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Neuroscience

人間の高速ストレッチ損傷法による 96 ウェル形式で多能性幹細胞由来神経細胞

Published: April 20, 2018 doi: 10.3791/57305
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 1
1Department of Neurosurgery, NorthShore University HealthSystem, 2Midwestern University/Chicago College of Osteopathic Medicine, 3Independent Contractor

Summary

ここで外傷に影響を与えるに関連するタイム スケール上の 96 ウェル形式でストレッチ損傷の人間の in vitroモデルの手法を提案します。力学的侮辱、培養し細胞を傷つける、イメージングと傷害を定量化する高の内容分析を定量化伸縮性のプレートを製造するためのメソッドが含まれます。

Abstract

外傷性脳損傷 (TBI) は、高い罹患率と死亡率の主要な臨床的課題です。前臨床研究の数十年にもかかわらず、TBI の実績のある治療法を開発されているはありません。既存の前臨床モデルを補完するために意図した頭部外傷の臨床研究の手法を提案する.ひと誘導多能性幹細胞由来神経細胞 (hiPSCNs) を使用して人間の病態を紹介します。それは読み込みパルスを実現臨床のローディング期間と同様の期間閉鎖頭部衝撃損傷。高スループット実験を容易にし、高価な細胞と培養試薬の効率的な使用は、96 ウェル形式を採用しています。シリコーン膜は神経毒性の未硬化樹脂を削除する最初扱われ伸縮 96 ウェルのプレートを作成する商業の 96 ウェル プレート体とそれから結ばれる。カスタム デバイスは、機械的に井戸に培養細胞を傷つける軸ひずみを誘導下から井戸の底の一部またはすべてのインデントを設定する使用されます。インデントの深さと機械的ひずみとの関係は、インデントの中にも底の高速度撮影を用いて経験的決定されます。HiPSCNs を含むセルは、従来の細胞培養のプロトコルの変更されたバージョンを使用してこれらのシリコーンの膜に培養することができます。培養細胞の蛍光顕微鏡画像が取得され、各ウェルに損傷のレベルを定量化する半自動化された方法で損傷後分析します。提示されたモデルは hiPSCNs 用に最適化されたが、理論的には他の細胞型に適用することができます。

Introduction

TBI は、毎年1約 52,000 人が死亡と 275,000 入院の原因と死亡率および罹患率、米国での主要な原因です。単一の成功2TBI の治療薬候補の 30 以上の臨床試験を行っています。この制服の障害は、人間固有のプロセスが一般的に使用される臨床齧歯動物モデルにみられる病態から人間の TBI を分離することを示唆しています。

HiPSCNs の出現は、人間の in vitroモデルで頭部外傷を勉強する機会を作成しています。薬剤のスクリーニングの hiPSCN ベースのモデルでは、齧歯動物細胞を用いたモデルよりも臨床成功のより正確な予測の結果を提供可能性があります。また、hiPSCNs は分離し、病理学3に個々 の人間の遺伝的変異の影響を検討する遺伝子操作できます。

本稿で説明する方法は、hiPSCN ベースの疾患頭部外傷にモデリングのユニークな利点をもたらす設計されています。頭部外傷のストレッチ損傷モデル体外は、よく確立された4,5,6主齧歯動物細胞とひと神経癌細胞株です。これらのモデルのほとんどは、空気圧シリコン膜を読み込むことによってストレッチを生成します。この方法は単一の井戸のフォーマットに有効であるが、ウェル フォーマット7までスケールすることは困難証明されています。結果としてはストレッチ傷ついた神経を治療するためにエージェントの高スループット画面はありませんでした。

このモデルの硬質の圧子を下から押込みによる膜が広がっています。この方法は、単一の井戸系8,9,10で臨床的に関連する病理体外生成する繰り返し示されています。私たちの最近の仕事は、簡単にスケール アップ 96 ウェル形式のドメインを閉じる頭部衝撃イベント12,13時間である数十ミリ秒11、パルス持続時間を維持しながら示しています。

要約すると、この体外損傷モデルの主な利点は 96-well フォーマット、hiPSCNs の使用および侮辱の臨床的に関連した時間領域。

Protocol

1. シリコーン解毒

  1. 254 μ m 厚い、30.48 × 30.48 cm シリコーン膜をかみそりの刃とアクリルのテンプレートを使用して 7.5 cm × 11 cm の長方形にカットします。10 長方形膜の各シートで作ることができます。シリコーンに付属している用紙を節約します。
  2. ガラスの石鹸 (DI) 純水の浴槽で膜を配置します。1 つずつ、スクラブ、少なくとも 20 の手袋をはめた指先で精力的に膜 s またはディップまで。
  3. Lathered の石鹸が目に見えて削除されるまで・ ディ ・流水の下で膜を洗い流してください。(包装) から紙と重力サイクル オートクレーブに膜を置きます。
  4. ポリプロピレンなどのエタノールと反応しない素材から作られたコンテナー 24 時間使用の 60 rpm で軌道シェーカーで膜あたり 70% のエタノールの 250 mL の各シリコーン膜を浸漬します。
    1. 複数膜は単一のビンに配置されます膜箱の下部に固執する場合や、プラスチックのピペット チップとその環境から膜を分離し、ピペット チップ ラック。
  5. 手袋をはめた手でシリコン膜を膜ごと・ ディ ・水 250 mL に転送し、60 rpm で 48 時間軌道シェーカーで浸る。
  6. 紙と 4 h 93 ° C ガラス オーブンの場所に膜を置きます。
  7. 膜をほこりから身を守るために、紙の別のシートで覆われている紙で、清潔で乾燥した場所に保存します。

2. プレートの製作

  1. プラズマ治療 200 W プラズマの 96 ウェル プレート トップ クリーナー (材料表参照) 60 s ハイパワー クリーナー下部サイドアップ プラズマ内に配置。効果的なプラズマが形成されることを示しますの部屋の窓から見える紫の輝きを確認します。この接合技術は Sunkaraらから適応14
  2. 60 s、1.5% (3-アミノプロピル) プタデカフルオロテトラヒドロデシルトリエトキシシラン (APTES) 20 分水に 200 mL にプレート上部下部側ダウン。このソリューションは安定した: 60 以上準備 s プレートを導入する前に。
    注意: は、ヒューム フードの APTES と動作します。
  3. プラズマ クリーナー 60 プラズマで抽出されたシリコーン膜を扱うハイパワー s。手順 2.2 で 20 分の期間の終わりの前に 5 分以上を完了するようにプラズマ処理を時間します。
  4. 鉗子を使用して、7.5 x 11 cm2羊皮紙紙の四角形の上にプラズマ処理膜を配置します。7.5 cm × 11 cm × 0.5 cm アルミニウム スラブ プレート作製クランプの下の部分に合わせます。鉗子を用いたアルミニウム スラブのシリコン膜と羊皮紙紙に合わせます。
    メモ: このデバイスのコンピューター支援設計 (CAD) ファイル、補助コード ファイルとして補足資料に提供されて ' プレス金型 - 汎用 3 D。ステップ '。材料の関連法案を提供補足表 1: カスタム内蔵デバイス - BOM.xlsx。
  5. APTES バスからプレート トップを外し、余分なソリューションを振り払います。5 s の余分な水を振る 200 mL ・ ディ ・水浴に浸し。5 s と余分な水分を振り切るのため異なる 200 mL ・ ディ ・水浴に浸し。別の板の上部を浸漬する前にこれらの浴室の水を交換してください。
  6. プレートの上部を完全に乾燥するのにには、圧縮空気を使用します。
  7. プレート作製クランプの上部にプレート上を配置します。プレート トップ シリコーンを一緒に押すプレート作製クランプをそっと閉じます。少なくとも 1 時間クランプ。
  8. 粉塵からの保護、使用する前に室温で 24 時間を治すためにプレートを許可します。

3. ストレッチ プレート

  1. 圧子押込みをクリーンアップします。
    注: は、補足の図 1を参照してください。
    1. Di では超音波発生装置 60 W お風呂スタイルに常温の水を準備します。
    2. 42 kHz で 8 分の圧子押込み超音波照射、圧子押込みの上部だけがの少なくとも 1 mm. の深さに水中に沈むように反転超音波発生装置バス上圧子ブロックのサポート
    3. 打撃は乾燥圧縮空気で圧子です。
  2. 圧子ブロックを合わせます。
    1. それは圧子配列を見下ろしては、ライブフィード ストレッチ デバイス上のカメラを位置します。圧子押込みのトップスに焦点を当てます。
      注:「膜ストレッチの特徴」のセクション 4 で説明されているセットアップはこのタスクの 1 つの可能なカメラのセットアップです。
    2. 段階クランプ (図 1) を使用して損傷デバイスの段階でプレートを固定し、デバイスのドーム ライトを配置します。
      注: は、計測器制御ソフトウェアのための材料の表を参照してください。
    3. 傷害のデバイスを制御するコンピューターのデスクトップ上のソフトウェアのアイコンをクリックして計測器制御ソフトウェアを起動します。"In_vitro_neurotrauma.lvproj"プロジェクトを実行するには、起動ウィンドウでそれをクリックします。プロジェクト ウィンドウからモーション コントロールを起動し、名前は 'motion_control.vi' と 'position_tracker.vi'、それぞれ、それらをダブルクリックするとトラッカー仮想楽器 (VIs) を配置します。
    4. 檻に囲まれて傷害デバイスを閉じます。VI が VI を実行し、ダイヤモンドの圧子を接触の 2 mm 以内にステージを下げるための '近く下' をクリックするモーション コントロールの左上隅の「矢印」ボタンを押します。VI を停止する '停止' ボタンをクリックします。
      注意: ケージでカメラを操作するときは、手は担架のクリアします。ケージのドアを閉じたときにのみストレッチ デバイスに電力を供給するドアスイッチと合うべきであるケージ。
    5. [プロジェクト] ウィンドウで、右クリック「軸 1' します。「対話型テスト パネル」をクリックしてします。ウィンドウが開いたら、「ターゲット位置」フィールドに '500' ユニットを入力して 50 μ m のステップ サイズを設定します。
    6. まずプレートまで繰り返し「インタラクティブ テスト パネル」ウィンドウの下部にボタンが緑に行く」をクリック任意の圧子押込みに接触。カメラによって表示されるライブ イメージからのお問い合わせを確認します。注垂直ステージ位置で報告された「インタラクティブ テスト パネル」ウィンドウの左上にこれは、最初の接触位置です。
    7. すべての井戸が作られたまで低い (前述の 3.2.6 の手順で) をさらに、圧子と接触。必要に応じて、全体の板を見るし、(否定的な「ターゲット位置」を指定する) でステージを移動するカメラを移動し、下。垂直ステージ位置報告メモ ウィンドウの左上のすべての記事 (これは完全な接触の位置) 接触しているとき。
    8. 最初の接触および完全な接触の位置の違いに注意してください。対話型テスト パネルを閉じます。「運動制御 VI' を実行 (手順 3.2.4 参照) 'Top' ステージを上げる] をクリックします。'停止' ボタンに動き制御 VI を停止します。
    9. 舞台は、その旅行の上部には、一度は、デバイスを無効にするドアを開きます。圧子ブロックの四隅のネジを設定を調整します。お問い合わせ最初に、それを下げるし、連絡先をしたコーナーを高めるために反対のネジ締めをしたコーナーのセットのネジを緩めます。
    10. プレート接触、舞台の引き上げの傾きの連絡先の画像を検査インデンター (ステップ 3.2.9) を調整する、圧子をブロックまでステージを下げることのプロセスを繰り返します。すべての圧子押込みになるステージとブロックが配置されると、すぐにお問い合わせください。
    11. デバイスを非アクティブ化への扉を開きます。タイダウン ネジを圧子ブロックの穴に挿入して締め付けてください。ブロックが場所 (手順 3.2.4-3.2.8) でタイダウン ネジでレベルを確認します。プレートを作るときに「対話型テスト パネル」によって報告されるステージ位置の注意してくださいお問い合わせ。インデントの実験のためのゼロの位置となります。
  3. 圧子押込みを塗ります。
    1. 圧子ブロックだけ設定されているまだ潤滑されていない場合は、きれいに固体ゴム製パッド (7.5 cm × 11 cm × 1.5 mm) とソフト、クローズドセル発泡ゴム パッド (7.5 cm × 11 cm × 3 mm) ラボのエタノールに浸したワイプで。乾燥空気にそれらを許可します。
    2. コーン油にラボ ワイプを浸漬し、鈍い輝きに固体ゴム製パッドの上に 。
    3. 泡パッドにオイルを転送する固体ゴム製パッドに泡パッドを配置します。7.5 cm × 11 cm × 泡パッドの上に 0.5 cm アルミニウム スラブを配置し、バラスト重量約 360 g (例えば、45 ml の水各ロード 6 円錐管) を読み込むという泡パッドに固体ゴム製パッドから油の一貫した転送を確実にします。10 許可発泡ゴム製パッドに転送する石油のための s。
    4. 圧子配列上に発泡ゴム製パッドを移動します。アルミニウム スラブと、ダイヤモンドの圧子の先端にオイルの安定した転送を確保するためその上にバラストの重量を配置します。10 許可、圧子押込みに転送する石油のための s。
    5. 圧子ブロックがセットアップされ、初めて潤滑ので板が伸縮されてない、実験を開始する前にテスト プレートをストレッチします。
      注: これにより、防ぐ最初のストレッチと後続の伸張の間に矛盾がある実験を交絡します。その後ストレッチ、各ストレッチの前にのみ手順 3.3.2-3.3.5 を繰り返します。
  4. プレートをストレッチします。
    1. ステップ 3.3 で説明したように、圧子押込みを塗ります。
    2. 傷害デバイスのステージでステージのクランプでプレートを固定します。滅菌が必要な場合は、部屋の空気に文化面をさらすことがなくプレートを保護する蓋の位置を調整します。
    3. 'モーション制御 VI を使用してゼロ位置にステージを下げる' (3.2.4-3.2.6 の手順を参照)。ゼロ位置は、3.2 の手順で決定されます。
    4. そのウィンドウの左上隅の「矢印」ボタンで実行し一意のファイル名に '位置の追跡 VI' で「ファイルのパス」フィールドにファイル名を変更。
    5. 深さとインデントの期間を設定 (通常 1 から 4 ミリメートル、30 ms、それぞれ、最大深さ 5 mm の最小期間 15 ms) '傷害 (mm)'、' 損傷時間 (ms)' '移動コントロール パネル VI' フィールドをクリックし、目的の入力欄値。
    6. '移動コントロール パネル VI' を実行し、「傷害」プレートをインデントするをクリックします。
    7. 'Top' をクリックしてその旅行の頂上までステージを移動します。'停止' ボタンを持つ VI を停止し、ドアを開くことによって傷害のデバイスを非アクティブ化します。
    8. 指定した最大距離が適用されたことを確認する '位置の追跡 VI' の舞台の変位履歴を確認します。グラフを右クリックし、[Excel にエクスポート] をクリックします。クリックして ' ファイル |保存 ' データを保存します。

4. 膜ストレッチの特徴

  1. 高速度撮影のコントラストの高い背景を提供するために各圧子白の上部に凹部をペイントします。
    注意: は、時代ものの圧子押込みのリムを塗装しないでプレートとの接触。
  2. 3 D 印刷 poly(lactic acid))、またはそれ以外の場合、各ウェルにドットをする円筒形のスタンプを作製します。シリンダー トップを中心とした 5.9 mm 径、12.2 mm 円筒状突起 1.5 mm 径と高さ 1.0 mm の高を確認します。
    注: 3 D 印刷モデル ' スタンプ。STL' 補足ファイルとして利用可能です。
  3. プラズマ治療、プレート右-側アップ 60 の井戸でシリコーン細胞培養面をアクティブにする s、手順 2.1 で述べたように。
  4. ゴム製のパッドやその他のソフト面にプレートを配置します。スタンプの小さな突起をプライム (手順 4.2 参照) 永久的なマーカー ペンからのインクで。テストする井戸にスタンプを挿入し、インクの良い転送を確実にタップします。すべての井戸の前にスタンプを首相します。
  5. 圧子ブロックに合わせ、傷害デバイス インデンター注油 (3.2 3.3 手順を参照)。傷害デバイスのステージ上にプレートをクランプします。傷害デバイス上にびまん性軸の明るいを配置します。
  6. 傷害デバイス上でブーム スタンドに高速カメラを設定、レンズをまっすぐ下に直面している番号の最小絞りに設定してそれを入れます。カメラに接続されているコンピューターでカメラのソフトウェアを起動します。フレーム レート ドロップ ダウン メニューで選択した 2,000 フレーム毎秒とシャッターにドロップダウン ・ メニュー選択最速露光時間高コントラスト画像が得られます。点線の井上センター。
    1. 12 井 3 x 4 グリッド ビューのフィールドを含むようにカメラを配置します。
      注: このフィールドのビューは、スループットと 1,280 × 1,024 イメージの解像度との間の最適な妥協点を提供しています。
  7. ゼロ点にプレートを下げる (手順 3.2.4-3.2.6 を参照してください)。ワンクリック レコード'にトリガー'を読むことができるので、カメラのソフトウェアのボタンをクリックします。位置追跡 VI (ステップ 3.4.4) を開始します。
  8. 明るいのディフューズ軸光を入れます。3.4.6 の手順で説明されているように、プレートをインデントします。
  9. 明るい射光軸をオフにします。
  10. カメラ制御コンピューターにインデントが発生した記録の 30-40 ms のウィンドウを見つける: カメラ ソフトウェアの高速ビデオの再生バーに開始と終了の矢印をドラッグします。保存] をクリックして、' ファイル名 ' フィールドの名前を設定、'形式' フィールドに「TIFF」を選択し、「保存」をクリックします。
    1. 目を通すのです。以上の画像を TIF ファイル (初め) を適用され、最も伸縮 (ピーク インデント) 状態。
    2. 、両方の画像でドットの幅と高さを測定するのにには、以上の画像を開き、ピーク ストレッチ サイド バイ サイド、フィジーを使用します。既定の四角形の選択ツールを使用して、クリックし、ドラッグして少なくともストレッチのイメージのドットの周りにボックスを描画します。高さと幅の単位 ' 分析 |メジャー '。
    3. ピーク ストレッチ画像を同じよくドットの繰り返し。井戸の残りの部分に対して繰り返します。
  11. Xおよびy方向にラグランジュのひずみを次のように計算します。
    Equation 1
    Equation 2
    注: ここでは、 Exxがx方向にラグランジュのひずみ、 Eyyがy方向にラグランジュのひずみ、 Xはドットの幅、 Yはドット、 f の高さ(すなわち、ピーク インデント画像)、最終的なイメージを示します、私は (すなわち、前のインデントのイメージ) の最初のイメージを表します。その井戸にひずみを決定する 2 つの値の平均値します。

5. めっき培養細胞

  1. オートクレーブ箱と滅菌に使用されるバラスト重量。
  2. プラズマ治療、シリコン底板右-側アップ 60 s (手順 2.1 を参照してください)。すぐに 15 分間 70% のエタノールを含む無菌箱の板が水没します。
  3. 30 分の個別の無菌箱に滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でプレートが水没します。
  4. 井戸から PBS を吸い出しなさい。井戸がプラズマ治療を失うを防ぐために一度に 1 つのプレートを乾燥のみ。
    注意: シリコーン底プレート ピペッティングするとき剛板よりも少ない触覚フィードバックを提供、ピペットの先端をブロックする可能性が高い。
  5. 滅菌プレートによくあたり 0.1 mg/mL ポリ L-オルニチン (PLO) の 100 μ L を追加します。1 時間室温で孵化させなさい。
  6. 100 μ L 滅菌 PBS、細胞懸濁液の準備が整うまで、ウェルズの 2 番目の洗浄を残して二度と井戸をすすいでください。
  7. 安全手袋を使用して液体窒素貯蔵から hiPSCNs の小瓶を取り出し、ドライアイスに置きます。迅速に 37 ° C の水浴にバイアルを輸送し、まさに 3 分解凍。バイアルを旋回できません。
  8. 無菌フードで軽く 1 mL の血清ピペットを使用して 50 mL の円錐管にバイアルの内容を転送します。
  9. 部屋の温度完全なメンテナンス中 (メディア ベース + サプリメント) 1 mL で空のセラムをすすいでください。
  10. 1 秒あたり約 1 つのドロップで drop-wise 50 mL チューブにメディアの 1 mL を移します。そっと追加しながらチューブを旋回します。室温用完全培地の 8 mL を約 2 滴/秒で 50 mL のチューブに追加します。
  11. チューブをキャップし、反転 2-3 回。診断とセルをカウントします。225,000 セル/ml に細胞懸濁液を希釈するために必要な追加のメディアの量を計算します。
  12. (計算上) 25 mL の血清ピペットを使用して細胞懸濁液の管にメディアの量をピペット優しく。
  13. 細胞懸濁液における laminin の 10 μ G/ml を達成するために 1,000 μ L ピペットで細胞を懸濁液の 1 mL あたり 1 mg/mL ラミニン株式の 10 μ L を追加します。ラミニンの使用したチップを一度上下に吸引チューブをキャップし、一度チューブを反転します。
  14. 一度に 1 つのプレート、プレートから PBS を吸い出しなさい。マルチ チャンネル ピペットを使用して、各ウェルに hiPSCN 細胞懸濁液 100 μ L を追加します。井戸のため、面積あたりの細胞密度は 67,500 セル/cm20.33 cm2、文化エリアがあります。
  15. 添付ファイルを促進するために播種後 15 分間室温でプレートを置きます。無菌培養のフードのファン振動を避けるためには、研究室のベンチにカバー プレートを配置します。5% CO2と 37 ° C で文化を孵化させなさい。
  16. 24 時間、完全な維持媒体の 200 μ L で井戸を補充で一杯になったメディア変更を実行します。100 μ L/ウェルのメディア変更のすべての 2-3 日半を実行します。

6. 文化を毀損する行為

  1. 圧子ブロックを合わせ、3.2 で説明するように、ゼロの位置を検索します。ステップ 3.3 で説明したように、圧子押込みを塗ります。
  2. '位置追跡 VI' (ステップ 3.4.4) の変位履歴のファイル名を設定します。(ステップ 3.4.5) '運動制御 VI' における損傷パラメーターを設定します。
  3. インキュベーター外負傷し、ステージ上にクランプ プレートを取る。部屋の空気に培養をさらすことがなく、プレートを固定するための蓋の位置を調整します。
  4. 「モーション コントロール VI」を使用してゼロ点 (手順 3.2.4-3.2.6) にプレートを下げます。'位置追跡 VI' を開始 (ステップ 3.4.4)。
  5. (前述の手順 3.4.6 で) プレートをインデントするのに運動制御 VI を使用します。偽伸張のためのみ、このステップをスキップします。
  6. ステージを動きの範囲の先頭に戻る (3.4.7 の手順を参照してください)。プレートをインキュベーターに戻ります。
  7. 検査し、(ステップ 3.4.8) のように変位のトレースを保存します。

7. 顕微鏡

  1. X の染色液 2 μ G/ml ヘキスト 33342 と 5 μ G/ml 維持媒体のカルセイン AM と 10 を準備します。
  2. それぞれを染色染色液 x 10 の 20 μ L スパイクとも。
  3. 染色 37 ° C で 15 分間インキュベートします。
  4. 幅広い分野の蛍光画像を取得します。フィルター使用従来 FITC と DAPI カルセイン AM とヘキスト 33342 信号をそれぞれイメージにセット。ウェルの画像シーケンスに 10 分以上を要する場合は、文化の健康を維持するためにステージ上のインキュベーターでプレートを囲みます。
    注: 10 X、0.30 NA レンズ詳細を提供十分な細胞の形態を決定するため。これが原因で多くの明るい相馬のいくつかの彩度も、神経突起の良い可視化できるように利益を調整します。
  5. 相馬と突起を識別する緑のカルセイン AM チャネルの生きているセル画像をセグメント化します。青のヘキスト 33342 チャネルで、相馬の識別を支援する核の画像を使用します。

Representative Results

担架装置です (図 2 a) パルスの振幅に応じてパルス持続時間の短い 10-15 ms パルスパワー ステージを動かすことができます。パルス振幅は脈拍の持続期間は約 1 によって異なりますが、再現性の高い繰り返しの ms。実際のパルス振幅は所定のパルス振幅から逸脱した井戸の多数が読み込まれ、所定の振幅が高い場合 (図 2B参照)。ステージ移動の振幅が 3 ミリメートルを超えて増加する、実際の変位振幅ますます下回る変位振幅 (図 2B参照)。投稿ブロックの慎重に位置合わせは、行または列 (図 2) にわたって膜ひずみにおける傾向を排除します。52 井戸インデントを段階変位振幅 (3.3 mm 実際の変位振幅) を規定する 3.5 ミリメートル、すべての井戸の位置間で平均ラグランジュのひずみは 0.451 (すべての場所のための手段の標準偏差 = 0.051, 標準偏差の意味すべての場所 = 0.065、n = 5 測定ウェルあたり)。これらの結果は、それらのいくつかされているが、既に報告された11完全を期すのためここで掲載されています。

最適な無傷の文化があれば、いくつかの以上 5 細胞の塊があります。神経突起は、個々、長い、細い、緊張やビーズ (図 3 a) の気配がほとんど、あるいはまったく曲線になります。理想的な条件の下で文化の生存率必要があります密接に製造元のデータ シート (通常 60-70%) で指定された生存率のアプローチし、シリコンを文化従来硬質文化基板上 (に維持されているもののようになります図 3B)。神経突起は、低消費電力の明視野顕微鏡に表示できない場合があります。ラミニン濃度と細胞密度の両方ベースライン時と損傷後の文化に影響を与えます。細胞密度が増加数と文化で形成される塊のサイズ。しばしばラミニン濃度を増加させると、この効果 (図 3 a) が抑制されます。しかし、増加、ラミニン濃度あまり鈍化傷害 (図 4) に文化の感度。無傷のカルチャ最適ラミニン濃度は 50 μ G/ml のラミニン (図 3)、しかし、ラミニン (図 4) の 10 μ G/ml で偽とストレッチの負傷者集団間の最適な分離が得られました。ラミニン濃度が高い短時間ポイント (図 4) での負傷も長い時間ポイント (例えば、7 日間) で細胞生存率を改善する文化の感受性の低下。要約すると、各実験のシナリオのラミニン濃度を最適化する価値があります。

膜ひずみ、受傷後イメージング時点、ラミニン濃度および細胞密度セルごと神経突起の長さに非常に有意な主効果を発揮 ( ANOVA, < 0.001)。セルごとの突起の長さ膜ひずみの影響は受傷後撮像時間ポイントとラミニン濃度と統計上極めて重要な相互作用をあった ( ANOVA, < 0.001) とセルとの統計的に有意な相互作用密度 ( ANOVA, < 0.05)。同様に、膜ひずみ、受傷後の時点をイメージング細胞の密度、およびラミニン濃度のすべてがセル実行可能性の高い統計学的に有意な主効果を発揮 ( ANOVA, < 0.001)。細胞の膜ひずみの影響は受傷後のイメージング時点で統計上極めて重要な相互作用 ( ANOVA, < 0.001) と細胞密度(ANOVA,統計的に有意な相互作用< 0.05)。これらの結果は、タイミング、細胞密度、およびラミニン濃度がそれぞれ慎重に最適化する必要がありますので応用侮辱と実験結果との関係に重要な影響を出すことを証明します。

低細胞の生存率と発育を妨げられた神経突起の成長と一緒に、ビーズの突起を示す不適切から生じる有毒な培養条件準備シリコーン。スキップまたは水浸漬または乾燥オーブンを短縮吸収エタノールを残したり水膜、それぞれ、メディアに拡散し、細胞のストレスします。よく負傷した文化はセル実行可能性、短縮または行方不明の神経突起、ビーズの突起、緊張やテンションに見える突起が減少します。傷害は、よく分散した前怪我をした培養細胞の凝集を引き起こす可能性があります。大きな塊は、形態素解析を混同することができます。形態素解析などの顕著な変化が発生するが、細胞がまだいくつかの突起に存在するよう傷害レベルを調整する必要があります。

Figure 1
図 1: A ラベル損傷デバイスの概略図。(A) トップビュー、等角図法 (B)、(C) 正面、(D) 右側面図。スケール バーは、三面 (A、B、および D) に適用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 機械の侮辱のキネマティック。(A) 段階の変位履歴 (所定振幅は凡例に表示) 所定振幅の範囲で 5 パルス以上井戸が読み込まれていないとき。(B) ステージ移動履歴 (所定振幅は凡例に表示) 所定振幅の範囲で 10 パルス以上 52 井戸がいつ読み込まれるか。(C) 3.3 mm の段階の変位振幅の各ウェルに、平均化ひずみ (n = 5 測定好評につき、平均ウェルあたり標準エラー 0.029 を =)。C4 F4 と C9 f9 キーは伸縮制御井戸であることに注意してください。この図は、シャーマンらから変更されています。11この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 文化の最適化条件シリコーン。(A) セル密度とラミニン濃度シリコンを hiPSCN 文化を様々 なエフェクト。細胞密度の増加、ラミニン濃度の減少と増加を凝集します。セル密度とラミニン濃度は、単分散の文化を達成するために最適化されなければなりません。単分散の文化は、定量化の中に人工物を発生しにくく。神経突起の可視化を最適化するためにダイナミック レンジを調整されて ことに注意してください。結果として、多くの明るい相馬が飽和状態します。このプレゼンテーション多くの調光器の突起をほとんど目に見えないレンダリングする相馬に関してダイナミック レンジの最適化の代替にお勧めします。赤色の四角形で強調表示された条件はストレッチ損傷実験体外に最適とみなされました。(B) 従来のリジッド基板上の文化にシリコン膜上の文化のよう最適な条件の下で。左側のパネルは、33,750 セル/cm2 (細胞培養基材は培養治療環状オレフィン共重合体)、従来の硬質の 96 ウェル プレートでラミニンの 3.3 μ g/ml で培養した hiPSCNs を示しています。右側のパネルは、(A) から赤で記載されているパネルを再現します。スケール バー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: 損傷表現型とそのラミニン濃度依存します。(A) 健康的な文化は、10 μ G/ml ラミニンと 67,500 セル/cm2を使ってします。神経突起はないビーズと長いです。いくつか死んで核, といくつかの塊があります。(B) 文化 57% ピークひずみと負傷し 4 h 突起を短縮後のイメージを作成または行方不明、同じ培養条件を使用して、いくつかビーズ (矢印によって示されます) があります。カルセイン AM 陽性細胞は数が少ないともっとカルセイン AM 負の核 (つまり、死んでいる) があります。傷害は、存続の細胞の中で群生していることを増加しています。(C) 損傷後 4 h、セルごとの突起の長さはラミニン濃度に依存した方法でひずみの増加とともに低下します。(D) 受傷後 4 h、ラミニン濃度に依存した方法でひずみの増加とともに低下する細胞。(E) 外傷後 24 h、セルごとの突起の長さはラミニン濃度に依存した方法でひずみの増加とともに低下します。(F) 外傷後 24 h、ラミニン濃度に依存した方法でひずみの増加とともに低下する細胞生存率。(n = 4 バー、あたりは誤差範囲、± 1 標準偏差、スケールバー = 100 μ m)。歪みの値、シャーマンらによって事前パブリケーションからのデータを使用して段階の変位からみた11この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

補足図 1: 技術、圧子の描画します。この図をダウンロードするここをクリックしてください。

補足表 1: カスタム内蔵デバイス。この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。

配線図補足テーブル 2:96 よくプレート ローダー ピンアウト。この表をダウンロードするにはここをクリックしてください。

補足コード ファイル 1: 損傷デバイスのコンピューター援用設計図面。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

補足コード ファイル 2: プレート作製クランプのコンピューター援用設計図面。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

補足コード ファイル 3: スタンプ幾何学、3 D プリンターでの使用に適した 3 D 表現します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

補足コード ファイル 4: motion_control.vi のサブ Vi である MuStLiMo_si_initialize.vi のサブ Vi。ダイアログ ボックスでエントリをモーションのパラメーターに変換します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

補足コード ファイル 5: motion_control.vi のサブ Vi である複数ストレート ライン Moves_simplified.vi のサブ Vi。ダイアログ ボックスでエントリをモーションのパラメーターに変換します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

補足コード ファイル 6: position_tracker.vi のサブ Vi。カウンター トラック変位入力リニアエンコーダーから。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

補足コード ファイル 7: LabVIEW プロジェクトのベースします。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

補足コード ファイル 8: デバイスを移動レベル VI をトップします。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

補足コード ファイル 9: motion_control.vi のサブ Vi。プレートを伸ばす急速な変位を実行します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

補足コード ファイル 10: motion_control.vi のサブ Vi。ステージに移動遅い変位を実行します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

補足コード ファイル 11: motion_control.vi のサブ Vi。Motion_control.vi コントロール パネルの (通常アンダー サンプルされる) 変位履歴をプロットします。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

補足コード ファイル 12: 変位履歴を記録レベル VI をトップします。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

補足コード ファイル 13: motion_control.vi と position_tracker.vi の間の通信が含まれています Variable2 です。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

補足コード ファイル 14: プリント基板の回路図です。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

補足コード ファイル 15: プリント回路基板のレイアウト。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。

Discussion

一貫性のある取得するキー、biofidelic このモデルで表現は、一貫性のある biofidelic 機械侮辱が適用されます。このモデルは、10-15 ms 死体実験12,13によると人間の頭部の影響のパルスの期間に類似している限り短い期間のパルスを生成できます。この侮辱の一貫性は、圧子ブロックとプレートの配置と、圧子押込みの一貫性のある潤滑によって異なります。圧子ブロックも揃っていれば、傾向に無い適用ひずみ行または列 (図 2)。潤滑剤の薄層は通常厚い層より少ない摩擦を作成し、粘性グリース、シリコーンをファウルして顕微鏡の中に光の通過を妨げるために推奨されません。実際のステージの変位振幅が大幅に低下する変位振幅と多くの圧子を使用すると、所定の段階の変位振幅は大きい (> 3 mm)。ただし、実際の変位は大きな振幅で変位よりも小さいが、繰り返し (図 2 b) が残っています。したがって、大規模な実際の変位振幅は、所定の目的の値を超える値を入力することによって確実に得られます。変位振幅のピーク膜ひずみ病理を引き起こす力学的侮辱を直接測定するため簡単に記録されたプロキシだからこそ問題します。したがって、膜段階の変位から歪を求める手順は重要です。プレートと圧子押込み、たとえば異なる場合の相互作用に影響を与えるシステムが変更される場合は、いずれかの主要なこのプロセスを繰り返す必要があります直径圧子押込み、異なる圧子材料またはコーティング、シリコーンの種類底板が使用されます。各実験の開始時に、圧子ブロックを再編成し、ゼロの位置を決定するプロセスを繰り返す必要があります。伸縮装置の概略は図 1に示します。デバイスを再現するための CAD モデルは、補足資料として提供されます: ' 傷害デバイス - 完全なアセンブリ - 汎用 3 D。ステップ ';材料提供の関連法案として補足表 1: カスタム内蔵デバイス - BOM.xlsx。また補足テーブル 2 96 ウェル プレート _loader - のピン配置配線 Diagram.xlsxシステムのさまざまなコンポーネントを接続するケーブルの接続を記述するを参照してください。'Interconnector_circuit_board.dip' では、ケーブルを配線基板について説明します。

その旅行の中央付近の段階でデバイスが無効になった場合、ステージはバネ式だから、電源が切断された後に移動します。電源が回復すると、フィード バック ループは最後の知られている所定の位置と実際の位置との間の大きな違いを検出します。これはこれは、デバイスが無効にされた位置に突然移動する段階になります。この突然の動きは休んで、旅行の上部に位置、無動力で場合にのみデバイスを無効にする注意する必要がありますので、エンコーダーの出力でエラーが発生します。

作製クランプにより、最適な接合方法でプレートのボディとシリコンの下部をもたらす設計されています。このため、補足のファイルで説明する設計の 3 つの特徴がある「プレス金型 - 汎用 3 d。ステップ '。まず、クランプ プレート体ホルダーは、シリコーンの下部に平行です。これは正しくビルドされている場合、最初のセットアップ後の調整は不要です。第二に、クランプの発泡ゴムの層は、完全に剛体システムと無限の締め金で止める力をゼロの締付け力から急激な増加を経験する理論的にクランプを閉じたときプレートの下のコンプライアンスの少量を提供します。クロスバーの位置とクランプのセット スクリューは、クランプの 2 つの側の間の距離を微調整できるように調整できます。

ひずみ特性実験中に井戸の底にドットの明るく、白い背景を提供するためにあらゆる努力をすべきであります。良いコントラスト、これらの画像が容易になります大実験を分析人間のオペレーターの退屈になることができるドットの幅と高さを測定するプロセスを自動化します。96 ウェル プレートで井戸の底の高速ビデオ撮影は、井戸の壁が影を落とす傾向があるために、課題を提示します。ドーム ライトやカメラの視線に沿ってイメージを隠すことがなく照らすことができる拡散の軸光の使用には、影や従来光源と起こる鏡面反射がなくなります。明るい照明は、短い露光時間で取得する画像をことができますので、明るいの使用可能な光源を使用ください。短い露光時間では、モーション ブラーを最小限に抑えます。びまん性軸光発光ダイオード (Led) をアップグレードにより高速ビデオ集録中に露出時間の短縮ができます。Led でアップグレードできるびまん性軸光を開く株式 Led を取り外し、取付 4 ハイパワー LED アレイ バック ウィンドウ Led ホルダーを使用して、定電流電源に接続して、再組み立てびまん性軸光 (のテーブルを参照する材料カタログ番号のため)。Led のアップグレードの欠点は、過熱の危険があるためよりも数秒受動的冷却 Led を維持できないことです。したがって、別の光は、後ブロックとカメラ調整の配置に必要です。

膜にスタンプ ドットの膨張を測定することにより膜ひずみを定量化の提案手法は比較的粗さが、それは複数の井戸に堅牢な方法でスケール アップすることができます。ウェルの底全体の歪場はデジタル画像相関法を使用して詳細に特徴付けられます。この手法では、井戸のベースの上に細かいまだら模様を噴霧し、それをイメージング変形中に高速です。商用ソフトウェアは、斑点状のパターンの進化を追跡することによってイメージの各ポイントでひずみを定量化する使用できます。

このプロトコルは、hiPSCNs の多面的、臨床的に関連する、ストレッチ損傷表現型を作り出します。細胞死、神経変性および神経突起ビーズは人間の TBI のすべてのよくとり上げられる後遺症と動物モデル15。このモデルで成功への鍵はの確立と健全な文化を維持します。一般的に言えば、従来の硬質プレートを開発した細胞培養のプロトコルは伸縮性平板培養の価値が出発点です。ただし、問題のセルがシリコンを異なる応答可能性があります可能性は常に考慮されなければなりません。これは特に、hiPSCNs 培養条件に非常に敏感であります。セル密度とラミニン濃度を最適化するいくつかの例は、代表結果] セクション (図 3図 4) に提供されます。プラズマ処理とシリコーンの活性化は不可欠です。シリコーンは、疎水性とたがわず。自然の状態ではラミニンや細胞接着を促進するために使用される他の分子にそれバインドできません。プラズマ処理は、表面の親水性をレンダリングし、反応性基を公開します。これらの変更により、シリコーンに結合し、細胞接着を促進する接着分子です。プラズマ処理効果は、表面は、液体に浸漬しない限り、そしてできるだけ早く活性表面を乾燥を含む手順を実行する必要があります数分消費電力に注意してくださいすることが重要です。プラズマ処理の効果を着用しているかどうか確認する簡単な方法は、表面に水の滴を配置することです。未処理のシリコンをプラズマ処理シリコンをに広がっていくに対しを液滴のビーズします。昔は hiPSCNs と (材料の表を参照)、製造元は、細胞懸濁液ではなく、塗装の前処理でラミニンの追加をお勧めします。このプロトコルは、正常にこのアプローチに組み込まれています。セグメンテーション、理論的で実現できるオープン ソース ソフトウェアまたは汎用のプログラミング言語、これらのツールと能力の高い良い結果を取得する必要です。神経突起がよくとても痩せているので、バック グラウンド信号から区別することは困難です。したがって、可能な場合のセグメンテーションとニューロンの定量化のための専用モジュールと高コンテンツ顕微鏡社配布商用ソフトウェア ツールの使用を勧めます。市販のソフトウェアであっても精度を視覚的に検証するセグメンテーションのイメージをエクスポートすることをお勧めします。

従来、硬質板の使用と比較して伸縮性のプレートでの作業に関連付けられているいくつかの制限があります。伸縮性プレート空気目的で通常どおりイメージを作成することができます。ただし、浸漬の目的の画像は非常に難しい。レンズのオイルは、シリコーンを恐れがあります。さらに、それを上向きに移動すると、目的はシリコン膜に圧力をかけます。この圧力は垂直方向に焦点に、サンプルを持参して困難に膜を転置します。現在のプレートを製造に使用シリコーン膜は、約 250 μ m 厚いです。この厚さは、多くの高出力、浸漬の目的の焦点距離を超えています。顕微鏡に必要な平坦度を達成するためにクランプする前に完全に平ら、膜をレイアウトする特別な注意が必要です。オート フォーカス システムは、ある程度完成したプレートの平坦度の偏差を補正できます。平坦性を確保するためプレート上部に接着する前に、プロトコルの将来のバージョンは膜を緊張事前可能性があります。プレート トップ14にシリコン膜を接着するための接着剤フリー手順は、現在のプロトコルの重要な強さと見なされます。不均一接着層の厚さによる平坦性接着剤として任意の偏差から神経毒性のリスクがなくなります。

多電極アレイは、hiPSCNs での実験の成熟度と機能を評価するために使用されます。残念ながら、これらのシステムは、細胞培養基材は堅いので、このモデルと互換性があります。伸縮性マルチ電極アレイを作成、このところだけで実証されている単一のよくがフォーマット16,17することが可能です。圧子押込み削除できるように個別に圧子ブロックからいくつかの井戸がインデントされないとシャムスとして使用できるように注意してください。圧子を削除するインデントを防ぐことができますが、ステージを移動しながら井戸内の流体のまだ慣性があるので機械的負荷に完全に排除していません。決して流体運動の病理学的影響を測定する段階運動の対象となったプレートで井戸にこれらの井戸を比較する価値があります。また、ブロックに圧子押込みの配列は対称 (前面から背面に左右対称、左右に) をする必要があります。この予防措置により、ステージが横傾斜しないし、自分の立場でバインドする棒を引き起こすので、プレートがインデント時に均等にロードされています。

頭部外傷の治療のイノベーションへの主な課題は、複雑さと状態の不均一性があります。外傷は、同時に中枢神経系のあらゆるセルの種類にマルチ モーダル ストレスを適用します。ニューロンは、商用ベンダーから広く利用可能今確実にひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) から生成されています。この分野で技術革新が進行してすぐに、アストロ サイト18とミクログリア19など他の神経細胞の種類、また hiPSCs から派生しています。それはやがて体外トラウマにし培養異なったセルタイプ外傷後通信する方法を理解するこれらの細胞型のそれぞれの細胞の自律的応答を分離することが可能。この方法では、徹底的に人間システムの理解を底から臨床的課題を再現が可能それ最終的にあります。このアプローチは、齧歯動物モデルに依存する従来のアプローチとは異なる、この壊滅的な一般的な難治性の条件の最初の治療につながる知見を生成する可能性があります。

Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この作品は、一部健康の国民の協会 (R21NS098129) からの助成金によってサポートされます。SueSan 陳、ジョナサン ・ タン、コートニー ノースパーク、市貝 Ng 風水元 Bu、デザインと高速撮像実験でこの原稿に記載の間に使用されるライトをサポートする体制を構築から優秀なテクニカル サポートを確認したいと思います.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
.010" Silicone Sheet Specialty Manufacturing, Inc #70P001200010 Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet
Sparkleen Fisher Scientific  #043204
Nunc 256665 Fisher Scientific  #12-565-600 Bottomless 96 Well Plate
Kim Wipes ULINE S-8115
Plasma Cleaner Harrick Plasma #PDC-001-HC
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich #440140 APTES
Parchment Paper Reynolds N/A
Dome Light CCS inc LFX2-100SW
Dome Light Power Supply CCS inc PSB-1024VB
Axial Diffuse Lighting Unit             Siemens Nerlite DOAL-75-LED Diffuse axial light
High Power LED Array                 CREE XLamp CXA2540 High Power LED Array                
LED holder Molex 1807200001 LED Holder  
LED power supply Mean Well HLG-320H-36B Constant Current Power Supply   
FastCam Viewer software  Photron camera softeware
Fastcam Mini UX50 Photron N/A High Speed Camera
Micro-NIKKOR 105mm f/2.8 Nikon #1455 High Speed Camera Lens
0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine Sigma-Aldrich #P4597
iCells Cellular Dynamics International #NRC-100-010-001
iCell media Cellular Dynamics International #NRM-100-121-001 
iCell supplement Cellular Dynamics International #NRM-100-031-001
Laminin Sigma-Aldrich #L2020
Hoechst 33342 Fisher Scientific  #H3570
Calcein AM Fisher Scientific  #C3099
voice coil actuator  BEI Kimco LA43-67-000A 
optical linear encoder  Renishaw T1031-30A 
servo drive Copley Controls Xenus XTL 
Controller National Instruments cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller 
cRIO chassis National Instruments cRIO 9113
digital input module National Instruments NI 9411
data acquistion chassis National Instruments NI 9113
LabVIEW National Instruments instrument control software
hiPSCNs Cellular Dynamics International

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References

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神経科学、問題 134、ストレッチ、頭部外傷、神経細胞、ひと誘導多能性幹細胞、シリコーン、細胞培養、高コンテンツ イメージング
人間の高速ストレッチ損傷法による 96 ウェル形式で多能性幹細胞由来神経細胞
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Phillips, J. K., Sherman, S. A., Oungoulian, S. R., Finan, J. D. Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format. J. Vis. Exp. (134), e57305, doi:10.3791/57305 (2018).

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