Summary
Ett detaljerat protokoll för att utföra en titrering ELISA beskrivs. Dessutom presenteras en ny algoritm att utvärdera titrering ELISA-test och få en dissociationskonstant bindning av ett lösligt ligand till en mikrotiter plattan-orörlig receptor.
Abstract
Dissociationskonstant beskriver samspelet mellan två partner i den bindande jämvikten och är ett mått på deras affinitet. Det är en avgörande parameter att jämföra olika ligander, t.ex., konkurrenskraftiga hämmare, protein isoformer och mutanter, för sin bindande styrka till en bindande partner. Dissociation konstanter bestäms av plottning koncentrationer av bundna kontra fria liganden som bindande kurvor. Titrering kurvor, där en signal som är proportionell mot koncentrationen av bundna ligand plottas mot den totala koncentrationen av extra ligand, är däremot mycket lättare att spela in. Signalen kan upptäckas spectroscopically och av enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Detta exemplifieras i ett protokoll för en titrering ELISA som mäter bindningen av den snake venom-derived rhodocetin till dess immobiliserade måldomän för α2β1 integrin. Titrering ELISAs är mångsidiga och utbredda. Något par av samverkande proteiner kan användas som immobiliserade receptor och lösliga ligand, förutsatt att båda proteiner är ren, och deras koncentrationer är kända. Svårigheten har hittills varit att avgöra dissociationskonstant från en Titrerkurvan. I den här studien introduceras en matematisk funktion som underliggande titrering kurvor. Utan någon felbenägen grafiska uppskattning av en mättnad avkastning tillåter denna algoritm bearbetning av raw-data (signal stödnivåer vid olika koncentrationer av extra ligand) direkt av matematiska utvärdering via icke-linjär regression. Således flera titrering kurvor kan registreras samtidigt och omvandlas till en uppsättning av karakteristiska parametrar, bland dem dissociationskonstant och koncentrationen av bindande-aktiv-receptorn, och de kan utvärderas statistiskt. Kombination med denna algoritm, titrering ELISAs få fördelen att direkt presentera dissociationskonstant. Därför kan de användas mer effektivt i framtiden.
Introduction
Dissociationskonstant K är en viktig parameter att beskriva en receptor (R) affinitet för dess ligand (L). Baserat på lagen i massa åtgärder, definieras K för equilibriumen, där receptor-ligand komplexa RL dissocierar i receptorn R och liganden L:
Ekvation 1
med index f som visar gratis/unbound delstaten receptor och ligand. Koncentrationen av receptor-ligand komplexet, RL, är identisk med koncentrationen av receptor-bundna ligand Lb. Som den totala koncentrationen av receptorn Rt är summan av den gratis receptorn Rf och ligand-bundna receptorn Rb = Lb, dissociationskonstant kan också skrivas som:
Ekvation 2
Därför mättnad avkastning Y, definierad som andelen bundna ligand Lb i förhållandet av den totala koncentrationen av receptorn Rt,
Ekvation 3
beror på koncentrationen av fria liganden Lf:
Ekvation 4
Denna hyperbolisk beskriver bindande kurvan för en receptor-ligand interaktion och sin tomt visar koncentrationen av bundna ligand Lb som funktion av koncentrationen av fria liganden Lf. Från kurvan är bindande, kan dissociationskonstant K härledas som koncentrationen av fria liganden på halv maximal mättnad yield. Dessutom har olika algoritmer till linjär bindande kurvor fastställts, såsom dubbel-ömsesidiga tomten av Klotz1,2, eller transformationer enligt mikrosatellitsmarkörer eller Hanes (granskas av Bisswanger3). Dock lider alla algoritmer av problem som det högsta värdet av mättnad avkastningen, som att närma sig asymptotiskt vid höga koncentrationer av gratis ligand i bindande kurvan, har uppskattas i en grafisk före utvärdering och därför är fel-benägen.
Dessutom, kräver fastställande av en bindande kurva kvantifiering av fria och bundna ligand under bindande equilibriumen. För detta ändamål har den fria liganden avskiljas från den receptor-bundna liganden och kvantifieras. Därför har den ligand och receptor skiljer sig i deras egenskaper, till exempel en icke-protein ligand i motsats till en protein receptor. Om parterna bindande proteiner, måste de vara distinguishable i deras storlek, avgifter eller andra molekylär funktioner. Kvantifiering av liganden koncentrationer i småskaliga bindande metoder är dock en svår uppgift. Radioaktiv märkning av liganden har ofta varit nödvändig för att upptäcka den låga koncentrationen av bundna ligand, särskilt om stora mängder receptorer inte var tillgängliga eller prisvärda. Dessutom kan den receptor-bundna liganden separera under och efter isolering i en icke försumbar sätt. Komplexa metoder, såsom jämvikt gel filtrering4, kapillärelektrofores5och puls proteolys6, krävs därför att kvantifiera receptor-bundna ligand och skilja det från gratis ligand.
I motsats till dessa bindande analyser kräver titrering experiment inte kvantitativa separation av bundna och fria liganden. I detta syfte titreras en receptor på en konstant koncentration med olika koncentrationer av extra ligand. Genom bindning till receptorn har den bundna liganden biofysiska egenskapen som skiljer den från den fria liganden och är mätbara genom, t.ex., fotometri, fluorometry eller påvisande av antikroppar. Således en signal S, som är proportionell till mättnad avkastning Y och följaktligen också i koncentrationen av receptor-bundna ligand (Lb), identifieras som en funktion av den totala koncentrationen av extra ligand (Lt). Både parametrar, signalen S och den totala koncentrationen av extra ligand är kvantifierade på ett direkt och enklare sätt än koncentrationerna av bundna och fria liganden. Särskilt, tillåtna detektion av receptor-bundna ligand av enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) minskning av provvolymer till under 100 µL samt parallella mätningar av flera ligand koncentrationer i flera mikrotiter plattor. I en titrering ELISA, är en receptor fysiskt adsorberas till en mikrotiterplattan i samma koncentration och titreras med lösliga ligand. Receptorn är orörlig till plastytan i huvudsak genom hydrofob adsorption. Yta koncentrationen av immobiliserade receptor korrelerar med beläggning koncentrationen av receptorn i en ickelinjär relation, sannolikt enligt Langmuir´s adsorption isotherm7. Förutom det totala antalet adsorberade mottagarmolekyler är deras aktivitetsläge en annan viktig parameter för titrering analyser. Endast orörlig receptorer som har behållit ligand bindande aktivitet, är relevanta för titrering analysen och så småningom bidra till den totala koncentrationen av aktiva receptorer Rt titrering analysens, som inte kan fastställas direkt.
Platser på plastytan, som inte omfattas av immobiliserade receptorn är benägna att adsorbera andra proteiner, såsom liganden. Fysiska adsorption av liganden till sådan plast yta webbplatser skulle resultera i en liknande signal som den receptor-bundna liganden, men på ett sätt som ospecifik. Att minska denna ospecifik signal, plast yta platserna av de mikrotiter plattor som inte har varit belagd med protein men blockeras med bovint serumalbumin (BSA). Dock för vissa receptor-ligand titrering analyser, kan ospecifik bakgrund signaler observeras. Då, andra blockerande medel, såsom en lösning på 0,2% gelatin eller 0,04% Tween 20, rekommenderas.
Efter bindning till receptorn avlägsnas den fria liganden av två tvätt steg. Bundna ligand förblir med receptorn, som är orörlig på plast ytan av mikrotiter brunnen, och eventuellt förstärkt av kemiska fixering. För efterföljande kovalent cross-sammanlänkningen av bundna ligand och immobiliserade receptor med glutaraldehyd, buffert ämnet TRIS ersätts för HEPES, utan någon förändring i liganden bindande. HEPES, i motsats till TRIS, inte inaktivera glutaraldehyd. Kovalent cross-länkaget med glutaraldehyd fixar den bundna liganden med dess receptor och förhindrar dess dissociation under efterföljande tvättning och inkubation steg. Således, receptor-ligand interaktionen är kemiskt fryst och garanterar en Titrerkurvan som är opåverkad av efterföljande steg tvätt och inkubation. Glutaraldehyd fixering kan dock kemiskt ändra ligand och receptor på ett sådant sätt att deras interaktion är sänktes eller avskaffades. Ändring av epitoper inom liganden kan dessutom ändra bindande affinitet upptäcka antikroppen, särskilt om en monoklonal antikropp används för att kvantifiera bundna ligand. Även om ingen av dessa negativa effekter av glutaraldehyd fixering sker i denna titrering ELISA, måste känsligheten hos testet mot glutaraldehyd testas för varje receptor-ligand interaktion före titrering experimentet. Efter fixering avlägsnas överflödigt glutaraldehyd i tre tvätt steg med innehållande TRIS buffert. TRIS inactivates återstående aldehyd-grupper, som nonspecifically kan reagera med påvisande av antikroppar i efterföljande steg.
Mängden bundna ligand kvantifieras med enzymkopplad antikroppar, som ger en fotometriska ELISA signal S. Detta är plottade kontra den totala ligand koncentration Lt lagt till varje brunn. Trots dess lättare förvärv är Titrerkurvan inte en hyperbolisk funktion i motsats till bindande kurvan. Dessutom att det har varit oklart hur man beräknar dissociationskonstant K från en Titrerkurvan. Även om algoritmer till linjär spectroscopically förvärvade titrering kurvor har rapporterats självständigt av Stockell8 och Heyn och Weischet9, de föll kort på grund av deras osäkerhet för att beräkna den maximala signalen värde som den mättnad avkastning metoder vid höga koncentrationer av extra ligand.
Här, som en titrering ELISA och en icke-linjär regression algoritm beskrivs att härleda dissociationskonstant K för en receptor ligand interaktion från en Titrerkurvan. Detta protokoll exemplifieras för samspelet mellan kollagen bindande A-domänen för den integrin α2β1 med en snake venom-derived hämmare. Integriner är Celladhesionmolekylar, som medlar ankringen av celler till omgivande extracellulärmatrix eller underliggande basalmembranet10,11. Dessutom förmedla integriner viktiga signaler mellan celler och den extracellular matrisen genom att rekrytera ytterligare signalmolekyler och bildar nya cell organeller, adhesomes, på cell-matrix interaktion12,13, 14. kollagen, liganden av α2β1-integrin, är det mest förekommande proteinet i den mänskliga kroppen och är en avgörande byggnadsställningar komponent av bindväv15. Samspelet mellan α2β1-integrin och kollagen medieras av A-domänen för den integrin α2 subuniten. Integrin α2A-domänen innehåller en tvåvärda cation, som krävs för kollagen bindande och stabiliserar dess struktur. Såväl vildtyp form som mutanter av α2A domänen, till exempel där ytan-utsatt återstoden Y216 hade ersatts för en glycin, kan enkelt recombinantly som produceras i en bakteriell uttryck systemet och isolerade via deras oligo-hans-Taggar med en NiNTA Superflow kolumn med en efterföljande dialys mot TRIS-buffrad koksaltlösning (TBS; 50 mM TRIS/HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl) innehållande 2 mM MgCl216. Deras koncentrationer bestämdes med bicinchoninic syra analys (BCA) och deras föroreningar är testade av konventionella SDS-PAGE och fläckade Coomassie-lysande blå R250.
Samspelet mellan α2β1-integrin och kollagen blockeras genom bindning av komponenten venom snake, rhodocetin, från Malayan pit viper (Calloselasma rhodostoma)16,17. Används som en löslig ligand i denna titrering ELISA, rhodocetin renades från rå venom som tidigare beskrivits16. Det löses i HEPES-buffrad koksaltlösning (HBS; 10 mM HEPES/NaOH, pH 7,4, 150 mM NaCl) och förvaras fryst vid-20 ° C. Dess koncentration bestämdes av BCA och dess renhet bevisades av SDS-PAGE. Som en antagonist, rhodocetin inte bara blockerar kollagen bindande till integrin α2β1 A-domän, men också stabiliserar inaktiva konformation av integrin vilket hindrar någon signalering från kollagen i blodkroppar eller blodplättar18. Det är av stor biomedicinsk betydelse Bestäm konstanten dissociation av rhodocetin med dess receptor mål och därmed avslöja dess molekylära mekanism och farmaceutiska potentiella t.ex., som ett antitrombosmedel. För detta ändamål, en titrering ELISA beskrivs inklusive dess utvärdering, som är tillämpligt till nästan alla receptor-ligand interaktion med en 1:1 interaktion stökiometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. stamlösningar
- För att bereda 100 mL 10 x TBS pH 7,4 lösning, lös 6.06 g TRIS och 8,77 g NaCl i 90 mL avjoniserat vatten, justera pH till 7,4 med 37% HCl-lösning, fylla volymen till 100 mL med avjoniserat vatten och filtrera lösningen.
- För att bereda 100 mL 1 M HEPES/NaOH, pH 7,4 lösning, lös 23.83 g HEPES i 90 mL avjoniserat vatten, justera pH till 7,4 med 1,5 M NaOH, fylla volymen till 100 mL med avjoniserat vatten och filtrera lösningen.
- För att bereda 100 mL 5 M NaCl lösning, lös 29,2 g NaCl 90 mL avjoniserat vatten. Fyll volymen till 100 mL med avjoniserat vatten och filtrera lösningen.
- För att bereda 100 mL 1 M MgCl2 lösning, upplösa 20,33 g MgCl2 · 6H2O i 90 mL avjoniserat vatten. Fyll volymen till 100 mL med avjoniserat vatten och filtrera lösningen.
- För att förbereda 5% Värmeinaktiverade BSA i vatten, väg in 2,5 g av BSA (bråkdel V, pH 7,0) i en 50 mL tub och Lös det i 45 mL avjoniserat vatten. Fyll lösningen till 50 mL med avjoniserat vatten och värma lösningen i ett vattenbad vid 68 ° C för 45 min. kyla den i ett isbad och lagra den på-20 ° C.
- Förbereda 25% glutaraldehyd vattenlösning.
FÖRSIKTIGHET: Glutaraldehyd är skadligt om förtäring, giftigt vid inandning, och orsakar brännskador. Använd skyddskläder, handskar och skyddsglasögon eller ansiktsskydd. - Höja det kanin-antiserumet som tidigare beskrivits19. Antikroppnivåns på antiserum bestämdes enligt standardprotokoll20.
- Förbereda anti-kanin immunoglobulin-antikroppar från get konjugerat med alkaliskt fosfatas.
- För att bereda 100 mL 0,1 M glycin lösning, Lös 0,75 g av glycin i 90 mL avjoniserat vatten. Justera pH till 10.4 med 1,5 M NaOH-lösning, fylla volymen till 100 mL med avjoniserat vatten och filtrera lösningen.
- Att bereda 100 mL 0,5 M Zn (II)-Acetat lösning, lös 10,98 g av Zn (II)-acetat · 2H2O i 90 mL avjoniserat vatten. Fyll volymen till 100 mL med avjoniserat vatten och filtrera lösningen.
- För att bereda 100 mL 1,5 M NaOH lösning, lös 6,0 g NaOH i 90 mL avjoniserat vatten. Fyll volymen till 100 mL med avjoniserat vatten och filtrera lösningen.
2. Förbered buffertar och arbetar lösningar
- Späd 5 mL 10 x TBS pH 7,4, med 45 mL avjoniserat vatten och tillsätt 100 µL av 1 M MgCl2 stamlösning. Förvara den i rumstemperatur. TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2 lösning är för immobilisering av receptorn och tvättning mikrotiterplattan.
- Späd 10 mL av 5% av Värmeinaktiverade BSA i vatten och 5 mL 10 x TBS, pH 7,4 med avjoniserat vatten till 50 mL. Tillsätt 100 µL av 1 M MgCl2 stamlösning och blanda lösningen väl. Förvara det på isen och för ytterligare experiment vid-20 ° C. Observera att 2,5 mL av 1% BSA i TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2 krävs för varje Titrerkurvan.
- Späd 2,5 mL 1 M HEPES/NaOH, pH 7,4 och 1,5 mL 5 M NaCl-lösning till 50 mL med avjoniserat vatten, tillsätt 100 µL 1 M MgCl2 lösning och blanda lösningen noggrant för att förbereda 50 mL HBS, pH 7,4: 50 mM HEPES/NaOH , 150 mM NaCl.
- Tillsätt 5 µL av 1M MgCl2 stamlösning och 2 µL 0,5 M Zn (II)-acetat stamlösningen till 5 mL 0,1 M glycin lösning, pH 10.4 att förbereda alkaliskt fosfatas (AP) buffert (0,1 M glycin lösning, pH 10.4, 1 mM MgCl2, 0,2 mM Zn(II)-acetate).
3. immobilisering av receptorn (Integrin α2A-domän) till en mikrotiterplattan
- Späd stamlösningen av integrin α2A-domän i TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2 för en slutlig koncentration på 5 µg/mL.
Obs: Volymen av beläggning lösningen är 650 µL för en Titrerkurvan bestående av 12 brunn-rad av en halv område-mikrotiterplattan. - Fyll varje brunn på en rad på en halv område-mikrotiterplattan med 50 µL per brunn av 5 µg/mL beläggning lösningen av integrin α2A-domän (vildtyp eller mutant). Utför varje titrering rad minst i dubbletter (i detta exempel som fyrlingar; se layouten på mikrotiterplattan i figur 1).
- Försegla plattan med folie eller stänga den med lock. Lämna tallriken vid 4 ° C över natten.
4. Tvätta belagda brunnar i den platta två gånger med TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2
- Att ta bort lösliga receptorn molekyler, som inte har varit orörlig till plastytan med fysiska adsorption, ta bort beläggning lösningen och fylla varje väl med 50 µL av TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2.
- Avlägsna tvättlösningen. Säkerställa att brunnarna inte blir torr. Därför inte Knacka mikrotiterplattan på en vävnad trasa för att avlägsna kvarvarande vätska. Använda utgångsämnet pipett eller en flerkanalig pipett för att snabbt fylla brunnarna.
- Upprepa detta tvätt en gång.
5. blockera ospecifik bindning webbplatser
- Tillsätt 50 µL av 1% BSA lösning i TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2 till varje brunn.
- Återförslut brunnarna med folie eller nära med lock.
- Inkubera brunnarna för 1 h i rumstemperatur.
Obs: Inkubation steg i detta protokoll kan utföras på en gunga eller skakar plattform. Men detta krävs inte och ändrar inte resultatet av experimentet.
6. beredning av seriell utspädning rad av liganden, Rhodocetin
- Variera start koncentrationen av rhodocetin och utspädningsfaktorn för den seriella utspädningen, att få ett lämpligt urval av liganden koncentrationer och spela in en fullständig titrering kurva med en lägsta och högsta signal. I detta experiment, anställa en start koncentration av 243 nM rhodocetin och en utspädningsfaktor på 2,3. Späd rhodocetin stamlösning till högsta ligand koncentrationen av raden seriell utspädning. För varje Titrerkurvan med en utspädningsfaktor på 2,3, förbereda 115 µL av 243 nM (dvs, 15,2 µg/mL) rhodocetin lösning i 1% BSA/TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2 i provrör #1.
- Fyll 65 µL av 1% BSA lösning i TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2 10 provrör, märkt #2 genom #11.
- Överföra 50 µL av den rhodocetin utspädningen från provröret #1 till provröret #2, blanda båda lösningarna (total volym: 115 µL; utspädningsfaktorn: 1: 2 3) av sönderdelning och sedan överföra 50 µL från denna blandning till provröret #3 osv
- Fortsätta denna följetong spädning tills provrör #11.
Obs: De volymer som anges i steg 6.1-6.4 är tillräckliga för en Titrerkurvan. Multiplicera dessa volymer med antalet replikat. I det här fallet utför åtta titrering kurvor (fyrlingar av två α2A-domän former) och förbereda följande volymer: 920 µL rhodocetin lösning med den högsta koncentrationen i provrör #1; 520 µL av 1% BSA i TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2 att fylla i alla provrören #2 och #11; och 400 µL av överföring volym från en tub till nästa.
7. bindande av Ligand (Rhodocetin) vid olika koncentrationer till orörlig Receptor (Integrin α2A-domän)
- Ta bort blockering lösningen från i mikrotiterbrunnarna plattan av en vakuum linje.
- Tillsätt omedelbart 50 µL av den rhodocetin lösningen i 1% BSA/TBS, pH 7,4/MgCl2 lösning av provrör #1 i brunnar i kolumn 1, lösning av provrör #2 till brunnar i kolumn 2,etc. Tillsätt 50 µL av 1% BSA i TBS, pH 7,4 , 2 mM MgCl2 (blockering och utspädning buffert) som en ligand-fri kontroll till brunnar i kolumn 12 (se layouten på mikrotiterplattan, figur 1).
- Återförslut brunnarna med folie eller nära med lock.
- Inkubera brunnarna för 1,5 h i rumstemperatur (cirka 20-22 ° C).
8. Tvätta brunnarna av plattan två gånger med HBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2
- Ta bort icke-bundna ligand molekyler, ta bort den bindande lösningen och fyll varje brunn med 50 µL av HBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2. Ta sedan bort tvättlösningen.
- Ta hand att brunnarna inte blir torr. Därför inte Knacka mikrotiterplattan på en vävnad trasa för att avlägsna kvarvarande vätska. Använda utgångsämnet pipett eller en flerkanalig pipett för att snabbt fylla brunnarna.
- Upprepa detta tvätt en gång.
9. fixa den Receptor-bundna liganden med 2,5% glutaraldehyd i HBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2
- Förbered en ny 2,5% glutaraldehyd lösning genom att blanda 1 del 25% glutaraldehyd lösning och 9 delar av HBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2.
- Fyll varje brunn på mikrotiterplattan med 50 µL av 2,5% glutaraldehyd lösningen i HBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2. Inkubera mikrotiterplattan i 10 min i rumstemperatur.
10. Tvätta brunnarna av plattan tre gånger med 50 µL per brunn av TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2
- Om du vill ta bort och inaktivera överskott glutaraldehyd, ta bort fixering lösningen och fyll varje brunn med 50 µL av TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2. Ta sedan bort tvättlösningen.
Obs: Häll över glutaraldehyd-innehållande fixering lösningen från mikrotiterplattan i en maträtt och kassera den fixering lösningen efter det har inaktiverats av en lika stor volym av TBS, pH 7,4. - Ta hand att brunnarna inte blir torr. Därför inte Knacka mikrotiterplattan på en vävnad trasa för att avlägsna kvarvarande vätska. Använda utgångsämnet pipett eller en flerkanalig pipett för att snabbt fylla brunnarna.
- Upprepa detta tvätt två gånger.
11. kvantifiering av Receptor-bundna Ligand av ELISA
- Tillsätt 50 µL per brunn av primär antikropp lösningen i 1% BSA i TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2. Primär antikropp lösningen är en kanin-antiserum upp mot rhodocetin19, utspädd 1:2,000 i 1% BSA i TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2.
- Inkubera plattan för 75-90 min i rumstemperatur. Tvätta alla brunnar i plattan tre gånger med 50 µL per brunn av TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2. Under de tre tvätt steg, avlyssning av mikrotiterplattan på en vävnad krävs inte trasa.
- Tillsätt 50 µL per brunn av sekundär antikropp lösningen i 1% BSA i TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2. För detta ändamål, späd den sekundära antikroppar, kanin immunoglobulin-targeting get antikroppar konjugerat med alkaliskt fosfatas, att 1:2,000 i 1% BSA i TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2. Inkubera plattan för 75-90 min i rumstemperatur.
- Förbereda AP-upptäcka lösning genom att lösa upp en 5 mg tablett innehåller 4-nitrofenyl fosfat dinatrium salt hexahydrat (fosfatas substrat) i 5 mL AP buffert (0,1 M glycin lösning, pH 10.4, med 1 mM MgCl2 och 0,2 mM Zn(II)-acetate).
- Tvätta alla brunnar i plattan tre gånger med 50 µL per brunn av TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2, omedelbart innan du utför nästa steg. Tryck på mikrotiterplattan på en vävnad duk efter steget sista tvätt för att avlägsna alla spår av vätska.
- Tillsätt 50 µL per brunn av AP-upptäcka lösningen till brunnarna på mikrotiterplattan. Lägga till AP-upptäcka lösning omgående alla brunnar att starta enzymatisk omvandling som samtidigt som möjligt. Använd därför en flerkanalig pipett.
- Inkubera plattan i rumstemperatur tills lösningen i brunnarna med den högsta koncentrationen av liganden gulnar.
Obs: Inkubationstiden kan variera mellan 5 min och 1 h beroende på signal intensiteten. - Stoppa omvandlingen av fosfatas substratet genom att lägga till 50 µL per brunn av 1,5 M NaOH-lösning. Lämna den platta stående i flera minuter för att säkerställa streckfri blandning av båda lösningarna. För att motivera den samma inkubationstiden i alla brunnar, Använd en flerkanalig pipett och tillsätt den 1,5 M NaOH i samma ordning till brunnarna som för AP-upptäcka substratet i steg 11,8.
- Mät den optiska densiteten (OD) vid 405 nm för varje brunn av en ELISA-avläsare.
12. utvärdering av signalerna som titrering
- Öppna tabellen av rådata, OD405nm värdena, med Excel. Som dessa signal värden av titrering kurvorna läses i rader, införliva värdena till en kolumn och etikett med koncentrationerna av extra liganden i en annan kolumn.
- Öppna Graphpad Prism 5 (Version 5.0). Öppna en ny projektfil i huvudmenyn. Välj formatet XY enligt nya data & graf. Välj alternativet RETUR och tomten en enda kontaktpunkt för varje värde för y-axeln.
- Kopiera de två kolumnerna, koncentration av extra ligand och signal värden (OD405nm värden) från excel fil och klistra in dem i databladet för GraphPad Prism som X- och Y-värdena, respektive.
- Öppna programmet analys sub GraphPad Prism 5 och välj alternativet icke-linjär regression under XY-analys. Välj användardefinierad ekvation och tryck på knappen Ny för att skapa en ny ekvation.
- Skriv ekvationen titrering kurva i form: Y =(Smax-Smin)*((X+R+K)-sqrt((X+R+K)^2-4*R*X)) /(2*R) + Liselott + B * X in bladet nyöppnade mall, med Y att signalvärdet S, X är koncentrationen av extra ligand L , R att koncentrationen av orörlig receptorn, K är dissociationskonstant, och B är bakgrunden lutning. Definiera de lämpliga begränsningarna, såsom K > 0 och R > 0.
Obs: Denna ekvation är den samma ekvationen av ekvation 9 i annan form. - Analysera värdena i databladet genom att välja användardefinierade ekvationen, som nyligen skapades. Öppna tabellen med beräknade tillnärmning värden (K, Rt, Smax, Sminoch B) som visas under avsnittet resultat på vänster sida av skärmen programvara.
Obs: Programvaran bestämmer 5 parametrar av iterativa passande för den icke-linjära regressionen endast om Titrerkurvan består av minst 5 datapunkter. - Utvärdera parametrar K, Rt, Smax, Smin, och B för varje grupp av titrering kurvor statistiskt och korrelera parametrarna med den specifika funktionen av gruppen (muterade eller kemiskt modifierade ligand eller receptor).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter ELISA har utvecklats, den gula färgen av konverterade alkaliskt fosfatas substratet, para- nitrofenolat, indikerar att bundna rhodocetin ligand minskar med minskande koncentrationer av extra rhodocetin från kolumnerna 1 till 11 (figur 1). Färglös brunnarna i rhodocetin-fri brunnar i kolumn 12 visar en låg bakgrund signal.
Fotometriska kvantifiering vid 405 nm ger data som direkt kan matas in i en analys programvara, och med hjälp av en icke-linjär regression och ekvation 9, approximerar rådata av varje titrering rad och beräknar signalen S (vilket motsvarar OD 405nm) som en funktion av den totala koncentrationen av tillagda rhodocetin ligand Lt (figur 2). De fyra titrering kurvorna för varje receptor (vildtyp och muterade) är mycket reproducerbara och superpose nästan varandra. I motsats till detta låg koncerninterna varians, är de två grupperna av titrering kurvor klart avgränsade från varandra. Högre koncentrationer av rhodocetin ligand krävs för bindning till mutant α2A-domänen att få signaler av liknande värden med de i formuläret vildtyp. Denna rätt förskjutning av titrering kurvorna visar att muterade liganden har en reducerad affinitet för liganden. Således, mutationen införs i domänen α2A försämrar rhodocetin bindande eftersom det är en del av webbplatsen rhodocetin bindande av integrin domän18.
Titrerkurvan kan beskrivas av 5 karakteristiska parametrar: a dissociationskonstant K, (ii) koncentrationen av orörlig, biologiskt aktiva receptorn Rt, (iii) maximal och (iv) minimum signaler (Smax och Smin), samt (v ) lutningen på bakgrunden signalen B. Bland dessa parametrar är dissociationskonstant K grundläggande och mest relevanta för biologiska tolkningen av titrering kurvor. Varje Titrerkurvan ger ett värde för K. Enda och också grupperade titrering kurvor kan således jämföras statistiskt med varandra. Sådan en statistisk analys av fyra titrering kurvor för vildtyp och muterade α2A-domänen visas i figur 3. Konstanten affinitet för bindning av rhodocetin till vildtyp α2A-domänen är 5.80 ± 0,15 nM, medan rhodocetin binder till muterad receptor med en betydligt lägre affinitet 9.68 ± 0,18 nm (p < 0,0001).
Således, titreringen ELISA tillsammans med denna matematiska utvärdering ger en snabb och statistiskt korrekt utvärdering av liganden binda till en receptor och dess muterade eller kemiskt modifierade derivat. Både titrering ELISA och utvärdering algoritmen är därför värdefulla verktyg för att analysera struktur och funktion relationer.
Figur 1: representativa layouten för en mikrotiterplattan för en titrering ELISA. Varje rad visar data för en Titrerkurvan. För att jämföra deras bindning av rhodocetin (RC) ligand, är vildtyp (rader A-D) eller muterade form (rader E-H) av α2A-domän orörlig i brunnar i fyra rader varje (fyrling bestämning). Horisontell dot linjen separerar de två grupperna av titrering kurvor. Koncentrationen av rhodocetin ligand minskar från kolumn 1 och 11, medan brunnar i kolumn 12, anges på höger sida av den vertikala dot linjen, inte innehåller någon rhodocetin och representera bakgrund kontroll. Plattan visas efter den bundna liganden kvantifieras i ELISA där alkaliskt fosfatas substratet omvandlas till gula para- nitrofenolat. Uppgifterna presenteras från en av tre repetitiva experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa titrering kurvor. Rådata för titreringen orörlig vildtyp och muterade former av integrin α2A-domän med rhodocetin som lösliga ligand (symboler), liksom tillnärmade titrering kurvorna (linjer) visas i en semi logaritmisk tomt. Rådata fyrling bestämningar (cirklar, trianglar upp och ner, rutor för var och en av de fyra titrering raderna) visas för orörlig vildtyp (öppna symboler) och muterat (fyllda symboler) α2A-receptorer. De beräknade titrering kurvorna visas som linjer (solid, kort streckad, Prickig, kedja-prickade) för vildtyp (svarta linjer) och mutant (grå linje) form av receptorn. De fyra titrering kurvorna inom var och en av de två grupperna (vildtyp och muterade receptor) superpose, titrering kurvorna tydligt skiljer sig åt mellan de två grupperna. Titreringar kurvorna av muterade α2A-domänen skiftas till högre rhodocetin koncentrationer som anger att rhodocetin binder med lägre affinitet till muterad receptor. Uppgifterna presenteras från en av tre repetitiva experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Statistiska jämförelser av dissociation konstanter K härrör från titrering kurvor.
Dissociations konstanter åtta titrering kurvorna från figur 2 är ritade och grupperade för vildtyp och muterade form av α2A-domän. Enskilda värden, grupp medel och standardavvikelser indikeras av punkter, med streckad svarta linjer, och grå felstaplar, respektive. Liten variansen inom varje grupp och en distinkt skillnad mellan gruppen innebär att påvisa en signifikant skillnad (p < 0,0001) i liganden affinitet till vilda och till mutant-receptorn. En tvåsidiga Students t-test användes för jämförelse. Uppgifterna presenteras från en av tre repetitiva experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Titreringen ELISA är ett mångsidigt testsystem att bestämma dissociationen av en receptor-ligand interaktion. Som titreringen ELISA kringgår behovet att skilja fri och bunden ligander effektivt och att analysera deras koncentrationer kvantitativt sett betydligt fler studier och publikationer har sysselsatt titrering ELISAs istället för inspelning bindande kurvor . Dessutom titrering ELISAs är lätta att utföra och kräver relativt låga mängder receptor och ligand. För exakt analys av dissociation konstanter, måste ren preparat både receptor och ligand användas. Kontaminerande proteiner inom receptor preparatet konkurrera med receptorn för adsorption webbplatser på mikrotiterplattan plast yta. Eftersom de binder inte ligand men minska antalet ligand-bindande receptorer, minska föroreningar av receptorn lösningen signalerna titreringen ELISA. Om renhet av receptorn preparatet inte kan förbättras något ytterligare, en antikropp riktad mot receptorn kan vara orörlig till mikrotiterplattan och efter blockering brunnarna, kommer att fånga receptorn från en beredning som innehåller föroreningar. Försiktighet måste dock iakttas så att fånga antikroppen stör inte detektion av bundna ligand med de primära och sekundära antikropparna på grund av arter störningar av antikroppar, eller att det hindrar ligand bindande.
För att få en omfattande uppsättning data, är det uppskattat för att utföra titrering ELISA i ett ömsesidigt sätt, vilket är att använda lösliga liganden av ett experiment som receptorn i andra försöket genom att immobilisera det till mikrotiterplattan och att titrera den med den tidigare receptorn som kommer att tillämpas lösliga ligand-partnern. Detta fungerar oftast väl såvida immobilisering inactivates bindande aktiviteten av en partner eller om verktyg, såsom antikroppar att upptäcka titrerad partnern, inte existerar eller är svårt att få. I rhodocetin-α2A domain bindande system, detta fungerade bra efter en glutation-S-transferas (GST)-delen var smält till α2A-domänen att underlätta dess upptäckt med GST-antikroppar16.
En annan fördel med titreringen ELISA är att endast koncentrationen av extra liganden (Lt), men inte av den fria och bundna liganden (Lf och Lb, respektive), måste vara känd. Ligand preparatet bör därför så rena som möjligt. Om detta är omöjligt eller genomförbart endast i begränsad utsträckning, titreringen ELISA kan fortfarande användas, efter molar förhållandet av ligand inom beredning har bestäms självständigt, t.ex., av SDS-PAGE, immunoblotting eller sandwich-ELISA.
Problem med titreringen ELISA kan uppstå om samhörigheten mellan den receptor och ligand är för låg eller om glutaraldehyd fixering avskaffar bindande interaktionen. I det senare fallet måste en fixering-fritt protokoll titreringen ELISA upprättas. Dissociation konstanter kan i praktiken endast upptäckas om de bindande partnerna interagerar med någorlunda hög affinitet, vilket är i intervallet under cirka 200 nM.
Titreringen ger signal stödnivåer S som funktion av totala koncentrationerna av extra ligand, Lt. Koncentrationerna av fria och obundna ligander, Lf och Lb, summera upp till Ltsamt som Lb är lika med produkten av Y· Tt enligt ekvation 3, ekvation 4 omvandlas till:
Ekvation 5
vilket resulterar i kvadratiska ekvationen,
Ekvation 6
vars praktiska lösningen är,
Ekvation 7
Dessutom representerar signal intensiteten S (Lt) vid en viss koncentration av extra ligand Lt den mättnad avkastningen Y, efter det har korrigeras genom subtraktion av minsta signalvärdet, Smin, och normaliserade till det dynamiska omfånget , givet som skillnaden mellan högsta och lägsta signalen värden, Smax och Smin:
Ekvation 8
Kombinationen av ekvation 7 och ekvation 8 ger en matematisk funktion som korrelerar signal intensiteten S (Lt) med koncentrationen av extra ligand Lt. En term B· Lt kan läggas för att beskriva signalen ospecifik bakgrunden vilken linjärt höjer med Lt. B är proportionalitet konstant i bakgrunden. Således, den allmänna funktionen att beskriva en Titrerkurvan är:
Ekvation 9
Funktionen av en Titrerkurvan motsvarar en sammansatt funktion med en kvadratrot och en linjär sikt, som beskriver det specifika samspelet mellan receptorn och ligand och ospecifik interaktioner av ligand, respektive. Denna funktion är olika från hyperbolic funktionen av bindande kurvan (Lbvs. Lf).
I motsats till bindande kurvan, där koncentrationerna av bundna ligand ritas på y-axeln, Titrerkurvan är mer flexibelt och tillåter någon signal, som korrelerar koncentrationen av bundna ligand, ritas på y-axeln. Denna signal kan vara fotometriskt upptäckta bindningen av en enzymkopplad antikropp (som i detta fall av ELISA), men det kan också vara andra spektrometriska signaler, såsom en förändring av absorbansen, cirkulärdichroism9, fluorescence polarization21 , och NMR signalerar22. Dessutom också bör termodynamiska signaler från isotermiska titrering kalorimetri23 utvärderas. Andra studier fastställa bindande affinitet från den kinetiska on - och off priser för bildandet och dissociation av receptor-ligand komplexet av mätning i realtid förändringar i fältet flyktig av ytan plasmon resonans24,25 , massa nedfall av en quartz crystal microbalance26, eller i fluorescens av hur provtagningsutrustningen skall thermophoresis26,27. Mätningarna i realtid har blivit kraftfulla verktyg på grund av deras sofistikerade utvärderingsprogramvara. Titrering ELISA och SPR är generellt metoden för val att undersöka bindande partner i protein-kemisk analys. Titrering ELISA åtgärder konstanten affinitet thermodynamically av kvantifiera mängden bundna ligand på olika jämvikt påstår, SPR använder en kinetisk metod och approximerar den kinetiska konstanter, koff och kpå , förhållandet mellan som ger de kinetiskt beslutsamma dissociation konstant24,25. Beroende på de två olika synsätten, kan K värdena avvika från varandra. I rhodocetin-α2A domän bindande experiment, SPR data visade koff och kpå konstanter, och följaktligen en kinetiskt avgöra affinitet konstant K, för rhodocetin-α2A komplexa19, vilka är mycket liknar de K-värdena som uppmätts i denna studie genom titrering ELISA. Små skillnader kan förklaras av aktivitet varianter av olika partier eller olika villkor och varaktighet för lagring av protein proverna. I detta senare hänseende i titreringen ELISA mäts alla prover samtidigt och inte sekventiellt som i SPR maskinen. Nu, att vara matematiskt tillgänglig och lätt att hantera med titrering kurva ekvation (ekvation 9), denna slutpunkt mätning av titreringen ELISA kan bli precis lika kraftfulla som kinetiskt utvärderade realtid mätningarna, som kräver en kostnadsintensiv SPR maskin.
Denna ekvation tar hänsyn till att den totala koncentrationen av liganden är nedsatt av koncentrationen av bundna ligand, särskilt vid låga ligand koncentrationer. Detta tillåter mycket bättre approximationer av Titrerkurvan till data över hela intervallet av liganden koncentrationer. En nackdel med titreringen ELISA, jämfört med kurvan är bindande, har hittills varit svårigheten att matematiskt utvärdera Titrerkurvan. Medan i en bindande kurva koncentrationen av fria liganden Lf på halv maximal mättnad motsvarar dissociationskonstant, är detta inte sant för en Titrerkurvan. Två algoritmer har utvecklats självständigt att grafiskt linjär titrering kurvor och bestämma konstanten dissociation. Dock båda algoritmer utvecklats för spektroskopisk titrering experiment av Stockell et al. 8 och av Heyn & Weischet9 lider av nackdelen att den maximala signalen för mättnad avkastning Y måste bestämmas grafiskt. När det här värdet är närmade sig asymptotiskt, är mättnad avkastningen och följaktligen den beräknade dissociationskonstant egensäkra felbenägen. Däremot den algoritm baserat på ekvation 9 använder rådata från titrering experiment och beräknar dissociationskonstant K samt andra parametrar i en icke-linjär regression för att hitta den bäst anpassade lösningen (figur 2 och figur 3 ). Dessutom, som denna algoritm inte behöver grafiskt uppskatta eventuellt ut nå maximal signalen på ligand mättnad, utvärderingsprocessen blir mycket snabbare och korrekt och det bär mindre bias än grafiska utvärderingen. Flera titrering kurvor kan utvärderas parallellt. Således, flera grupper av titrering kurvor kan mätas samtidigt, och deras parametrar kan vara statistiskt analyseras och jämförs. Dessutom varje Titrerkurvan ger en uppsättning värden, bland dem dissociationskonstant K, koncentrationen av immobiliserade och bindande-aktiva receptorn Rt, det dynamiska omfånget som skillnaden mellan högsta och lägsta signalen värden Smax och Smin as well as den linjära faktorn B vilket motsvarar den experimentella bakgrund signal med hjälp av dessa värden, mättnad avkastningen Y kan beräknas och ritade i beroende av koncentrationen av lagt till ligand Lt. I sådan en mättnad avkastning tomt motsvarar koncentrationen av extra liganden vid halv maximal mättnad signal Lt(50%) summan av dissociationskonstant K plus halva koncentrationen av immobiliserade aktiv receptor Rt
Ekvation 10
Detta kan härledas för Y = 0,5 med ekvation 7. Koncentrationen av immobiliserade aktiv receptor Rt kan således bestämmas genom att utföra titrering ELISA med olika beläggning koncentrationer av receptorn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har något att avslöja.
Acknowledgments
Protokoll och algoritmen utvecklades inom ett projekt som finansieras av den Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG grant SFB1009 A09 och EB177/13-1). Författaren tack Barbara Schedding och Felix Schmalbein för teknisk support och Dr Niland för att kritiskt läsa manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIS | neoFrox | 1125KG001 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| NaCl | Applichem | 1,316,591,214 | |
| MgCl2 | Merck | 172571 | |
| integrin a2A, wild-type and mutant, recombinant | isolated in author's lab | ||
| NiNTA superflow column | Qiagen, Germany | 30821 | |
| Coomassie-Brilliant Blue R250 | Serva | 35050 | |
| bicinchoninic acid assay (BCA), protein concentration determination kit | Fisher Scientific | 23225 | |
| bovine serum albumine (BSA), fraction V | Applichem | A1391 | |
| 25 % solution of glutaraldehyde | Merck | 354400 | |
| anti-rabbit immunglobulin-antibodies from goat, conjugated with alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | A9919 | |
| Glycine | Applichem | A1377 | |
| Zn(II)-acetate | Applichem | A4324 | |
| NaOH | Applichem | A1551 | |
| Alkaline phosphatase substrate tablet (5 mg) | Sigma-Aldrich | S0942 | |
| Costar half-area microtiter plate | Thermo Scientific | Corning 3690 | |
| micro reaction tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Microplate ELISA reader | BioTek | Synergy HT |
References
- Klotz, I. M. The application of the law of mass action to binding by proteins; interactions with calcium. Arch Biochem. 9, 109-117 (1946).
- Klotz, I. M. Ligand-receptor complexes: origin and development of the concept. J Biol Chem. 279 (1), 1-12 (2004).
- Bisswanger, H. Ch. 1: Multiple Equilibria, Principles and Derivations. Enzyme Kinetics: Principles and Methods. , Wiley VCH Verlag GmbH. 1-26 (2017).
- Shimura, K., Kasai, K. Affinity gel titration: quantitative analysis of the binding equilibrium between immobilized protein and free ligand by a continuous titration procedure. Anal Biochem. 149 (2), 369-378 (1985).
- Gong, M., Nikcevic, I., Wehmeyer, K. R., Limbach, P. A., Heineman, W. R. Protein-aptamer binding studies using microchip affinity capillary electrophoresis. Electrophoresis. 29 (7), 1415-1422 (2008).
- Hanes, M. S., Ratcliff, K., Marqusee, S., Handel, T. M. Protein-protein binding affinities by pulse proteolysis: application to TEM-1/BLIP protein complexes. Protein Sci. 19 (10), 1996-2000 (2010).
- Latour, R. A. The Langmuir isotherm: a commonly applied but misleading approach for the analysis of protein adsorption behavior. J Biomed Mater Res A. 103 (3), 949-958 (2015).
- Stockell, A. The binding of diphosphopyridine nucleotide by yeast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J Biol Chem. 234 (5), 1286-1292 (1959).
- Heyn, M. P., Weischet, W. O. Circular dichroism and fluorescence studies on the binding of ligands to the α subunit of tryptophan synthase. Biochem. 14 (13), 2962-2968 (1975).
- Campbell, I. D., Humphries, M. J. Integrin structure, activation, and interactions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (3), (2011).
- Zeltz, C., Gullberg, D. The integrin-collagen connection--a glue for tissue repair? J Cell Sci. 129 (4), 653-664 (2016).
- Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468 (7323), 580-584 (2010).
- Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annu Rev Immunol. 25, 619-647 (2007).
- Luo, B. H., Springer, T. A. Integrin structures and conformational signaling. Curr Opin Cell Biol. 18 (5), 579-586 (2006).
- Ricard-Blum, S. The collagen family. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a004978 (2011).
- Eble, J. A., Tuckwell, D. S. The α2β1 integrin inhibitor rhodocetin binds to the A-domain of the integrin α2 subunit proximal to the collagen-binding site. Biochem J. 376 (Pt 1), 77-85 (2003).
- Eble, J. A., et al. The α2β1 integrin-specific antagonist rhodocetin is a cruciform, heterotetrameric molecule. FASEB J. 23 (9), 2917-2927 (2009).
- Eble, J. A., et al. Dramatic and concerted conformational changes enable rhodocetin to block α2β1 integrin selectively. PLoS Biol. 15 (7), e2001492 (2017).
- Bracht, T., Figueiredo de Rezende, F., Stetefeld, J., Sorokin, L. M., Eble, J. A. Monoclonal antibodies reveal the alteration of the rhodocetin structure upon α2β1 integrin binding. Biochem J. 440 (1), 1-11 (2011).
- Harlow, E., Lane, D. Chapter 5: Immunizations. Antibodies, a laboratory manual. 5, Cold Spring Harbor Laboratory. 53-138 (1988).
- Lu, D. Analyzing interactions between SSB and proteins by the use of fluorescence anisotropy. Methods Mol Biol. 922, 155-159 (2012).
- Fielding, L. NMR methods for the determination of protein-ligand dissociation constants. Curr Top Med Chem. 3 (1), 39-53 (2003).
- Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Curr Opin Struct Biol. 11 (5), 560-566 (2001).
- McDonnell, J. M. Surface plasmon resonance: towards an understanding of the mechanisms of biological molecular recognition. Curr Opin Chem Biol. 5 (5), 572-577 (2001).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Curr Opin Biotechnol. 11 (1), 54-61 (2000).
- Pesquero, N. C., et al. Real-time monitoring and kinetic parameter estimation of the affinity interaction of jArtinM and rArtinM with peroxidase glycoprotein by the electrogravimetric technique. Biosens Bioelectron. 26 (1), 36-42 (2010).
- Scheuermann, T. H., Padrick, S. B., Gardner, K. H., Brautigam, C. A. On the acquisition and analysis of microscale thermophoresis data. Anal Biochem. 496, 79-93 (2016).
