डीएनए ऐसे बढ़ाने के रूप में नियामक तत्वों, शारीरिक रूप से लक्ष्य जीन प्रवर्तकों से संपर्क द्वारा जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण, अक्सर लंबी दूरी के माध्यम से गुणसूत्र बड़ी जीनोमिक दूरी फैले बातचीत । प्रमोटर कब्जा हाय-सी (PCHi-सी) अपने लक्ष्य जीन के लिए संभावित विनियामक दृश्यों के काम को सक्षम करने, प्रवर्तकों और बाहर के क्षेत्रों के बीच महत्वपूर्ण बातचीत की पहचान करता है ।
जीनोम का तीन आयामी संगठन अपने कार्य से जुड़ा हुआ है. उदाहरण के लिए, transcriptional बढ़ाने के रूप में विनियामक तत्वों शारीरिक संपर्क के माध्यम से अपने लक्ष्य जीन की spatio-लौकिक अभिव्यक्ति नियंत्रण, अक्सर काफी पाटन (कुछ मामलों में kilobases के सैकड़ों) जीनोमिक दूरी और बाईपास पास जीन । मानव जीनोम एक अनुमानित १,०००,००० बढ़ाने के बंदरगाह, जिनमें से विशाल बहुमत अज्ञात जीन लक्ष्य है । उनके लक्ष्य जीन के लिए बाहर का नियामक क्षेत्रों निर्दिष्ट इस प्रकार जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । हम एक ही प्रयोग में सभी प्रवर्तकों के लिए, बाहर प्रमोटर-बातचीत क्षेत्रों (PIRs) के जीनोम चौड़ा पता लगाने को सक्षम करने के लिए प्रवर्तक कब्जा हाय-सी (PCHi-सी) का विकास किया । PCHi-सी में, अत्यधिक जटिल उच्च सी पुस्तकालयों विशेष रूप से सभी प्रमोटर युक्त प्रतिबंध टुकड़े के सिरों के पूरक biotinylated आरएनए चारा के हजारों के साथ में समाधान संकर चयन के माध्यम से प्रमोटर दृश्यों के लिए समृद्ध कर रहे हैं । उद्देश्य के लिए तो खींच-नीचे प्रमोटर दृश्यों और उनके ऐसे बढ़ाने और अंय संभावित नियामक तत्वों के रूप में लगातार बातचीत भागीदारों है । उच्च-प्रवाह युग्मित-समाप्त sequencing के बाद, एक सांख्यिकीय परीक्षण प्रतिबंध अंश स्तर पर महत्वपूर्ण PIRs की पहचान करने के लिए प्रत्येक promotion-ligated प्रतिबंध अंश करने के लिए लागू किया जाता है । हम PCHi-सी का इस्तेमाल किया है के लिए मानव और माउस सेल प्रकार के दर्जनों में लंबी दूरी के प्रमोटर बातचीत के एक एटलस उत्पंन करते हैं । इन प्रमोटर interactome मैप्स अपने लक्ष्य जीन को ख्यात विनियामक क्षेत्रों निर्दिष्ट और तरजीही स्थानिक प्रमोटर-प्रमोटर संपर्क नेटवर्क का खुलासा द्वारा स्तनधारी जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण की एक बड़ी समझ में योगदान दिया है । यह भी जानकारी मानव आनुवंशिक रोग और संभावित रोग जीन की पहचान को समझने के लिए उच्च प्रासंगिकता है, गैर कोडिंग रोग-संबंधित अनुक्रम वेरिएंट में या नियंत्रण अनुक्रम के पास अपने लक्ष्य जीन को जोड़ने के द्वारा ।
सबूत जमा पता चलता है कि तीन जीनोम के आयामी संगठन परमाणु प्रक्रियाओं की एक श्रेणी में एक महत्वपूर्ण कार्यात्मक भूमिका निभाता है, जीन सक्रियण सहित1,2,3, दमन4 ,5,6,7,8, पुनर्संयोजन9,10, डीएनए मरंमत11, डीएनए प्रतिकृति12,13, और सेलुलर वार्धक्य14. दूर बढ़ाने के प्रवर्तकों वे15,16,17, जो उचित spatio-लौकिक जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण के लिए आवश्यक है विनियमित करने के लिए करीब स्थानिक निकटता में पाए जाते हैं । बढ़ाने हटाने से पता चलता है कि बाहर बढ़ाने लक्ष्य जीन प्रतिलेखन18,19,20,21,22के लिए आवश्यक हैं, और ‘ मजबूर क्रोमेटिन looping ‘ दर्शाता है कि इंजीनियर एक बढ़ाने और Hbb लोकस में अपने लक्ष्य प्रमोटर के बीच tethering transcriptional सक्रियण23ड्राइव करने के लिए पर्याप्त है । इसके अलावा, जीनोम reअस्थानिक बढ़ाने के नियंत्रण के तहत जीन लाने कि अनुपयुक्त जीन सक्रियकरण और रोग24,25,26में परिणाम कर सकते हैं । साथ में, इन उदाहरणों का वर्णन है कि प्रमोटर बढ़ाने बातचीत जीन नियंत्रण के लिए आवश्यक है और तंग विनियमन उचित जीन अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने की आवश्यकता है । मानव और माउस जीनोम प्रत्येक १,०००,००० बढ़ाने के आसपास बंदरगाह का अनुमान है । इन बढ़ाने के विशाल बहुमत के लिए, लक्ष्य जीन अज्ञात हैं, और प्रवर्तकों और बढ़ाने के बीच ‘ सगाई के नियम ‘ खराब समझ रहे हैं । अपने लक्ष्य जीन को transcriptional बढ़ाने निर्दिष्ट इस प्रकार स्तनधारी जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण का गूढ़ रहस्य में एक बड़ी चुनौती बनी हुई है ।
तीन आयामी जीनोम वास्तुकला की हमारी समझ 3 सी27 (गुणसूत्र अनुरूप कब्जा) की शुरूआत से क्रांति की गई है और उसके वेरिएंट28,29,30,31 . इन तकनीकों का सबसे शक्तिशाली, हाय-सी (उच्च प्रवाह गुणसूत्र अनुरूप कब्जा) एक सेल जनसंख्या के भीतर गुणसूत्र बातचीत की पूरी पहनावा की पहचान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । उच्च सी पुस्तकालयों, आमतौर पर कोशिकाओं के लाखों लोगों से उत्पंन, मानव जीनोम३२में एक अनुमानित 1011 के बीच स्वतंत्र बंधाव उत्पादों ~ 4 kb टुकड़े के साथ अत्यधिक जटिल हैं । एक परिणाम के रूप में, व्यक्तिगत प्रतिबंध टुकड़े के बीच बातचीत की विश्वसनीय और reproducible पहचान (जैसे एक प्रमोटर या बढ़ाने से युक्त उन के रूप में) उच्च सी डेटा से जब तक उच्च-सी पुस्तकालयों अल्ट्रा गहरे अनुक्रमण के अधीन है व्यवहार्य नहीं है, जो नियमित रूप से हाय-सी पुस्तकालयों की तैयारी करने वाली प्रयोगशालाओं के लिए आर्थिक रूप से व्यवहार्य समाधान नहीं है । इस कमियों को दरकिनार करने के लिए, हमने उच्च-सी पुस्तकालयों से प्रमोटर-युक्त बंधाव उत्पादों को विशेष रूप से समृद्ध करने के लिए प्रमोटर कैप्चर हाय-सी विकसित किया । हमने दो कारणों से प्रवर्तकों पर ध्यान केंद्रित किया । पहले, प्रमोटर-बढ़ाने के संपर्क के लिए कई अध्ययनों में उचित जीन अभिव्यक्ति के स्तर के लिए महत्वपूर्ण हो दिखाया गया है (ऊपर संदर्भ देखें), और दूसरा, के रूप में प्रवर्तक कोशिका प्रकार के बीच बड़े पैमाने पर अपरिवर्तनीय हैं, एक ही कब्जा चारा प्रणाली के लिए पूछताछ किया जा सकता है कई सेल प्रकार और शर्तों के पार नियामक सर्किट । हमारे दृष्टिकोण में biotinylated आरएनए के हजारों के साथ उच्च सी पुस्तकालयों के समाधान संकरण पर निर्भर करता है 120mers प्रमोटर-युक्त हाय-सी बंधाव उत्पादों और streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों पर बाद में कब्जा करने के लिए पूरक । PCHi-सी पुस्तकालयों में यह परिणाम बहुत कम जटिलता के साथ मूल उच्च सी पुस्तकालय की तुलना में, कि काफी अधिक आवृत्तियों पर प्रवर्तकों के लिए ligated हैं कि केवल टुकड़े की पहचान पर ध्यान केंद्रित.
हम मानव और माउस सेल प्रकार के एक नंबर में PCHi सी का इस्तेमाल किया है लंबी दूरी के बाहर प्रमोटर ख्यात विनियामक समारोह के साथ क्षेत्रों में बातचीत, साथ ही गैर यादृच्छिक द्वारा जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण की एक बेहतर समझ में योगदान नाभिक के तीन आयामी अंतरिक्ष में प्रमोटर-प्रमोटर संपर्क । अध्ययनों से कई सेल प्रकार३३,३४,३५,३६,३७,३८ भर में प्रमोटर-बढ़ाने संपर्कों के हजारों की सैकड़ों मैप किया है, ३९, Polycomb दमनात्मक जटिल की पहचान की-माउस भ्रूण स्टेम सेल7में स्थानिक जीनोम संगठन मध्यस्थता, सेलुलर भेदभाव३७के दौरान प्रमोटर interactomes के बड़े पैमाने पर तारों का प्रदर्शन किया, ३८ , ३९, और लिंक्ड गैर कोडिंग रोग-जीन प्रवर्तकों३५के लिए अनुक्रम वेरिएंट जुड़े ।
PCHi-सी एक आदर्श के लिए डीएनए के जीनोम-व्यापक पहनावा के नक्शे को बढ़ावा देने वालों के साथ बातचीत के जुगाड़ के अनुकूल विधि है । संबंधित approaches, जैसे निरंतर जीनोमिक क्षेत्रों के कैप्चर हाय-C ( चर्चादेखें) चयनित जीनोमिक क्षेत्रों के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन सहभागिता प्रोफ़ाइल प्राप्त करने के लिए पसंद की विधि हैं । PCHi-सी और कब्जा हाय-सी देखने के एक प्रयोगात्मक बिंदु से बेहद समान है (केवल अंतर कब्जा प्रणाली का विकल्प है), ताकि सलाह और दिशानिर्देश हम प्रदान दोनों तरीकों के लिए लागू होते हैं । यहाँ, हम PCHi-सी का विस्तृत वर्णन प्रस्तुत करते हैं । हम तर्क और एक PCHi-c प्रयोग के डिजाइन रूपरेखा, एक कदम दर कदम PCHi-सी पुस्तकालय पीढ़ी प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, और उदाहरण देकर स्पष्ट करना कि कैसे PCHi-सी पुस्तकालयों की गुणवत्ता के लिए उच्च गुणवत्ता वाले डेटा उपज प्रोटोकॉल में विभिंन चरणों में निगरानी की जा सकती है ।
प्रमोटर कैप्चर हाय-सी की मॉड्यूलर डिजाइन
प्रमोटर कब्जा हाय-सी विशेष रूप से बढ़ावा देने वाले बातचीत के लिए उच्च सी पुस्तकालयों को समृद्ध बनाया गया है । इन बातचीत में एक उच्च सी पुस्तकालय में मौजूद बंधाव उत्पादों का केवल एक सबसेट शामिल हैं ।
कैप्चर हाय-सी आसानी से कब्जा प्रणाली को बदलकर किसी भी जीनोमिक क्षेत्र या ब्याज के क्षेत्रों के लिए उच्च सी पुस्तकालयों को समृद्ध करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । कब्जा क्षेत्रों सतत जीनोमिक खंडों४४,४५,४६,४८, बढ़ाने कि PCHi-सी में पहचान की गई है हो सकता है (‘ रिवर्स कैप्चर हाय-सी ‘३५), या DNase मैं अनुभुत साइटें४९ . कैप्चर सिस्टम का आकार प्रायोगिक दायरे के आधार पर समायोजित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, Dryden एट अल. लक्ष्य ५१९ तीन जीन स्तन कैंसर४४के साथ जुड़े रेगिस्तान में चारा टुकड़े । मार्टिन एट अलद्वारा कब्जा प्रणाली । लक्ष्य दोनों सतत जीनोमिक सेगमेंट (‘ क्षेत्र कैप्चर ‘: २११ जीनोमिक क्षेत्रों में कुल; २,१३१ प्रतिबंध अंशों) और चयनित प्रवर्तकों (३,८५७ जीन प्रवर्तकों)४५.
SureSelect पुस्तकालयों विभिन्न आकार पर्वतमाला में उपलब्ध हैं: 1 kb से ४९९ kb (5190 – 4806), ५०० केबी करने के लिए २.९ एमबी (5190 – 4816), और 3 एमबी करने के लिए ५.९ एमबी (5190 – 4831). प्रत्येक व्यक्ति को पकड़ने के रूप में बायोटिन-आरएनए १२० न्यूक्लियोटाइड लंबी है, इन कैप्चर सिस्टम क्रमशः ४,१५८, २४,१६६ और ४९,१६६ व्यक्तिगत कब्जा जांच की एक अधिकतम समायोजित । यह २,०७९, १२,०८३, और २४,५८३ लक्षित प्रतिबंध अंशों से मेल खाती है, क्रमशः (ध्यान दें कि प्रतिबंध अंशों के लिए संख्याएं कम सीमा इस धारणा पर आधारित है कि दो व्यक्तिगत कैप्चर जांच हर प्रतिबंध के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है टुकड़ा-वास्तव में दोहराव अनुक्रम के कारण यह हर प्रतिबंध अंश के लिए मामला नहीं होगा (यह भी आंकड़ा 1b, C), उपलब्ध कब्जा जांच की एक निरंतर संख्या के लिए लक्षित प्रतिबंध टुकड़े की एक उच्च संख्या में जिसके परिणामस्वरूप ).
प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक 6 बीपी मांयता साइट के साथ एक प्रतिबंध एंजाइम के उपयोग के लिए लंबी दूरी की बातचीत को उजागर पर आधारित है । अधिक समीपस्थ बातचीत के अधिक से अधिक संकल्प के लिए एक 4 बीपी पहचान साइट के साथ एक प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग भी४०,४९संभव है ।
PCHi-सी की सीमाएं
सभी गुणसूत्र अनुरूप कब्जा परख की एक अंतर्निहित सीमा है कि उनके संकल्प पुस्तकालय पीढ़ी के लिए इस्तेमाल प्रतिबंध एंजाइम द्वारा निर्धारित किया जाता है । एक ही प्रतिबंध अंश पर स्थित डीएनए तत्वों के बीच होने वाले इंटरैक्शन ‘ C-type ‘ की परख करने के लिए अदृश्य होते हैं. इसके अलावा, PCHi-सी में, कुछ मामलों में एक से अधिक प्रतिलेखन प्रारंभ साइट एक ही प्रवर्तक-प्रतिबंध अंश युक्त पर स्थित किया जा सकता है, और कुछ मामलों में PIRs दोनों सक्रिय और दमन हिस्टोन के निशान बंदरगाह, यह मुश्किल है जो नियामक को तुच्छ बनाने तत्वों बातचीत मध्यस्थता, और प्रमोटर बातचीत के विनियामक उत्पादन की भविष्यवाणी करने के लिए । 4 बीपी मांयता साइटों के साथ प्रतिबंध एंजाइमों का प्रयोग इस मुद्दे को कम करने पर आता है, लेकिन बेहद बढ़ी हुई हाय-सी पुस्तकालय जटिलता की कीमत पर आती है (4 बीपी पहचान साइट प्रतिबंध एंजाइमों के साथ उत्पंन उच्च सी पुस्तकालयों उच्च से कम १०० बार अधिक जटिल है सी 6 बीपी पहचान साइट प्रतिबंध एंजाइमों के साथ उत्पंन पुस्तकालयों), और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए संबद्ध लागत ।
एक और सीमा है कि वर्तमान PCHi-सी प्रोटोकॉल सामग्री शुरू करने के रूप में कोशिकाओं के लाखों की आवश्यकता है, precluding दुर्लभ कोशिका प्रकार में प्रमोटर बातचीत के विश्लेषण । PCHi के एक संशोधित संस्करण-सी सेल आबादी में प्रमोटर संपर्कों के १०,००० १००,००० कोशिकाओं के साथ पूछताछ के लिए सक्षम करने के लिए (जल्दी भ्रूण विकास या टेम स्टेम सेल के दौरान उदाहरण कोशिकाओं के लिए) इसलिए कब्जा करने के लिए एक मूल्यवान इसके अतिरिक्त होगा हाय-सी toolbox.
अंत में, सभी तरीकों कि formaldehyde निर्धारण पर निर्भर की तरह, PCHi-सी केवल बातचीत कि निर्धारण के समय बिंदु पर ‘ जमे हुए है ‘ रिकॉर्ड । इस प्रकार, कैनेटीक्स और प्रमोटर बातचीत की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, सुपर संकल्प लाइव सेल माइक्रोस्कोपी के रूप में तरीकों PCHi-सी के साथ आवश्यक हैं ।
उच्च रिज़ॉल्यूशन पर स्थानिक गुणसूत्र संगठन को काटना करने के तरीके
गुणसूत्र इंटरेक्शन लाइब्रेरी की विशाल जटिलता सांख्यिकीय महत्व के साथ दो विशिष्ट प्रतिबंध अंशों के बीच इंटरैक्शन उत्पादों की विश्वसनीय पहचान प्रतिबंधित करती है. इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, अनुक्रम कैप्चर को या तो हाय-सी३३,३४,४०,४४ या 3 सी५०,विशिष्ट बातचीत के लिए५१ पुस्तकालयों को समृद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । संवर्धन कदम के लिए 3 सी पुस्तकालयों पर हाय-सी पुस्तकालयों का उपयोग करने का प्रमुख लाभ यह है कि 3 सी के विपरीत हाय-सी, वास्तविक बंधाव उत्पादों के लिए एक संवर्धन कदम भी शामिल है । एक परिणाम के रूप में, मांय का प्रतिशत PCHi-सी पुस्तकालयों में पढ़ता है लगभग 10-कब्जा की तुलना में अधिक गुना-सी पुस्तकालयों५०, जो 5 के आसपास समाहित-8% मांय HiCUP फ़िल्टरिंग के बाद पढ़ता है । Sahlen एट अल. सीधे कब्जा-सी की तुलना में HiCap, जो PCHi-सी की तरह कब्जा संवर्धन के लिए हाय-सी पुस्तकालयों का उपयोग करता है, इसके विपरीत में कब्जा करने के लिए सी जो 3 सी पुस्तकालयों का उपयोग करता है । हमारे निष्कर्षों के अनुरूप, उंहोंने पाया कि कब्जा सी पुस्तकालयों मुख्य रूप से संयुक्त राष्ट्र के ligated टुकड़े४०से बना रहे हैं । इसके अलावा, HiCap पुस्तकालयों कब्जा-सी पुस्तकालयों४०से एक उच्च जटिलता था ।
कैप्चर-c का एक संस्करण, नामक अगली पीढ़ी पर कब्जा-c५२ (कब्जा एनजी-सी) प्रतिबंध टुकड़ा अंत प्रति एक oligo का उपयोग करता है, के रूप में पहले PCHi-c३३,३४में स्थापित, के बजाय अतिव्यापी जांच के मूल में इस्तेमाल किया कैप्चर-C प्रोटोकॉल५०। इस पर कब्जा-सी विनय की तुलना में वैध पढ़ता का प्रतिशत बढ़ जाती है, लेकिन कब्जा-सी एनजी कब्जा संवर्धन के दो क्रमिक दौर, और पीसीआर चक्र के एक अपेक्षाकृत उच्च संख्या (कुल में 20 से 24 चक्र, के लिए आम तौर पर 11 चक्र की तुलना में PCHi-c), जो अनिवार्य रूप से अनुक्रम डुप्लिकेट और कम पुस्तकालय जटिलता के उच्च संख्या में परिणाम है । PCHi-सी के अनुकूलन के दौरान परीक्षण प्रयोगों में, हमने पाया है कि अद्वितीय का प्रतिशत (यानी, डुप्लिकेट नहीं) पढ़ें जोड़े केवल 15% के आसपास था जब हम 19 पीसीआर चक्र (13 चक्र पूर्व कब्जा + 6 चक्रों के बाद कब्जा; डेटा नहीं दिखाया गया है), लेकिन पीसीआर चक्रों की कम संख्या के लिए अनुकूलन, आमतौर पर 75 पैदावार-90% अद्वितीय पढ़ें जोड़े । इस प्रकार, पीसीआर चक्र की संख्या को कम करने में काफी जानकारीपूर्ण अनुक्रम डेटा की मात्रा बढ़ जाती है ।
हाल ही में एक विधि हाय-सी के साथ चिप को जोड़ती है गुणसूत्र ब्याज की एक विशिष्ट प्रोटीन (HiChIP५३) द्वारा मध्यस्थता बातचीत पर ध्यान केंद्रित । चिया-पीईटी५४, जो एक समान तर्क पर आधारित है की तुलना में, HiChIP डेटा जानकारीपूर्ण अनुक्रम की एक उच्च संख्या में पढ़ता है, उच्च विश्वास बातचीत५३फोन करने के लिए अनुमति देता है । यह बहुत ही सीधे संगत HiChIP और कब्जा हाय-सी डेटा सेट की तुलना करने के लिए एक बार वे उपलब्ध हो दिलचस्प हो जाएगा (उदाहरण के लिए cohesin इकाई Smc1a के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग HiChIP के साथ कब्जा हाय सभी Smc1a बाध्य प्रतिबंध के लिए सी टुकड़े) की ओर से । इन दो तरीकों के बीच एक अंतर्निहित अंतर यह है कि कब्जा हाय-सी क्रोमेटिन immunoprecipitation पर भरोसा नहीं करता है, और इसलिए प्रोटीन अधिभोग के गुणसूत्र बातचीत चाहे पूछताछ करने में सक्षम है । इस उपस्थिति या विशिष्ट कारक बाध्यकारी की अनुपस्थिति में 3 डी जीनोम संगठन की तुलना में सक्षम बनाता है, के रूप में माउस ESC स्थानिक जीनोम वास्तुकला7के एक प्रमुख नियामक के रूप में PRC1 की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।
PCHi-सी और GWAS
जीनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन (GWAS) से पता चला है कि अधिक से अधिक ९५% की बीमारी से जुड़े अनुक्रम वेरिएंट गैर में स्थित हैं, जीनोम के क्षेत्र कोडिंग, प्रोटीन के लिए महान दूरी पर अक्सर-कोडिंग जीन५५। GWAS वेरिएंट अक्सर DNase मैं अनुभुत साइटों के करीब निकटता में पाया जाता है, जो संभावित नियामक गतिविधि के साथ दृश्यों की एक बानगी है । PCHi-सी और कब्जा हाय-सी बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है GWAS जोखिम loci स्तन कैंसर४४, कोलोरेक्टल कैंसर४८, और स्व-प्रतिरक्षित रोग३५,४५,४६में फंसा के लिए प्रमोटरों लिंक । 17 विभिंन मानव टेम कोशिका प्रकार पर एक PCHi-सी अध्ययन पाया SNPs स्व-प्रतिरक्षित रोग के साथ जुड़े लसीकावत् कोशिकाओं में PIRs में समृद्ध थे, जबकि अनुक्रम प्लेटलेट और लाल रक्त कोशिका विशिष्ट लक्षण के साथ जुड़े वेरिएंट में मुख्य रूप से पाए गए मैक्रोफेज और erythroblasts, क्रमशः३५,५६. इस प्रकार, ऊतक प्रकार विशिष्ट प्रवर्तक interactomes PCHi-सी द्वारा खुला गैर कोडिंग रोग जुड़े अनुक्रम वेरिएंट के समारोह को समझने में मदद मिलेगी और उपचारात्मक हस्तक्षेप के लिए नए संभावित रोग जीन की पहचान कर सकते हैं ।
प्रमोटर के लक्षण-आदान-प्रदान क्षेत्र
जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण के लिए सबूत लिंक प्रमोटर interactomes के कई लाइनें । सबसे पहले, कई PCHi-सी अध्ययनों का प्रदर्शन किया है कि जीनोमिक क्षेत्रों (अत्यधिक) के प्रवर्तकों के साथ बातचीत व्यक्त की जीन बढ़ाने गतिविधि के साथ जुड़े निशान में समृद्ध कर रहे हैं, जैसे H3K27 acetylation और p300 बंधन३३,३४ , ३७. हमें जीन अभिव्यक्ति स्तर और आदान-प्रदान बढ़ाने वालों की संख्या के बीच सकारात्मक संबंध पाया गया, सुझाव है कि बढ़ाने वाले जीन अभिव्यक्ति के स्तर में वृद्धि के additive प्रभाव३४,३५. दूसरा, स्वाभाविक रूप से होने वाली अभिव्यक्ति मात्रात्मक विशेषता loci (eQTLs) PIRs में समृद्ध होती है जो उसी जीन से जुड़े होते हैं जिनकी अभिव्यक्ति eQTLs३५से प्रभावित होती है. तीसरे, यात्रा५७ और PCHi-सी डेटा को एकीकृत करके, केर्न्स एट अल । पाया गया कि ट्रिप रिपोर्टर जीन में PIRs को मानचित्रण माउस ESCs दिखाएं मजबूत रिपोर्टर जीन की तुलना में गैर-प्रवर्तक में एकीकरण स्थलों पर रिपोर्टर जीनों-क्षेत्रों बातचीत ५८, यह दर्शाता है कि PIRs transcriptional विनियामक गतिविधि के अधिकारी हैं । साथ में, इन निष्कर्षों का सुझाव है कि प्रवर्तक interactomes PCHi द्वारा खुला-विभिंन माउस और मानव कोशिका प्रकार में सी जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण के लिए प्रमुख नियामक मॉड्यूल शामिल हैं ।
यह ध्यान देने योग्य है कि बढ़ाने के लायक केवल एक छोटा सा अंश का प्रतिनिधित्व (~ 20%) सभी PIRs PCHi-C३३,३४द्वारा खुला । अंय PIRs संरचनात्मक या टोपोलॉजिकल भूमिकाओं के बजाय प्रत्यक्ष transcriptional विनियामक कार्य हो सकता है । हालांकि, वहां भी सबूत है कि PCHi-सी है कि शास्त्रीय बढ़ाने के निशान बंदरगाह नहीं है विनियामक समारोह के साथ डीएनए तत्वों को उजागर कर सकते हैं । एक मानव लसीकावत् सेल लाइन में, BRD7 प्रमोटर को बढ़ाने के निशान है कि रिपोर्टर जीन परख३३में बढ़ाने गतिविधि के अधिकारी दिखाया गया था की एक क्षेत्र के साथ बातचीत पाया गया । समान विशेषताओं के साथ विनियामक तत्व वर्तमान में सराहना की तुलना में अधिक प्रचुर मात्रा में हो सकते हैं । उदाहरण के लिए, नियामक डीएनए तत्वों के लिए एक CRISPR आधारित स्क्रीन की पहचान की अचिह्नित विनियामक तत्व (UREs) है कि जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण लेकिन बढ़ाने के निशान से रहित है५९।
अन्य मामलों में, PIRs को transcriptional दमन से जुड़े हार्बर क्रोमेटिन चिह्नों को दिखाया गया है । PIRs और बातचीत के प्रवर्तकों में माउस ESCs PRC1 से बंधे दमित जीन दमन मार्क H3K27me37असर के एक व्यापक स्थानिक नेटवर्क में लगे थे । मानव lymphoblastoid कोशिकाओं में, एक दूर BCL6 प्रमोटर दमित transgene रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति३३के साथ बातचीत के तत्व, सुझाव है कि यह अपने मूल संदर्भ में BCL6 प्रतिलेखन दमन के लिए कार्य कर सकते हैं ।
PIRs मानव ESCs और एनईसीएस३७ में क्रोमेटिन इंसुलेटर प्रोटीन CTCF के अधिभोग के लिए समृद्ध PIRs का एक और वर्ग अभी तक प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । सामूहिक रूप से, इन परिणामों का सुझाव है कि PIRs अभी तक जीन विनियामक गतिविधियों का संग्रह करने के लिए कार्यात्मक विशेषता है ।
The authors have nothing to disclose.
हम चित्र 1 के साथ पांडुलिपि और विशेषज्ञ की मदद के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Valeriya Malysheva धंयवाद । यह काम चिकित्सा अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित किया गया था, uk (MR/L007150/और uk जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद्, यूके (BB/J004480/
16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
Low-retention filter tips | Starlab | S1180-3810, S1180-1810, S1180-8810 and S1182-1830 | |
10x PBS pH 7.4 | Life Technologies | 70011-036 | |
Molecular biology grade water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
1 M Tris-HCl pH 8.0 | Life Technologies | 15568-025 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
5 M NaCl | Life Technologies | 24740-011 | |
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
Restriction buffer 2 (10x NEBuffer 2) | New England Biolabs | B7002 | |
DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 108.051 | |
DNA LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | 30108078 | |
20% (wt/vol) SDS | Bio-Rad Laboratories | 161-0418 | |
20% (vol/vol) Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
HindIII, 100 U/uL | New England Biolabs | R0104 | |
10 mM dCTP | Life Technologies | 18253-013 | |
10 mM dGTP | Life Technologies | 18254-011 | |
10 mM dTTP | Life Technologies | 18255-018 | |
0.4 mM Biotin-14-dATP | Life Technologies | 19524-016 | |
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL | New England Biolabs | M0210 | |
10x T4 DNA ligase reaction buffer | New England Biolabs | B0202 | |
100x 10mg/ml Bovine Serum Albumin | New England Biolabs | B9001 | |
T4 DNA ligase, 1 U/μL | Invitrogen | 15224-025 | |
RNase A | Roche | 10109142001 | |
Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche | 3115836001 | |
20 000×g 50 ml centrifuge tube | VWR | 525-0156 | |
0.5 M EDTA pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
Phenol pH 8.0 | Sigma | P4557 | |
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1 | Sigma | P3803 | |
Sodium acetate pH 5.2 | Sigma | S7899 | |
Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Restriction buffer 2.1 (10x NEBuffer 2.1) | New England Biolabs | B7202 | |
NheI, 100U/uL | New England Biolabs | R0131 | |
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6x16mm vials | Covaris | 520045 | For sonication |
SPRI beads (Agencourt AMPure XP) | Beckman Coulter | A63881 | |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads | Invitrogen | 65001 | |
Tween 20 | Sigma | P9416 | |
10 mM dATP | Life Technologies | 18252-015 | |
T4 DNA polymerase 3000 units/mL | New England Biolabs | M0203 | |
T4 PNK 10000 units/mL | New England Biolabs | M0201 | |
Klenow exo minus 5000 units/mL | New England Biolabs | M0212 | |
Quick ligation reaction buffer | New England Biolabs | B6058 | |
NEB DNA Quick ligase | New England Biolabs | M2200 | |
PE adapter 1.0 (5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGC AGGAATGCCGAG-3') |
Illumina | ||
PE adapter 2.0 (5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3') |
Illumina | ||
NEB Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530 | |
PE PCR primer 1.0 (5'-AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT-3') |
Illumina | ||
PE PCR primer 2.0 (5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GATCGGTCTCGGCATTCCT GCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3') |
Illumina | ||
PCR strips | Agilent Technologies | 410022 and 401425 | |
SureSelect SSEL TE Reagent ILM PE full adaptor kit | Agilent Technologies | 931108 | |
SureSelect custom 3-5.9 Mb library | Agilent Technologies | 5190-4831 | custom design mouse or human PCHi-C system |
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads | Invitrogen | 65601 | |
E220 high-performance focused ultra-sonicator | Corvaris | E220 |