Summary
Este estudio presenta un conejo mejorado modelo infectado con Staphylococcus aureus mediante el bloqueo de la misma cantidad de bacterias en la médula ósea. Vancomicina cargado sulfato de calcio y hueso autógeno se utilizan para el tratamiento de antibiótico y hueso reparación. El protocolo podría ser útil para estudiar la infección del hueso y la regeneración.
Abstract
Infección del hueso resultado de invasión bacteriana, que es extremadamente difícil de tratar en la cirugía de la clínica ortopédica y traumática. La infección ósea puede resultar en inflamación mantenida, osteomielitis y eventual no-la Unión del hueso. Establecimiento de un modelo factible, reproducible es importante hueso investigación de infección y tratamiento antibiótico. Como un modelo in vivo, el modelo del conejo es ampliamente utilizado en la investigación de infección ósea. Sin embargo, estudios anteriores realizados sobre conejo hueso modelos de infección mostró que el estado de la infección era incompatible, como la cantidad de bacterias fue variable. Este estudio presenta un método quirúrgico mejorado para inducir la infección del hueso de una de conejo, mediante el bloqueo de las bacterias en la médula ósea. Entonces, se pueden realizar evaluaciones de niveles múltiples para verificar el método de modelado.
En general, desbridan tejido necrótico y la implantación de sulfato de calcio de carga de vancomicina (VCS) son predominantes en el tratamiento antibiótico. Aunque el sulfato de calcio en VCS beneficios Osteocito arrastrándose y neoformación de hueso, defectos óseos masivos ocurren después de desbridamiento. Hueso autógeno (AB) es una estrategia atractiva para superar defectos óseos para el tratamiento de defectos óseos masivos después de desbridamiento óseo necrótico.
En este estudio, hemos utilizado el hueso de la cola como un hueso autógeno en el defecto óseo. Reparación ósea se midió usando tomografía micro computada (micro-CT) y el análisis histológico después de sacrificio de animales. Como resultado, en el grupo de VCS, no-la Unión del hueso se obtuvo consistentemente. En contraste, las zonas de defecto óseo en el grupo de VCS-AB disminuyeron significativamente. El presente método de modelado describe un método factible, reproducible y estable para preparar un modelo de infección ósea. El VCS-AB tratamiento dio lugar a tasas de no Unión ósea después del tratamiento antibiótico. El modelo de infección ósea mejorada y el tratamiento de combinación de VCS y hueso autógeno podrían ser útiles en el estudio de los mecanismos subyacentes en la infección y el hueso la regeneración ósea pertinente a las aplicaciones ortopédicas traumatología.
Introduction
Infección del hueso resulta generalmente de bacterias o la invasión de otros microorganismos después de trauma, fractura de hueso u otras enfermedades de hueso1. Infección del hueso puede inducir un alto nivel de destrucción tisular inflamación y hueso. En la clínica, Staphylococcus aureus (S. aureus) es el agente causal predominante de infección de hueso2,3. La infección ósea es dolorosa, debilitante y a menudo toma un curso crónico que es muy difícil de tratar4. En la actualidad, desbridamiento de tejido necrótico y la implantación de granos de calcio de carga de vancomicina (VCS) se han confirmado como una estrategia eficiente para controlar la infección local5,6. Sin embargo, 10% a 15% de los pacientes experimentaron un proceso de reparación ósea prolongada unión retrasada y no unión después de la lucha contra la infección tratamiento7. El gran segmento de un defecto del hueso es la cuestión más difícil para los cirujanos ortopédicos. Un injerto de hueso autólogo se considera la sustitución ósea óptima en el tratamiento de no Unión de hueso8,9.
Hasta la fecha, la mayoría de los estudios sobre hueso implantación de hueso autólogo y la infección se han realizado en diversos tipos de modelos animales, como ratas, conejos, perros, cerdos y ovejas10,11. Modelos de conejo son más comúnmente utilizados para los estudios de la infección del hueso, como primera realizado por Norden y Kennedy en 197012,13. En nuestro estudio anterior, utilizamos modelos de conejo siguiendo método de Norden, y encontramos que la cantidad de S. aureus inyectado en la médula ósea podría no ser cuantificada con exactitud, como la sangre que sale de la médula provocado derrame de solución de las bacterias.
Este artículo presenta un método quirúrgico mejorado para inducir infección ósea en conejos. Al final del procedimiento, se realizaron un examen de bioquímica de la sangre, un examen bacteriológico y una examinación histopatológica para verificar el modelo de infección ósea. A continuación, VCS se implantó para inhibir la infección y hueso autógeno se implantó para promover la regeneración del hueso.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Los conejos utilizados en el presente estudio fueron tratados de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Todos los procedimientos experimentales fueron seguidos por las reglas de la bioética Comité de Zhejiang Academia de medicina tradicional China.
1. preparación de la suspensión bacteriana
- Disolver 0,5 mg de S. aureus (ATCC 6538) en polvo de liofilización con 0,3 mL de medio de cultivo Luria Bertani. Suspensión de la mezcla completamente.
- Raya la suspensión de bacterias en placas de agar soja tríptico e incubar las colonias bacterianas a 37 ° C por 16 h.
- Seleccione una única colonia bacteriana formando unidad (UFC) y cultivo en tubos de caldo de soja tríptica para 24 h. realizar un subcultivo durante aproximadamente 24 h a 37 ° C y obtener crecimiento medio logarítmicos bacterias fase después de 16 a 18 h, cuando el valor de densidad óptica (OD) es de 0.6 a 600 nm 14.
- Transfiera 1 mL de la suspensión de las bacterias en un tubo de centrífuga. Centrifugar durante 5 min a 825 x g y 4 ° C y descarte el sobrenadante. Suspender y lavar las bacterias con 100 μl de tampón fosfato salino (PBS); repetir este paso 3 veces. Por último, resuspender las bacterias con 3 mL de PBS.
-
Calcular la concentración de bacterias utilizando turbidimetría15 de McFarland.
- Transferencia de 100 a 500 μl de la suspensión de bacterias de un tubo colorimétrico hasta que la turbiedad es equivalente a un 0,5 McFarland estándar.
- Evaluar turbidez por comparación visual a 0,5 McFarland, cuando el contenido de bacterias alcanza aproximadamente 108 UFC/mL.
Nota: Asegúrese de que el volumen de la suspensión de bacterias es suficiente para los siguientes protocolos. Para cada conejo, el volumen de la suspensión de las bacterias es menos de 1 mL.
- Transferir 0,2 mL de la suspensión bacteriana a una placa de agar y aplicarla uniformemente. Incubar la placa a 37 ° C por 16 h. recuento de las colonias de bacterias para comprobar la UFC de la suspensión de las bacterias.
2. elaboración de modelos de infección ósea
- Mantener machos Nueva Zelanda conejos blancos, de 3 meses, en jaulas individuales, bajo condiciones controladas de aire (20 ± 1 ° C) y ciclos de iluminación de luz / oscuridad de 12 h/12 h. Ofrecemos rutina dieta y agua del grifo cada día.
- Asegúrese de que en el momento de la cirugía que el conejo pesa más de 3 kg.
- Anestesie conejos por inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (3 mg por 100 g de peso corporal). Asegúrese de conejos están completamente anestesiados por la falta de responder a una pizca de pata. Reparación de conejos en la mesa de operaciones durante el procedimiento de la operación.
Nota: Asegúrese de que el modelado duración del procedimiento es de menos de 1 h. - Afeitado de la región de la tibia proximal con una afeitadora eléctrica contra la dirección del crecimiento del pelo. Desinfectar la piel mediante la aplicación de una solución de povidona-yodo.
- Marcar el extremo superior de la tibia y la posición del agujero perforación para inyección con S. aureus (la distancia al extremo superior de la tibia es 1,5 cm) con lápiz y regla. Asegúrese de que las posiciones de orificio taladrado en el centro de la meseta tibial horizontal (figura 1A).
- Cortar tibia piel con un bisturí del nº 11 y haga una incisión de 1 cm en el periostio (figura 1B, C). Perforar un agujero de diámetro de 2 mm en la tibia mediante una unidad de taladro eléctrico del hueso (figura 1D).
- Presione los orificios de 2 mm de diámetro en la meseta tibial con un cilindro de cera ósea de 2 mm de diámetro y 2 mm de altura (figura 1E). Quitar la cera de hueso libre en el plano horizontal de la meseta tibial (figura 1F). Compruebe que el orificio de 2 mm está lleno de cera de hueso (figura 1G).
Nota: Asegúrese de que los agujeros están llenos de cera ósea activando el agujero con o sin derrame de sangre. - Coser el periostio y piel con sutura quirúrgica absorbible en una sutura vertical del colchón para evitar que el animal masticar las suturas (figura 1H).
- Inyectar 1 x 108 UFC/mL de las soluciones de S. aureus (30 μL por 100 g de peso corporal) con un inyector de asepsia de 1 mL (figura 1). Asegúrese de que las agujas penetran la cera de hueso e inyectan lentamente la solución de S. aureus en la médula ósea.
- Mantener el animal en condiciones cálidas y limpias para evitar la pérdida de calor después de modelado. Vigilar frecuencia respiratoria y frecuencia cardíaca. Después de despertar, casa de los conejos en jaulas individuales con libre acceso al alimento y agua.
3. evaluación del modelo de infección ósea
- A los días 7, 14, 21 y 28 después de la infección, coloque un conejos el fixer de conejo con la cabeza y oído fuera el fixer.
-
Extraer 2 mL de sangre de las venas auriculares en un recipiente de sangre anticoagulante (EDTA-K2) ácido de dipotásico etilendiaminotetracético. Extraer 1 mL de sangre de un vaso sanguíneo en un recipiente de sangre. Centrifugar el suero por 10 min con una velocidad de 651 x g a temperatura ambiente.
- Determinar el conteo de glóbulos blancos (WBC) en sangre entera usando un analizador bioquímico de sangre, y análisis de proteína C reactiva (PCR) por una enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) método16.
- A los días 7, 14, 21 y 28 después de la infección, anestesiar un conejo modelo con pentobarbital sódico a la dosis de 3 mg por 100 g de peso de cuerpo. Cortar tibia piel con un bisturí del nº 11 y haga una incisión de 2 cm en el periostio (figura 2A).
- Limpiar la cera de hueso. Desbridar el hueso necrótico perforando dos agujeros de diámetro 4,8 mm adyacentes utilizando una unidad de taladro eléctrico del hueso (figura 2B). Desbridar necrosis de médula ósea y tejido de granulación con una cuchara de hueso (figura 2C).
Nota: Limpiar el tejido óseo durante el desbridamiento para evitar tejido óseo en la médula ósea. - Raspar y limpiar el tejido óseo entre los dos orificios (figura 2D).
- Separado 1 mL de médula ósea en placas de agar sangre de oveja. Incubar las placas durante la noche a 37 ° C. Seleccione las placas de 30 – 300 colonias y calcular el número de colonias.
- Al final del día 28 después de la infección, extraer a muestras de tibia a lo largo de los bordes de las articulaciones de la rodilla y el tobillo. Fijar a los especímenes de tibia en paraformaldehído al 4% para 24 h. Descalcifique los especímenes de tibia en EDTA 10% durante 8 semanas.
- Deshidratar a los especímenes de tibia en una serie gradual de diluciones de etanol y luego incrustar en cera de parafina. Corte 4 secciones consecutivas de 5 μm de los planos coronales. Secciones con una hematoxilina y eosina (H & E) kit de tinción de la mancha.
- Utilizar un microscopio para ver las secciones manchadas y grabación de imágenes de luz transmitidas con software estándar.
4. preparación de granos de la VCS
- Añadir 1 g de vancomicina clorhidrato polvo a 9,5 g de sulfato de calcio grado médico y luego agregar 3 mL de solución salina normal a la alimentación mixta. Mezclar bien con una espátula de 30 a 45 s.
- Coloque el producto mezclado en un molde de gel de silicona flexible (cilindro de 4,8 mm de diámetro y 4,8 mm de altura) y secar a temperatura ambiente por 15 minutos quitar los granos de la VCS por doblar el molde.
5. antibioterapia e implantación de hueso autógeno
- Anestesie conejos modelo con pentobarbital sódico a la dosis de 3 mg por 100 g de peso de cuerpo enel día 28 después de la infección . Afeitado de la región de la tibia proximal con una afeitadora eléctrica. Desinfectar la piel mediante la aplicación de solución de povidona-yodo.
Nota: Asegúrese de que el procedimiento de modelización es menos de 1 h. - Afeitado de la región de la cola con una afeitadora eléctrica y desinfecte la cola mediante la aplicación de solución de povidona-yodo.
- Corta la cola con tijeras quirúrgicas. Cortar cola piel con un bisturí del nº 11 y revelan el hueso de la cola. Coser la piel en la región de la cola con suturas quirúrgicas absorbibles en una sutura vertical del colchón para evitar que el animal masticar las suturas.
- Retire cualquier músculo, tejidos blandos y periostio. Separar el hueso de la cola en cada empalme y transferir el fragmento de hueso a un plato de plástico de 100 mm que contiene solución salina estéril.
- Implante de 4 pedazos de granos de la VCS (cilindro de 4,8 mm de diámetro y 4,8 mm de altura, vancomicina 1,25 mg por unidad de grano) en la cavidad de la médula ósea usando pinzas curvadas (figura 2E).
- Llenar el defecto óseo con 8 pedazos de huesos autógenos (cilindro de 2 mm de diámetro y 4 mm de altura por cada pieza) utilizando curva pinzas (figura 2E).
- Coser el periostio y piel con suturas quirúrgicas absorbibles en forma de sutura colchón (figura 2F).
Nota: Mantener la temperatura a 25 ° C durante la cirugía. - Mantener el animal en condiciones cálidas y limpias para evitar pérdida de calor después de la cirugía. Vigilar frecuencia respiratoria y frecuencia cardíaca. Después de despertar, casa de los conejos en jaulas individuales con libre acceso al alimento y agua.
6. evaluaciones de actividad antibiótica
- Poner conejos en un fixer de conejo y la cabeza y oído fuera el fixer en 2, 4, 6 y 8 semanas después del tratamiento.
- Extraer la sangre de las venas auriculares con vascular anticoagulante EDTA-K2. Extraer 1 mL de sangre de un vaso sanguíneo en un recipiente de sangre. Centrifugar el suero por 10 min con una velocidad de 651 x g a temperatura ambiente.
- Determinar el recuento de glóbulos blancos (WBC) en sangre entera mediante analizador bioquímico de sangre y proteína C reactiva (PCR) por un método de ELISA16.
7. evaluaciones de la regeneración ósea
- Eutanasia de conejos mediante la inyección con una dosis de pentobarbital sódico, en el final de 8 o 12 semanas después del tratamiento.
- Extraer a muestras de la tibia, a lo largo de los bordes de las articulaciones de la rodilla y el tobillo. Desbridar los músculos y capas fasciales.
- Analizar estructura de tibia mediante tomografía computada micro (micro-CT). Elija un área oval 4,8 mm de diámetro y 9.6 mm de longitud como la región de interés (ROI). Reconstruir imágenes 3D del modelo utilizando datos de mapa de bits.
- Elegir cuentas de la relación de volumen de volumen tisular del hueso (BV/TV), espesor trabecular (Tb.Th), número de trabécula (Tb.N) y separación trabecular (Tb.Sp)from the3D modelos para evaluar la regeneración ósea.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evaluación del modelo de infección ósea
Después de la infección con S. aureus, las manifestaciones patológicas de los conejos fueron similares a lo síntoma representativo de osteomielitis crónica en la clínica. En nuestro estudio, 30 conejos fueron infectados y sometidos como grupo modelo, y se sometieron 10 conejos como animales de control. Todos los conejos modelo han infectado los senos del sitio local de tibia, con pus blanco y amarillo sobre el flujo de los senos paranasales (figura 3A). Los resultados de la tinción H & E indican que agregados bacterianos se encuentran alrededor del hueso muerto en el grupo modelo, y osteocitos normales no pueden ser identificados. Los niveles de CRP y CMB son mayores en el grupo de modelos que el grupo control (figura 3B). Los lisados de médula necrótica son veteados en placas de agar, que resultan en un aumento del número de colonias para el grupo de modelos después de la infección (figura 3C). Al final de la modelización, hubo 3 conejos muertos debido a una infección grave. Los conejos infectados restantes fueron identificados como el modelo de infección del hueso y se dividieron en 3 grupos: grupo, grupo de VCS y VCS-AB Grupo de modelo.
Evaluación de la actividad antibiótica y regeneración ósea
En 2, 4, 6 y 8 semanas después del tratamiento con VCS-AB o VCS, los niveles de CRP y WBC se reducen significativamente (figura 4A). Después de 12 semanas de la implantación de VCS y aloinjerto de hueso, defectos tibiales del grupo AB-VCS parecían completamente coalescentes. Meseta tibial superficies del grupo de VCS-AB son más planas que la del grupo de VCS. Imágenes de reconstrucción 2D indican un aumento progresivo de volumen del hueso durante el período de 12 semanas después del tratamiento con VCS-AB y VCS, mientras que la pérdida ósea es significativa en el grupo modelo (figura 4B). Para analizar los índices cuantitativos de regeneración de hueso, un área oval 4,8 mm de diámetro y 9,6 mm de largo fue elegida como la región de interés (ROI) (figura 4C), y se reconstruyeron imágenes del modelo 3D usando datos de mapa de bits. Los índices micro-CT BV/TV en el grupo modelo fueron significativamente menores que en la VCS y VCS-AB grupos. Las puntuaciones en el grupo de VCS-AB Tb.N y Tb.Th fueron significativamente mayores que en el modelo y el grupo de VCS. Por otra parte, las puntuaciones Tb.Sp en el grupo de VCS-AB son marcadamente más bajas que en el grupo modelo y grupo de VCS (figura 4D).
Estos resultados sugieren que la infección con S. aureus causa aumento de WBC y la PCR en el grupo modelo, que se puede disminuir utilizando el VCS. La implantación de la VCS es considerada como el tratamiento antibiótico óptimo. Sin embargo, el defecto óseo es observable en el grupo de VCS. El VCS y el tratamiento de hueso autógeno aumentan el espesor de las trabéculas y el número de trabéculas y disminuyen la separación trabecular. El tratamiento de AB-VCS demostró capacidad de promover la curación del hueso.
Figura 1 . Preparación quirúrgica del hueso infección modelo. (A) muestra la perforación Coloque en la tibia. La distancia entre la posición del agujero de perforación para inyección con S. aureus al extremo superior de tibia es 1,5 cm. (B) incisión hecha en la piel para exponer el periostio. (C) muestra la incisión a través del periostio para exponer la tibia. (D) perforadora un orificio de 2 mm de diámetro en la tibia. (E) Llene el agujero de diámetro de 2 mm de cera de hueso. (F) cortar cera de hueso libre. (G) Mostrar la cera de hueso llenando el defecto óseo. (H) costura encima de la piel y periostio. () Inyectar solución de S. aureus . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Preparación de hueso del allograft y antibiótico tratamiento. (A) incisión en la piel para exponer el periostio. (B) dos agujeros de diámetro 4,8 mm adyacentes. (C) desbridar el hueso necrótico y médula ósea inflamatoria. (D) raspar y limpiar el tejido óseo entre los dos orificios para hacer un círculo largo de 4,8 mm de diámetro y 9,6 mm de largo. (E) llenar el hoyo con VCS y aloinjerto de hueso. (F) coser el periostio y piel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Evaluación del modelo de infección ósea. (A) características de la apariencia de las patas de conejo infectadas con S. aureuse imágenes de histopatología típica de la tibia de conejo en el modelo y el grupo control. Flecha azul: Osteocito; flecha rosa: hueso trabéculas; flecha amarilla: agregados bacterianos; flecha verde: hueso muerto. (B) el CMB y el CRP produce en el suero de conejo en los momentos de antes del modelado, 7, 14, 21 y 28 días después de la infección. Las columnas representan la media ±SE, *p < 0.05 vs el grupo control. (C) cuenta el número de colonias bacterianas en la médula ósea de tibia tras incubación durante la noche. Las columnas representan la media ±SE, *p < 0.05 vs la Colonia cuenta en el día 0. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Evaluaciones de la regeneración de la actividad y hueso antibiótica. (A) los resultados de WBC y CRP en suero de conejo en los puntos de tiempo de 2, 4, 6 y 8 semanas después de la implantación de VCS y VCS-AB, los puntos representan la media ±SE, #p < 0.05 y *p < 0.05 en comparación con el grupo modelo. (B) la sección coronal imágenes de tibia analizadas por el micro-CT. (C) la ubicación de retorno de la inversión. (D) el show de histogramas el hueso tejido volumen volumen (BV/TV), espesor trabecular (Tb.Th), número de trabécula (Tb.N) y decenas de separación trabecular (Tb.Sp) de retorno de la inversión de cinco conejos por grupo. Las columnas representan la media ±SE, *p < 0.05 vs el grupo de control o el grupo de modelos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . La línea de tiempo de todos los procedimientos de. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En los estudios anteriores, se construyeron diversos tipos de modelos animales para estudiar ambos infección de hueso aguda y crónica; sin embargo, la búsqueda del modelo ideal persiste17,18. Además, el modelo de infección ósea ideal pretende simular las características patológicas de la infección del hueso en el ajuste clínico, mientras que los períodos de modelación, permanecen bajo costo y fácil de realizar. Hasta ahora, el modelo de infección del hueso de conejo es el modelo más común en la investigación de la enfermedad inflamatoria del hueso, como los conejos son disponible, factible y económico. En nuestro anterior estudio, se compararon la tasa de mortalidad y tasa de infección de conejos con diferentes pesos corporales. Los resultados mostraron que el peso del cuerpo debe ser más de 3 kg; de lo contrario, habría una alta tasa de muerte o una alta incidencia de haematosepsis y una mayor tasa de mortalidad después de la cirugía.
A diferencia de estudios anteriores, los modelos de infección de hueso de conejo y tratamiento antibiótico en nuestro estudio son consistentes con las características patológicas de la enfermedad humana y la terapia quirúrgica. En el estudio anterior, los animales inyectados con morrhuate sódico y S. aureus no tenía estado patológico más de 60 días. Además, la tasa de mortalidad fue más que 20%12,19. El desbordamiento S. aureus solución de defectos de hueso había demostrado para inducir una tasa de infección baja. Se utilizó cera ósea para llenar el agujero de 2 mm en la tibia, con el fin de bloquear la solución de S. aureus en la médula ósea y aseguró que los agujeros estaban llenos de cera ósea activando el agujero con o sin derrame de sangre. Como el grueso de la tibia de un conejo de 2 mm, presionamos un cilindro de 2 mm de diámetro y cera de hueso de 2 mm de altura en los agujeros de diámetro de 2 mm, que aseguró la cera de hueso llenó el agujero y no podía infiltrarse en la médula ósea. Por otra parte, como la cera del hueso fue flexible y estable, llena los orificios y podría no derretir o reaccionar con médula ósea. En nuestro estudio, en el día 28 después de la infección, la cera de hueso era aún completa y llena completamente los huecos. Como el peso de los conejos fueron más de 3 kg y menos de 3,2 kg, el volumen de la suspensión de las bacterias era 900 μl μl 960. Debido a la lenta velocidad de inyección y la función bloqueo de cera de hueso, este volumen de la suspensión de bacterias se podría inyectar en médula ósea sin alta presión. Los resultados mostraron que este protocolo asegura la cantidad de S. aureus , infectada en la médula ósea. Fue perforado un orificio de diámetro de 2 mm en la tibia para asegurar que la distancia al extremo superior de la tibia es de 1,5 cm, que se localiza el agujero en la meseta tibial, asegurando espacio suficiente para desbridar y granos de VCS y hueso autógeno en el siguiente tratamiento de implantes. Durante el proceso de modelado, 3 conejos murieron debido a una infección grave. El conejo seguía siendo identificado como conejos de la infección del hueso, y la tasa de infección en los conejos restantes 100%. En comparación con otros protocolos de infección ósea, como la implantación de esponjas empapadas con S. aureus o la implantación de material extraño, nuestros protocolos estrechamente simular infección del hueso en el ajuste clínico y tiene poco efecto sobre los procedimientos, tal desbridan hueso necrótico y el tratamiento antibiótico.
Diagnóstico de infección ósea es un desafío para los cirujanos. Resultados de la prueba de laboratorio, incluyendo la detección de marcadores de inflamación suero, análisis de Microbiología y análisis de la histopatología se utilizaron para evaluar infección ósea en ajustes clínicos20. También, diagnóstico por imágenes, como ultrasonido, radiología, tomografía computada, resonancia magnética o Espectroscopía Raman se aplicaron para detectar infección de hueso21. Desafortunadamente, diagnosticar la osteomielitis a través de métodos de imagen se retrasa a menudo debido a la necrosis de hueso es difícil detectar por radiografía llana hasta la semana 3 de la infección. En nuestro estudio, se utilizó análisis de detección y la histopatología de marcador inflamación suero a evaluar modelos de infección ósea, ya que estos métodos eran efectivos, operable y los índices fueron sensibles. Los siguientes fueron los pasos más importantes de la intervención quirúrgica para crear un modelo de infección ósea en nuestro estudio. Elegir los conejos con peso adecuado para llevar a cabo la cirugía y el tratamiento. Mantener un ambiente estéril durante el procedimiento quirúrgico y sensibilización y asegurar condiciones cálidas, siguiendo el protocolo de procedimiento quirúrgico. Perforar un agujero de diámetro de 2 mm en la tibia y que la distancia al extremo superior de la tibia es de 1,5 cm. rellenar el agujero con cera de hueso y coser el periostio y piel con el fin de bloquear la solución de las bacterias. Los pasos más importantes del tratamiento antibiótico son los siguientes. Asegúrese de que la infección del hueso patológico de los conejos por detección de WBC en sangre y la PCR en el suero. Desbridar el hueso necrótico completamente, dos agujeros de diámetro 4,8 mm adyacentes y raspar y limpiar el tejido óseo entre los 2 agujeros. Implante de 4 pedazos de granos de la VCS y 8 pedazos de hueso autógeno en médula ósea y el defecto óseo.
Después del tratamiento antibiótico, se observó que los conejos en el grupo de VCS-AB tenían un potencial osteogénico mayor que en el grupo de VCS. Esto puede ser porque el hueso autógeno contiene osteocitos activados y factores de crecimiento de formación ósea, que producen la matriz ósea a lo largo de la superficie del injerto, mientras que induce la degradación de VCS escaso hueso matriz en la región del defecto. Nuestros resultados indican que el hueso autógeno tiene la superior capacidad osteogénica. Aunque la recolección de hueso autógeno es limitada en volumen y conlleva morbilidad del sitio donante, la importancia del hueso autógeno no es insignificante22,23,24. En nuestro estudio, fue adquirido el hueso autógeno del hueso de la cola, que evita lesión sistémica y disminuye la tasa de mortalidad en comparación con obtener hueso autógeno del hueso ilíaco. Autoinjerto de hueso del hueso de la cola puede ser el material de injerto preferido en el estudio animal de infección ósea.
En conclusión, se estableció un modelo de conejo mayor de infección ósea en este estudio. Índices de inflamación e índices bioquímicos de sangre fueron utilizados para estimar el modelo de infección ósea. También, después del tratamiento antibiótico, análisis multiniveles se llevaron a cabo para detectar antibióticos actividad y ósea la capacidad de regeneración. El modelado, protocolos de tratamiento y métodos de evaluación son factibles y confiables. Otros estudios se centrará en el aprovechamiento de modalidad múltiple dispositivos visuales para controlar el proceso patológico de la infección del hueso y el proceso de reparación ósea.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no divulgan conflictos de interés en este trabajo.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Ciencia Natural la Fundación de China nacional (81803808, 81873062), Zhejiang Provincial médica y Ciencias de la salud y fondo de tecnología (2017KY271) y la ciencia y proyecto de tecnología de la provincia de Zhejiang (2017 37181).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| absorbable surgical suture | Jinghuan | 18S0604A | |
| asepsis injector | Jinglong | 20170501 | |
| bone wax | ETHICON | JH5CQLM | |
| CCD camera | Olympus | DP72 | |
| EDTA-K2 anticoagulant blood vessel | XINGE | 20170802 | |
| Electric bone drill unit | Bao Kang | BKZ-1 | |
| Electric shaver | Codos | 3800 | |
| flexible silica gel mold | WRIGHT | 1527745 | |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Beyotime | 20170523 | |
| Luria-Bertani culture medium | Baisi Biothchnology | 20170306 | |
| Medical-grade calcium sulphate | WRIGHT | 1527745 | |
| microcomputed tomography (micro-CT) | Bruker | SkyScan 1172 | |
| Microscope | Olympus | CX41 | |
| New Zealand white rabbits | Zhejiang Experimental Animal Center | SCXK 2014-0047 | |
| No. 11 scalpel | Yuanlikang | 20170604 | |
| normal saline | Mingsheng | 20170903 | |
| PBS | TBD(Jingyi) | 20170703-0592 | |
| pentobarbital sodium | Merk | 2070124 | |
| povidone-iodinesolution | Lierkang | 20170114 | |
| S. aureus freeze drying powder | China General Microbiological Culture Collection Center | ATCC 6538 | |
| sheep blood agar | HuanKai Microbial | 3103210 | |
| tryptic soy agar plates | HuanKai Microbial | 3105697 | |
| tryptic soy broth tubes | HuanKai Microbial | 3104260 | |
| Vancomycin | Lilly | C599180 |
References
- Malizos, K. N. Global Forum: The Burden of Bone and Joint Infection: A Growing Demand for More Resources. Journal of Bone and Joint Surgery-American Volume. 99, 20 (2017).
- Peeters, O. Teicoplanin - based antimicrobial therapy in Staphylococcus aureus bone and joint infection: tolerance, efficacy and experience with subcutaneous administration. BMC Infectious Diseases. 16, 622 (2016).
- Sugaya, H., et al. Percutaneous autologous concentrated bone marrow grafting in the treatment for nonunion. European Journal of Orthopeadic Surgery and Traumatology. 24, 671-678 (2014).
- Birt, M. C., Anderson, D. W., Bruce, T. E., Wang, J. Osteomyelitis: Recent advances in pathophysiology and therapeutic strategies. Journal of Orthopeadics. 14, 45-52 (2017).
- Walter, G., Kemmerer, M., Kappler, C., Hoffmann, R. Treatment algorithms for chronic osteomyelitis. Deutsches Arzteblatt International. 109, 257-264 (2012).
- Henriksen, K., Neutzsky-Wulff, A. V., Bonewald, L. F., Karsdal, M. A. Local communication on and within bone controls bone remodeling. Bone. 44, 1026-1033 (2009).
- Mendoza, M. C., et al. The effect of vancomycin powder on bone healing in a rat spinal rhBMP-2 model. Journal of Neurosurgery Spine. 25, 147-153 (2016).
- Cohn Yakubovich, D., et al. Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts. Journal of Visualized Experiments. (106), e53459 (2015).
- Brecevich, A. T., et al. Efficacy Comparison of Accell Evo3 and Grafton Demineralized Bone Matrix Putties against Autologous Bone in a Rat Posterolateral Spine Fusion Model. Spine Journal. 17, 855-862 (2017).
- Jensen, L. K., et al. Novel porcine model of implant-associated osteomyelitis: A comprehensive analysis of local, regional, and systemic response. Journal of Orthopeadic Research. 35, 2211-2221 (2016).
- de Mesy Bentley, K. L., et al. Evidence of Staphylococcus Aureus Deformation, Proliferation, and Migration in Canaliculi of Live Cortical Bone in Murine Models of Osteomyelitis. Journal of Bone and Mineral Research. 32, 985-990 (2017).
- Norden, C. W., Kennedy, E. Experimental osteomyelitis. I: A description of the model. Journal of Infectious Diseases. 122, 410-418 (1970).
- Mistry, S., et al. A novel, multi-barrier, drug eluting calcium sulfate/biphasic calcium phosphate biodegradable composite bone cement for treatment of experimental MRSA osteomyelitis in rabbit model. Journal of Controlled Release. 239, 169-181 (2016).
- Bernthal, N. M., et al. Combined In vivo Optical and µCT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51612 (2014).
- Koeth, L. M., DiFranco-Fisher, J. M., McCurdy, S. A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically. Journal of Visualized Experiments. (103), e53028 (2015).
- Uttra, A. M., et al. Ephedra gerardiana aqueous ethanolic extract and fractions attenuate Freund Complete Adjuvant induced arthritis in Sprague Dawley rats by downregulating PGE2, COX2, IL-1β, IL-6, TNF-α, NF-kB and upregulating IL-4 and IL-10. Journal of Ethnopharmacology. 224, 482-496 (2018).
- Harrasser, N., et al. A new model of implant-related osteomyelitis in the metaphysis of rat tibiae. BMC Musculoskeletal Disorders. 17, 152 (2016).
- Abedon, S. T. Commentary: Phage Therapy of Staphylococcal Chronic Osteomyelitis in Experimental Animal Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1251 (2016).
- Tan, H. L., Ao, H. Y., Ma, R., Lin, W. T., Tang, T. T. In vivo effect of quaternized chitosan-loaded polymethylmethacrylate bone cement on methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis infection of the tibial metaphysis in a rabbit model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 6016-6023 (2014).
- Chiara, L., et al. Detection of Osteomyelitis in the Diabetic Foot by Imaging Techniques: A Systematic Review and Meta-analysis Comparing MRI, White Blood Cell Scintigraphy, and FDG-PET. Diabetes Care. 40, 1111-1120 (2017).
- Khalid, M., et al. Raman Spectroscopy detects changes in Bone Mineral Quality and Collagen Cross-linkage in Staphylococcus Infected Human Bone. Scientific Reports. 8, 9417 (2018).
- Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44, 513-517 (2015).
- Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7, 1169-1171 (2014).
- Takehiko, S., et al. Preliminary results of managing large medial tibial defects in primary total arthroplasty: autogenous morcellised bone graft. International Orthopaedics. 41, 931-937 (2017).
