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Chemistry

Bau von Thioether/Vinyl-sulfid-angebunden spiralförmige Peptide über Foto-induzierte Thiol-ene/Yne Hydrothiolation

Published: August 1, 2018 doi: 10.3791/57356
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology, Peking University Shenzhen Graduate School
* These authors contributed equally

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll für den Bau von Thioether/Vinyl sulfid angebunden spiralförmige Peptide mit Foto-induzierte Thiol-ene/Thiol-Yne Hydrothiolation.

Abstract

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung der Thioether angebunden Peptide mit am Harz Intramolekulare/intermolekulare Thiol-ene Hydrothiolation. Dieses Protokoll beschreibt darüber hinaus die Vorbereitung der Vinyl-sulfid-angebunden Peptide mit in Lösung Intramolekulare Thiol-Yne Hydrothiolation zwischen Amino acids, die Alken/Alkinen Seitenketten besitzen und Cystein Rückstände am ich, ich + 4 Positionen. Mit einem standard Fmoc-basierte Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) lineare Peptide synthetisiert. Thiol-ene Hydrothiolation erfolgt über eine Intramolekulare Thio-ene Reaktion oder eine intermolekulare Thio-ene Reaktion abhängig von der Peptid-Länge. In dieser Studie erfolgt eine Intramolekulare Thio-ene Reaktion bei kürzeren Peptiden mit auf Harz-Deprotection der Trityl Gruppen von Cystein-Rückstände, die nach der vollständigen Synthese von linearen Peptid. Das Harz wird dann auf UV-Bestrahlung mit Photoinitiator 4-Methoxyacetophenone (MAP) und 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP) festgelegt. Die intermolekularen Thiol-ene Reaktion erfolgt durch Fmoc-Cys-OH in einem N, N- Dimethylformamid (DMF) Lösungsmittel auflösen. Dies wird dann mit dem Peptid mit der Alken-Lager Rückstand auf Harz reagiert. Danach die Macrolactamization erfolgt mit benzotriazol-1-Yl-Oxytripyrrolidinophosphonium Hexafluorophosphate (PyBop), 1-Hydroxybenzotriazole (HoBt) und 4-Methylmorpholine (NMM) als Aktivierung Reagenzien auf das Harz. Im Anschluss an die Macrolactamization die Peptidsynthese wird fortgesetzt mit standard SPPS. Im Falle der Thio-Yne Hydrothiolation der linearen Peptid gespalten aus dem Harz, getrocknet und anschließend in entgastem DMF gelöst. Dies wird dann bestrahlt, mit UV-Licht mit Photoinitiator 2,2-Dimethoxy-2-Phenylacetophenone (DMPA). Nach der Reaktion DMF wird verdampft und die grobe Rückstände wird ausgefällt und gereinigt mit Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC). Diese Methoden könnte funktionieren, um die Generation der Thioether angebunden zyklische Peptide durch den Einsatz von Thio-ene/Yne Click-Chemie zu vereinfachen, die überlegene funktionelle Gruppe Toleranz und guten Ertrag besitzt. Die Einführung von Thioether Anleihen in Peptide nutzt der nukleophilen Natur von Cystein-Rückständen und Redox-inert gegenüber Disulfid-Bindungen.

Introduction

Die Entwicklung des Liganden zu modulieren, Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) bietet ein attraktives Konzept für die moderne Arzneimittelforschung. So wurde viel Aufwand in Studium neuartige chemische Modalitäten investiert, die effizient ppi1,2,3modulieren kann. Ppi in der Regel bestehen aus flachen, großen und/oder aufgegebenen wechselwirkenden Oberflächen und kleine Moleküle sind in der Regel als ungeeignet Liganden für die Modulation des ppi4,5. Mit einer geeigneten exponierten interagierende Fläche stellen kurze Peptide, die die strukturellen Merkmale des Proteins Schnittstellen imitieren ideale Kandidaten für dieses Problem6,7Adresse dar. Kurze Peptide sind jedoch in der Regel unstrukturiert in einer wässrigen Lösung. Dies ist die Wassermoleküle, die mit dem Intramolekulare Wasserstoff Verklebung Netzwerk der Peptidrückgrat und klar definierte Konformationen konkurrieren im Wasser8entropically ungünstig sind. Darüber hinaus die Peptide von Natur aus geringe Stabilität und Durchlässigkeit Zelleneigenschaften weitgehend beschränken ihre Verwendung in Anwendungen in der Biologie9,10. Nach der Protein Data Bank (PDB) Analyse > 50 % der PPI beinhalten kurze α-Helix-Wechselwirkungen-11. So wurden verschiedene chemische Methoden in Bezug auf Helix Stabilisierung entwickelt. Dazu gehören Disulfid/Thioether Anleihe Bildung12,13,14, Ring-Schließung Metathese15, Lactam-Ring Bildung16, "klicken" Chemie17, Zugabe von Perfluoroarenes18,19und Vinyl-sulfid Bildung20.

Stabilisierte spiralförmige Peptide werden weithin genutzt, für verschiedene intrazelluläre Ziele, einschließlich p53, Östrogen-Rezeptoren, Ras, BCL-2 Familie Proteine und andere21,22,23,24. ALRN-6924, eine All-Kohlenwasserstoff Peptid duale Inhibitor von MDM2 und MDMX geheftet, ist derzeit für klinische Untersuchung25verwendet wird. In den letzten Jahren konzentriert sich unsere Gruppe auf die Entwicklung von neuartigen Peptid-Stabilisierung-Methoden mit Thiol-ene und Thiol-Yne Reaktionen26,27,28. Im Allgemeinen haben wir gezeigt, dass diese Foto-initiierten Reaktionen sind effizient unter milden Bedingungen, wenn natürlich reichlich Cystein verwendet wird. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass diese Reaktionen eine ausgezeichnete funktionelle Gruppe Toleranz haben, sind Bio-orthogonal und erwiesen sich als für Peptid und Protein Änderungen29anwendbar. Die daraus resultierende Thioether/Vinyl sulfid angebunden Peptide weitgehend verbessern den chemischen Raum Einschränkung Peptide, bieten eine labile-Tether Modification Centers und erweist sich für den Einsatz in zahlreichen Anwendungen in der Biologie30 ,31,32. Bisher wurden nur begrenzte Berichte über Thiol-ene/Thiol-Yne Peptid biosyntheseschritt beschrieben. In einer Studie von Anseth Et Al. im Jahr 2009 war eine Reaktion auf Harz Intramolekulare Thiol-ene für Peptid-biosyntheseschritt zwischen aktivierten Alkenen mit Cystein demonstriert33. Im Jahr 2015 Chou Et Al. eine Zweikomponenten-radikale initiiert Thiol-ene Reaktion für Peptid Heften34 und eine anschließende, sequentielle Thiol-Yne/ene Kupplung Reaktion35beschrieben. Vor kurzem haben wir eine Reihe von arbeiten, die basierend auf Thioether/Vinyl sulfid angebunden Peptide20,26,27beschrieben. Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Synthese der oben genannten Thioether/Vinyl sulfid angebunden Peptide in der Hoffnung, dass es für die Allgemeinheit Forschung nützlich sind.

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Protocol

1. Ausrüstung Vorbereitung

  1. Legen Sie für die manuelle Peptid-Synthese-Apparat einen Vakuum-Verteiler (Table of Materials) in einen effizienten Abzug. Als nächstes legen Sie drei-Wege-Hähne auf Vakuum Krümmer und verbinden Sie diese mit Stickstoff oder Argon Gas-Linie. Verschließen Sie alle unbenutzten Eingänge mit Kautschuk Septen.
  2. Schließen Sie Harz gefüllten Spalten (0,8 x 4 cm, 10-mL-Behälter, siehe Tabelle der Materialien) an die monteurhilfe mit der drei-Wege-Hähne (Abbildung 1). Verwenden Sie eine Pumpe ein Vakuum-System als Vakuumfiltration oder einer Pipette Gummiball durch Extrudieren verbunden, um das Lösungsmittel in den Spalten zu entfernen.
  3. Verwendung eines Photoreactor (Abbildung 2), ausgestattet mit zehn 350 nm-Lampen (Table of Materials) für UV-Bestrahlung. Schließen Sie diese an einem Argon-Gas-Tank über der Photoreactor Lufteinlass um sicherzustellen, dass die Photoreactor mit Argon-Gas vor und während der lichtreaktionen gefüllt ist.
  4. Sicherstellen Sie vor der Inbetriebnahme der UV Lampe von der Photoreactor, dass das Photoreactor geschlossen ist, für den Fall, dass es gibt Einstrahlung von UV-Licht.

(2) Harz-Vorbereitung

Hinweis: In der Regel der Bau von Peptid Substrate erfolgt mit Fmoc-basierte Festphasen-Peptid-Synthese-Protokolle. Diese werden mit der Eisbahn Amid Harz, das Blätter eine C-terminalen Amid verbleibenden folgende Peptid Spaltung durchgeführt. Dieses Protokoll wird in dem Papier verwendet.

Achtung: N, N- Dimethylformamid (DMF), Dichlormethan (DCM), 4-Methylmorpholine (NMM) und N, N- Diisoproylethylamine (DIPEA) sind giftig und schädlich durch Einatmen, Verschlucken oder Hautkontakt. Diethylether ist Hochentzündlich. Trifluoroacetic Säure (TFA) ist ätzend. 1,2-Ethanedithiol (EDT) ist sehr übelriechend. Daher sollten alle organischen Lösungsmitteln und Chemikalien mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Nitril-Handschuhe, Kittel und schützende Brillen) behandelt und innerhalb einer chemischen Dampfhaube behandelt werden.

  1. Berechnen Sie die Menge des Harzes erforderlich, mithilfe der folgenden Formel:
    Skalieren (Mmol) / (Harz Ladekapazität (Mmol/g) (mg/g) 1.000) = Masse des Harzes (mg)
    Z.B., die Höhe der Eisbahn Amid MBHA Harz (0,5 Mmol/g) für 25 µmol = 0,025 Mmol / (0,5 Mmol/g 1.000 mg/g) = 50 mg. Als nächstes wiegen Sie 50 mg des Harzes in einer Spalte und legen Sie es auf dem Vakuum Verteiler mit drei-Wege-Hähne.
  2. Das Harz in einer Spalte (0,8 x 4 cm, 10-mL-Reservoir) 1-2 mL von DCM hinzufügen. Um das Harz zu Schwellen, schütteln Sie sanft ihn mit Stickstoff oder Argon Stream für 10 Minuten. Als nächstes Entfernen des Lösungsmittels mit Vakuumfiltration.

(3) N-terminale Fmoc Deprotection und waschen

  1. Bereiten Sie die N-terminale Fmoc deprotecting Lösung: bereiten Sie eine angemessene Lautstärke (200 mL) von 50 % (V/V) Morpholine in DMF in einer Glasflasche.
  2. Das Harz 1-2 mL der Lösung Deprotection hinzu, schütteln Sie sanft es 10 min und dann abgießen Sie die Lösung mit Vakuum. Mit DMF (1-2 mL) und DCM (1-2 mL) in dieser Reihenfolge, das Harz und den Reaktionsbehälter gründlich für eine Gesamtmenge von 3 X waschen. Anschließend wiederholen Sie die Deprotection und Wash Verfahren 1 X.

(4) Fmoc-geschützten Aminosäure-Kupplung

  1. Mit der Kopplung von Alanin Rückstände als beispielsweise im Falle von 25 µmol-Skala manuelle Synthese, wiegen Fmoc-Ala-OH (5 Äquiv, 41,4 mg), 2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium Hexafluorophosphate (HCTU; 4,9 Äquiv, 50,5 mg) in einer Polypropylen-Container und in DMF (0,5 mL) auflösen.
  2. Fügen Sie DIPEA (10 Äquiv, 43,5 µl) um 0,25-m generieren aktiviert Aminosäurelösung (Tabelle 1). Nach einer ca. 1 min vor Aktivierung des Harzes die Lösung hinzu, und dann Blase es mit N2 für ca. 1-2 h.
  3. Von diesem Schritt auf jede Aminosäure in der Peptid-Kette zu integrieren, als eine Abfolge von Schritten: zuerst die Deprotection von der N-terminalen Fmoc-Gruppe, und dann waschen, gefolgt durch die Kopplung der Aminosäure über Aktivierung unter Verwendung des HCTU.
    Hinweis: Kupplung länger (zB., 2 h) wird empfohlen, wenn nach einem sterisch gehinderten Aminosäurerest Kupplung [zB., Fmoc-Thr (tBu) - OH, Fmoc-Cys (Trt) - OH, Fmoc-HSI (Trt) - OH, Fmoc-Arg (Pbf) - OH]. Die Alken/Alkinen mit unnatürlichen Aminosäuren werden in 3 Äquivalente statt 5 verwendet und sind um 3 h einwirken gelassen.
  4. Der Peptid-Synthese Arbeitsfortschritt durch Kaiser oder Chloranil Tests wie von Arora Et Al. beschrieben 36 diese Tests liefern qualitative Bewertungen der Anwesenheit oder Abwesenheit von freien primären und sekundären Aminen. Alternativ können ca. 2-3 mg des Peptids abgespalten aus dem Harz und von LC-MS analysiert.

5. Thiol-ene Hydrothiolation und Thiol-Yne Biosyntheseschritt

  1. Konstrukt Thioether Linker durch auf-Harz biosyntheseschritt (Abbildung 3).
    1. Ca. 50 mL der Trt Deprotection Lösung (TFA/TIS/DCM 0.03/0.06/1.0) vorzubereiten. Behandeln der Cys und mS5-Lager Harz [NH2-R-mS5-A-A-A-Cys (Trt)-R'-Harz, 50 mg] mit 1-2 mL der Trt Deprotection Lösung in einer 10-mL-Spalte. Schütteln Sie sanft die Lösung für 10 min mit N2. Schließlich waschen Sie ihn mit DCM (1-2 mL) für eine Gesamtmenge von 3 X.
      Hinweis: MS5 stellt der Alkylenoxide(s)-Lager-Baustein (siehe die Struktur in Abbildung 6dargestellt) für Peptid Kupplung und Thio-ene biosyntheseschritt38verwendet.
    2. Wiederholen Sie den Vorgang für eine Gesamtmenge von ca. 6 X um die Trityl-Schutz-Gruppe von Cystein, zu entfernen, bis die Farbe der Lösung nicht mehr gelb ist oben beschrieben.
    3. Sprudelte mit N2, waschen Sie die R-mS5- A-A-A-Cys(-SH)-R'-Harz [Cystein mit kostenlosen Thio (-SH)] mit DMF (1-2 mL) und DCM (1-2 mL) in dieser Reihenfolge. Schrumpfen Sie des Harzes unter Verwendung von Methanol (1-2 mL) für 2 min und dann entfernen Sie des Lösungsmittels mit Filtration. Als nächstes nacheinander trocknen Sie das Harz unter Dampf von N2 Gas für ca. 5 min in der Spalte.
    4. Bereiten Sie entgast DMF vorher innerhalb einer Mund-Kolben, durch sprudelnden Stickstoffgas für ca. 1 h durch eine lange Nadel, die in dem Lösungsmittel gestreckt wurde.
    5. Übertragen Sie das Harz in einem 10 mL Runde Talsohle Kolben durch wiegen Papier. Das Harz in 2 mL der entgast DMF, gefolgt durch die Zugabe von 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone Photoinitiator auszusetzen (MMP; 1 Äquiv, 5,6 mg), 4-Methoxyacetophenone (Karte; 1 Äquiv, 3,8 mg).
    6. Fügen Sie Aufsehen bar (0,3 cm) in den Kolben und den Kolben mit einer geeigneten Gummistopfen verschließen, dann verdrängen die Luft in die Flasche mit Stickstoffgas mit einer Ölpumpe.
      Hinweis: Der inerte Atmosphäre ist nicht unbedingt erforderlich für die effektive Thio-ene Photoreaktion auf einer festen Phase. Allerdings ist es sehr notwendig für Thio-Yne Photoreaktion in der Lösungsphase in Abbildung 5. Andernfalls wird Schwefel während der UV-Bestrahlung oxidieren.
    7. Die Photoreactor eingelassen Sie der Reaktionskolben und rühren Sie das Harz für 1 h unter UV-Bestrahlung bei Raumtemperatur (Abbildung 2).
      Achtung: Vor dem Einschalten der Photoreactor UV-Lampe sicherstellen Sie, dass das Photoreactor geschlossen ist, für den Fall, dass gibt es schädliche Einstrahlung von UV-Licht.
      Hinweis: Häufig Probenahme des Reaktionsgemisches während der lichtreaktionen ist für neue Sequenzen empfohlen, da der linearen Peptid-Vorläufer der identische Molekulargewicht des Produktes hat. Im Allgemeinen zeigen lineare und zyklische Peptide deutlich unterschiedliche Hydrophilie. Dies könnte leicht mittels HPLC zu unterscheiden. Alternativ die 5, 5' - Dithiobis-(2-Nitrobenzoic Säure) (DTNB) Reagenz könnte auch verwendet werden, um das Vorhandensein von freien Thiol37zu studieren.
    8. Übertragen Sie das Harz aus der Flasche in der Spalte und entfernen Sie der Vakuumfiltration mit Lösungsmittel. Waschen Sie und trocknen Sie des Harzes, wie unter Punkt 5.1.3 beschrieben.
    9. Bereiten Sie etwa 10 mL der Spaltung cocktail (TFA/Tipps/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) in der Dunstabzugshaube.
    10. Übertragen das Harz in einer 2-mL Polypropylen Behälter füllen 1 mL der Spaltung cocktail (TFA/Tipps/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) in den Behälter und verschließen der Behälter dicht mit einem Schraubverschluss. Dann schütteln Sie sanft den Container auf einem Orbitalschüttler mit einer Rate von 60 u/min in der Dunstabzugshaube für 1,5-2 h.
      Achtung: TFA ist stark ätzend. Tragen Sie Schutzkleidung und arbeiten in einer effizienten Abzug. EDT ist eine stark riechende Substanz und muss in einen effizienten Abzug gehandhabt werden.
    11. Entfernen Sie die TFA-Cocktail durch Verdampfung unter einer N-2 -Gasstrom in der Dunstabzugshaube. Als nächstes Niederschlag den Rückstand mit kaltem Diethylether (1 mL) für 30 s und isolieren es durch Zentrifugation bei 12.000 x g 2 min. lang. Nach der Zentrifugation sanft Ausgießen der Äther-Komponente. Wiederholen Sie der Niederschlag und Zentrifugation Schritte für 2 X. Verdunsten Sie den Rückstand auf Trockenheit.
    12. Schließlich lösen sich die Rückstände in 1 mL H2O/Acetonitril (2:1) und reinigen durch HPLC mit einer C18 analytische Säule (4,6 x 250 mm, Durchfluss 1,0 mL/min). Verwendung H2O (mit 0,1 % TFA) und reinem Acetonitril als Lösungsmittel bei einem linearen Farbverlauf 2%/min von 20 % bis 70 % Acetonitril über 25 min. Monitor HPLC Spektren mit UV-280 nm und 220 nm Wellenlängen (Tabelle 2).
  2. Konstruieren Sie den Thioether Linker durch intermolekulare Thio-ene Reaktion und dann Cyclize das Peptid von Macrolactamization (Abbildung 4).
    1. Die Alkylenoxide(s) Rückstände mit linearen Peptid H2N-A-A-A-mS5zu synthetisieren (2-R'')-R'-Harz (50 mg) mit standard Fmoc-basierte Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) im beschriebenen Schritte 2 bis 4. Anschließend waschen Sie und trocknen Sie des Harzes, wie unter Punkt 5.1.3 beschrieben.
    2. Unterbrechen Sie das Harz in einem 10 mL Runde Talsohle Kolben, 2 mL entgast DMF enthalten, wie in Schritt 5.1.4 beschrieben.
    3. Fügen Sie den Photoinitiator MMP und Karte (MMP: 1 Äquiv, 5,6 mg; Karte: 1 Äquiv, 3,8 mg), Fmoc-Cys-OH (3 Äquiv, 25,7 mg) und einen Stir bar (0,3 cm) in den Kolben. Verschließen Sie den Kolben mit einer geeigneten Gummistopfen und verwenden Sie die Öl-Pumpe, um die Luft in der Flasche mit Stickstoff zu ersetzen.
    4. Die Photoreactor der Reaktionskolben eingelassen. Rühren Sie für 1-2 h unter UV-Bestrahlung bei Raumtemperatur (Abbildung 2).
    5. Überwachen Sie die Reaktion unter eine LC-MS-Analyse: 2-3 mg des Harzes mit der Spaltung Cocktail zu Spalten. Dann überstürzen sich die Rückstände mit kalten Diethylether (300 µL), isolieren Sie die Rückstände durch Zentrifugation und verdunsten des Rückstands zu Trockenheit, wie in Schritt 5.1.11 beschrieben. Danach lösen sich die Rückstände in 100 µL H2O/Acetonitril (2:1). Die peptidlösung unter Verwendung eines 0,22 µm mikroporösen Films filtrierbar und analysieren sie mit LC-MS mit der Verbindung in der Elektrospray-Ionisation (ESI) ionisiert und in positive Modus betrieben.
    6. Wenn nötig, wiederholen Sie 5.2.2 Schritte - erfolgt bis zur Fertigstellung 5.2.4 um die Reaktion zu gewährleisten.
    7. Übertragen Sie nach dem Abschluss der Foto-Reaktion das Harz aus der Flasche in die Spalte zu, und entfernen Sie des Lösungsmittels mit Vakuumfiltration. Waschen Sie und trocknen Sie des Harzes, wie unter Punkt 5.1.3 beschrieben.
    8. Fügen Sie die DMF-Lösung von benzotriazol-1-Yl-Oxytripyrrolidinophosphonium Hexafluorophosphate (PyBob; 2,4 Äquiv, 31,2 mg), 1-Hydroxybenzotriazole (HoBt; 2,4 Äquiv, 8,1 mg), und NMM (4 Äquiv, 11 µL) in das Harz in der Spalte für die Macrolactamization. Diese Lösung mit N2 2 h-Blase.
      1. Darüber hinaus überwachen Sie diese Koppelung Reaktion mit LC-MS, wie unter Punkt 5.2.3 beschrieben. Falls erforderlich, wiederholen Sie diesen Schritt, um die Reaktion zu gewährleisten bis zur Fertigstellung durchgeführt wird.
    9. Verlängern Sie das Peptid mit standard Fmoc-basierte SPPS, wie in den Schritten 3 und 4 beschrieben.
    10. Spalten Sie bei der Montage von allen Aminosäurereste das Peptid aus dem Harz zu, wie in den Schritten 5.1.10 und 5.1.11 beschrieben und reinigen Sie es zu, wie im Schritt 5.1.12. beschrieben.
  3. Konstruieren Sie Vinyl-sulfid-Linker in der Lösungsphase (Abbildung 5).
    1. Synthetisieren Sie die Alkinen Rückstände mit linearen Peptid mit standard Fmoc-basierte SPPS, wie in den Schritten 2 bis 4 beschrieben. Synthetisieren Sie die Alkinen mit Aminosäure nach einem etablierten Protokoll, wie in einer früheren Studie20beschrieben.
    2. Spalten Sie das Peptid aus dem Harz zu und überstürzen Sie es mit kalten Diethylether wie 5.1.9 - 5.1.11 beschrieben. Nach der Spaltung und Niederschlag des Harzes sammeln Sie das Peptid über 2 min Zentrifugation bei 12.000 x g.
    3. Trocknen Sie den daraus resultierende Rückstand in einem Vakuum. Auflösen den Rückstand im entgast DMF (50 mL) in einem 100 mL Runde Talsohle Kolben um eine Endkonzentration von 0,5 mM zu erreichen (basierend auf das Laden des Harzes, 0,025 Mmol (1000 mL/L / 0,5 Mmol/L) = 50 mL).
      1. Hinzufügen der Photoinitiator DMPA (0,5 Äquiv, 3,2 mg) und dann Entgasen der Reaktionslösung für 10 min mit N2 durch eine lange Nadel dehnte sich in der Lösung. Als nächstes bestrahlen Sie die Probe unter UV-Licht bei Raumtemperatur für 0,5 - 1 h ohne Aufregung.
    4. Entfernen Sie das ZMS im Hochvakuum und überstürzen Sie sich die grobe Rückstände durch Zugabe von Diethylether um seine organische Nebenprodukte aufzulösen. Dann, Isolieren des Zentrifugation mit 12.000 x g für 2 min Rückstands. Nach der Zentrifugation sanft Ausgießen der Äther-Komponente. Verdunsten Sie den Rückstand auf Trockenheit. Schließlich lösen sich die Rückstände in 1 mL H2O/Acetonitril (2:1) und mittels HPLC wie in Schritt 5.1.7 beschrieben reinigen.

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Representative Results

Die HPLC und MS Spektren von Peptid Ac-YmS5AAAC-NH2 und deren cyclisiert Produkt Ac - Y-(Cyclo-1,5)-[mS5AAAC] - NH2 , die erstellt wurden mit der am Harz Intramolekulare Thiol-ene Photoreaktion in Abbildung dargestellt 6 b. das zyklische Peptid wurde festgestellt, dass eine identische Molekulargewicht im Verhältnis zu seinem linearen Vorläufer haben. Die HPLC-Verweilzeit wurde allerdings beobachtet, ca. 2 min früher als die seiner Vorstufen unter den gleichen Bedingungen der Trennung sein. Kurze Peptide mit verschiedenen Sequenzen wurden alle auf eine gute Verarbeitung haben beobachtet, wie in Abbildung 6dargestellt.

Das Screening-Verfahren für die Thio-Yne Photoreaktion Bedingungen ist in Abbildung 7dargestellt, und die Isomer Umwandlung und das Verhältnis wurden mit der Integration der Reverse-Phase-HPLC bestimmt. Nach UV-Bestrahlung nur Ablaufverfolgungsebenen Peptid 2c beobachtet. Dies ist wahrscheinlich auf eine conformational Präferenz für ein Abfangen von radikalen am N-Terminus Thiyl während der Auftraggeber Schritt zu einem 20-gliedriger Macrocycle. Peptide 1a und 1 b befanden sich um zwei Isomere mit einer 8-köpfigen Vinyl-sulfid-Crosslink zu generieren. Peptide 2a-A und 2a-B, die Peptid-1a generiert wurden, stellte unterschiedliche Retentionszeiten sowie unterschiedliche Kennzahlen für verschiedene UV-Bestrahlung Zeiten (0 - 30 min) (Abbildung 7). Diese wurden als die E/Z-Isomere durch die Doppelbindung Proton Signale auf der 1H-NMR-Spektroskopie (Abbildung 7) zugeordnet. Im Falle von Peptiden 2d-2f das Z-Isomer erwies sich das dominierende Produkt. Dies ist wahrscheinlich auf die conformational Präferenz während des Baus einer kompakten Struktur im Vergleich zu der 8-köpfigen Vinyl-sulfid-Crosslink. Wie dargestellt in Abbildung 7E, nach dem kreisförmigen Dichroismus (CD)-Spektrum, Peptide 2a-A/B und 2 b-A/B, die eine 8-köpfige Vinyl-sulfid-Crosslink besitzen weisen eine zufällige Spule, während Peptid 2d, die eine 7-köpfige Vinyl besitzt sulfid Crosslink weist eine helikale Konformation. Zusammenfassend lässt sich sagen das Z-Isomer der Vinyl-sulfid-Anleihe wurde festgestellt, dass bevorzugt gebildet werden und eine bessere Helix Induktion angezeigt.

Figure 1
Abbildung 1: manuelle Peptidsynthese Vorrichtung zur Festphasen-Peptidsynthese. Die Spalten wurden auf dem Vakuum Verteiler durch den drei-Wege-Hähne und das Gerät mit einem Stickstoff oder Argon Gas-Linie für das sprudeln verbunden war. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: das Photoreactor Gerät verwendet für den lichtreaktionen. Das Gerät war mit zehn 350 nm Lampen (Table of Materials) für UV-Bestrahlung und eine Argon-Gas-Tank ausgestattet, um sicherzustellen, dass die Photoreactor mit Argon-Gas vor und während der lichtreaktionen gefüllt war. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Intramolekulare Thiol-ene Reaktion bei kürzeren Peptiden auf Harz. Diese Reaktion wurde durchgeführt, mit einer auf Harz-Deprotection der Trityl Gruppen von Cystein-Rückstände, die nach der vollständigen Synthese von linearen Peptid und legen Sie dann das Harz auf die UV-Bestrahlung mit Photoinitiatoren Karte und MMP. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: intermolekulare Thio-ene Reaktion auf Harz. Diese Reaktion wurde durchgeführt durch Fmoc-Cys-OH im DMF Lösungsmittel auflösen und dann mit dem Alken-Lager Peptid Rückstand auf dem Harz, gefolgt von einem Macrolactamization mit PyBop, HoBt und NMM als Aktivierung Reagenzien bestrahlt. Dann die Peptidsynthese fortgesetzt wurde mit einem standard SPPS. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Intramolekulare Thiol-Yne Reaktion in der Lösungsphase. Diese Reaktion wurde in der Lösungsphase Anschluss an die vollständige Synthese von linearen Peptid, nach dem der linearen Peptid löste sich in entgastem DMF und Bestrahlung mit UV-Licht mit Photoinitiator DMPA durchgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Thioether angebunden zyklische Peptide mit einer am Harz Intramolekulare Thiol-ene Reaktion erzeugt. A. dieses Panel zeigt das Schema der am Harz Intramolekulare Thio-ene Reaktion. mS5: "m" steht für die Mono-ersetzt Olenic Aminosäuren, "S" steht für die Aminosäure S konfiguriert und "5" bezieht sich auf die Anzahl der Seite Kette Atome38. B. diese Platten zeigt die HPLC und MS Spektren des Peptids Ac-YmS5AAAC-NH2 vor und nach seiner biosyntheseschritt. C. dieses Panel zeigt die Umrechnung der zyklische Peptide mit verschiedenen Sequenzen. Diese Zahl wurde von Zhao, B. Et Al.28 geändert Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Peptid Heften durch Foto-induzierte Thiol-Yne Hydrothiolation. A. Dies ist eine schematische Darstellung der Intramolekulare Thiol-Yne Hydrothiolation. B. dieses Panel zeigt die Peptid-Sequenzen, die in dieser Studie ausgewertet. Initiator: (I) 0,5 EQ DMPA, 1 h; (II) keine Initiator, 1 h; (III) 0,5 EQ DMPA, 0,5 EQ Karte, 1 h; (IV) 0,5 EQ MMP, 0,5 h. C. Dieses Fenster zeigt die HPLC-Spuren des Reaktionsgemisches von Peptid-1a mit unterschiedlichen UV-Bestrahlung-Zeiten und überwacht bei 220 nm. D. dieses Panel zeigt der 1H-NMR-Spektren der 1a, 2a-A, und 2a-B (gemessen in DMSO-d6 bei 400 MHz). Die Sternchen zeigen die Entstehung einer Vinyl-sulfid-Doppelbindung nach UV-Bestrahlung. E. dieses Panel zeigt die kreisförmigen Dichroismus Spektren von Peptiden mit Vinyl sulfid Querverbindungen. Diese Zahl wurde von Tian, j. Et Al. modifiziert 44 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Materialien MW N(0.5mmol / g Harz × 0. 0 5 g × 5eq.) M(Aminosäure) (mg)
(Da) (Mmol)
Fmoc-Gly-OH 297 0,125 37.1
Fmoc-Ala-OH 331 0,125 41,4
Fmoc-Val-OH 339 0,125 42,4
Fmoc-Leu-OH 353 0,125 44.1
Fmoc-Ile-OH 353 0,125 44.1
Fmoc-Pro-OH 337 0,125 42,1
Fmoc-Phe-OH 387 0,125 48,4
Fmoc-Tyr (tBu)-OH 460 0,125 57,5
Fmoc-Trp (Boc)-OH 527 0,125 65,9
Fmoc-Ser (tBu)-OH 384 0,125 48
Fmoc-Thr (tBu)-OH 398 0,125 49,8
Fmoc-Cys (Trt)-OH 586 0,125 73,3
Fmoc-traf-OH 372 0,125 46,5
Fmoc-Asn (Trt)-OH 597 0,125 74,6
Fmoc-Gln (Trt)-OH 611 0,125 76,4
Fmoc-Asp (OtBu)-OH 412 0,125 51,5
Fmoc-Glu (OtBu)-OH 426 0,125 53,3
Fmoc-Lys (Boc)-OH 469 0,125 58,6
Fmoc-Arg (Pbf)-OH 617 0,125 77,1
Fmoc-HSI (Trt)-OH 620 0,125 77,5
HCTU 414 0,122 50,5
DIPEA 129 0,25 43.5(ΜL)
DMF 0,5 mL

Tabelle 1: Die Beträge der Kupplung Bedingungen.

Spalte Zorbaxmaterialien SB-Aq Spalte, 4,6 × 250 mm (Porengröße 80 Å, Partikel Größe 5 μm)
Lösungsmittel A: Wasser, 0,1 % (Vol/Vol) TFA; B: Acetonitril
Durchflussmenge 1 mL/min.
Farbverlauf 20-70 % (Vol/Vol) B über 25 min; 70-98 % über 5 min; 98 % über 5min;
Injektionsvolumen 30 – 500 ΜL
Wellenlänge (nm) 280 (für Fmoc, Trp oder Tyr-haltiger Peptide) oder 494 (FITC-markierte Peptide) oder 220 (für andere)

Tabelle 2: Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie Bedingungen.

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Discussion

In der am Harz Intramolekulare Thio-ene biosyntheseschritt in Abbildung 3beschrieben die Beseitigung der Trityl Gruppe von Cystein-Rückstand erwies sich ein entscheidender Schritt für die anschließende Photoreaktion. Darüber hinaus dargestellt das Peptid Molekulargewicht vor und im Anschluss an die Reaktion erwies sich als identisch in Abbildung 6 b. Daher ist die Verwendung einer HPLC-Identifikation oder ein DTNB Assay erforderlich, um die Reaktion zu überwachen. Im Falle der intermolekularen Thio-ene Reaktion in Abbildung 4beschrieben ist MS Überwachung notwendig. Während ein weiterer Schritt der Lactam-Kupplung erwies sich für den Bau einer Thioether Kräfte erforderlich, empfehlen wir, dass dieses Protokoll für lange Peptide verwendet wird, um eine höhere Effizienz zu erreichen.

Das Vinyl sulfid Band erzeugte Thio-Yne Photoreaktion war nicht stabil in der stark saure TFA-Lösung, die für Harz Dekolleté verwendet wird. Daher wurde die Verwendung von Thio-Yne Photoreaktion in der Lösungsphase angenommen. Diese Reaktion wurde zu einer niedrigen Konzentration (0,5 mM) verdünnt, um mögliche intermolekulare von Reaktionen zu vermeiden. Es ist auch ebenso wichtig, das Lösungsmittel zu entgasen, um Produkt Oxidation während der lichtreaktionen zu vermeiden. Im Anschluss an die Reaktion sollte Vakuumverdampfung von organischen Lösungsmitteln DMF auch sorgfältig erfolgen, um Peptid Oxidation/Abbau oder Maschinen Abschreibungen zu verhindern. Die Thio-Yne biosyntheseschritt Reaktion, dargestellt in Abbildung 5 stellt einen Mechanismus für Post-Peptidsynthese Änderung35.

Während die Intramolekulare Thiol-ene Reaktion Thioether angebunden Peptide mit gute Conversion erfolgreich generiert, keine einfache Thioether Querverbindung entsteht die Peptide in der gewünschten helikale Konformation zu beschränken. Basierend auf dieser Strategie auf-Tether Modifikation, eine in-Tether chiralen Zentrum induzierte Peptid Helizität Konzept wurde entwickelt, wo die γ-Gruppe mit der R-Konfiguration an das Peptid ersetzt C-terminale konnte das Peptid helikale Konformation ( induzieren Abbildung 4)39,40. Die Einschränkung verbunden mit diesem Ansatz ist die Synthese der enantiomerically reinen unnatürliche Aminosäure mit zwei chiralen Zentren (α (S), γ(R))41,42.

Diese Forschung gezeigt, dass Thio-Yne Reaktion das Peptid in eine helikale Konformation mit gute Conversion einschränken kann, wie in Abbildung 7Edargestellt. In Bezug auf den Bau von spiralförmigen Peptide empfehlen wir Thio-Yne Photoreaktion für den Bau von spiralförmigen Peptide. Am Harz Intramolekulare Thio-ene biosyntheseschritt zeigte sich für den Bau von kurzen Thioether Tether Peptide (weniger als 15) geeignet, für den Fall, dass lange Peptide sind auch flexibel sein, um effektive biosyntheseschritt zu gewährleisten. Darüber hinaus empfiehlt sich die auf Harz intermolekulare Thio-ene biosyntheseschritt für lange Peptid biosyntheseschritt.

Zusammenfassend lässt sich sagen haben wir eine Reihe von chemischen Protokolle für den Bau von Thioether/Vinyl sulfid angebunden Peptiden durch den Einsatz von photoinduzierte Thio-ene/Thio-Yne Click-Chemie entwickelt. Die Reaktion ist effizient, Metall-Katalysator-frei, bequem für Manipulationen und wurde gezeigt, eine überlegene funktionelle Gruppe Toleranz besitzen und Bio-orthogonal. Diese Methode war weiterentwickelt, um andere Peptid Sekundärstrukturen wie ein β-Haarnadel43,44zu stabilisieren. Dieses Papier zeigt, dass das Thioether-Tether eine spurlose Modifikation-Website bietet. Dadurch wird weitgehend den chemischen Abstand nach Peptid-Synthese-Modifikation erweitert. Darüber hinaus werden die aliphatischen Thioether/Vinyl sulfid angebunden Peptide, die eine reduzierte Membran Toxizität im Vergleich zu den Kohlenwasserstoff Grundnahrungsmittel Peptide ausgestellt in vielfältigen Anwendungen in der Biologie mit nachgewiesene gute Bioaktivität aufgetragen und Bioverfügbarkeit45,46.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren erkennen finanziellen Unterstützung durch die Natural Science Foundation von China Grants (Nr. 21372023, 21778009 und 81701818); Das Ministerium für Wissenschaft und Technologie der Volksrepublik China (Nr. 2015DFA31590); die Shenzhen Science and Technology Innovation Committee (No. JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 und GJHS20170310093122365); und die China Postdoc Wissenschaftsstiftung (Nr. 2017 M 610704).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) HECHENG GRM50407
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem (Shanghai) Ltd.
N-Methyl-2-pyrrolidinone Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. 3230 skin harmful
N,N-Dimethyl formamide Energy B020051 skin harmful
Dichloromethane Energy W330229 skin harmful
N,N-Diisoproylethylamine Aldrich 9578 irritant
Trifluoroacetic acid J&K 101398 corrosive
Triisopropylsilane J&K 973821
1,2-Ethanedithiol J&K 248897 Stench
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate  GL Biochem (Shanghai) Ltd. 851012
Morpholine Aldrich M109062 irritant
Diethyl ether Aldrich 673811 flammable
Acetonitrile Aldrich 9758 toxicity
Methanol Aldrich 9758 toxicity
2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone Energy A050035
4-methoxyacetophenone Energy A050098
2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone Energy D070132
5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) J&K 281281
Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Energy E020172
1-Hydroxybenzotriazole Energy D050256
4-Methylmorpholine Energy W320038
High Performance Liquid Chromatography SHIMADZU LC-30AD
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU LCMS-8030
Lyophilizer Labconco FreeZone
SpeedVac concentration system Thermo Savant
vacuum manifold promega A7231
three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
poly-prep chromatography columns  Bio-Rad 7311550

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References

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Chemie Ausgabe 138 Thio-ene/Yne Reaktion Foto-induzierte Cystein Thioether Stabilisierung spiralförmige Peptide Protein-Protein-Wechselwirkungen
Bau von Thioether/Vinyl-sulfid-angebunden spiralförmige Peptide über Foto-induzierte Thiol-ene/Yne Hydrothiolation
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Shi, X., Liu, Y., Zhao, R., Li, Z.… More

Shi, X., Liu, Y., Zhao, R., Li, Z. Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation. J. Vis. Exp. (138), e57356, doi:10.3791/57356 (2018).

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