Summary
Hier präsentieren wir eine Methode für eine menschliche in Vitro Modell der Stretch Verletzungen in einem 96-Well-Format auf einer Zeitskala für Trauma auswirken. Dazu gehören Methoden für die Herstellung von dehnbaren Platten, Quantifizierung der mechanischen Beleidigung, Kultivierung und verletzte Zellen, Bildgebung und hohe Inhaltsanalyse, Verletzungen zu quantifizieren.
Abstract
Schädel-Hirn-Trauma (SHT) ist eine klinische Herausforderung mit hoher Morbidität und Mortalität. Trotz jahrzehntelanger präklinische Forschung sind keine bewährten Therapien für TBI entwickelt worden. Dieses Papier stellt eine neuartige Methode zur präklinischen Neurotrauma Forschung vorhandenen präklinische Modellen ergänzen. Es stellt menschliche Pathophysiologie durch den Einsatz von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Neuronen (HiPSCNs). Es erreicht laden Puls Dauer ähnlich wie die Beladung Dauer der klinischen geschlossen Kopf Auswirkungen Verletzungen. Das Unternehmen beschäftigt eine 96-Well-Format, die erleichtert das Hochdurchsatz Experimenten und effiziente Nutzung von teuren Zellen und Kultur Reagenzien macht. Silikonmembranen sind zuerst behandelt, um neurotoxische ausgehärtete Polymer zu entfernen und dann verklebt kommerzielle 96-Well-Platte stellen, dehnbare 96-Well-Platten schaffen. Ein Custom-Built Gerät wird verwendet, um einige oder alle der gut Böden von unten, einrücken, induzieren äquibiaxial mechanische Belastung, der Zellen in der Kultur in den Vertiefungen mechanisch verletzt. Die Beziehung zwischen Eindringtiefe und mechanischer Belastung richtet sich empirisch mit high-Speed-Videografie gut Böden bei Einzug. Zellen, einschließlich HiPSCNs, können auf diese silikonmembranen mit modifizierten Versionen von konventionellen Zelle Kultur Protokolle kultiviert werden. Fluoreszierende mikroskopische Aufnahmen von Zellkulturen werden erworben und analysiert nach einer Verletzung in einem semi-automatischen Mode, die Höhe der Verletzung in jede Vertiefung zu quantifizieren. Das vorgestellte Modell ist optimiert für HiPSCNs aber könnte theoretisch auf andere Zelltypen angewendet werden.
Introduction
TBI ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität in den Vereinigten Staaten verursacht rund 52.000 Todesfälle und 275.000 Krankenhausaufenthalte pro Jahr1. Mehr als 30 klinische Studien der Kandidat Therapeutika für TBI wurden ohne einen einzigen Erfolg2durchgeführt. Dieses einheitliche Versagen legt nahe, dass Mensch-spezifische Prozesse der Pathophysiologie beobachtet in gängigen vorklinischen Nager-Modelle menschlichen TBI trennen.
Das Aufkommen des HiPSCNs schuf Neurotrauma in einem menschlichen in-vitro- Modell zu lernen. Drogen-screening mit HiPSCN-basierte Modelle kann Ergebnisse liefern, die mehr vorausschauende klinischen Erfolg als Modelle Nagetiere Zellen beschäftigt sind. HiPSCNs können auch genetisch manipuliert werden, um zu isolieren und die Wirkung der einzelnen menschlichen genetischen Varianten auf Pathologie3studieren.
In diesem Manuskript beschriebene Methode soll die einzigartigen Vorteile der HiPSCN-basierte Krankheit Modellierung bis Neurotrauma bringen. In-vitro- Stretch Verletzungen Modelle von Neurotrauma sind gut etablierte4,5,6 mit primären Nagetier Zellen und menschlichen neuronalen Krebszelllinien. Die meisten dieser Modelle erzeugen Strecke durch pneumatisch laden eine Silikonmembran. Dieser Ansatz ist wirksam bei einer einzigen-well-Format aber schwierig, bis hin zu einem Multi-well-Format7bewährt. Infolgedessen gab es nie ein hohen Durchsatz-Bildschirm für Agenten, Stretch verletzte Neuronen zu behandeln.
In diesem Modell erstreckt sich die Membran durch Einrückung von unten mit einer starren Eindringkörper. Dieser Ansatz hat immer wieder gezeigt, klinisch relevante Pathologie in Vitro in einzelnen Brunnenanlagen8,9,10zu generieren. Unsere jüngsten Arbeit hat gezeigt, dass es leicht auf einem 96-Well-Format skaliert unter Beibehaltung Pulsdauern in der Größenordnung von zehn Millisekunden11, das ist die Zeit, die Domäne der Kopf Auswirkungen Veranstaltungen12,13geschlossen.
Zusammenfassend lässt sich sagen sind die wichtigsten Vorteile dieses Modells in-vitro- Verletzung der 96-Well-Format, die Verwendung von HiPSCNs und klinisch relevanten Zeitbereich der Beleidigung.
Protocol
(1) Silikon-Entgiftung
- 7,5 cm x 11 cm Rechtecke mit einer Rasierklinge und ein Acryl-Vorlage geschnitten Sie 254 µm dick, 30,48 x 30,48 cm silikonmembranen. 10 rechteckigen Membranen können mit jedem Blatt erfolgen. Speichern Sie das Papier, das mit dem Silikon kommt.
- Legen Sie die Membranen in einer Wanne mit deionisiertes (DI) Wasser mit Seife Glaswaren. Einzeln nacheinander, Schrubben die Membranen kräftig mit behandschuhten Fingerspitzen für mindestens 20 s oder bis eingeseift.
- Spülen Sie die Membranen unter fließendem DI-Wasser, bis die Seife eingeschäumt sichtbar entfernt wird. Legen Sie die Membranen auf Papier (aus der Verpackung) und Autoklaven auf eine Schwerkraft-Zyklus.
-
Genießen Sie jedes Silikonmembran in 250 mL 70 % igem Ethanol pro Membran auf einem Orbitalschüttler bei 60 u/min für 24 h Nutzung einen Container, gefertigt aus einem Material, das nicht mit Ethanol, wie Polypropylen reagiert.
- Wenn mehr als eine Membran in einem einzelnen Lagerplatz befindet, oder wenn die Membranen an den Boden des Kastens zu halten, trennen die Membranen aus ihrer Umgebung mit Kunststoff Pipettenspitzen und pipette Tipp-Racks.
- Die silikonmembranen mit behandschuhten Händen auf 250 mL VE-Wasser pro Membran übertragen und auf die Orbitalschüttler für 48 h bei 60 u/min einweichen.
- Legen Sie die Membranen wieder auf dem Papier und in einem 93 ° C Glaswaren Ofen für 4 h.
- Speichern Sie die Membranen auf dem Papier, in einem sauberen und trockenen Ort, bedeckt mit einem anderen Blatt Papier, um sie vor Staub zu schützen.
2. Platte Herstellung
- Plasma einer 96-Well-Platte oben mit ein 200 W Plasma Reiniger behandeln (siehe Tabelle der Materialien) für 60 s bei hoher Leistung, indem es unteren Seite nach oben in das Plasma Reiniger. Suchen Sie einen violetten Schimmer sichtbar durch das Fenster der Kammer, die angibt, dass eine wirksame Plasma gebildet hat. Diese Klebetechnik wird angepasst von Sunkara Et al. 14
- Innerhalb von 60 s, legen Sie den oberen Platte in 200 mL 1,5 % (3-Aminopropyl) Triethoxysilane (APTES) in VE-Wasser für 20 min, unten-Side-Down. Diese Lösung ist instabil: bereiten Sie es nicht mehr als 60 s vor der Einführung der Plattenrandes.
Achtung: Arbeiten Sie mit APTES unter einem Abzug. - Plasma behandeln einen extrahierten Silikonmembran im Plasma Reiniger für 60 s bei hoher Leistung. Die Plasmabehandlung Zeit, so dass es nicht mehr als 5 min vor dem Ende der 20 min im Schritt 2.2 beendet.
- Verwenden Sie Zangen behandelt Plasmamembran auf eine 7,5 x 11 cm2 Pergament Papier Rechteck zu positionieren. Richten Sie eine 7,5 cm x 11 cm x 0,5 cm-Aluminium-Platte auf dem unteren Teil der Platte Herstellung Schelle. Richten Sie das Silikon-Membran und Pergament Papier auf der Aluminium-Platte mit Pinzette.
Hinweis: Computer aided Design (CAD) Dateien für dieses Gerät sind ausgestattet in den ergänzenden Materialien als eine ergänzende Codedatei "Presse sterben - generische 3D. SCHRITT ". Die zugehörige Stückliste wird geliefert ergänzenden Tabelle1: Custom gebaut Geräte - BOM.xlsx. - Entfernen Sie die Platte Spitzen aus dem APTES Bad und überschüssige Lösung abschütteln. Tauchen Sie ein in ein 200 mL DI Wasserbad für 5 s und schütteln Sie überschüssiges Wasser. Tauchen Sie ein in eine andere 200 mL DI Wasserbad für 5 s und schütteln Sie überschüssiges Wasser. Ersetzen Sie das Wasser in diese Bäder vor dem Eintauchen eine andere Platte oben.
- Verwenden Sie Druckluft Platte oben vollständig trocknen.
- Legen Sie den Teller oberen im oberen Bereich der Platte Herstellung Schelle. Schließen Sie sanft die Platte Herstellung Klammer um die Platte oben und Silikon zusammen drücken. Klemme für mindestens 1 h.
- Lassen Sie die Platte für 24 h bei Raumtemperatur vor Gebrauch, staubgeschützt zu heilen.
(3) erstreckt sich eine Platte
- Reinigen der Eindringkörper.
Hinweis: Siehe ergänzende Abbildung 1.- Bereiten Sie eine 60 W Bad-Stil sonikator mit DI Wasser bei Raumtemperatur.
- Unterstützung der Eindringkörper Block über dem sonikator Bad, invertiert, so dass nur die Spitzen der Eindringkörper bis zu einer Tiefe von mindestens 1 mm. eingetaucht bist beschallen die Eindringkörper für 8 min bei 42 kHz.
- Der Eindringkörper mit komprimierter Luft Föhnen.
- Ausrichten des Eindringkörpers Blocks.
- Positionieren Sie eine Kamera mit einer live-Feed über die ausdehnende Vorrichtung so, dass sie auf dem Eindringkörper Array sucht. Konzentrieren Sie sich auf den Gipfeln der Eindringkörper.
Hinweis: Das Setup beschrieben in Abschnitt 4, "Charakterisierung der Membran-Stretch" ist eine mögliche Kamera-Setup für diese Aufgabe. - Sichern einer Platte auf der Bühne der Verletzung Gerät über die Bühne-Klemmen (Abbildung 1) und legen Sie eine Innenbeleuchtung über das Gerät.
Hinweis: Siehe die Tabelle der Materialien für die Instrument-Steuerungs-Software. - Starten Sie die Instrument-Steuerungs-Software durch Klicken auf das Icon auf dem Desktop des Computers, der die Verletzung Gerät steuert. Führen Sie das "in_vitro_neurotrauma.lvproj"-Projekt, indem Sie darauf im Fenster "Start" klicken. Starten Sie aus dem Projektfenster die Bewegungssteuerung und positionieren Sie Tracker virtuelle Instrumente (VIs), die "motion_control.vi" und "position_tracker.vi", bzw. benannt werden, indem Sie darauf doppelklicken.
- Schließen Sie den Käfig rund um die Verletzung Gerät. Drücken Sie die Taste "Pfeil" in der oberen linken Ecke der Bewegungssteuerung VI führen Sie das VI und klicken Sie auf "In der Nähe von unten" um die Bühne, um innerhalb von 2 mm zur Kontaktaufnahme mit dem Eindringkörper zu senken. Klicken Sie auf "Beenden" um das VI zu stoppen.
Achtung: Halten Sie Hände Deaktivieren der Bahre, wenn die Kamera in den Käfig zu manipulieren. Der Käfig sollte mit einem Türschalter montiert werden, die Macht an die Dehnung Gerät liefert, nur, wenn die Käfigtür geschlossen wird. - Im Projektfenster Rechtsklick auf "Achse 1". Klicken Sie auf "Interaktives Testpanel". Legen Sie in dem, das sich öffnenden Fenster die Schrittgröße bis 50 µm durch Eingabe von "500" Einheiten im Feld 'Sollposition'.
- Klicken Sie die grüne "gehe" Taste an der Unterseite des Fensters "Interaktives Testpanel" wiederholt bis die Platte zuerst Kontakt mit jedem Eindringkörper. Suchen Sie nach Kontakt auf das live-Bild der Kamera angezeigt. Hinweis die vertikale Tischposition im berichtet oben links des Fensters "Interaktives Testpanel"; Dies ist der erste Kontakt Position.
- Weiter senken (wie in Schritt 3.2.6 beschrieben), bis alle gut gemacht, hat Kontakt mit dem Eindringkörper. Falls erforderlich, bewegen Sie die Kamera zu sehen, die ganze Platte und verschieben Sie die Phase (durch Angabe einer negativen Zielposition) und nach unten. Hinweis die vertikale Tischposition im berichtet oben links im Fenster, wenn alle Beiträge in Kontakt sind (Dies ist die Vollkontakt-Position).
- Beachte den Unterschied zwischen dem ersten Kontakt und Vollkontakt Positionen. Schließen Sie das "interaktiver Test-Panel". Motion Control VI ausführen (siehe Schritt 3.2.4) und klicken Sie auf "Top" auf die Bühne zu erhöhen. Die Bewegungssteuerung VI mit der Taste "Stop" zu stoppen.
- Sobald die Phase am Ende seiner Reise ist, öffnen Sie die Tür, um das Gerät zu deaktivieren. Passen Sie die Schrauben an den Ecken des Eindringkörpers Blocks. Lösen Sie die Schraube an der Ecke, die Kontakt erste, um es zu senken und die gegenüberliegende Schraube um die Ecke zu erhöhen, die Kontakt letzte gemacht.
- Wiederholen Sie den Vorgang die Bühne zu senken, bis die Platte der Eindringkörper Kontakte, Inspektion der Kontaktbilder für Neigung, Erhöhung der Bühne und Anpassung (Schritt 3.2.9) des Eindringkörpers blockieren. Wenn die Bühne und Block ausgerichtet sind, machen alle Eindringkörper kontaktieren Sie sofort.
- Öffnen Sie die Tür, um das Gerät zu deaktivieren. Die Tie-Down-Schrauben in die Löcher auf dem Eindringkörper Block und festziehen. Bestätigen Sie, dass der Block mit den Tie-Down-Schrauben im Ort (Schritte 3.2.4-3.2.8) liegt. Achten Sie auf die Bühne-Position von der "interaktiven Testpanel" gemeldet, wenn die Platte macht Kontakt. Dies wird die Nullstellung für Einrückung Experimente sein.
- Positionieren Sie eine Kamera mit einer live-Feed über die ausdehnende Vorrichtung so, dass sie auf dem Eindringkörper Array sucht. Konzentrieren Sie sich auf den Gipfeln der Eindringkörper.
- Schmieren der Eindringkörper.
- Wenn der Eindringkörper Block nur eingerichtet wurde und noch nicht geschmiert, reinigen eine Vollgummi-Pad (7,5 cm x 11 cm x 1,5 mm) und einen weichen, geschlossenzelle Schaumstoff-Pad (7,5 cm x 11 cm x 3 mm) mit einer Ethanol-getränkten Lab wischen. Lassen Sie sie an der Luft trocknen.
- Genießen Sie ein Labor abwischen Maisöl und breitete sie auf Vollgummi-Pad zu einem dumpfen Glanz.
- Legen Sie das Schaumstoff-Pad auf der Vollgummi-Pad, Öl auf den Schaumstoff-Pad zu übertragen. Legen Sie eine 7,5 cm x 11 cm x 0,5 cm-Aluminium-Platte auf das Schaumkissen und laden Sie es mit ein ballastgewicht von ca. 360 g (z. B.6 konische Rohre mit 45 mL Wasser pro geladen), konsequente Übertragung von Öl aus Vollgummi-Pad auf das Schaumkissen zu gewährleisten. Ermöglichen 10 s für das Öl auf das Schaumstoff-Pad übertragen.
- Das Schaumstoff-Pad auf dem Eindringkörper Array zu bewegen. Legen Sie die Aluminium-Platte und das Vorschaltgerät Gewicht oben drauf um konsequente Übertragung des Öls bis in die Spitzen der Eindringkörper zu gewährleisten. Ermöglichen 10 s für das Öl auf der Eindringkörper übertragen.
- Wenn keine Platte gedehnt wurde, da der Eindringkörper Block eingerichtet wurde und zum ersten Mal geschmiert Strecken Sie eine Testplatte vor Beginn des Experiments.
Hinweis: Dadurch wird Unstimmigkeiten zwischen der ersten Strecke und anschließende Strecken verhindert Störfaktoren das Experiment. Wiederholen Sie für nachfolgende Abschnitte nur Schritte 3.3.2-3.3.5 vor jeder Strecke.
- Eine Platte zu dehnen.
- Schmieren Sie die Eindringkörper, wie unter Punkt 3.3 beschrieben.
- Befestigen Sie die Platte auf der Bühne des Geräts Verletzungen mit der Bühne Klemmen. Wenn Sterilität erforderlich ist, passen Sie die Position des Deckels, die Platte zu sichern, ohne aussetzen der Kultur Oberfläche Raumluft.
- Senken Sie die Bühne, um die NULL-Position mit dem 'Motion Control VI "(siehe Schritte 3.2.4-3.2.6); NULL-Position wird bei Schritt 3.2 ermittelt.
- Ändern Sie den Dateinamen im Feld "Pfad" in der "position Tracking VI" für einen eindeutigen Dateinamen, führen Sie es dann mit der Taste "Pfeil" in der oberen linken Ecke des Fensters.
- Legen Sie die Tiefe und Dauer der Einrückung (in der Regel 1-4 mm und 30 ms, bzw. maximale Tiefe 5 mm, Mindestdauer 15 ms) in die "Verletzung (mm)" und "Verletzung Dauer (ms)" Felder "Bewegung über die Systemsteuerung VI' durch Klicken auf die Felder und in der gewünschten Eingabe Werte.
- Die "Bewegung-Systemsteuerung VI" und klicken Sie auf 'Injure' um die Platte einzurücken.
- Verschieben Sie die Phase bis zur Spitze von seinen Reisen durch Klicken auf "Top". Dann beenden Sie VI mit der Taste "Stop" und deaktivieren Sie die Verletzung Gerät durch Öffnen der Tür.
- Überprüfen Sie die Verschiebung Geschichte auf die Bühne, präsentiert in der "position Tracker VI" um zu bestätigen, dass die angegebene maximale Verschiebung angewendet wurde. Der rechten Maustaste auf das Diagramm, und klicken Sie auf "Export to Excel". Klicken Sie auf "Datei | Speichern ' um die Daten zu speichern.
4. Charakterisierung von Membran-Stretch
- Die Aussparung am oberen Rand jeder Eindringkörpers weiß für high-Speed-Videografie zu einem kontrastreichen Hintergrund zu malen.
Achtung: Nicht Lackieren die Felgen der Eindringkörper, wo sie machen, Kontakt mit Platten. - 3D Drucken mit Poly(lactic acid) (PLA) oder sonst zu fabrizieren, einen zylindrischen Stempel mit dem einen Punkt in jedem gut zu machen. Machen Sie den Zylinder 5,9 mm Durchmesser und 12,2 mm hoch, mit einer zylindrischen Vorsprung 1,5 mm Durchmesser und 1,0 mm hoch oben zentriert.
Hinweis: Eine druckbare 3D-Modell "Stempel. STL "ist als eine zusätzliche Datei verfügbar. - Plasma behandeln die Platte rechts-Side-Up zur Aktivierung der Silikon-Zelloberfläche-Kultur in den Vertiefungen für 60 s, wie in Schritt 2.1 erwähnt.
- Legen Sie die Platte auf eine Gummiunterlage oder anderen weichen Untergrund. Den kleinen Vorsprung auf dem Stempel Prime (siehe Punkt 4.2) mit Tinte aus einem permanent-Marker-Stift. Legen Sie den Stempel in den Brunnen zu prüfenden und tippen Sie, um gute Übertragung der Tinte zu gewährleisten. Grundieren Sie die Stempel vor jedem gut.
- Ausrichten des Eindringkörpers Blocks und Schmieren der Eindringkörper des Geräts Verletzungen (siehe Schritte 3.2-3.3). Spannen Sie die Platte auf die Bühne des Geräts Verletzungen. Positionieren Sie eine diffuse axiale helle über die Verletzung Gerät.
-
Einrichten einer Highspeed-Kamera auf einem Stativ Boom über die Verletzung Gerät, vor gerade nach unten mit dem Objektiv auf die kleinste nummerierten Blende gesetzt, und schalten Sie ihn ein. Starten Sie die Kamerasoftware auf dem Computer an die Kamera angeschlossen. Im Frame Rate Drop-down Menü drop wählen Sie 2.000 Frames pro Sekunde und in den Auslöser-down-Menü, wählen Sie die schnellste Belichtungszeit die kontrastreiche Bilder liefert. Center über die punktierten Vertiefungen.
- Positionieren Sie die Kamera, so dass das Sichtfeld 12 Brunnen in einem 3 x 4-Raster enthält.
Hinweis: Das Sichtfeld bietet einen optimalen Kompromiss zwischen Durchsatz und die Auflösung für ein 1.280 × 1.024 Bild.
- Positionieren Sie die Kamera, so dass das Sichtfeld 12 Brunnen in einem 3 x 4-Raster enthält.
- Die Platte, um den Nullpunkt zu senken (siehe Schritte 3.2.4-3.2.6). Ein-Klick den Datensatz Taste auf der Kamerasoftware, damit es "Trigger"liest. Initiieren des Lage Trackers VI (Schritt 3.4.4).
- Schalten Sie das Licht diffus axial. Einrücken der Plattenrandes, wie in Schritt 3.4.6 beschrieben.
- Schalten Sie das Licht diffus axial.
-
Auf der Kamera-Steuerrechner finden Sie die 30-40 ms-Fenster der Aufnahme, in der die Einrückung auftritt: ziehen Sie die Pfeile, Anfang und Ende in der High-Speed-video-Wiedergabe-Bar in der Kamerasoftware. Klicken Sie auf speichern, legen Sie den Namen in das Feld "Dateiname", wählen Sie "TIFF" im Feld "Format" und klicken Sie auf "Speichern".
- Schauen Sie durch die. TIF-Dateien für Bilder der am wenigsten gestreckt (Anfang) und am meisten gedehnt (Peak Einrückung) Staaten.
- Um die Höhe und Breite der Punkte in beiden Bildern zu messen, verwenden Sie Fidschi zum Öffnen der Bilder der am wenigsten und Spitze Stretch Side-by-Side. Mit dem Standard-rechteckige Auswahl-Werkzeug Klicken Sie und ziehen Sie einen Rahmen um einen Punkt in das zuletzt Stretch Bild zeichnen. Messen Sie die Höhe und Breite mit "Analyze | Maßnahme ".
- Wiederholen Sie für den Punkt in der gleichen Brunnen auf der Spitze Stretch Bild. Wiederholen Sie für den Rest der Brunnen.
- Berechnen Sie die Lagrange-Belastung in der x- und y -Richtung wie folgt:
Hinweis: Hier, EXx ist die Lagrange-Dehnung in X -Richtung, E-Yy ist die Lagrange-Belastung in y -Richtung, X ist die Breite des Punktes, Y ist die Höhe des Punktes, f bezeichnet das endgültige Bild (d. h., die Gipfel Einzug Bild), und ich das Anfangsbild (d. h., das Bild vor Einzug) bezeichnet. Durchschnitt der beiden Werte um die Belastung in diesen Brunnen zu bestimmen.
(5) Beschichtung der kultivierten Zellen
- Autoklaven der Lagerplätze und Ballastgewichte, die für die Sterilisation verwendet werden.
- Plasma behandeln die Silikon-Talsohle Platten rechts-Side-Up für 60 s (siehe Punkt 2.1). Sofort Tauchen Sie die Platten in sterilen Behälter mit 70 % Ethanol zu 15 Minuten.
- Tauchen Sie die Platten in sterilen Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in separaten sterilen Behälter für 30 min.
- Aspirieren der PBS aus den Brunnen. Nur eine Trockenplatte gleichzeitig zu verhindern, dass der Brunnen die Plasmabehandlung verlieren.
Achtung: Silikon Boden Platten weniger taktiles Feedback als starren Platten beim pipettieren und sind eher zu einer PIPETTENSPITZE blockieren. - Die sterilisierten Platten 100 µL von 0,1 mg/mL Poly-L-Ornithin (PLO) pro Bohrloch hinzufügen. Inkubation bei Raumtemperatur für 1 h.
- Spülen Sie die Brunnen zweimal mit 100 µL steriler PBS, die zweite Wäsche auf den Brunnen zu verlassen, bis die Zellsuspension bereit ist.
- Entfernen Sie das Fläschchen des HiPSCNs von flüssigem Stickstoff-Speicher mit Schutzhandschuhen und auf Trockeneis. Schnell transportieren Sie das Fläschchen auf 37 ° C Wasserbad zu und tauen Sie genau 3 Minuten lang auf. Schwenken Sie das Fläschchen nicht.
- Übertragen Sie in einem sterilen Haube sanft der Inhalt der Durchstechflasche auf eine 50 mL konische Rohr mit einer serologischen 1 mL-Pipette.
- Spülen Sie das leere kryogene Fläschchen mit 1 mL der Raumtemperatur komplette Wartung Medium (MediaBase + Zuschlag).
- Übertragen Sie 1 mL der Medien in der 50-mL-Tube tropfenweise auf etwa einen Tropfen pro Sekunde. Vorsichtig schwenken das Rohr beim Hinzufügen. Die 50 mL-Tube mit ca. 2 Tropfen/s 8 mL Raumtemperatur komplette Wartung Medium hinzufügen.
- Die Röhrchen und invertieren 2-3 Mal. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer. Berechnen Sie das Volumen der zusätzlichen Medien erforderlich, um die Zellsuspension auf 225.000 Zellen/mL zu verdünnen.
- Pipette vorsichtig die Menge an Medien (oben berechneten) auf dem Rohr der Zellsuspension mit einer serologischen 25 mL-Pipette.
- Fügen Sie 10 µL 1 mg/mL Laminin Lager pro 1 mL Zellsuspension mit einem 1.000 µL Mikropipette 10 µg/mL von Laminin in der Zellsuspension zu erreichen. Aspirieren Sie einmal rauf und runter mit der Spitze für Laminin, verwendet dann Röhrchen Sie die und umkehren Sie den Schlauch einmal.
- Aspirieren Sie die PBS von den Platten, eine Platte zu einem Zeitpunkt. Verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette, 100 µL Zellsuspension HiPSCN in jede Vertiefung hinzuzufügen. Die Brunnen haben Kulturkreis 0,33 cm2, so dass die Zelldichte pro Fläche 67.500 Zellen/cm2.
- Ruhen Sie die Platten bei Raumtemperatur 15 Minuten nach der Aussaat zur Förderung der Anlage. Um Fan Schwingungen der sterilen Kultur Haube zu vermeiden, legen Sie die überdachte Platten auf dem Labortisch. Inkubation der Kulturen bei 37 ° C mit 5 % CO2.
- Führen Sie eine vollständige Medienwechsel bei 24 h, Nachfüllen der Brunnen mit 200 µL der kompletten Wartung Medien. Führen Sie eine halbe, die Medien von 100 µL/Well alle 2-3 Tage gewechselt.
6. verletzt der Kulturen
- Richten Sie des Eindringkörpers Blocks aus und finden Sie die NULL-Position zu, wie in Schritt 3.2 beschrieben. Schmieren Sie die Eindringkörper, wie unter Punkt 3.3 beschrieben.
- Legen Sie den Dateinamen für die Geschichte der Vertreibung in Position Tracker VI (Schritt 3.4.4). Legen Sie die Verletzung Parameter in Motion Control VI (Schritt 3.4.5).
- Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator verletzt werden und Klemmen Sie es auf die Bühne. Passen Sie die Position des Deckels, die Platte zu sichern, ohne dass die Kulturen an Raumluft ausgesetzt.
- Senken Sie die Platte auf den NULL-Punkt (Schritte 3.2.4-3.2.6) mit der "Motion Control VI". "Lage Tracker VI" starten (Schritt 3.4.4).
- Verwenden Sie die Bewegungskontrolle VI die Platte einrücken (wie in Schritt 3.4.6 beschrieben). Überspringen Sie für Schein erstreckt nur diesen Schritt.
- Die Bühne an die Spitze der seine Bewegungsfreiheit zurück (siehe Schritt 3.4.7). Die Platte in den Inkubator zurück.
- Prüfen Sie und speichern Sie die Hubraum-Spur (wie in Schritt 3.4.8).
(7) Mikroskopie
- Bereiten Sie ein 10 x Färbelösung mit 2 µg/mL Hoechst 33342 und 5 µg/mL Calcein AM in Wartung Medien vor.
- Jeder Fleck gut mit einer Spitze 20 µL 10 x Färbelösung.
- 15 min mit Fleck bei 37 ° c inkubieren
- Weites Feld fluoreszierende Bilder zu erwerben. Einsatz konventioneller FITC und DAPI Filtersätze, Calcein AM und Hoechst 33342 Signale bzw. abzubilden. Wenn die Multi-gut bildgebende Sequenz mehr als 10 min dauert, schließen Sie die Platte in eine Bühne Top Inkubator zur Erhaltung der Gesundheit der Kulturen.
Hinweis: Ein 10 X 0,30 NA Objektiv bietet ausreichend detailliert zur Bestimmung der Zellviabilität und Morphologie. Stellen Sie Gewinne dafür gute Visualisierung von Neuriten, selbst wenn dadurch etwas Sättigung der viel heller Soma. - Segment live Zelle Bilder in den grünen Calcein AM Kanal, Soma und Neuriten zu identifizieren. Verwenden Sie nukleare Bilder im Blaukanal Hoechst 33342 gerne bei der Identifikation der Soma.
Representative Results
Die Bahre Gerät ist in der Lage, Bewegung der Bühne wiederholbar mit Pulsdauern so kurz wie 10-15 ms abhängig von der Amplitude des Impulses (Abbildung 2A). Die Puls-Amplituden sind höchst wiederholbar, aber die Impulsdauer variiert von ca. 1 ms zwischen Wiederholungen. Die tatsächlichen Puls Amplitude weicht von der vorgeschriebenen Puls Amplitude wenn eine große Anzahl von Brunnen werden geladen, und die vorgeschriebene Amplitude hoch (siehe Abb. 2 b). Mit zunehmender Amplitude Phase Hubraum über 3 mm unterschreitet die tatsächliche Verdrängung Amplitude zunehmend die zwangsverschiebung Amplitude (siehe Abbildung 2 b). Sorgfältige Ausrichtung des Blocks Post entfällt jeder Trend in der Membran Belastung in Zeilen oder Spalten (Abbildung 2). An der 3,5 mm vorgeschrieben Bühne Verdrängung Amplitude (3,3 mm tatsächliche Verdrängung Amplitude) mit 52 Brunnen nicht eingerückt, der mittlere Lagrange-Stamm an allen Standorten gut wurde 0.451 (Standardabweichung der Mittel für alle Standorte = 0,051, Mittelwert der Standardabweichungen für alle Standorte = 0,065, n = 5 Messungen pro Well). Diese Ergebnisse werden hier auf Vollständigkeit vorgestellt, obwohl einige von ihnen bereits gemeldeten11 wurden.
Eine optimale, unverletzte Kultur haben wenige oder gar keine Klumpen von mehr als 5 Zellen. Neuriten werden einzelnen, langen, schlanken und geschwungenen mit wenig oder gar keine Zeichen von Anspannung oder Sicken (Abb. 3A). Unter idealen Bedingungen die Lebensfähigkeit der Kulturen sollte eng nähern sich die Tragfähigkeit gemäß Datenblatt des Herstellers (in der Regel 60-70 %) und Kulturen auf Silikon sollte ähneln denen auf herkömmlichen starren Kultursubstrate ( gepflegt Abb. 3 b). Neuriten möglicherweise oder möglicherweise nicht auf einem low-Power-Hellfeld-Mikroskop sichtbar. Laminin Konzentration und Zelldichte beeinflussen Kulturen zu Studienbeginn und nach Verletzungen. Erhöhung der Zelle Dichte erhöht die Anzahl und Größe der Klumpen, die sich in der Kultur gebildet. Erhöhung der Konzentration von Laminin oft entgegen dieser Effekt (Abb. 3A). Allerdings erhöht die Laminin Konzentration abgestumpft zu viel die Empfindlichkeit der Kulturen zu Verletzungen (Abbildung 4). Die optimale Laminin-Konzentration für unverletzt Kulturen war 50 µg/mL von Laminin (Abbildung 3), aber die optimale Trennung zwischen der Schein und Stretch verletzte Bevölkerung erhielt bei 10 µg/mL von Laminin (Abbildung 4). Höhere Konzentrationen von Laminin reduziert die Empfindlichkeit der Kulturen zu Verletzungen in kürzester Zeitpunkte (Abbildung 4), aber auch verbesserte Grundlinie Zellviabilität zu längeren Zeitpunkten (z.B.7 Tage). Zusammenfassend lässt sich sagen lohnt es sich, die Laminin-Konzentration für jedes experimentelle Szenario zu optimieren.
Membran-Stamm, bildgebenden Zeitpunkt nach der Verletzung, Laminin Konzentration und Zelldichte ausgeübt eine statistisch hoch signifikant Haupteffekt auf die Neuriten Länge pro Zelle (ANOVA, p < 0,001). Die Wirkung der Membran Belastung Neuriten Länge pro Zelle hatte statistisch hoch signifikante Wechselwirkungen mit posttraumatischen bildgebenden Punkt und Laminin Konzentrationszeit (ANOVA, p < 0,001) und eine statistisch signifikante Wechselwirkung mit Zelle Dichte (ANOVA, p < 0,05). Ebenso Membran Belastung, posttraumatischen cell imaging Zeitpunkt, Dichte und Laminin Konzentration aller ausgeübt eine statistisch hoch signifikant Hauptwirkung im Zellviabilität (ANOVA, p < 0,001). Die Wirkung der Membran Belastung im Zellviabilität hatte eine statistisch hoch signifikante Interaktion mit der posttraumatischen bildgebenden Zeitpunkt (ANOVA, p < 0,001) und eine statistisch signifikante Wechselwirkung mit der Zelldichte (ANOVA, p < 0,05). Diese Ergebnisse belegen, dass Timing, Zelldichte und Laminin Konzentration üben einen wichtigen Einfluss auf die Beziehung zwischen der angewandten Beleidigung und experimentelle Ergebnisse so jeweils sorgfältig optimiert werden sollte.
Niedrige Zellviabilität und Perlen Neuriten, zusammen mit verkümmerte Neuriten Wachstum zeigen, dass giftige Kulturbedingungen, die aus unsachgemäßer entstehen können Silikon vorbereitet. Überspringen oder Verkürzung der Wasser einweichen oder den Ofen trocken kann lassen absorbiert Ethanol oder Wasser in die Membran, bzw. die in den Medien zu verbreiten und betonen die Zellen können. Gut verletzte Kulturen werden Zellviabilität, verkürzte oder fehlende Neuriten, wulstige Neuriten und Neuriten, die straff oder gespannten aussehen reduziert haben. Verletzung kann verursachen Klumpenbildung in Zellkulturen, die waren gut dispergierte vor Verletzungen. Große Klumpen können die morphologische Analyse verwechseln. Für die morphologische Analyse sollten die Schadensschwelle optimiert werden, so dass spürbare Veränderungen auftreten, aber Zellen noch vorhanden, mit einigen Neuriten sind.
Abbildung 1 : A beschriftet schematische des Geräts Verletzungen. (A) Draufsicht (B) isometrische Ansicht, Vorderansicht (C), (D) Rechte Seitenansicht. Die Maßstabsleiste gilt grundsätzlich für die orthogonalen (A, B und D). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Kinematik der mechanischen Beleidigung. (A) die Bühne Verschiebung Geschichten über 5 Impulse bei einer Reihe von vorgegebenen Amplituden (vorgeschriebene Amplituden sind in der Legende aufgeführt) Wenn keine Brunnen geladen sind. (B) die Bühne Verschiebung Geschichten über 10 Impulse bei einer Reihe von vorgegebenen Amplituden (vorgeschriebene Amplituden sind in der Legende aufgeführt) als 52 Brunnen werden geladen. (C) die durchschnittliche Belastung in jede Vertiefung mit Bühne Verdrängung Amplitude von 3,3 mm (n = 5 Messungen pro Bohrloch, durchschnittliche Standardfehler pro Bohrloch = 0.029). Beachten Sie, dass C4-F4 und C9-F9 ungedehnten Kontroll-Vertiefungen sind. Diese Zahl wurde von Sherman Et Al. modifiziert 11 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Optimierung der Kultur Bedingungen auf Silikon. (A) die Wirkung unterschiedlicher Dichte und Laminin Zellkonzentration auf HiPSCN Kulturen auf Silikon. Verklumpung steigt mit zunehmender Zelldichte und abnehmender Laminin Konzentration. Dichte und Laminin Zellkonzentration muss optimiert werden, um Mono-zerstreut Kulturen zu erreichen. Mono-zerstreut Kulturen sind weniger anfällig für Artefakte während Quantifizierung. Beachten Sie, dass der dynamische Bereich Visualisierung von den Neuriten optimieren angepasst worden. Infolgedessen sind die viel hellere Soma gesättigt. Diese Präsentation wird bevorzugt auf die Alternative der Optimierung des dynamischen Bereichs in Bezug auf die Soma, die viel Dimmen Neuriten fast unsichtbar macht. Die Bedingung, die durch das rote Quadrat hervorgehoben wurde als optimal für in-vitro- Stretch Verletzung Experimente. (B) unter optimalen Bedingungen, Kulturen auf silikonmembranen erscheinen ähnlich wie Kulturen auf herkömmlichen starren Substraten. Die linke Tafel zeigt HiPSCNs bei 33.750 Zellen/cm2 mit 3,3 µg/mL Laminin auf eine herkömmliche, starre 96-Well-Platte (das anzuchtsubstrat Zelle ist eine Gewebekultur behandelt zyklische Olefin-Copolymer) kultiviert. Im Rechte Bereich reproduziert das Panel in rot von (A) beschrieben. Skalieren von Balken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Die Verletzung Phänotyp und seine Abhängigkeit von Laminin Konzentration. (A) gesunde Kultur, mit 10 µg/mL Laminin und 67.500 Zellen/cm2. Neuriten sind längst keine Perlen. Es gibt einige Tote Kerne und einige Klumpen. (B) Kultur mit der gleichen Kulturbedingungen, mit 57 % Spitze Dehnung verletzt und nach 4 Std. Neuriten verkürzt abgebildet oder fehlen, und einige haben Perlen (durch Pfeile angedeutet). Es gibt weniger Calcein AM-positiven Zellen und Calcein AM-negativer (d.h.tot) Kerne. Unter den Überlebenden Zellen verklumpen Verletzung gestiegen. (C) 4 h nach der Verletzung, lehnt Neuriten Länge pro Zelle mit zunehmender Belastung in einer Weise, die von der Laminin-Konzentration abhängt. (D) 4 h nach der Verletzung, lehnt Zellviabilität mit zunehmender Belastung in einer Weise, die von der Laminin-Konzentration abhängt. (E) 24 Stunden nach der Verletzung, lehnt Neuriten Länge pro Zelle mit zunehmender Belastung in einer Weise, die von der Laminin-Konzentration abhängt. (F) 24 Stunden nach der Verletzung, lehnt Zellviabilität mit zunehmender Belastung in einer Weise, die von der Laminin-Konzentration abhängt. (n = 4 pro bar, Fehlerbalken sind ± 1 Standardabweichung, Maßstabsleisten = 100 µm). Dehnungswerte sind aus Bühne Verschiebung anhand von Daten aus einer Vorveröffentlichung von Sherman Et Al. abgeleitet. 11 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Abbildung1: Technische Zeichnung des Eindringkörpers. Klicken Sie bitte hier, um diese Zahl zu downloaden.
Ergänzende Tabelle 1: Custom Built Geräte. Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 2:96 gut Platte-Loader Pinout Schaltplan. Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Code Datei 1: CAD-Zeichnungen des Geräts Verletzungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Ergänzende Code File 2: CAD-Zeichnungen der Platte Herstellung Schelle. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Ergänzende Code Datei 3: 3D-Darstellung der Stempel Geometrie, geeignet für den Einsatz mit einem 3D-Drucker. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Ergänzende Code Datei 4: SubVI für MuStLiMo_si_initialize.vi, die ein SubVI für motion_control.vi ist. Parameter für Bewegung verwandelt Einträge in Dialogfeldern. Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Code Datei 5: SubVI für mehrere geraden Linie Moves_simplified.vi, die ein SubVI für motion_control.vi ist. Parameter für Bewegung verwandelt Einträge in Dialogfeldern. Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Code Datei 6: SubVI für position_tracker.vi. Zähler Spuren Verschiebung von linearen Encoder-Eingang. Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Codedatei 7: LabVIEW-Projekt stützen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Ergänzende Code File 8: Top Level VI, die das Gerät bewegt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Ergänzende Code Datei 9: SubVI für motion_control.vi. Führt die schnelle Verschiebung, die die Platte erstreckt. Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Code Datei 10: SubVI für motion_control.vi. Führt die langsame Verschiebung, die die Bühne bewegt. Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Code Datei 11: SubVI für motion_control.vi. Grundstücke (in der Regel Blickwinkels) Hubraum Geschichte in der Systemsteuerung motion_control.vi. Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Code Datei 12: Top Level VI, in dem die Verschiebung Geschichte aufgezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Ergänzende Code File 13: enthält Variable2, die kommuniziert, zwischen motion_control.vi und position_tracker.vi. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Ergänzende Code Datei 14: Schematische für Leiterplatte. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Ergänzende Code Datei 15: Layout für Leiterplatte. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Discussion
Der Schlüssel zur Erlangung eines konsistenten, wendet Biofidelic Phänotyp in diesem Modell eine konsistente Biofidelic mechanische Beleidigung. Dieses Modell kann Puls Dauer so kurz wie 10-15 ms, generieren die Pulsdauern für menschliche Kopf Einflüsse nach cadaveric Experimente12,13ähneln. Die Konsistenz dieser Beleidigung richtet sich nach der Ausrichtung der Platte mit dem Eindringkörper Block und konsequente Schmierung der Eindringkörper. Wenn der Eindringkörper Block gut ausgerichtet ist, gibt es kein Trend in der angewandten Belastung in Zeilen oder Spalten (Abbildung 2). Eine dünne Schicht Gleitmittel erstellt in der Regel weniger Reibung als eine dicke Schicht und zähe Fette sind nicht empfohlen, da sie das Silikon foul und behindern den Durchgang des Lichtes während Mikroskopie. Die derzeitige Phase Verdrängung Amplitude kann wesentlich unterschreiten die zwangsverschiebung Amplitude wenn viele Eindringkörper verwendet werden, und die vorgeschriebenen Bühne Verdrängung Amplitude ist groß (> 3 mm). Jedoch während die tatsächliche Verschiebung kleiner als die zwangsverschiebung an große Amplituden ist, bleibt es wiederholbar (Abb. 2 b). Also, große, tatsächliche Verschiebungen Amplituden zuverlässig erhalten Sie durch einen vorgeschriebenen Wert über den gewünschten Wert eingeben. Verdrängung Amplitude zählt nur weil es einen leicht aufgezeichneten Proxy für die Peak-Membran-Sorte, die direkt die mechanische Beleidigung misst, die Pathologie induziert. Daher ist für die Bestimmung der Membran Belastung von Bühne Verschiebung beschriebene Verfahren entscheidend. Dieser Prozess sollte wiederholt werden, wenn alle wichtigen Änderungen an das System, das die Interaktion zwischen der Platte und der Eindringkörper, zum Beispiel, wenn verschiedene beeinflussen Durchmesser Eindringkörper, verschiedene Eindringkörper Materialien oder Beschichtungen oder verschiedene Arten von Silikon Talsohle Teller dienen. Der Prozess der Neuausrichtung des Eindringkörpers Blocks und Bestimmung der Nullstellung sollte zu Beginn jedes Experiment wiederholt werden. Eine schematische Darstellung der ausdehnende Vorrichtung ist in Abbildung 1dargestellt. CAD-Modelle benötigt, um das Gerät zu reproduzieren sind als zusätzliches Material zur Verfügung gestellt: "Verletzung Gerät - Vollversammlung - generische 3D. SCHRITT "; die zugehörige Stückliste zur Verfügung gestellt alsergänzenden Tabelle1: Custom gebaut Geräte - BOM.xlsx. Siehe auch ergänzende 2 96 gut Tischplatte _loader – Belegung Verdrahtung Diagram.xlsx, beschreibt die Verkabelung Anschlüsse, die verschiedenen Komponenten der Systeme zu verbinden. "Interconnector_circuit_board.dip" beschreibt eine Platine, die die Kabel miteinander verbindet.
Wenn das Gerät mit der Bühne in der Mitte des Bewegungsbereichs deaktiviert ist, wird die Bühne bewegen, nachdem die Stromversorgung unterbrochen ist, da es federbelastet ist. Wenn die Stromversorgung wiederhergestellt ist, erkennt die Feedback-Schleife einen großen Unterschied zwischen der letzten bekannten vorgeschriebenen Position und die aktuelle Position. Dadurch wird die Bühne plötzlich zu bewegen, um die Position war es in, wenn das Gerät ausgeschaltet wurde. Dieser plötzliche Bewegungen kann Fehler in der Ausgabe des Encoders, verursachen, so darauf geachtet werden, sollte um das Gerät zu deaktivieren, nur dann, wenn es in seiner unpowered Position an der Spitze des Bewegungsbereichs ruht.
Die Herstellung Klemme dient zur Platte Körper und Silikon unten in einer Art und Weise zusammenzubringen, die optimale Verklebung ermöglicht. Zu diesem Zweck gibt es drei wichtige Funktionen im Design präsentiert die zusätzliche Datei "Presse sterben - generische 3D. SCHRITT ". Erstens ist die Klemme Kennzeichenhalter Körper parallel zum Boden Silikon. Wenn dies richtig gebaut wird, erfordert es keine Anpassung nach der Ersteinrichtung. Zweitens bietet die Schicht aus Schaumstoff in die Klemme eine kleine Menge der Compliance unter der Platte vollständig starres System einen plötzlichen Anstieg von NULL Spannkraft auf unendliche Spannkraft theoretisch erleben würden, wenn die Klemme geschlossen wurde. Die Position der Querlatte und Schraube der Klemme sind verstellbar, so dass der Abstand zwischen den beiden Seiten der Schelle fein abgestimmt werden kann.
Alle Anstrengungen sollten zu einem hellen, weißen Hintergrund hinter dem Punkt gut unten während der Belastung Charakterisierung Experimente erfolgen. Je besser der Kontrast in diesen Bildern, desto leichter wird es, automatisieren Sie den Prozess zur Messung der Höhe und Breite des Punktes, der mühsam werden kann für einen menschlichen Operator eine große Experiment zu analysieren sein. Hochgeschwindigkeits-Videographie der Unterseite eines Brunnens in einer 96-Well-Platte stellt Herausforderungen, da die Wände des Brunnens tendenziell Schatten werfen. Die Verwendung einer Lichtkuppel oder axiale Streulicht, die entlang der Sichtlinie der Kamera beleuchten kann, ohne das Bild verdunkelt eliminiert Schatten oder spiegelnde Reflexionen, die mit einer herkömmlichen Lichtquelle entstehen würden. Die hellste verfügbare Lichtquelle sollte verwendet werden, da heller Beleuchtung Bilder mit einer kurzen Belichtungszeit erworben werden kann. Kurze Belichtungszeiten zu Bewegungsunschärfe minimieren. Aktualisieren der Leuchtdioden (LEDs) in der axialen Streulicht ermöglicht kürzere Belichtungszeiten bei High-Speed-video Akquisition. Die LEDs können durch Öffnen der axialen Streulicht, entfernen die Aktie LEDs aufgerüstet werden, Montage 4 high-Power LED arrays in den hinteren Bereich mit LEDs Inhaber, Anschluss an eine Konstante Stromversorgung und Zusammenbau der axialen Streulicht (siehe Tabelle des Materialien für Katalog-Nummern). Der Nachteil der Modernisierung der LEDs ist, dass die passiv gekühlten LEDs für mehr als ein paar Sekunden durch die Gefahr der Überhitzung eingehalten werden können. Daher ist ein anderes Licht für die Ausrichtung der Post-Block und Kamera Anpassung erforderlich.
Die vorgestellte Methode zur Quantifizierung der Membran Belastung durch die Messung der Ausdehnung eines Punktes auf der Membran gestempelt ist relativ grob, aber können für mehrere Bohrlöcher in einer robusten Weise skalieren. Stamm-Bereich gut unten kann etwas ausführlicher mit digitaler Bildkorrelation charakterisiert werden. Diese Technik beinhaltet die gesprenkelten Strahlbild auf den Sockel des Brunnens und dann imaging bei High-Speed-während der Verformung. Kommerzieller Software lässt dann Stamm an jedem Punkt im Bild durch die Verfolgung der Entwicklung des gesprenkelten Musters zu quantifizieren.
Dieses Protokoll stellt einen facettenreiche, klinisch relevante, Stretch Verletzungen Phänotyp in HiPSCNs. Zelltod, Neurit Degeneration und Neurit Sicken sind alle gut dokumentierte Folgeerscheinungen von TBI bei Menschen und Tiermodelle15. Der Schlüssel zum Erfolg in diesem Modell ist zur Gründung und Aufrechterhaltung gesunde Kulturen. Im Allgemeinen ist ein Zelle Kultur Protokoll mit herkömmlichen starren Platten entwickelt eine lohnende Ausgangspunkt für dehnbare Platte Kultur. Allerdings muss immer die Möglichkeit, dass die fraglichen Zellen anders auf Silikon reagiert ggf. berücksichtigt werden. Dies gilt insbesondere für HiPSCNs, die sehr empfindlich auf Kulturbedingungen sind. Einige Beispiele für die Optimierung der Zellkonzentration Dichte und Laminin werden im Abschnitt Vertreter Ergebnisse (Abbildung 3, Abbildung 4) geliefert. Aktivierung des Silikons mit Plasmabehandlung ist von entscheidender Bedeutung. Silikon ist hydrophob und Plattierung; in seinem natürlichen Zustand wird es nicht an Laminin oder anderen Molekülen zur Förderung Zellhaftung binden. Plasmabehandlung rendert die Oberfläche hydrophil und reaktive Gruppen macht. Diese Änderungen ermöglichen Adhäsionsmoleküle an das Silikon zu binden und zu fördern Zellhaftung. Es ist wichtig zu beachten, dass die Wirkung der Plasma-Behandlung innerhalb von Minuten zerstreut, es sei denn, die Oberfläche in Flüssigkeit eingetaucht ist, und so Verfahren, bei denen die aktivierte Oberfläche Trocknen so schnell wie möglich durchgeführt werden sollte. Eine einfache Möglichkeit zu prüfen, ob die Wirkung der Plasmabehandlung abgeklungen ist ist ein Tröpfchen des Wassers auf der Oberfläche zu platzieren. Auf unbehandelten Silikon wird das Droplet, Perle, während auf Plasma behandelt Silikon, es verteilt wird. Mit der HiPSCNs, die wir verwendet (siehe Tabelle der Materialien), der Hersteller empfiehlt die Laminin mit der Zellsuspension als Pre-Beschichtung hinzufügen. Dieses Protokoll wurde dieser Ansatz erfolgreich integriert. Zwar die Segmentierung in der Theorie mit open-Source-Software oder allgemeine Programmiersprachen, erreicht werden kann, ist ein hohes Maß an Kompetenz mit diesen Tools erforderlich, um gute Ergebnisse zu erzielen. Neuriten sind häufig schwer zu Hintergrundsignal unterscheiden, weil sie so schlank sind. Wir empfehlen daher, die Nutzung der kommerziellen Software-Tools, die von hohen Inhalt Mikroskopie Unternehmen mit speziellen Modulen zur Segmentierung und Quantifizierung von Neuronen, verteilt, wenn sie verfügbar sind. Auch mit kommerzieller Software ist es ratsam, Exportieren von Bildern der Segmentierung, visuell Richtigkeit zu überprüfen.
Es gibt einige Einschränkungen, die verbunden sind mit der Arbeit in dehnbare Platten im Vergleich mit konventionellen, starren Platten zu arbeiten. Dehnbare Platten können wie gewohnt mit Luft Ziele abgebildet werden. Bildgebung mit Immersion Ziele ist jedoch sehr schwierig. Objektiv-Öl kann das Silikon beschädigen. Darüber hinaus übt das Ziel Druck auf die Silikonmembran, wie es nach oben bewegt. Dieser Druck verdrängt die Membran vertikal, macht es schwierig, die Probe in den Mittelpunkt zu rücken. Die silikonmembranen derzeit verwendet in der Herstellung der Platten sind etwa 250 µm dick. Diese Dicke überschreitet die Brennweite der vielen high-Power, Eintauchen Ziele. Besondere Sorgfalt müssen die Membranen lag perfekt flach vor spannen um die Ebenheit erforderlich für die Mikroskopie zu erreichen. Autofokus-Systeme können Abweichungen in der Ebenheit der fertigen Platte zu einem gewissen Grad ausgleichen. Zukünftige Versionen des Protokolls können die Membran vor Spannung, bevor es an die Platte oben nach Ebenheit gewährleistet gebunden ist. Das Klebstoff-freie Verfahren für die Verklebung der Silikonmembran, die Platte oben14 gilt als eine wichtige Stärke des aktuellen Protokolls. Es eliminiert das Risiko von Neurotoxizität von den Kleber als auch Abweichungen in Ebenheit durch ungleichmäßige Dicke der Klebstoffschicht.
Multi-Elektroden werden häufig in Experimenten mit HiPSCNs verwendet, um ihre Reife und Funktionalität zu bewerten. Leider sind diese Systeme nicht kompatibel mit diesem Modell, denn die Zelle anzuchtsubstrat starr. Es ist möglich eine dehnbare Multi-Elektroden-Array zu erstellen, obwohl dies bisher nur in einem einzigen gut nachgewiesen format16,17. Beachten Sie, dass Eindringkörper einzeln aus dem Eindringkörper Block entfernt werden können, so dass einige Brunnen nicht eingerückt sind und als Shams dienen können. Entfernen des Eindringkörpers Einzug verhindert aber nicht vollständig beseitigen, mechanische laden, da gibt es noch träge Bewegung der Flüssigkeit in den Vertiefungen, während die Bühne bewegt. Es lohnt sich vergleichen diese Brunnen, Brunnen in Platten, die nie Gegenstand Bühne Bewegung um einen pathologischen Einfluss der flüssigen Bewegung zu messen waren. Das Array der Eindringkörper im Block sollten auch Bisymmetric (symmetrische von vorne nach hinten und seitlich). Diese Vorsichtsmaßnahme wird sichergestellt, dass die Platte gleichmäßig während der Einrückung, geladen wird, so dass die Bühne nicht zur Seite kippen und verursachen die Stäbe in der Lagerung zu binden.
Eines der primären Herausforderungen zu therapeutischen Innovationen in Neurotrauma ist die Komplexität und Heterogenität der Erkrankung. Trauma gilt gleichzeitig multi-modale Stress für jeden Zelltyp in das zentrale Nervensystem. Neuronen zuverlässig aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) generiert worden und sind jetzt weit verbreitet von kommerziellen Anbietern. Innovation in diesem Bereich schnell verläuft, und anderen neuronalen Zelltypen wie Astrozyten18 und Mikroglia19 stammen auch von HiPSCs. Es können möglicherweise bald die Zelle-autonomen Antworten jedes dieser Zelltypen Trauma in Vitro und dann kokultur verschiedene Zelltypen zu verstehen, wie sie kommunizieren nach dem Trauma zu isolieren. Auf diese Weise kann es letztlich möglich, die klinische Herausforderung von unten, neu erstellen, um es gründlich in einem menschlichen System zu verstehen sein. Dieser Ansatz unterscheidet sich von den herkömmlichen Ansatz unter Berufung auf Nager-Modelle und hat das Potenzial, neue Erkenntnisse zu generieren, die zu den ersten Therapien für diese gemeinsame, verheerende und hartnäckigen Erkrankung führen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird teilweise durch ein Stipendium der National Institutes of Health (R21NS098129) unterstützt. Wir würden gerne bestätigen hervorragende technische Unterstützung von SueSan Chen, Jonathan Tan, Courtney Cavanaugh, Shi Kai Ng und Feng Yuan Bu, der entwarf und baute eine Struktur zur Unterstützung der Lichter bei high-Speed bildgebenden Experimenten in dieser Handschrift beschrieben verwendet .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| .010" Silicone Sheet | Specialty Manufacturing, Inc | #70P001200010 | Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet |
| Sparkleen | Fisher Scientific | #043204 | |
| Nunc 256665 | Fisher Scientific | #12-565-600 | Bottomless 96 Well Plate |
| Kim Wipes | ULINE | S-8115 | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | #PDC-001-HC | |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane | Sigma-Aldrich | #440140 | APTES |
| Parchment Paper | Reynolds | N/A | |
| Dome Light | CCS inc | LFX2-100SW | |
| Dome Light Power Supply | CCS inc | PSB-1024VB | |
| Axial Diffuse Lighting Unit | Siemens | Nerlite DOAL-75-LED | Diffuse axial light |
| High Power LED Array | CREE | XLamp CXA2540 | High Power LED Array |
| LED holder | Molex | 1807200001 | LED Holder |
| LED power supply | Mean Well | HLG-320H-36B | Constant Current Power Supply |
| FastCam Viewer software | Photron | camera softeware | |
| Fastcam Mini UX50 | Photron | N/A | High Speed Camera |
| Micro-NIKKOR 105mm f/2.8 | Nikon | #1455 | High Speed Camera Lens |
| 0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | #P4597 | |
| iCells | Cellular Dynamics International | #NRC-100-010-001 | |
| iCell media | Cellular Dynamics International | #NRM-100-121-001 | |
| iCell supplement | Cellular Dynamics International | #NRM-100-031-001 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L2020 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | #H3570 | |
| Calcein AM | Fisher Scientific | #C3099 | |
| voice coil actuator | BEI Kimco | LA43-67-000A | |
| optical linear encoder | Renishaw | T1031-30A | |
| servo drive | Copley Controls | Xenus XTL | |
| Controller | National Instruments | cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller | |
| cRIO chassis | National Instruments | cRIO 9113 | |
| digital input module | National Instruments | NI 9411 | |
| data acquistion chassis | National Instruments | NI 9113 | |
| LabVIEW | National Instruments | instrument control software | |
| hiPSCNs | Cellular Dynamics International |
References
- Faul, M., L, X. u, Wald, M. M., Coronado, V. Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006. , (2010).
- Kabadi, S. V., Faden, A. I. Neuroprotective strategies for traumatic brain injury: improving clinical translation. Int J Mol Sci. 15 (1), 1216-1236 (2014).
- Kiskinis, E., et al. Pathways disrupted in human ALS motor neurons identified through genetic correction of mutant SOD1. Cell Stem Cell. 14 (6), 781-795 (2014).
- Smith, D. H., Wolf, J. A., Lusardi, T. A., Lee, V. M., Meaney, D. F. High tolerance and delayed elastic response of cultured axons to dynamic stretch injury. J Neurosci. 19 (11), 4263-4269 (1999).
- Wolf, J. A., Stys, P. K., Lusardi, T., Meaney, D., Smith, D. H. Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels. J Neurosci. 21 (6), 1923-1930 (2001).
- Lusardi, T. A., Wolf, J. A., Putt, M. E., Smith, D. H., Meaney, D. F. Effect of acute calcium influx after mechanical stretch injury in vitro on the viability of hippocampal neurons. J Neurotrauma. 21 (1), 61-72 (2004).
- Magou, G. C., et al. Engineering a high throughput axon injury system. J Neurotrauma. 28 (11), 2203-2218 (2011).
- Morrison, B. 3rd, Cater, H. L., Benham, C. D., Sundstrom, L. E. An in vitro model of traumatic brain injury utilising two-dimensional stretch of organotypic hippocampal slice cultures. J Neurosci Methods. 150 (2), 192-201 (2006).
- Cater, H. L., et al. Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels. J Neurochem. 101 (2), 434-447 (2007).
- Kang, W. H., Morrison, B. 3rd Functional tolerance to mechanical deformation developed from organotypic hippocampal slice cultures. Biomech Model Mechanobiol. 14 (3), 561-575 (2015).
- Sherman, S. A., et al. Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neurons in a 96 Well Format. Sci Rep. 6, 34097 (2016).
- Hardy, W. N., et al. Investigation of Head Injury Mechanisms Using Neutral Density Technology and High-Speed Biplanar X-ray. Stapp Car Crash J. 45, 337-368 (2001).
- Hardy, W. N., et al. A study of the response of the human cadaver head to impact. Stapp Car Crash J. 51, 17-80 (2007).
- Sunkara, V., et al. Simple room temperature bonding of thermoplastics and poly(dimethylsiloxane). Lab Chip. 11 (5), 962-965 (2011).
- Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp Neurol. 246, 35-43 (2013).
- Lacour, S. P., et al. Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces. Med Biol Eng Comput. 48 (10), 945-954 (2010).
- Yu, Z., Morrison, B. 3rd Experimental mild traumatic brain injury induces functional alteration of the developing hippocampus. J Neurophysiol. 103 (1), 499-510 (2010).
- Tcw, J., et al. An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).
