العظام في دراستنا ما يلي. اختر الأرانب مع وزن الجسم المناسب لإجراء الجراحة والعلاج. الحفاظ على بيئة معقمة أثناء الإجراءات الجراحية وزيادة، وضمان الظروف الحارة بعد البروتوكول إجراء العمليات الجراحية. لكمه حفرة قطرها 2 ملم في الساق، والتأكد من المسافة إلى نهاية العلوي من الساق هو 1.5 سم. ملء الحفرة مع الشمع العظام، وخياطة السمحاق والجلد من أجل عرقلة الحل البكتيريا. وفيما يلي أهم الخطوات للعلاج بالمضادات الحيوية. ضمان العدوى المرضية العظام من الأرانب عن طريق الكشف عن مكافحة حرائق آبار النفط في الدم كله والبروتين في المصل. ديبريدي نخرية العظام تماما ولكمه ثقبين قطر المجاورة 4.8 مم وكشط وتنظيف الأنسجة العظام بين الثقوب 2. زرع 4 قطع من حبات فكس و 8 قطعة من العظام الغازي في نخاع العظام وخلل العظام.
بعد العلاج بالمضادات الحيوية، لاحظنا أن الأرانب في المجموعة AB فكس تنطوي على إمكانيات osteogenic أعلى من ذلك في مجموعة فكس. قد يكون هذا لعظم الغازي يحتوي على أوستيوسيتيس المنشط وعوامل النمو تشكيل العظام، التي تنتج مصفوفة العظام في جميع أنحاء سطح الاختلاس، بينما يدفع تدهور فكس نادرة العظام مصفوفة في منطقة عيب. نتائجنا تشير إلى أن العظام الغازي لديها القدرة osteogenic متفوقة. على الرغم من الحصاد العظام الغازي محدودة في الحجم ويستتبع الاعتلال إلى الموقع الجهات المانحة، أهمية العظام الغازي لا تذكر22،،من2324. وفي دراستنا، حصل عظم الغازي من عظم الذيل، الذي يتجنب الإصابة الجهازية، ويقلل من معدل الوفيات بالمقارنة مع اكتساب العظام الغازي من العظم الحرقفي. عظم أوتوجرافت من عظم الذيل قد يكون مواد التطعيم المفضل في دراسة الحيوان من الإصابة بالعظام.
وفي الختام، أنشئ نموذج أرنب محسنة لالتهاب العظام في هذه الدراسة. التهاب والفهارس الدم البيوكيميائية استخدمت لتقدير النموذج التهاب العظام. أيضا، بعد العلاج بالمضادات الحيوية، متعدد المستويات أجريت تحليلات للكشف عن المضادات الحيوية النشاط وعظم القدرة على التجدد. النمذجة، وبروتوكولات العلاج وطرق التقييم ممكنة ويمكن الاعتماد عليها. سوف تركز إجراء المزيد من الدراسات على الاستفادة من أسلوب متعدد الأجهزة البصرية لرصد عملية مرضية لعدوى العظام وعملية إصلاح العظام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
واضعي التقرير لا تضارب في المصالح في هذا العمل.
Acknowledgments
وكان يدعمها هذا العمل الوطني العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (81803808, 81873062)، ومقاطعة تشجيانغ الطبية والعلوم الصحية وصندوق التكنولوجيا (2017KY271) والعلوم ومشروع التكنولوجيا لمقاطعة تشجيانغ (37181 2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| absorbable surgical suture | Jinghuan | 18S0604A | |
| asepsis injector | Jinglong | 20170501 | |
| bone wax | ETHICON | JH5CQLM | |
| CCD camera | Olympus | DP72 | |
| EDTA-K2 anticoagulant blood vessel | XINGE | 20170802 | |
| Electric bone drill unit | Bao Kang | BKZ-1 | |
| Electric shaver | Codos | 3800 | |
| flexible silica gel mold | WRIGHT | 1527745 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Beyotime | 20170523 | |
| Luria-Bertani culture medium | Baisi Biothchnology | 20170306 | |
| Medical-grade calcium sulphate | WRIGHT | 1527745 | |
| microcomputed tomography (micro-CT) | Bruker | SkyScan 1172 | |
| Microscope | Olympus | CX41 | |
| New Zealand white rabbits | Zhejiang Experimental Animal Center | SCXK 2014-0047 | |
| No. 11 scalpel | Yuanlikang | 20170604 | |
| normal saline | Mingsheng | 20170903 | |
| PBS | TBD(Jingyi) | 20170703-0592 | |
| pentobarbital sodium | Merk | 2070124 | |
| povidone-iodinesolution | Lierkang | 20170114 | |
| S. aureus freeze drying powder | China General Microbiological Culture Collection Center | ATCC 6538 | |
| sheep blood agar | HuanKai Microbial | 3103210 | |
| tryptic soy agar plates | HuanKai Microbial | 3105697 | |
| tryptic soy broth tubes | HuanKai Microbial | 3104260 | |
| Vancomycin | Lilly | C599180 |
References
- Malizos, K. N. Global Forum: The Burden of Bone and Joint Infection: A Growing Demand for More Resources. Journal of Bone and Joint Surgery-American Volume. 99, 20 (2017).
- Peeters, O. Teicoplanin - based antimicrobial therapy in Staphylococcus aureus bone and joint infection: tolerance, efficacy and experience with subcutaneous administration. BMC Infectious Diseases. 16, 622 (2016).
- Sugaya, H., et al. Percutaneous autologous concentrated bone marrow grafting in the treatment for nonunion. European Journal of Orthopeadic Surgery and Traumatology. 24, 671-678 (2014).
- Birt, M. C., Anderson, D. W., Bruce, T. E., Wang, J. Osteomyelitis: Recent advances in pathophysiology and therapeutic strategies. Journal of Orthopeadics. 14, 45-52 (2017).
- Walter, G., Kemmerer, M., Kappler, C., Hoffmann, R. Treatment algorithms for chronic osteomyelitis. Deutsches Arzteblatt International. 109, 257-264 (2012).
- Henriksen, K., Neutzsky-Wulff, A. V., Bonewald, L. F., Karsdal, M. A. Local communication on and within bone controls bone remodeling. Bone. 44, 1026-1033 (2009).
- Mendoza, M. C., et al. The effect of vancomycin powder on bone healing in a rat spinal rhBMP-2 model. Journal of Neurosurgery Spine. 25, 147-153 (2016).
- Cohn Yakubovich, D., et al. Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts. Journal of Visualized Experiments. (106), e53459 (2015).
- Brecevich, A. T., et al. Efficacy Comparison of Accell Evo3 and Grafton Demineralized Bone Matrix Putties against Autologous Bone in a Rat Posterolateral Spine Fusion Model. Spine Journal. 17, 855-862 (2017).
- Jensen, L. K., et al. Novel porcine model of implant-associated osteomyelitis: A comprehensive analysis of local, regional, and systemic response. Journal of Orthopeadic Research. 35, 2211-2221 (2016).
- de Mesy Bentley, K. L., et al. Evidence of Staphylococcus Aureus Deformation, Proliferation, and Migration in Canaliculi of Live Cortical Bone in Murine Models of Osteomyelitis. Journal of Bone and Mineral Research. 32, 985-990 (2017).
- Norden, C. W., Kennedy, E. Experimental osteomyelitis. I: A description of the model. Journal of Infectious Diseases. 122, 410-418 (1970).
- Mistry, S., et al. A novel, multi-barrier, drug eluting calcium sulfate/biphasic calcium phosphate biodegradable composite bone cement for treatment of experimental MRSA osteomyelitis in rabbit model. Journal of Controlled Release. 239, 169-181 (2016).
- Bernthal, N. M., et al. Combined In vivo Optical and µCT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51612 (2014).
- Koeth, L. M., DiFranco-Fisher, J. M., McCurdy, S. A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically. Journal of Visualized Experiments. (103), e53028 (2015).
- Uttra, A. M., et al. Ephedra gerardiana aqueous ethanolic extract and fractions attenuate Freund Complete Adjuvant induced arthritis in Sprague Dawley rats by downregulating PGE2, COX2, IL-1β, IL-6, TNF-α, NF-kB and upregulating IL-4 and IL-10. Journal of Ethnopharmacology. 224, 482-496 (2018).
- Harrasser, N., et al. A new model of implant-related osteomyelitis in the metaphysis of rat tibiae. BMC Musculoskeletal Disorders. 17, 152 (2016).
- Abedon, S. T. Commentary: Phage Therapy of Staphylococcal Chronic Osteomyelitis in Experimental Animal Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1251 (2016).
- Tan, H. L., Ao, H. Y., Ma, R., Lin, W. T., Tang, T. T. In vivo effect of quaternized chitosan-loaded polymethylmethacrylate bone cement on methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis infection of the tibial metaphysis in a rabbit model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 6016-6023 (2014).
- Chiara, L., et al. Detection of Osteomyelitis in the Diabetic Foot by Imaging Techniques: A Systematic Review and Meta-analysis Comparing MRI, White Blood Cell Scintigraphy, and FDG-PET. Diabetes Care. 40, 1111-1120 (2017).
- Khalid, M., et al. Raman Spectroscopy detects changes in Bone Mineral Quality and Collagen Cross-linkage in Staphylococcus Infected Human Bone. Scientific Reports. 8, 9417 (2018).
- Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44, 513-517 (2015).
- Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7, 1169-1171 (2014).
- Takehiko, S., et al. Preliminary results of managing large medial tibial defects in primary total arthroplasty: autogenous morcellised bone graft. International Orthopaedics. 41, 931-937 (2017).
