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Chemistry

Construindo Tioéter/sulfeto de vinil-amarrados induzida por peptídeos helicoidais Via foto Thiol-ene/ino Hydrothiolation

Published: August 1, 2018 doi: 10.3791/57356
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology, Peking University Shenzhen Graduate School
* These authors contributed equally

Summary

Apresentamos um protocolo para a construção de vinil/Tioéter peptídeos helicoidais sulfeto-amarrados usando foto-induzido thiol-ene/thiol-ino hydrothiolation.

Abstract

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de peptídeos Tioéter-amarrados usando hydrothiolation em resina/intramolecular intermolecular thiol-ene. Além disso, este protocolo descreve a preparação de peptídeos de vinil-sulfeto-amarrados usando na solução intramolecular thiol-ino hydrothiolation entre amino acids que possuem cadeias laterais de alceno/alquino e resíduos de cisteína na eu, i + 4 posições. Peptídeos lineares foram sintetizados usando uma síntese do peptide de fase sólida baseada em Fmoc padrão (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation é realizado usando uma reação intramolecular thio-ene ou uma reação intermolecular thio-ene, dependendo do comprimento do peptide. Nesta pesquisa, é realizada uma reação intramolecular thio-ene no caso de peptídeos menores usando na resina desproteção dos grupos trityl de resíduos de cisteína, após a completa síntese do peptide linear. A resina é então definida como irradiação UV usando fotoiniciador 4-methoxyacetophenone (mapa) e 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). A reação intermolecular thiol-ene é realizada pela dissolução de Fmoc-Cys-OH em um solvente de N, N- dimetilformamida (DMF). Isto é então reagiu com o peptídeo usando o resíduo de alceno-rolamento na resina. Depois disso, o macrolactamization é executada utilizando Hexafluorofosfato de benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt) e 4-Methylmorpholine (NMM) como reagentes de ativação na resina. Após o macrolactamization, a síntese do peptide é continuou usando padrão SPPS. No caso do thio-ino hydrothiolation, o peptídeo linear é clivado da resina, seco e posteriormente dissolvido em DMF desgaseificado. Isto então é irradiado usando luz UV com fotoiniciador 2,2-dimetoxi-2-phenylacetophenone (DMPA). Após a reação, DMF é evaporado e o resíduo bruto é precipitado e purified usando cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Esses métodos poderiam funcionar para simplificar a geração de péptidos cíclicos Tioéter-amarrados devido ao uso da química clique thio-ene/ino que possui tolerância superior grupo funcional e bom rendimento. A introdução de títulos Tioéter peptídeos aproveita-se da natureza nucleofílica de resíduos de cisteína e redox-inerte em relação a ligações de bissulfeto.

Introduction

O desenvolvimento de ligantes para modular interações da proteína-proteína (PPIs) fornece uma abordagem atraente para descoberta de drogas modernas. Assim, uma grande quantidade de esforço tem sido investida em estudar modalidades chemical romance que podem eficientemente modular PPIs1,2,3. IPP consiste geralmente em superfícies de interação superficiais, grandes e/ou descontinuadas, e pequenas moléculas são normalmente consideradas ligantes impróprios para a modulação de PPIs4,5. Com uma adequada expostas interação superfície, peptides curtos que imitam as características estruturais das interfaces de proteína representam candidatos ideais para abordar este problema6,7. No entanto, peptides curtos são tipicamente não-estruturados em uma solução aquosa. Isto é devido ao fato de que as moléculas de água que competem com a rede de ligação de hidrogênio intramolecular da espinha dorsal do peptide e conformações bem-definidos são entropically desfavoráveis em água8. Além disso, os peptídeos inerentemente baixa estabilidade e propriedades de permeabilidade da célula, em grande parte, limitar seu uso em aplicações biológicas9,10. De acordo com a análise de banco de dados (PDB) de proteína, > 50% de IPP envolvem interações de α-hélice curta11. Assim, foram desenvolvidos métodos químicos diferentes em relação à estabilização da hélice. Estes incluem bissulfeto/Tioéter vínculo formação12,13,14, anel-fechamento metátese15, lactam anel formação16, "clique em" química17, adição de perfluoroarenes18,19e vinil-sulfureto formação20.

Peptídeos helicoidais estabilizados são amplamente utilizados para vários alvos intracelulares, incluindo p53, família proteínas do estrogênio receptores, Ras, BCL-2 e outros21,22,23,24. ALRN-6924, um hidrocarboneto-tudo grampeado inibidor duplo de peptídeo de MDM2 e MDMX, atualmente está sendo usado para investigações clínicas25. Nos últimos anos, nosso grupo tem focado o desenvolvimento de métodos de estabilização de peptídeo romance usando thiol-Eno e ino-tiol reações26,,27,28. Em geral, temos demonstrado que estas reações foto-iniciada são eficientes em condições suaves quando naturalmente abundante cisteína é usada. Além disso, mostramos que essas reações têm uma tolerância de excelente grupo funcional, são ortogonais-bio e tem sido provadas para ser aplicável para modificações de peptídeos e proteínas29. Os peptídeos de sulfeto amarrado Tioéter/vinil resultante em grande parte melhorar o espaço químico de peptídeos de restrição, fornecem um centro lábil em-baraço de modificação e provou para ser aplicável para usos em numerosas aplicações biológicas30 ,31,32. Até à data, apenas limitados relatórios têm sido descritos em relação a ciclização de peptídeo thiol-ene/thiol-ino. Em um estudo publicado por Anseth et al , em 2009, uma reação na resina intramolecular thiol-ene para ciclização de peptídeo entre alquenos ativados com cisteína foi demonstrada33. Em 2015, Chou et al. descreveu uma reação de dois componentes radicais tiol iniciados-ene para peptídeo grampeamento34 e uma reação de acoplamento de thiol-ino/ene subsequentes, sequencial35. Recentemente, nós descrevemos uma série de trabalhos baseados em vinil/Tioéter sulfeto amarrado peptídeos20,26,27. Este protocolo descreve uma síntese detalhada dos peptides sulfeto amarrado acima mencionados Tioéter/vinil na esperança que será útil para a comunidade de pesquisa mais ampla.

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Protocol

1. preparação do material

  1. Para o aparelho manual do peptide-síntese, coloca um distribuidor de vácuo (Tabela de materiais) em uma coifa eficiente. Em seguida, colocar torneiras de três vias para o distribuidor de vácuo e conectá-los a uma linha de gás nitrogênio ou argônio. Cap todas as entradas não utilizadas, usando os septos de borracha.
  2. Ligar colunas cheias de resina (0,8 x 4 cm, 10 mL de reservatório, consulte Tabela de materiais) para o distribuidor usando as torneiras de três vias (Figura 1). Use uma bomba conectada a um sistema de vácuo como filtração de vácuo ou uma lâmpada de pipeta de borracha por extrusão para remover o solvente nas colunas.
  3. Uso um photoreactor (Figura 2), equipados com lâmpadas de dez 350 nm (Tabela de materiais) para irradiação UV. Conecte estes a um tanque de gás argônio através da entrada de ar de photoreactor para garantir que o photoreactor é preenchido com gás argônio antes e durante as photoreactions.
  4. Antes de ligar a lâmpada de UV da photoreactor, certifique-se de que a porta de photoreactor é fechada no caso de irradiação da luz UV.

2. preparação da resina

Nota: em geral, a construção de substratos de peptídeo é executada utilizando protocolos de síntese do peptide de fase sólida baseada em Fmoc. Estas são realizadas usando a resina de amida de pista que deixa uma C-terminal Amida restantes seguinte peptídeo clivagem. Este protocolo é usado em todo o papel.

Cuidado: N, N- dimetilformamida (DMF), diclorometano (DCM), 4-methylmorpholine (NMM) e N, N- diisoproylethylamine (DIPEA) são tóxicos e nocivos por inalação, ingestão ou contacto com a pele. Éter etílico é altamente inflamável. Ácido trifluoroacético (TFA) é corrosivo. 1,2-Etanoditiol (EDT) é altamente malcheirosa. Portanto, todos os solventes orgânicos e produtos químicos devem ser manuseados com equipamento de protecção adequado (luvas de nitrilo, jaleco e óculos de protecção) e manipulados dentro de uma coifa de química.

  1. Calcule a quantidade de resina necessária usando a seguinte fórmula:
    escala (mmol) / (resina capacidade de carregamento (mmol/g) 1.000 (mg/g)) = massa de resina (mg)
    Por exemplo, a quantidade de pista Amida MBHA resina (0,5 mmol/g) para 25 µmol = 0.025 mmol / (0,5 mmol/g 1.000 mg/g) = 50 mg. Em seguida, pesar 50 mg de resina em uma coluna e configurá-lo em um tubo de vácuo usando torneiras de três vias.
  2. Adicione 1-2ml de DCM para a resina em uma coluna (0,8 x 4 cm, reservatório de 10 mL). Para inchar a resina, agite suavemente usando um fluxo de nitrogênio ou argônio por 10 min. Em seguida, remova o solvente usando filtragem de vácuo.

3. lavagem e desproteção Fmoc N-terminal

  1. Preparar o Fmoc N-terminal deprotecting solução: prepare um volume adequado (200 mL) de 50% (v/v) morfolina em DMF num frasco de vidro.
  2. Adicionar 1 a 2 mL da solução de desproteção à resina, delicadamente agite-a por 10 min e em seguida, drenar a solução usando um vácuo. Usando DMF (1-2 mL) e DCM (1-2 mL) nessa ordem, lave a resina e o recipiente de reação completamente para um total de 3 x. Em seguida, repita os procedimentos de desproteção e lavagem 1 x.

4. Fmoc protegido aminoácido acoplamento

  1. Usando o acoplamento de resíduo de alanina como um exemplo, no caso de uma síntese de 25 µmol-escala manual, pesar Fmoc-Ala-OH (equiv. 5, 41,4 mg), Hexafluorofosfato de 2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium (HCTU; 4,9 equiv, 50,5 mg) em um recipiente de polipropileno e dissolvê-lo em DMF (0,5 mL).
  2. Adicionar DIPEA (10 equiv, 43,5 µ l) a fim de gerar um 0,25 M ativado solução de aminoácido (tabela 1). Seguindo uma pré-ativação aproximada de 1 minuto, adicionar a solução para a resina, e em seguida como bolha-com N2 para aproximadamente 1-2 h.
  3. Desta etapa em, incorporar cada aminoácido da cadeia peptídica como uma sequência de etapas: primeiro a desproteção de Fmoc-Grupo N-terminal e então a lavagem, seguido da junção de aminoácidos através da ativação usando o HCTU.
    Nota: Um acoplamento tempo (EG., h 2) recomenda-se acoplamento na sequência de um resíduo de aminoácido impedido estericamente [EG., Fmoc-Thr (tBu) - OH, Fmoc-Cys (Trt) - OH, Fmoc-His (Trt) - OH, Fmoc-Arg (Pbf) - OH]. O alceno/alquino rolamento antinatural aminoácidos são utilizados em 3 equivalentes ao invés de 5 e são deixados a reagir durante 3 h.
  4. Monitorar o progresso de síntese do peptide usando testes de Kaiser ou Cloranil conforme descrito por Arora et al . 36 estes testes fornecem avaliações qualitativas da presença ou ausência de livre aminas primárias e secundárias. Alternativamente, aproximadamente 2-3 mg do peptide pode ser clivada da resina e analisado por LC-MS.

5. tiol-ene Hydrothiolation e ciclização Thiol-ino

  1. Construa o vinculador Tioéter com ciclização na resina (Figura 3).
    1. Prepare-se aproximadamente 50 mL da solução de desproteção de Trt (TFA/TIS/DCM 0.03/0.06/1.0). Tratar a Cys - e mS5-rolamento resina [NH2-R-mS5-A-A-A-Cys (Trt)-R'-resina, mg 50] com 1-2 mL da solução de desproteção de Trt em uma coluna de 10 mL. Suavemente agite a solução durante 10 minutos usando N2. Finalmente, lave-o com DCM (1-2 mL) para um total de 3 x.
      Nota: MS5 representa o bloco de construção de Alquileno-rolamento (veja a estrutura representada na Figura 6) usado para peptídeo acoplamento e thio-ene ciclização38.
    2. Repita o procedimento descrito acima, para um total de aproximadamente 6 x, a fim de remover o grupo de proteção trityl de cisteína, até a cor da solução não é mais amarela.
    3. Borbulhava com N2, lavar a R-mS5- uma-A-A-Cys(-SH)-R'-resina [cisteína com thio livre (-SH)] com DMF (1-2 mL) e DCM (1-2 mL), nessa ordem. Encolher a resina usando metanol (1-2 mL) por 2 min e remova o solvente usando filtragem. Em seguida, sequencialmente seca a resina sob um vapor de gás de2 N por aproximadamente 5 min na coluna.
    4. Prepare DMF desgaseificado antes, dentro de um frasco de boca, borbulhar gás nitrogênio para cerca de 1 h, através de uma agulha longa que foi esticada em solvente.
    5. Transferi a resina em um balão de fundo redondo de 10 mL por papel de pesagem. Suspender a resina em 2 mL do DMF desgaseificado, seguido pela adição de 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone o fotoiniciador (MMP; 1 equiv, 5,6 mg), 4-methoxyacetophenone (mapa; 1 equiv, 3,8 mg).
    6. Adicionar uma celeuma bar (0,3 cm) para o frasco e tampa do frasco com um plug de borracha adequada e, em seguida, deslocar o ar no balão com gás de nitrogênio, usando uma bomba de óleo.
      Nota: A atmosfera inerte não é estritamente necessária para a é eficaz thio-ene em uma fase sólida. No entanto, é muito necessário para o thio-ino é na fase de solução na Figura 5. Caso contrário, o enxofre irá oxidar durante a irradiação UV.
    7. Definir o balão de reação para o photoreactor e misture a resina por 1h sob irradiação UV à temperatura ambiente (Figura 2).
      Cuidado: Antes de ligar a lâmpada de UV photoreactor, certifique-se que a porta de photoreactor é fechada no caso de irradiação prejudicial da luz UV.
      Nota: Com frequência de amostragem a mistura de reação durante os photoreactions é recomendado para novas sequências, como o precursor do peptídeo linear tem o peso molecular idêntico do produto. Em geral, lineares e cíclicos de peptídeos exibem Hidrofilia significativamente diferente. Isto pode ser facilmente identificado usando HPLC. Alternativamente, a 5, 5' - dithiobis-(ácido 2-nitrobenzoic) reagente (DTNB) também pode ser usado para estudar a presença de tiol livre37.
    8. Transferir a resina do recipiente a coluna e remova o solvente usando filtragem de vácuo. Lave e seque a resina conforme descrito na etapa 5.1.3.
    9. Prepare-se cerca de 10 mL da clivagem cocktail (TFA/dicas/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) na coifa.
    10. Transferir a resina em um recipiente de polipropileno de 2 mL, adicionar 1 mL de clivagem cocktail (TFA/dicas/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) ao contêiner e selar o recipiente firmemente usando uma tampa de rosca. Em seguida, delicadamente agite o recipiente em um agitador orbital a uma velocidade de 60 rpm na coifa para 1,5 a 2 h.
      Atenção: O TFA é altamente corrosivo. Utilizar vestuário de protecção e trabalhar em uma coifa eficiente. EDT é uma substância altamente malcheirosa e deve ser manipulado em uma coifa eficiente.
    11. Remova o coquetel TFA por evaporação sob um fluxo de gás de2 N na coifa. Em seguida, precipitar o resíduo usando éter dietílico frio (1 mL) por 30 s e isolar isso através de centrifugação a 12.000 x g por 2 min. Após a centrifugação, delicadamente despeje o componente de éter. Repita as etapas de precipitado e centrifugação para 2x. Evapore o resíduo à secura.
    12. Finalmente, dissolver o resíduo em 1 mL de H2O e acetonitrilo (2:1) e purificar por HPLC usando uma coluna analítica C18 (4,6 x 250 mm, taxa de fluxo de 1,0 mL/min). Uso de H2O (contendo 0,1% TFA) e acetonitrila pura como solventes em um gradiente linear de 2%/min de 20% para 70% acetonitrila sobre espectros de Monitor HPLC 25 min. usando UV 280 nm e 220 nm comprimentos de onda (tabela 2).
  2. Construa o vinculador Tioéter através de reação intermolecular thio-ene e, em seguida, cyclize o peptídeo por macrolactamization (Figura 4).
    1. Sintetizar o resíduo de Alquileno tendo o peptídeo linear H2N-A-A-A-mS5(2-R ')-R'-resina (50 mg) usando a síntese do peptide de fase sólida baseada em Fmoc padrão (SPPS) conforme descrito nos passos 2-4. Em seguida, lavar e secar a resina, conforme descrito na etapa 5.1.3.
    2. Suspenda a resina em um balão de fundo redondo de 10 mL contendo 2 mL do DMF desgaseificado, conforme descrito na etapa 5.1.4.
    3. Adicionar o fotoiniciador MMP e mapa (MMP: 1 equiv, 5,6 mg; MAPA: 1 equiv, 3,8 mg), Fmoc-Cys-OH (equiv. 3, 25,7 mg) e uma celeuma bar (0,3 cm) para o balão. Tampe o balão usando um plug de borracha adequada e então usar a bomba de óleo para substituir o ar no frasco com nitrogênio.
    4. Defina o balão de reação para o photoreactor. Mexa por 1-2 h sob irradiação UV, à temperatura ambiente (Figura 2).
    5. Monitorar a reação sob uma análise de LC-MS: cleave 2-3 mg de resina usando o coquetel de clivagem. Então precipitar o resíduo com éter dietílico frio (300 µ l), isolar o resíduo por centrifugação e evaporar o resíduo à secura, conforme descrito na etapa 5.1.11. Depois disso, dissolva o resíduo em 100 µ l de H2O e acetonitrilo (2:1). Filtrar a solução de peptídeo usando uma película microporous de 0,22 µm e analisá-lo usando LC-MS com o composto ionizado na ionização electrospray (ESI) e operado no modo positivo.
    6. Se necessário, repito os passos 5.2.2 - 5.2.4 para assegurar a reação é realizada para conclusão.
    7. Após a conclusão da foto-reação, transferir a resina do recipiente a coluna e remova o solvente usando filtragem de vácuo. Lave e seque a resina conforme descrito na etapa 5.1.3.
    8. Adicionar a solução DMF de Hexafluorofosfato de benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium (PyBob; 2,4 equiv, 31,2 mg), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt; 2,4 equiv, 8,1 mg) e o NMM (4 equiv., 11 µ l) para a resina na coluna para o macrolactamization. Bolha esta solução com N2 por 2 h.
      1. Além disso, monitore esta reação de acoplamento utilizando LC-MS, conforme descrito na etapa 5.2.3. Se necessário, repita esta etapa para assegurar a reação é realizada para conclusão.
    9. Alongar o peptídeo usando padrão SPPS Fmoc-baseado conforme descrito nas etapas 3 e 4.
    10. Após a montagem de todos os resíduos de aminoácidos, cleave o peptídeo da resina, conforme descrito nas etapas 5.1.10 e 5.1.11 e purificá-la conforme descrito na etapa 5.1.12.
  3. Construa o vinculador de sulfeto de vinil em fase de solução (Figura 5).
    1. Sintetiza o resíduo de alquino rolamento linear do peptide usando padrão SPPS Fmoc-baseado como descrito nos passos 2-4. Sintetiza o alquino rolamento aminoácidos de acordo com um protocolo bem estabelecido, conforme descrito no estudo anterior20.
    2. Cleave o peptídeo da resina e usando o frio éter dietílico, conforme descrito nas etapas 5.1.9 - 5.1.11 precipitar. Após a clivagem e a precipitação da resina, colete o peptídeo usando centrifugação a 12.000 x g por 2 min.
    3. Seca o resíduo resultante em um vácuo. Dissolver o resíduo em DMF o libertos (50 mL) em um balão de fundo redondo de 100 mL para atingir uma concentração final de 0.5 mM (com base na carga da resina, 0.025 mmol (1000 mL/L / 0.5 mmol/L) = 50 mL).
      1. Adicionar o fotoiniciador DMPA (0,5 equiv, 3,2 mg) e em seguida desgaseificar a solução de reação para 10 min usando N2 através de uma agulha longa, esticada na solução. Em seguida, irradiar a amostra sob UV luz à temperatura ambiente para 0,5 - 1 h sem agitação.
    4. Remover o DMF de alto vácuo e precipitar o resíduo bruto acrescentando éter dietílico para dissolver seus derivados orgânicos. Em seguida, isole o resíduo usando centrifugação a 12.000 x g por 2 min. Após a centrifugação, delicadamente despeje o componente de éter. Evapore o resíduo à secura. Finalmente, dissolver o resíduo em 1 mL de H2O e acetonitrilo (2:1) e purificá-la usando HPLC conforme descrito na etapa 5.1.7.

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Representative Results

Os espectros HPLC e MS do peptide Ac-Aderson5AAAC-NH2 e seu produto ciclizada Ac - Y-(cyclo-1,5)-[mS5AAAC] - NH2 que foram gerados usando o é em resina intramolecular thiol-ene são retratados em Figura 6B. O peptídeo cíclico foi encontrado para ter um peso molecular idêntico em relação ao seu precursor linear. No entanto, observou-se seu tempo de retenção HPLC para ser aproximadamente 2 min mais cedo do que de seus precursores sob as mesmas condições de separação. Peptides curtos com sequências diferentes todos foram observados para ter uma boa conversão, conforme representado na Figura 6.

O processo de seleção para as condições de é thio-ino é retratado na Figura 7B, e a conversão do isômero e proporção foram determinados utilizando a integração de HPLC de fase reversa. Apenas traços de peptídeo c 2 foram observados após a irradiação UV. Isto é provavelmente devido a uma preferência conformacional para uma captura de radicais no N-terminal da thiyl durante a etapa de contratação de um macrociclo de 20 membros. Ambos os peptídeos 1a e 1b foram encontrados para gerar dois isômeros com um vinil 8-membro crosslink de sulfeto. Peptídeos 2a-A e 2a-B, que foram gerados de peptídeo 1a, exibiram tempos distintos de retenção, bem como diferentes proporções de irradiação de UV diferente tempos (0 - 30 min) (Figura 7). Estes foram designados como os isómeros E/Z devido os ligação dupla próton sinais sobre a espectroscopia de H-NMR 1(Figura 7). No caso de peptídeos 2d-2f, o Z-isômero foi encontrado para ser o produto dominante. Isto é provavelmente devido à preferência conformacional durante a construção de uma estrutura compacta em relação o crosslink sulfeto de vinil 8-membro. Conforme representado na Figura 7E, de acordo com o espectro de Dicroísmo circular (CD), peptídeos 2a-A/B e 2b-A/B que possuem um vinil 8-membro sulfeto crosslink exibem uma bobina aleatória, enquanto peptídeo 2d que possui um vinil de 7-membro sulfeto crosslink exibe uma conformação helicoidal. Em resumo, o Z-isômero do vínculo sulfeto vinil foi encontrado para ser formado preferencialmente e exibido uma indução de hélice a melhor.

Figure 1
Figura 1: aparelho Manual do peptide-síntese para a síntese do peptide de fase sólida. As colunas foram colocadas em um tubo de vácuo através de torneiras de três vias e o aparelho foi conectado a uma linha de gás nitrogênio ou argônio para a subida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: O dispositivo de photoreactor usado para os photoreactions. O dispositivo foi equipado com lâmpadas dez 350 nm (Tabela de materiais) para irradiação UV e um tanque de gás argônio para garantir que o photoreactor estava cheio de gás argônio antes e durante as photoreactions. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: reação intramolecular thiol-ene no caso de peptídeos mais curtos na resina. Esta reação foi realizada usando uma desproteção na resina dos grupos trityl de resíduos de cisteína, após a completa síntese do peptide linear e em seguida, defina a resina para a irradiação UV usando os Fotoiniciadores mapa e MMP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: reação intermolecular thio-ene na resina. Esta reação foi realizada pela dissolução de Fmoc-Cys-OH no solvente DMF e então irradiada com o resíduo de peptídeo alceno-rolamento na resina, seguido de um macrolactamization usando PyBop, HoBt e NMM como reagentes de ativação. Em seguida, a síntese do peptide foi continuou usando um padrão SPPS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: reação Intramolecular thiol-ino em fase de solução. Esta reação foi realizada na fase de solução, após a completa síntese do peptide linear, após o qual o peptídeo linear foi dissolvido em DMF desgaseificado e irradiados usando luz UV com o fotoiniciador DMPA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Tioéter amarrados cíclicos peptídeos gerados usando uma reação em resina intramolecular thiol-ene. A. este painel mostra o esquema da reação na resina intramolecular thio-ene. mS5: "m" representa os aminoácidos olenic mono-substituídos, "S" representa o aminoácido S configurado e "5" refere-se ao número de lado cadeia átomos38. B. este painéis mostra os espectros HPLC e MS do peptide Ac-Aderson5AAAC-NH2 antes e após a sua ciclização. C. este painel mostra a conversão dos peptides cíclicos com diferentes sequências. Esta figura foi modificada de Zhao, b. et al.28 clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: peptídeo grampeamento através de foto-induzido thiol-ino hydrothiolation. A. esta é uma ilustração esquemática da intramolecular thiol-ino hydrothiolation. B. este painel mostra as sequências peptídicas avaliadas neste estudo. Iniciador: (I) 0,5 EQ. DMPA, 1 h; (II) não iniciador, 1 h; (III) 0,5 EQ. DMPA, 0,5 EQ. mapa, 1 h; (IV) 0,5 EQ. MMP, 0,5 h. C. Este painel mostra os vestígios HPLC da mistura de reação de peptídeo 1a com diferentes tempos de irradiação UV e monitorados em 220 nm. D. este painel mostra o 1espectro de H-RMN de 1a, 2a-A e 2a-B (medido em DMSO-d6 a 400 MHz). Os asteriscos indicam a formação de uma ligação de dupla de sulfeto vinil após irradiação UV. E. este painel mostra os espectros de Dicroísmo circular de peptídeos com ligações cruzadas de sulfeto de vinil. Esta figura foi modificada de Tian, Y. et al . 44 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materiais MW N(0.5mmol / g resina × 0. 0 5 g × 5eq.) M(aminoácido) (mg)
(Da) (mmol)
Fmoc-Gly-OH 297 0,125 37,1
Fmoc-Ala-OH 331 0,125 41,4
Fmoc-Val-OH 339 0,125 42,4
Fmoc-Leu-OH 353 0,125 44.1
Fmoc-Ile-OH 353 0,125 44.1
Fmoc-Pro-OH 337 0,125 42.1
Fmoc-Phe-OH 387 0,125 48,4
Fmoc-Tyr (tBu)-OH 460 0,125 57,5
Fmoc-Trp (Boc)-OH 527 0,125 65,9
Fmoc-Ser (tBu)-OH 384 0,125 48
Fmoc-Thr (tBu)-OH 398 0,125 49,8
Fmoc-Cys (Trt)-OH 586 0,125 73.3
Fmoc-conheceu-OH 372 0,125 46,5
Fmoc-Asn (Trt)-OH 597 0,125 74,6
Fmoc-Gln (Trt)-OH 611 0,125 76,4
Fmoc-Asp (OtBu)-OH 412 0,125 51.5
Fmoc-Glu (OtBu)-OH 426 0,125 53.3
Fmoc-Lys (Boc)-OH 469 0,125 58,6
Fmoc-Arg (Pbf)-OH 617 0,125 77,1
Fmoc-sua (Trt)-OH 620 0,125 77,5
HCTU 414 0.122 50,5
DIPEA 129. 0.25 43.5(ΜL)
DMF 0,5 mL

Tabela 1: Os montantes das condições de acoplamento.

Coluna Coluna Zorbax SB-Aq, 4,6 × 250 mm (tamanho do pore 80 Å, partícula tamanho 5 μm)
Solventes R: água, 0,1% (vol/vol) TFA; B: acetonitrilo
Taxa de fluxo 1 mL/min
Gradiente B 20 – 70% (vol/vol) mais 25 min; 70% - 98% mais de 5 min; 98% mais de 5min;
Volume de injeção 30 – 500 ΜL
Comprimento de onda (nm) 280 (para Fmoc, Trp ou Tyr-contendo peptídeos), ou 494 (FITC-rotulado peptídeos) ou 220 (para outros)

Tabela 2: Condições de cromatografia líquida de alta performance.

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Discussion

Na ciclização em resina intramolecular thio-ene descrita na Figura 3, a remoção do grupo trityl de um resíduo de cisteína foi encontrada para ser um passo fundamental para a posterior é. Além disso, o peso molecular de peptídeo antes e seguintes, que a reação foi encontrada para ser idênticos como representado na Figura 6B. Portanto, o uso de uma identificação de HPLC ou um ensaio DTNB é necessário para monitorar a reação. No caso da reação intermolecular thio-ene descrita na Figura 4, MS monitoramento é necessária. Enquanto mais um passo do acoplamento lactama verificou-se que sejam necessários para a construção de um baraço Tioéter, sugerimos que este protocolo será usado para peptídeos longos para alcançar uma eficiência total mais elevada.

O vínculo de sulfeto de vinil gerado pelo thio-ino é não era estável em solução fortemente ácida TFA que é usada para a segmentação de resina. Portanto, o uso do thio-ino é na fase de solução foi adotado. Esta reação foi diluída a uma concentração baixa (0,5 mM) para evitar a potenciais intermolecular por reações. Também é igualmente importante desgaseificar o solvente para evitar a oxidação do produto durante os photoreactions. Após a reação, vácuo evaporação do solvente orgânico que Dmf deve também ser cuidadosamente efectuada para evitar depreciação de oxidação/degradação ou máquinas de peptídeo. A reação de ciclização thio-ino retratada na Figura 5 fornece um mecanismo para a síntese do pós-peptide modificação35.

Enquanto a reação intramolecular thiol-ene gerado com êxito peptídeos Tioéter amarrado com boa conversão, uma ligação cruzada Tioéter simples falha ao restringir os peptídeos para a conformação helicoidal desejada. Com base nesta estratégia de modificação em-baraço, um centro quiral em-baraço induzida por peptídeo helicity conceito foi desenvolvido, onde o γ substituiu o grupo com a configuração de R no peptídeo C-terminal foi capaz de induzir a conformação helicoidal do peptide ( Figura 4)39,40. A limitação de associados a essa abordagem é a síntese de aminoácidos enantiomerically puras antinatural com dois centros quirais (α (S), de41,γ(R))42.

Esta pesquisa demonstrou que a reação thio-ino pode restringir o peptídeo em uma conformação helicoidal com boa conversão, conforme representado na Figura 7E. Em termos de construção de péptidos helicoidais, recomendamos thio-ino é para a construção de peptídeos helicoidais. A ciclização em resina intramolecular thio-ene foi demonstrada ser adequado para a construção de peptídeos de baraço Tioéter curto (menos de 15) no caso de longos peptídeos são muito flexíveis para assegurar a eficaz ciclização. Além disso, a ciclização em resina intermoleculares thio-ene é recomendada para ciclização de peptídeo longo.

Em resumo, temos desenvolvido uma série de protocolos de químicos para a construção de peptídeos de sulfeto amarrado Tioéter/vinil através do uso de participação thio-ene/thio-ino clique em química. A reação é eficiente, conveniente para manipulações, livre de catalisador de metal e tem sido demonstrado possuir uma tolerância superior grupo funcional e bio-ortogonais. Além disso, este método foi desenvolvido a fim de estabilizar a outras estruturas secundárias do peptide como um β-gancho de cabelo43,44. Este documento mostra que o baraço Tioéter fornece um site de modificação traceless. Isso em grande parte expande o espaço químico após modificação de síntese do peptide. Além disso, os peptídeos de sulfeto amarrado alifáticos Tioéter/vinil que exibiram uma membrana reduzida toxicidade em relação os peptídeos descontínuas de hidrocarbonetos são aplicados em diversas aplicações biológicas com demonstrada boa Bioatividade e biodisponibilidade de45,46.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores reconhecem apoio financeiro por parte da ciência Natural da China subsídios da Fundação (n. º 21372023, 21778009 e 81701818); o Ministério da ciência e tecnologia da República Popular da China (n. º 2015DFA31590); a ciência de Shenzhen e tecnologia inovação Comitê (n. º JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 e GJHS20170310093122365); e a Fundação de ciência Postdoctoral China (n. º 2017 M 610704).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) HECHENG GRM50407
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem (Shanghai) Ltd.
N-Methyl-2-pyrrolidinone Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. 3230 skin harmful
N,N-Dimethyl formamide Energy B020051 skin harmful
Dichloromethane Energy W330229 skin harmful
N,N-Diisoproylethylamine Aldrich 9578 irritant
Trifluoroacetic acid J&K 101398 corrosive
Triisopropylsilane J&K 973821
1,2-Ethanedithiol J&K 248897 Stench
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate  GL Biochem (Shanghai) Ltd. 851012
Morpholine Aldrich M109062 irritant
Diethyl ether Aldrich 673811 flammable
Acetonitrile Aldrich 9758 toxicity
Methanol Aldrich 9758 toxicity
2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone Energy A050035
4-methoxyacetophenone Energy A050098
2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone Energy D070132
5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) J&K 281281
Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Energy E020172
1-Hydroxybenzotriazole Energy D050256
4-Methylmorpholine Energy W320038
High Performance Liquid Chromatography SHIMADZU LC-30AD
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU LCMS-8030
Lyophilizer Labconco FreeZone
SpeedVac concentration system Thermo Savant
vacuum manifold promega A7231
three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
poly-prep chromatography columns  Bio-Rad 7311550

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References

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Química edição 138 reação Thio-ene/Ino foto-induzido cisteína Tioéter estabilização peptídeos helicoidais interações da proteína-proteína
Construindo Tioéter/sulfeto de vinil-amarrados induzida por peptídeos helicoidais Via foto Thiol-ene/ino Hydrothiolation
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Shi, X., Liu, Y., Zhao, R., Li, Z.… More

Shi, X., Liu, Y., Zhao, R., Li, Z. Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation. J. Vis. Exp. (138), e57356, doi:10.3791/57356 (2018).

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