Summary
Aquí, presentamos un método modificado de electrospinning para fabricar injertos vasculares PCL con fibras gruesas y los poros grandes y para describir un protocolo para evaluar el desempeño en vivo en un modelo de rata de reemplazo de la aorta abdominal.
Abstract
Aquí, presentamos un protocolo para fabricar macroporoso PCL vascular injerto y para describir un protocolo de evaluación utilizando un modelo de rata de reemplazo de la aorta abdominal. Los injertos vasculares electrospun a menudo poseen poros relativamente pequeños, que limitan la infiltración celular en los injertos y dificultan la regeneración y remodelación de las arterias de neo. En este estudio, los injertos vasculares PCL con fibras más gruesas (5-6 μm) y los poros más grandes (~ 30 μm) fueron fabricados usando una técnica de tratamiento modificada. Se evaluó el rendimiento a largo plazo del injerto por la implantación de un modelo de aorta abdominal de la rata. El análisis de ultrasonido demostró que los injertos sigue siendo patentes sin aneurisma o estenosis que ocurren incluso después de 12 meses de implantación. Estructura macroporosa mejora el crecimiento de la célula y así promovido tejido regenerado en 3 meses. Más importante aún, no había señal de remodelado adverso, tales como la calcificación dentro de la pared del injerto después de 12 meses. Por lo tanto, electrospun injertos vasculares de PCL con macroporoso modificado procesamiento tienen potenciales para ser un sustituto de la arteria para la implantación a largo plazo.
Introduction
Injertos vasculares hechos de polímeros sintéticos son ampliamente utilizados en clínica para la terapia de las enfermedades cardiovasculares (ECV). Por desgracia, en el caso de injertos vasculares de pequeño diámetro (D < 6 mm) no se dispone de ninguna productos de éxito debido a la baja permeabilidad provocada por la velocidad de flujo reducido de la sangre, que a menudo conduce a la trombosis, la hiperplasia intimal y otros complicaciones1.
Ingeniería de tejidos provee una estrategia alternativa para realizar la permeabilidad a largo plazo y basada en una regeneración vascular guiado por el andamio y la reconstrucción de la homeostasis. En detalle, el injerto vascular, como una plantilla tridimensional podría proporcionar soporte mecánico y estructural orientación durante la regeneración del tejido vascular y la influencia funciones celulares, incluyendo la adhesión celular, migración, proliferación, y secreción de matriz extracelular2. Hasta ahora, se han evaluado diversos polímeros sintéticos para aplicaciones en la ingeniería de tejido vascular. Entre estos polímeros poly(ε-caprolactone) (PCL) se ha investigado intensivamente debido a compatibilidad buena célula y degradación lenta desde varios meses hasta dos años3. En una rata aorta modelo4,5,6, injertos vasculares PCL procesados por electrospinning exhibieron excelente integridad estructural y la permeabilidad, así como continuamente creciente de la célula invasión y neovascularización en la injerto de pared de hasta 6 meses. Sin embargo, remodelación tisular adversa, incluyendo la regresión de las células y los capilares y la calcificación, también se observaron en los puntos de tiempo más largo, por 18 meses.
Cellularization del injerto vascular es un factor clave en determinar la regeneración del tejido y remodelación7. Electrospinning, como una técnica versátil, ha sido ampliamente empleada para la preparación de los injertos vasculares con estructura fibrosa nano8. Desafortunadamente, la estructura de poro relativamente pequeños a menudo conduce a infiltración insuficiente de células en el injerto vascular electrospun, que limita la regeneración del tejido posterior. Para resolver este problema, se han intentado diversas técnicas para aumentar el tamaño de los poros y la porosidad total, incluyendo el sal/del polímero lixiviación9,10, modificación del aparato colector, después del tratamiento por radiación láser11 , etcetera. De hecho, la estructura de los injertos electrospun (incluyendo el diámetro de fibra, tamaño de los poros y porosidad) está estrechamente vinculada a las condiciones de procesamiento de12,13. Durante electrospinning, el diámetro de la fibra puede controlarse fácilmente cambiando los parámetros, tales como la concentración de la solución de polímero, flujo, voltaje, etcetera. 14 , 15, y por lo tanto, el tamaño de los poros y la porosidad se han mejorado en consecuencia.
Recientemente Reportamos un injerto modificado de electrospun PCL con estructura macroporosa (fibras con diámetro de 5-7 μm y poros de 30-40 μm). Implantación in vivo mediante la sustitución de aorta abdominal de la rata demostró la elevada tasa de permeabilidad, así como buena regeneración endotelialización y músculo liso en 3 meses después de la cirugía16. Más importante aún, no tejido adverso remodelación incluyendo la regresión de la calcificación y la célula se pudo observar incluso después de un año de implantación.
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Protocol
El uso de animales de experimentación fue aprobado por el Animal experimentos éticos Comité de la Universidad de Nankai y llevado a cabo conforme a la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
1. fabricación de injertos Electrospun PCL
Nota: En este documento, una técnica de Electrohilado fue utilizada para fabricar los injertos vasculares.
- Preparar soluciones PCL de 25 wt % y 10% en peso, disolviendo el PCL en una mezcla de metanol y cloroformo, respectivamente (cociente del volumen 1:5), a temperatura ambiente (RT) durante 12 h.
- Cargar la solución PCL en una jeringa de vidrio 10 mL.
- Coloque la jeringa con una aguja de 21 G.
- Coloque el mandril de acero inoxidable (2 mm de diámetro, 25 cm de longitud) en el instrumento de colección.
- Para los injertos de fibra más gruesa, use la solución PCL de 25% en peso, distancia de trabajo de 17 cm de la punta de la aguja al colector, tasa de flujo de 8 mL/h y la tensión de 11 kV como los parámetros de electrospinning. Para los injertos de fibra más fina, utilice la solución PCL de 10% en peso, distancia de trabajo de 20 cm de la punta de la aguja al colector, un caudal de 2 mL/h y la tensión de 18 kV como los parámetros de electrospinning.
- Asegúrese de que los injertos obtenidos se colocan en el vacío durante la noche para eliminar el solvente residual. Esterilizar todos los instrumentos antes del procedimiento y mantener una técnica aséptica en todo.
- Antes de la implantación, desinfectar los injertos por sumergir en 10 mL de etanol al 75% durante 30 minutos y luego exponerlos a la luz UV durante la noche.
- Medidas del tamaño de fibra y poro: calcular el diámetro promedio de fibra utilizando el software ImageJ basado en imágenes de microscopia electrónica (SEM).
- Ensayos mecánicos de andamios:
- Corte los andamios tubulares en secciones de 3 mm de longitud con una cuchilla de afeitar. Medir el espesor de andamios utilizando un micrómetro.
- Colocar los andamios tubulares en una máquina de ensayos de tracción con una capacidad de carga de 100 N.
- Sujetar los andamios con una distancia de 1 mm entre la abrazadera y tire longitudinalmente a una velocidad de 10 mm/min hasta la ruptura. Medir la resistencia a la tracción y alargamiento a la rotura. Calcular el módulo de Young de la región lineal inicial (hasta 5% tensión) de la curva del stress-strain.
2. rata Aorta Abdominal implantación modelo
Nota: Todos los materiales e instrumentos utilizados en cirugía son estériles. Durante la cirugía, asegúrese de que el operador lleva una máscara de Gasa y guantes estériles para evitar infecciones. Asegúrese de que la temperatura se mantiene a 27-30 ° C para mantener la temperatura corporal del animal. Seguir pautas IACUC locales con respecto a la analgesia.
- Utilizar ratas Sprague Dawley macho pesa 240-270 g como receptores de injerto vascular. Asegúrese de que la rata ha ayunado 24 h antes de la cirugía. El objetivo de ratas ayuno por 24 h es vacía las heces en el tracto intestinal lo suficiente, de tal modo amplían horizontes del operador.
- Agarre de cuello detrás de la rata y mantenga su cabeza hacia abajo, inserte la aguja de springe en la cavidad abdominal de la parte inferior del abdomen. Inducir a la rata para la anestesia con hidrato de cloral (330 mg/kg) por inyección intraperitoneal.
- Confirmar la anestesia adecuada al asegurar que la rata ha relajado los músculos y la respiración constante. Colocar la rata en el microscopio en una posición supina.
- Aplique petrolato veterinario oftálmica ungüento en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Administrar anticoagulación (100 UI/kg) con solución salina heparinizada (50 UI/mL) por inyección en la vena la cola antes de la cirugía.
- Afeitado de la piel en la pared abdominal anterior usando una cuchilla de afeitar y limpiar la piel con solución de yodo y alcohol médico.
- Realizar una incisión de laparotomía de línea media con tijeras quirúrgicas y garantizar que la incisión es de unos 4-5 cm de largo y luego exponer la cavidad abdominal.
- Repliegue y envuelva los intestinos con una gasa humedecida con solución salina preferentemente.
- Disecar cuidadosamente la aorta abdominal.
- Identificar y ligar todos los ramas pequeños utilizando suturas de nylon monofilamento 9-0.
- La sección aislada de la abrazadera (hasta 1 cm de longitud) de la aorta utilizando dos pinzas vasculares. La aorta puede permanecer sujeta durante 20-30 minutos.
- Transecto de la aorta abdominal entre dos pinzas con micro tijeras para crear los sitios de anastomosis.
- Lave los dos extremos de la aorta con solución salina heparinizada (50 UI/mL) para quitar la sangre residual.
- Pele apagado la adventicia con micro tijeras.
- Anastomizar el injerto con diámetro interno de 2 mm y 1 cm de longitud a aorta abdominal de la rata con un patrón de sutura figura de ocho con suturas de nylon monofilamento 9-0.
- En primer lugar, construir cuatro anastomosis según la secuencia de 9, 3, 12 y 6:00 posiciones en el lado proximal, luego anastomizar los bordes de corte en 4 puntos de sutura entre dos suturas. Después de terminar la sutura proximal, la sutura del lado distal por el mismo método.
Nota: Cada punto es necesaria para asegurar que el lado nativo se encaja un poco en el injerto. - Retire la abrazadera distal para permitir que la sangre fluya en el injerto, luego retire la pinza proximal.
- Presione los extremos de la sutura para detener el sangrado utilizando una bola de algodón estéril o con una esponja de Gasa pequeña. Pulse durante unos 3 minutos, hasta que la hemostasia.
- Regresar los intestinos a la cavidad abdominal.
- Lavar la cavidad abdominal con solución salina tibia con gentamicina (320 U/mL).
- Coser la pared abdominal usando una sutura de Nylon 3-0 en la capa de músculo y la piel, respectivamente.
- Colocar la rata en una jaula limpia y seca y poner una almohada debajo de la jaula para mantener la temperatura del cuerpo animal; Luego espere a que la rata para recuperarse de la anestesia. Asistir al animal hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal.
- Después recupera conciencia, puso la rata en una jaula solo con comida y agua. Aplicar yodo en la herida para prevenir la infección después de la cirugía. Vuelve la rata a la compañía de otros animales hasta que recupera completamente.
- Eutanasia ratas según las pautas en los puntos de tiempo predeterminado.
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Representative Results
Los injertos PCL fueron explantados en 3 meses y 12 meses postoperatorio y analizan por técnicas estándar histológicas por hematoxilina y eosina (H & E), tricrómica de Masson, Verhoeff-van Gieson (VVG), Von Kossa e inmunofluorescencia que manchaba para α-SMA, MYH, vWF y la elastina. Las imágenes histológicas fueron tomadas usando un microscopio vertical, y las imágenes de la inmunofluorescencia fueron tomadas usando un microscopio de fluorescence.
Todos los datos se expresaron como media ± SD Dos colas emparejadas de Student t-test se utilizó para comparar las diferencias. Un valor de p < 0.05 se consideró estadísticamente significativa.
Injertos PCL electrospun novela con estructura optimizada, es decir, las fibras más gruesas y los poros más grandes, fueron fabricados con éxito en este estudio. Imágenes SEM demostraron que el diámetro de fibra promedio fue casi 8 veces más grueso en los injertos modificados (figura 1A) que en la convencional uno (figura 1B) (5.59 ± 0.67 versus 0,69 μm ± 0,54). Como resultado, el tamaño de poro promedio fue considerablemente mayor, de ~ 4.66 μm en la fibra más fina del injerto a ~ 40.88 μm en la gruesa fibra uno. Cortes transversales demostraron fibra homogéneo de distribución dentro de la pared de los injertos tubulares en fibra más gruesa (Fde lafigura 1–) y grupos de fibra más fina (figura 1–). El espesor de la pared estaba sobre 400-500 μm. Las propiedades mecánicas de los injertos fueron caracterizadas por pruebas de resistencia a la tracción, y las curvas tensión-deformación típico se muestran en la figura 1. Las propiedades mecánicas de dos injertos eran evidentemente diferentes en términos de elongación. El valor correspondiente de los injertos de fibra más gruesa fue aproximadamente 3 veces mayor que los injertos de fibra más fina, lo que sugiere la mayor dureza.
Los injertos vasculares preparados (diámetro interno de 2.0 mm) y longitud de 1 cm (figura 2A) fueron implantados para reemplazar un segmento de aorta abdominal nativa en rata (figura 2B). En puntos de tiempo predeterminado, la permeabilidad de los injertos implantados fue examinada por ultrasonido. Resultados mostraron que la mayoría de los injertos eran patentes (figura 2). Además, la velocidad del flujo de sangre fue similar entre el injerto y vasos nativos juntos a los 12 meses. Injertos explanted conservan buena morfología sin aneurisma (Figura 2D), y no pudieran observarse ninguna estenosis o trombos en la superficie luminal (Figura 2E).
Regeneración de los tejidos y la secreción de ECM a los 3 meses más se evaluaron por análisis de la histología. H & E tinción demostró que se formó una capa de tejido neo en el lumen del injerto (figura 3-H). Por otra parte, vWF tinción muestran que la superficie luminal fue totalmente cubierta por endotelio recién formado (Figura 3A), que se asemeja a la de la aorta nativa (figura 3B). Mientras tanto, varias capas de células positivas de MYH se organizaron a lo largo de la dirección circunferencial, lo que indica la regeneración de los medios de comunicación vascular (figura 3–D). Síntesis de matriz extracelular fue observado por Masson y VVG coloración, respectivamente. Se pudo observar una cantidad significativa de colágeno y elastina fibroso dentro del injerto (figura 3I–J, K–L), que desempeña un papel importante en la regeneración vascular y el remodelado. Tinción de inmunofluorescencia demostró aún más que la estructura de la elastina se alineó circunferencial en un patrón que en la arteria nativa (figura 3E–F).
Además, los tejidos regenerados incluyendo endotelio y músculo liso mantenido integran y no regresan después de 12 meses de la implantación (Figura 4A–C). Más importante aún, no había rastro de la calcificación que ocurre dentro de la pared del injerto, basada en la (figura 4) la coloración de Von Kossa.
Figura 1 : La estructura y propiedades mecánicas del injerto PCL. Imágenes de SEM de electrospun PCL esteras con fibras más gruesas (A) y las fibras más finas (B). Cortes transversales de injertos tubulares de fibra más gruesa (FdeD–) e injertos de fibra más fina (G–). La curva de tensión-tensión representativa se muestra en (C). Estas cifras se han modificado de Zhao, et al. 16 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Implantación de injertos vasculares en un modelo de aorta abdominal de la rata. Injerto vascular Electrospun PCL de 1 cm de longitud (A) fue quirúrgico interpuesto en la aorta abdominal en la rata (B). La imagen de ultrasonido demostró que el injerto era patente en vivo en 1 año (C). Imágenes estereoscópica muestran que el injerto era bien integrado con aorta nativa adyacente sin aneurisma (D), y la superficie luminal está limpio y libre de trombosis (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Regeneración de los tejidos y la deposición de ECM en los injertos explantados en 3 meses en comparación con la aorta nativa. Imágenes seccionadas transversalmente de la regenerada injertos (A, Cy E) y la arteria nativa (B, Dy F) immunostained para detectar las células endoteliales, células musculares lisas y elastina. H & E tinción muestra la regeneración de los tejidos en los injertos explanted (G) en comparación con la aorta nativa (H). Masson de tinción reveló que la presencia de colágeno en el explanted injertos () y la aorta nativa (J). VVG coloración demostró la presencia de elastina en el explanted injertos (K) y la aorta nativa (L). Estas cifras se han modificado de Zhao, et al. 16 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Análisis histológico de los injertos explantados en 12 meses. (A) H & E tinción demostraron la regeneración de los tejidos en los injertos explanted. (B) endotelio fue immunostained anticuerpo de vWF. (C) del músculo liso era immunostained por anticuerpo α-SMA. (D) la calcificación se evaluó por tinción de Von Kossa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La infiltración celular es crítico para la regeneración y remodelación del injerto vascular en vivo16. Infiltración de la célula limitada está a menudo relacionada con los poros relativamente pequeños del injerto que impiden la migración de células en la pared del injerto. Para hacer frente a esta dificultad, hemos desarrollado un método modificado para preparar electrospun injertos vasculares de PCL con estructura de poro grande. En detalle, el tamaño del poro aumenta con el aumento de espesor de fibra que puede ser fácilmente controlado por los parámetros de procesamiento. Los resultados mostraron que las células del anfitrión podrían infiltrarse fácilmente en la pared de esta prótesis macroporosa después de la implantación en vivo y la celularidad se mantuvo en un nivel relativamente alto sin regresión celular obvio en la cirugía posterior de 12 meses.
Arteria nativa principalmente consiste en tres capas, es decir, endotelio, túnica media y adventicia. Endotelio, como interfaz anti-trombogénicas, juega un papel vital en el mantenimiento de la permeabilidad a largo plazo del vaso sanguíneo. En nuestro estudio, se observó completa endotelialización sobre el injerto a los 3 meses. Además, la túnica media compuesta por varias capas de células musculares lisas es muy importante en la regulación de la función de los vasos sanguíneos y propiedades mecánicas apropiadas de la arteria. El presente estudio reveló que el electrospun PCL injertos con fibra gruesa y grande del poro mejorado notablemente la regeneración de los medios de tunica funcional. Además, la estructura del regenerado de músculo liso es similar a la de la nativos de la túnica media. Tinción de inmunofluorescencia demostró varias capas de células MYH+ distribuidas dentro de la red de elastina, que reflejan el fenotipo contráctil de células musculares lisas circulares. Más importantemente, regeneraron tejidos (endotelio y músculo liso) mantenidos intactos y no había remodelado adverso aún después de 12 meses debido al desequilibrio entre degradación y síntesis de ECM.
La calcificación es todavía un problema importante asociado con los implantes cardiovasculares, especialmente en el injerto vascular. Células musculares lisas vasculares (VSMCs) pierden su fenotipo original y experimentan trans-diferenciación dirección osteochondrogenic a ectópica mineralización durante el proceso de la calcificación vascular. Nuestro estudio mostró que no había ninguna deposición de calcio que ocurren dentro de la pared del injerto, incluso después de 12 meses de la implantación. Las principales razones de la calcificación inhibida en el macro poroso injerto vascular incluyen: (1) la estructura del injerto macro porosa promueve el metabolismo, tales como intercambio iónico entre las células y la sangre; (2) las señales físicas de la estructura del injerto podrían regular o inhibir la diferenciación de la Coevolución en los osteoblastos1, (3) infiltración de la célula bien en los poros grandes promueve la secreción de la ECM e inhibe su degradación que se activará la calcificación17y VSMCs normales o funcionales (4) tienen un potencial para prevenir la deposición de calcio18.
En Resumen, la evaluación a largo plazo de los injertos vasculares de macro poroso electrospun PCL en el modelo de aorta abdominal de la rata proporciona la penetración importante en potenciales desafíos de los injertos vasculares degradables, que dirigirán la investigación siguiente.
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Disclosures
Los autores tienen intereses financieros conflictivos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por proyectos NSFC (81522023, 81530059, 91639113, 81772000, 81371699 y 81401534).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn=80,000) | Sigma | 704067 | |
| Methanol | Tianjin Chemical Reagent Company | 1060 | |
| Alcohol | Tianjin Chemical Reagent Company | 1083 | |
| Chloroform | Tianjin Chemical Reagent Company | A1007 | |
| Sucrose | Tianjin Fengchuan Company | 2296 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| Sprague Dawley rats | Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences | ||
| Normal saline | Hebei Tiancheng Pharmaceutical company | ||
| Chloral hydrate | Tianjin Ruijinte chemical company | 2223 | |
| Heparin sodium Injection | Tianjin Biochem Pharmaceutical company | ||
| Gentamycin Sulfate Injection | Jiangsu Lianshui Pharmaceutical company | ||
| Mouse anti-α-SMA primary antibody | Abcam | ab7817 | |
| Mouse anti-smooth MYH primary antibody | Abcam | ab683 | |
| Rabbit polyclonal anti-rat elastin antibody | Abcam | ab23748 | |
| Rabbit anti-von Willebrand factor primary antibody | Abcam | ab6994 | |
| Goat anti-mouse IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | ab150117 | |
| Goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | ab150077 | |
| 5% normal goat serum | Zhongshan Golden bridge | ZLI9022 | |
| Hematoxylin and eosin (H&E) | Beijing leagene biotech | DH0006 | |
| Masson's trichrome | Beijing leagene biotech | DC0032 | |
| Verhoeff-van Gieson (VVG) | Beijing leagene biotech | DC0059 | |
| Von Kossa | Beijing leagene biotech | DS0003 | |
| Surgical sutures needles with thread,3-0 silk | Shanghai Jinhuan medical supplies company | G3002b | |
| Surgical sutures needles with thread,9-0 silk | Shanghai Jinhuan medical supplies company | H901 |
References
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