Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Opprette Thioether/Vinyl Sulfide-bundet spiralformede peptider Via Foto-indusert Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Published: August 1, 2018 doi: 10.3791/57356
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology, Peking University Shenzhen Graduate School
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterer en protokoll for bygging av thioether/vinyl sulfide-bundet spiralformede peptider bruker Foto-indusert thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.

Abstract

Her beskriver vi en detaljert protokoll forberedelse til thioether-bundet peptider bruker på harpiks intramolekylære/intermolekylære thiol-ene hydrothiolation. I tillegg beskriver denne protokollen utarbeidelse av vinyl-sulfide-bundet peptider ved hjelp av i-løsning intramolekylære thiol-yne hydrothiolation mellom amino acids som har alken/alkyne siden kjeder og cystein rester på jeg, jeg + 4 posisjoner. Lineær peptider ble syntetisert bruker standard Fmoc-basert solid-fase peptid syntese (SPPER). Thiol-ene hydrothiolation er utført en intramolekylære deg selv thio-ene reaksjon eller en intermolekylære deg selv thio-ene reaksjon, avhengig av peptid lengden. I denne forskningen utføres en intramolekylære deg selv thio-ene reaksjon ved kortere peptider bruker på harpiks deprotection av trityl grupper av cystein rester etter fullført syntesen av lineær peptid. Harpiks settes da til UV bestråling med photoinitiator 4-methoxyacetophenone (kart) og 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). Intermolekylære thiol-ene reaksjonen utføres smelte Fmoc-Cys-OH i en N, N-(DMF) dimethylformamid. Dette er så reagert med peptid bruker alken rentebærende rester på harpiks. Etter at utføres macrolactamization ved hjelp av benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt) og 4-Methylmorpholine (NMM) som aktivisering reagenser på harpiks. Etter macrolactamization, peptid syntese er fortsatt bruke standard SPPER. Ved deg selv thio-yne-hydrothiolation er den lineære peptid kløyvde fra harpiks, tørket og senere oppløst i degassed DMF. Dette er så irradiated bruker UV-lys med photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Etter reaksjonen, DMF er fordampet og råolje rester bidrar og renset med høy ytelse flytende kromatografi (HPLC). Disse metodene kan fungere for å forenkle generering av thioether-bundet syklisk peptider skyldes bruk av deg selv thio-ene/yne Klikk kjemien som besitter overlegen funksjonsgruppe toleranse og god avkastning. Innføring av thioether obligasjoner i peptider utnytter nukleofil natur cystein rester og er redoks-inert i forhold til disulfide obligasjoner.

Introduction

Utviklingen av ligander å modulere protein-protein interaksjoner (PPIs) gir en attraktiv tilnærming for moderne medisiner. Dermed har mye innsats blitt investert i studere romanen kjemiske modaliteter som kunne effektivt modulerer PPIs1,2,3. PPIs vanligvis består av grunne, store og/eller utgåtte samspill overflater, og små molekyler er vanligvis vurdert å være uegnet ligander for modulering av PPIs4,5. Med et egnet eksponert samspill område representerer kort peptider som etterligner strukturfunksjonene protein grensesnitt ideelle kandidater å løse denne problem6,7. Men er kort peptider ustrukturerte i en vandig løsning. Dette er på grunn av det faktum at molekylene som konkurrerer med intramolekylære hydrogen bonding nettverket peptid ryggraden og veldefinert konformasjonen er entropically ugunstige i vann8. I tillegg peptidene lav iboende stabilitet og permeabilitet celleegenskaper i stor grad begrense deres bruk i biologisk programmer9,10. Ifølge protein databank (PDB) analyse, > 50% av PPIs involverer kort α-helix interaksjoner11. Dermed har kjemiske metoder blitt utviklet i forhold til helix stabilisering. Disse inkluderer disulfide/thioether bond formasjon12,13,14, ring-avsluttende metathesis15, Laktam ring formasjon16, "Klikk" kjemi17, tillegg perfluoroarenes18,19og vinyl-sulfide formasjon20.

Stabilisert spiralformede peptider benyttes mye for ulike intracellulær mål, inkludert p53, østrogen reseptorer, Ras, BCL-2 familie proteiner, og andre21,22,23,24. ALRN-6924, en all-hydrokarbon stiftet peptid dobbelt hemmer MDM2 og MDMX, blir brukt for klinisk undersøkelse25. I de siste årene, har vår gruppe fokusert på utviklingen av romanen peptid stabilisering metoder med thiol-ene og thiol-yne reaksjoner26,27,28. Vanligvis har vi vist at disse Foto startet reaksjoner er effektiv under mild forhold når naturlig rikelig cystein brukes. I tillegg har vi vist at disse reaksjonene har en utmerket funksjonsgruppe toleranse, er bio-ortogonale, og har vist seg for å være gjeldende peptid og protein modifikasjoner29. De resulterende thioether/vinyl sulfide bundet peptidene i stor grad forbedre kjemiske løpet av begrensning peptider, gir en labil på tjore endring center og er bevist for å være gjeldende for bruk i mange biologiske programmer30 ,31,32. Hittil har bare begrenset rapporter blitt beskrevet om thiol-ene/thiol-yne peptid cyclization. I en studie publisert av Anseth et al. i 2009, var en reaksjon på harpiks intramolekylære thiol-ene for peptid cyclization mellom aktivert alkener med cystein demonstrert33. I 2015, Chou et al. beskrevet en to-komponent radikale initiert thiol-ene reaksjon for peptid stifting34 og påfølgende, sekvensiell thiol-yne/ene kopling reaksjon35. Nylig beskrev vi en rekke arbeid basert på thioether/vinyl sulfide bundet peptider20,26,27. Denne protokollen beskriver en detaljert syntese av ovennevnte thioether/vinyl sulfide bundet peptider i håp at det vil være nyttig for bredere forskning samfunnet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. utstyr forberedelse

  1. For manuell peptid-syntese apparater, plassere en vakuum manifold (Tabell for materiale) i en effektiv avtrekksvifte. Deretter sted treveis stopcocks på vakuum manifold og koble dem til en nitrogen eller argon gass linje. Cap alle ubrukte viker med gummi septa.
  2. Koble harpiks fylt kolonner (0.8 x 4 cm, 10-mL reservoaret, se Tabell of Materials) til manifold bruker treveis stopcocks (figur 1). Bruk en pumpe som er koblet til et system som vakuum filtrering eller en gummi pipette lyspære ved ekstrudering for å fjerne løsemiddelet i kolonnene.
  3. Bruk en photoreactor (figur 2), utstyrt med ti 350 nm lamper (Tabell for materiale) for UV bestråling. Koble disse til en argon gass tank via photoreactor luftinntak slik at photoreactor er fylt med argongass før og under photoreactions.
  4. Før du bytter på UV lampen av photoreactor, sikre at photoreactor døren er lukket i tilfelle det er bestråling mot UV-lyset.

2. harpiks forberedelse

Merk: generelt byggingen av peptid underlag utføres ved hjelp av Fmoc-basert solid-fase peptid syntese protokoller. Dette er utført med skøytebane amid harpiks som etterlater en C-terminalen amid gjenværende følgende peptid cleavage. Denne protokollen er brukt gjennom papiret.

Advarsel: N, N- vannistedenfor (DMF), diklormetan (DCM), 4-methylmorpholine (NMM) og N, N- diisoproylethylamine (DIPEA) er toksisk og skadelig ved innånding og svelging hudkontakt. Diethyl Eter er meget brannfarlig. Trifluoroacetic syre (TFA) er etsende. 1,2-ethanedithiol (EDT) er svært malodorous. Alle organiske løsemidler og kjemikalier bør derfor håndteres riktig personlig verneutstyr (nitrilhansker Laboratoriefrakk og beskyttende briller) og håndtert innenfor kjemisk avtrekksvifte.

  1. Beregn mengden av harpiks må bruke følgende formel:
    skalere (mmol) / (harpiks lastekapasitet (mmol/g) 1000 (mg/g)) = masse harpiks (mg)
    Eksempel, mengden rink amid MBHA harpiks (0,5 mmol/g) for 25 µmol = 0.025 mmol / (0,5 mmol/g 1000 mg/g) = 50 mg. Deretter veie 50 mg harpiks i en kolonne og sette den opp på vakuum manifold bruker treveis stopcocks.
  2. Legge til 1-2 mL DCM harpiks i en kolonne (0.8 x 4 cm, 10-mL reservoar). For å svelle harpiks, forsiktig røre det bruker en nitrogen eller argon strøm for 10 min. Deretter fjerne løsemiddelet bruker vakuum filtrering.

3. N-terminal Fmoc Deprotection og vask

  1. Forberede den N-terminal Fmoc deprotecting løsning: forberede en tilstrekkelig volum (200 mL) på 50% (v/v) morpholine i DMF i ett glassflaske.
  2. Legge til 1-2 mL løsningen deprotection harpiks, forsiktig røre det på 10 min og deretter avløp løsningen ved å benytte et vakuum. Bruke DMF (1-2 mL) og DCM (1-2 mL) i den rekkefølgen, vask harpiks og reaksjonen fartøyet grundig for totalt 3 x. Deretter gjentar deprotection og vask prosedyrene 1 x.

4. Fmoc-beskyttet aminosyre kopling

  1. Bruke koblingen av alanin rester som et eksempel, i tilfelle av 25 µmol skala manuell syntese, veie Fmoc-Ala-OH (5 hovedfag, 41.4 mg), 2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate (HCTU; 4,9 hovedfag, 50.5 mg) i en polypropylen beholder og oppløse den i DMF (0,5 mL).
  2. Legge til DIPEA (10 hovedfag, 43.5 µl) for å generere en 0,25-M aktivert aminosyre løsning (tabell 1). Etter en omtrentlig 1 min pre-aktivisering, legge løsningen til harpiks, og deretter dukker det med N2 for ca 1-2 timer.
  3. Dette trinnet på, innlemme hver aminosyre i peptid kjeden som en rekke skritt: først deprotection N-terminal Fmoc-gruppen, og deretter vask, etterfulgt av koblingen av aminosyren via aktivering HCTU.
    Merk: Lengre kopling tid (f.eks., 2 timer) anbefales hvis kobling etter en sterically hindret aminosyre rester [f.eks., Fmoc-Thr (tBu) - OH, Fmoc-Cys (Trt) - OH, Fmoc-hans (Trt) - OH, Fmoc-Arg (Pbf) - å]. Alken/alkyne bærer fjern naturlig aminosyrer brukes i 3 ekvivalenter i stedet for 5 og er igjen for å reagere for 3t.
  4. Overvåke peptid syntese fremdriften bruker Kaiser eller chloranil tester som beskrevet av Arora et al. 36 testene gi kvalitative vurderinger av tilstedeværelse eller fravær av gratis primære og sekundære aminer. Ca 2-3 mg av peptid kan eventuelt kløyvde fra harpiks og analyseres av LC-MS.

5. thiol-ene Hydrothiolation og Thiol-yne Cyclization

  1. Konstruere thioether koblingsfunksjonalitet gjennom-harpiks cyclization (Figur 3).
    1. Forberede ca 50 mL av Trt deprotection løsningen (TFA/TIS/DCM 0.03/0.06/1.0). Behandle Cys- og mS5-bærer harpiks [NH2-R-mS5-A-A-A-Cys (Trt)-R'-harpiks, 50 mg] med 1-2 mL Trt deprotection løsningen i en 10-mL-kolonne. Forsiktig agitere løsningen for 10 min bruker N2. Til slutt, vask den med DCM (1-2 mL) for totalt 3 x.
      Merk: MS5 representerer alkylene-bærende byggeblokken (se strukturen avbildet i figur 6) brukes for peptid kopling og deg selv thio-ene cyclization38.
    2. Gjenta denne fremgangsmåten beskrevet ovenfor totalt ca 6 x for å fjerne gruppen trityl beskyttelsen cystein, før løsning fargen er ikke lenger gul.
    3. Frikirkelige N2, vask den R-mS5- A-A-A-Cys(-SH)-R'-harpiks [cystein med gratis deg selv thio (-SH)] med DMF (1-2 mL) og DCM (1-2 mL) i den rekkefølgen. Krympe harpiks bruker metanol (1-2 mL) i 2 minutter og deretter fjerne løsemiddelet bruke filtrering. Deretter sekvensielt tørr harpiks under en steam N2 gass i ca 5 min i kolonnen.
    4. Klargjør degassed DMF på forhånd, innen en munn kolbe, ved boblende nitrogen gass for ca 1 h gjennom en lang nål som var strukket til løsemiddelet.
    5. Overføre harpiks i en 10-mL rund bunn kolbe gjennom veie papir. Avbryte harpiks 2 mL degassed DMF etterfulgt av tillegg av photoinitiator 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP; 1 hovedfag, 5,6 mg), 4-methoxyacetophenone (kart; 1 hovedfag, 3,8 mg).
    6. Legge til en røre bar (0,3 cm) i flasken cap flasken en egnet gummi plugg, og fortrenge luften i flasken med nitrogen gass med en oljepumpe.
      Merk: Inert atmosfæren er ikke strengt nødvendig for effektiv deg selv thio-ene photoreaction på en solid fase. Men er det veldig nødvendig for deg selv thio-yne photoreaction i løsning fase i figur 5. Ellers vil svovel oksidere under UV-bestråling.
    7. Sette reaksjon kolbe photoreactor og rør harpiks 1t under UV bestråling ved romtemperatur (figur 2).
      FORSIKTIG: Før photoreactor UV-lampen, sikre at photoreactor døren er lukket i tilfelle det er skadelig bestråling mot UV-lyset.
      Merk: Ofte prøvetaking reaksjonsblandingen under photoreactions anbefales for nye sekvenser, som lineær peptid forløperen har identiske molekylvekt av produktet. Generelt, viser lineære og syklisk peptider signifikant forskjellig hydrophilicity. Dette kan lett skilles bruker mye HPLC. Alternativt 5, 5' - dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)-reagens kan også brukes til å studere tilstedeværelsen av gratis thiol37.
    8. Overføre harpiks fra flasken til kolonnen og fjerne løsemiddelet bruker vakuum filtrering. Vask og tørk harpiks som beskrevet i trinn 5.1.3.
    9. Forberede ca 10 mL cleavage cocktail (TFA/TIPS/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) i avtrekksvifte.
    10. Overføre harpiks i en 2-mL polypropylen beholder, legge til 1 mL av cleavage cocktail (TFA/TIPS/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) i beholderen og sel beholderen tett med skrukork. Deretter forsiktig agitere beholderen på en orbital shaker med en hastighet på 60 rpm i avtrekksvifte 1,5-2 h.
      FORSIKTIG: TFA er svært etsende. Bruk klær og arbeid i en effektiv avtrekksvifte. EDT er et stoff som svært malodorous og må behandles i en effektiv avtrekksvifte.
    11. Fjerne TFA cocktail ved fordampning under en N2 gasstrømmen i avtrekksvifte. Deretter bunnfall rester bruker kaldt diethyl Eter (1 mL) for 30 s og isolere den via sentrifugering 12.000 x g i 2 minutter. Etter sentrifugering, forsiktig helle komponenten Eter. Gjenta trinnene utløse og sentrifugering for 2 x. Fordampe rester til tørrhet.
    12. Endelig oppløse rester i 1 mL H2O/acetonitrile (2:1) og rense ved HPLC bruker en C18 analytisk kolonne (4.6 x 250 mm, flow rate 1,0 mL/min). Bruk H2O (0,1 prosent TFA) og ren acetonitrile løsemidler i en 2%/min lineær gradient fra 20% til 70% acetonitrile over 25 min. skjermen HPLC spectra UV 280 nm og 220 nm bølgelengder (tabell 2).
  2. Konstruere thioether linker gjennom intermolekylære deg selv thio-ene reaksjon, og cyclize peptid ved macrolactamization (Figur 4).
    1. Syntetisere alkylene rester bærer den lineære peptid H2N-A-A-A-mS5(2-R'')-R'-harpiks (50 mg) ved hjelp av standard Fmoc-basert solid-fase peptid syntese (SPPER) som beskrevet i trinn 2-4. Deretter vaske og tørke harpiks som beskrevet i trinn 5.1.3.
    2. Suspendere harpiks i en 10-mL rund bunn bolle med 2 mL degassed DMF som beskrevet i trinn 5.1.4.
    3. Legge til photoinitiator MMP og kart (MMP: 1 hovedfag, 5,6 mg; KART: 1 hovedfag, 3,8 mg), Fmoc-Cys-OH (3 hovedfag, 25,7 mg) og oppsikt bar (0,3 cm) i flasken. Cap flasken med en egnet gummi plugg og deretter bruke oljepumpe erstatte luften i flasken med nitrogen.
    4. Angi reaksjon kolbe inn i photoreactor. Rør i 1-2 h under UV bestråling ved romtemperatur (figur 2).
    5. Overvåke reaksjonen under en LC-MS analyse: cleave 2-3 mg av harpiks bruker cleavage cocktail. Så utløse resten med kaldt diethyl Eter (300 µL), isolere rester av sentrifugering og fordampe rester til tørrhet som beskrevet i trinn 5.1.11. Etter at oppløse rester i 100 µL av H2O/acetonitrile (2:1). Filtrer peptid løsningen bruker en 0.22-µm mikroporøs film og analysere den med LC-MULTIPLE Sclerosis med sammensatt ionisert i electrospray ionization (ESI) og drives i positiv modus.
    6. Hvis nødvendig, Gjenta trinn 5.2.2 - utført 5.2.4 å sikre reaksjonen til ferdigstillelse.
    7. Etter fullføringen av foto-reaksjon, overføre harpiks fra flasken i kolonnen, og fjern løsemiddelet bruker vakuum filtrering. Vask og tørk harpiks som beskrevet i trinn 5.1.3.
    8. Legge til DMF løsning av benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBob; 2,4 hovedfag, 31.2 mg), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt; 2,4 hovedfag, 8.1 mg), og NMM (4 hovedfag, 11 µL) til harpiks i kolonnen for macrolactamization. Boble denne løsningen med N2 for 2T.
      1. I tillegg overvåke denne koblingen reaksjonen bruker LC-MS som beskrevet i trinn 5.2.3. Om nødvendig gjentar du dette trinnet å sikre reaksjonen utføres til ferdigstillelse.
    9. Forlenge peptid bruker standard Fmoc-baserte SPPER som beskrevet i trinn 3 og 4.
    10. Ved montering av alle aminosyre rester, holde seg til peptid fra harpiks som beskrevet i trinn 5.1.10 og 5.1.11 og rense den som beskrevet i trinn 5.1.12.
  3. Konstruere vinyl sulfide linker i løsningen fase (figur 5).
    1. Syntetisere alkyne rester bærer lineær peptid bruker standard Fmoc-baserte SPPER som beskrevet i trinn 2-4. Syntetisere alkyne bærer aminosyre etter en veletablert protokoll som beskrevet i en tidligere studie20.
    2. Holde seg til peptid fra harpiks og utløse den med kaldt diethyl Eter som beskrevet i trinnene 5.1.9 - 5.1.11. Etter cleavage og nedbør av harpiks, samle peptid bruker sentrifugering 12.000 x g i 2 minutter.
    3. Tørr resulterende rester i et vakuum. Oppløse rester i degassed DMF (50 mL) i en 100-mL rund bunn kolbe for å nå en siste konsentrasjon på 0,5 mM (basert på lasting av harpiks, 0.025 mmol (1000 mL/L / 0,5 mmol/L) = 50 mL).
      1. Legg photoinitiator DMPA (0,5 hovedfag, 3,2 mg) og deretter degas reaksjon løsningen for 10 min bruker N2 gjennom en lang nål strukket i løsningen. Deretter irradiate prøven under UV-lys ved romtemperatur for 0,5 - 1 h uten agitering.
    4. Fjern DMF under en høy vakuum og føre den rå resten ved å legge diethyl Eter for å oppløse organisk relaterte produkter. Deretter isolere rester bruker sentrifugering 12.000 x g i 2 minutter. Etter sentrifugering, forsiktig helle komponenten Eter. Fordampe rester til tørrhet. Endelig oppløse rester i 1 mL av H2O/acetonitrile (2:1) og rense den med HPLC som beskrevet i trinn 5.1.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Til HPLC og MS spectra peptid Ac-YmS5AAAC-NH2 og cyclized produktet Ac - Y-(cyclo-1,5)-[mS5AAAC] - NH2 som ble generert ved hjelp av photoreaction på harpiks intramolekylære thiol-ene er avbildet i figur 6B. de sykliske peptid ble funnet for å ha en identisk molekylvekt i forhold til forløperen sin lineær. Men ble tiden sin HPLC observert for å være ca 2 min tidligere enn i forløperne oppstiller separasjon. Kort peptider med forskjellige sekvenser ble alle observert for å ha en god konvertering, som vist i figur 6C.

Screening-prosess for deg selv thio-yne photoreaction betingelsene er avbildet i figur 7Bog isomer konverteringen og forholdet var bestemmes ved hjelp av integreringen av reverse-fase HPLC. Bare sporingsnivåer av peptid 2c ble observert etter UV bestråling. Dette er sannsynligvis på grunn av en conformational preferanse for en overlapping av thiyl radikale på N-terminus under kontraherende foranstaltningen å en 20 medlemmer macrocycle. Både peptider 1a og 1b ble funnet for å generere to isomerene med en 8-medlem vinyl sulfide krysskobling. Peptider 2a-A og 2a-B, som ble generert fra peptid 1a, utstilt distinkte tid samt ulike prosenter for ulike UV bestråling ganger (0 - 30 min) (figur 7C). Dette ble tildelt som de E/Z isomerene på grunn av dobbelt bånd proton signalene på 1H-NMR spektroskopi (figur 7 d). I tilfelle av peptider 2d-2f, ble Z-isomer funnet for å være den dominerende produktet. Dette er sannsynligvis på grunn av conformational preferanse under byggingen av en kompakt struktur i forhold til 8-medlem vinyl sulfide krysskobling. Som vist i figur 7E, ifølge sirkulær dichroism (CD) spekteret, peptider 2a-A/B og 2b-A/B som har en 8-medlem vinyl sulfide krysskobling utstillingen en tilfeldig coil, mens peptid 2d som besitter en 7-medlem vinyl sulfide krysskobling utstillinger en spiralformede konformasjon. I sammendraget, Z-isomer vinyl sulfide Bond ble funnet å være dannet fortrinnsvis og vises en bedre helix induksjon.

Figure 1
Figur 1: manuell peptid-syntese apparater for solid fase peptid syntese. Kolonnene ble plassert på vakuum manifold gjennom treveis stopcocks og apparatet ble koblet til en nitrogen eller argon gass linje for boblende. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: photoreactor enheten brukes for photoreactions. Enheten ble utstyrt med ti 350 nm lamper (Tabell for materiale) for UV bestråling og en argon gass tank å sikre at photoreactor var fylt med argongass før og under photoreactions. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: på-harpiks intramolekylære thiol-ene reaksjon ved kortere peptider. Denne reaksjonen var gjennomført med en på-harpiks deprotection av trityl grupper av cystein rester etter fullført syntesen av lineær peptid og deretter angi harpiks UV bestråling med photoinitiators kart og MMP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: intermolekylære deg selv thio-ene reaksjon på harpiks. Denne reaksjonen var utført smelte Fmoc-Cys-OH i DMF løsemiddelet og deretter bestrålt med alken rentebærende peptid rester på harpiks, etterfulgt av en macrolactamization med PyBop, HoBt og NMM som aktivisering reagenser. Deretter peptid syntese ble fortsatt bruker en standard SPPER. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: intramolekylære thiol-yne reaksjon i løsningen fase. Dette ble utført i løsningen fasen etter fullført syntesen av lineær peptid, hvoretter den lineære peptid ble oppløst i degassed DMF og bestrålt bruker UV-lys med photoinitiator DMPA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Thioether bundet syklisk peptider generert ved hjelp av en på-harpiks intramolekylære thiol-ene reaksjon. A. dette panelet viser ordningen med på harpiks intramolekylære deg selv thio-ene reaksjonen. mS5: "m" representerer mono-substituert olenic aminosyrer, "S" representerer aminosyren S konfigurert og "5" refererer til antall side kjede atomer38. B. denne paneler viser HPLC og MS spektra av peptid Ac-YmS5AAAC-NH2 før og etter sin cyclization. C. dette panelet viser konvertering av syklisk peptider med forskjellige sekvenser. Dette tallet har blitt endret fra Zhao, B. et al.28 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: peptid stifting gjennom foto-indusert thiol-yne hydrothiolation. A. Dette er en skjematisk illustrasjon av intramolekylære thiol-yne hydrothiolation. B. dette panelet viser peptid sekvensene vurdert i denne studien. Initiatoren: (I) 0,5 eq. DMPA, 1 h; (II) ingen initiativtakeren, 1 h; (III) 0,5 eq. DMPA, 0,5 eq. kart, 1 h; (IV) 0,5 eq. MMP, 0,5 h. C. Dette panelet viser HPLC spor reaksjonsblandingen av peptid 1a med forskjellige UV bestråling tider og overvåket på 220 nm. D. dette panelet viser 1H-NMR spekter av 1a, 2a-A, og 2a-B (målt i DMSO-d6 på 400 MHz). Stjernene angir dannelsen av en vinyl sulfide dobbelt bånd etter UV bestråling. E. dette panelet viser de sirkulære dichroism spektra av peptider med vinyl sulfide cross-links. Dette tallet har blitt endret fra Tian, Y. et al. 44 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Materialer MW N(0.5mmol / g harpiks × 0. 0 5 g × 5eq.) M(aminosyre) (mg)
(Da) (mmol)
Fmoc-Gly-OH 297 0.125 Sett 37,1
Fmoc-Ala-OH 331 0.125 41,4
Fmoc-Val-OH 339 0.125 42.4
Fmoc-Leu-OH 353 0.125 44,1
Fmoc-Ile-OH 353 0.125 44,1
Fmoc-Pro-OH 337 0.125 42.1
Fmoc-Phe-OH 387 0.125 48,4
Fmoc-Tyr (tBu)-OH 460 0.125 57,5
Fmoc-Trp (Boc)-OH 527 0.125 65.9
Fmoc-Ser (tBu)-OH 384 0.125 48
Fmoc-Thr (tBu)-OH 398 0.125 49.8
Fmoc-Cys (Trt)-OH 586 0.125 73.3
Fmoc-møtte-OH 372 0.125 46,5
Fmoc-Asn (Trt)-OH 597 0.125 74.6
Fmoc-Gln (Trt)-OH 611 0.125 76,4
Fmoc-Asp (OtBu)-OH 412 0.125 51,5
Fmoc-Glu (OtBu)-OH 426 0.125 53.3
Fmoc-Lys (Boc)-OH 469 0.125 58,6
Fmoc-Arg (Pbf)-OH 617 0.125 77.1
Fmoc-hans (Trt)-OH 620 0.125 77,5
HCTU 414 0.122 50,5
DIPEA 129 0,25 43.5(ΜL)
DMF 0,5 mL

Tabell 1: Beløpene av kopling.

Kolonne Zorbax SB-Aq kolonnen 4.6 × 250 mm (porestørrelse 80 Å, partikkel størrelse 5 μm)
Løsningsmidler A: vann, 0,1% (vol/vol) TFA; B: acetonitrile
Gjennomstrømning 1 mL/min
Gradering 20 – 70% (vol/vol) B over 25 min; 70% - 98% over 5 min; 98% over 5min;
Injeksjon volum 30-500 ΜL
Bølgelengde (nm) 280 (for Fmoc-, Trp- eller Tyr inneholder peptider), eller 494 (FITC-merket peptider) eller 220 (for andre)

Tabell 2: Høy ytelse flytende kromatografi forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I på-harpiks intramolekylære deg selv thio-ene cyclization beskrevet i Figur 3, ble fjerning av gruppen trityl i en cystein rester funnet for å være et kritisk punkt for den påfølgende photoreaction. I tillegg avbildet peptid molekylvekt før og etter reaksjonen var funnet for å være identiske som i figur 6B. Derfor er bruk av en såkalt HPLC-ID eller en DTNB analysen nødvendig for å overvåke reaksjonen. Ved intermolekylære deg selv thio-ene reaksjonen beskrevet i Figur 4, er MS overvåking nødvendig. Mens et steg videre av Laktam kobling ble funnet for å være nødvendig for bygging av en thioether tjore, foreslår vi at denne protokollen skal brukes for lang peptider for å oppnå en total høyere effektivitet.

Vinyl sulfide bånd generert av deg selv thio-yne photoreaction var ikke stabilt i sterkt surt TFA løsningen som brukes for harpiks cleavage. Derfor ble bruk av deg selv thio-yne photoreaction i løsning fasen vedtatt. Denne reaksjonen var utvannet til en lav konsentrasjon (0,5 mM) for å unngå potensielle intermolekylære av-reaksjoner. Det er også like viktig å degas løsemiddelet for å unngå produktet oksidasjon under photoreactions. Etter reaksjonen, vakuum fordampning organisk løsemiddel DMF bør også være nøye gjennomført for å hindre peptid oksidasjon/degradering eller maskiner avskrivning. Deg selv thio-yne cyclization reaksjonen avbildet i figur 5 gir en mekanisme for post peptid syntese endring35.

Mens intramolekylære thiol-ene reaksjonen er generert thioether bundet peptider med god konvertering, en enkel thioether krysskobling ikke begrense peptidene inn ønsket spiralformede konformasjon. Basert på denne på tjore endring strategi, en i tjore chiral center indusert peptid helicity konseptet ble utviklet, der γ erstattet gruppe med R konfigurasjonen på peptid C-terminalen kunne overtale den peptid spiralformede konformasjon ( Figur 4)39,40. Begrensningen forbundet med denne tilnærmingen er syntese av enantiomerically ren unaturlig aminosyren med to chiral sentre (α (S), γ(R))41,42.

Denne forskningen viste at deg selv thio-yne reaksjonen kan begrense peptid i spiralformede ingen bekreftelse med god konvertering, som vist i figur 7E. I byggingen av spiralformede peptider anbefaler vi deg selv thio-yne photoreaction for bygging av spiralformede peptider. På-harpiks intramolekylære deg selv thio-ene cyclization ble vist for å være egnet for bygging av kort thioether tjore peptider (mindre enn 15) i tilfelle lang peptider er for fleksibel til å sikre effektiv cyclization. I tillegg anbefales på harpiks intermolekylære deg selv thio-ene cyclization for lang peptid cyclization.

I sammendraget, har vi utviklet en rekke kjemiske protokoller for bygging av thioether/vinyl sulfide bundet peptider ved hjelp av photoinduced deg selv thio-ene/deg selv thio-yne Klikk kjemi. Reaksjonen er effektiv, metall katalysator-fri, praktisk for manipulasjoner, og har blitt vist å ha en overlegen funksjonsgruppe toleranse og bio-ortogonale. Videre ble denne metoden utviklet for å stabilisere andre peptid sekundære strukturer som en β-hårnål43,44. Dette papiret viser at thioether tjore gir et traceless endring område. Dette utvider i stor grad den kjemiske mellomrom etter peptid syntese modifisering. Videre alifatisk thioether/vinyl sulfide bundet peptidene som utstilt en redusert membran toksisitet i forhold til hydrokarbon stift peptidene brukes i forskjellige biologiske programmer med demonstrert god bioactivity og biotilgjengelighet45,46.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne bekrefter økonomisk støtte fra Natural Science Foundation av Kina tilskudd (nr. 21372023, 21778009 og 81701818); Departementet for vitenskap og teknologi i Folkerepublikken Kina (nr. 2015DFA31590); Shenzhen vitenskap og teknologi innovasjon Committee (nr. JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 og GJHS20170310093122365); og Kina postdoktor Science Foundation (nr 2017 M 610704).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) HECHENG GRM50407
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem (Shanghai) Ltd.
N-Methyl-2-pyrrolidinone Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. 3230 skin harmful
N,N-Dimethyl formamide Energy B020051 skin harmful
Dichloromethane Energy W330229 skin harmful
N,N-Diisoproylethylamine Aldrich 9578 irritant
Trifluoroacetic acid J&K 101398 corrosive
Triisopropylsilane J&K 973821
1,2-Ethanedithiol J&K 248897 Stench
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate  GL Biochem (Shanghai) Ltd. 851012
Morpholine Aldrich M109062 irritant
Diethyl ether Aldrich 673811 flammable
Acetonitrile Aldrich 9758 toxicity
Methanol Aldrich 9758 toxicity
2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone Energy A050035
4-methoxyacetophenone Energy A050098
2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone Energy D070132
5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) J&K 281281
Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Energy E020172
1-Hydroxybenzotriazole Energy D050256
4-Methylmorpholine Energy W320038
High Performance Liquid Chromatography SHIMADZU LC-30AD
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU LCMS-8030
Lyophilizer Labconco FreeZone
SpeedVac concentration system Thermo Savant
vacuum manifold promega A7231
three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
poly-prep chromatography columns  Bio-Rad 7311550

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelay-Gimeno, M., Glas, A., Koch, O., Grossmann, T. N. Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions: mimicking peptide binding epitopes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (31), 8896-8927 (2015).
  2. Passioura, T., Katoh, T., Goto, Y., Suga, H. Selection-based discovery of druglike macrocyclic peptides. Annual Review of Biochemistry. 83, 727-752 (2014).
  3. Gonzalez, M. W., Kann, M. G. Protein interactions and disease. PLoS Computational Biology. 8 (12), 1-11 (2012).
  4. Wilson, A. J. Inhibition of protein-protein interactions using designed molecules. Chemical Society Reviews. 38 (12), 3289-3300 (2009).
  5. Teresa, A. F. C., Alessio, C. Cyclic and macrocyclic peptides as chemical tools to recognise protein surfaces and probe protein-protein interactions. ChemMedChem. 11 (8), 787-794 (2016).
  6. Craik, D. J., Fairlie, D. P., Liras, S., Price, D. The future of peptide-based drugs. Chemical Biology & Drug Design. 81 (1), 136-147 (2013).
  7. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  8. Zhang, Q. Z., Tian, Y., Lao, Y. Z., Li, Z. G. Peptides-staple method development and its application in cancer therapy. Current Medicinal Chemistry. 21 (21), 2438-2452 (2014).
  9. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  10. Wang, D., Liao, W., Arora, P. S. Enhanced metabolic stability and protein-binding properties of artificial alpha helices derived from a hydrogen-bond surrogate: application to Bcl-xL. Angewandte Chemie International Edition. 44 (40), 6525-6529 (2005).
  11. Bullock, B. N., Jochim, A. L., Arora, P. S. Assessing helical protein interfaces for inhibitor design. Journal of the American Chemical Society. 133, 14220-14223 (2011).
  12. Jackson, D. Y., King, D. S., Chmielewski, J., Singh, S., Schultz, P. G. General approach to the synthesis of short α-helical peptides. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9391-9392 (1991).
  13. Timmerman, P., Beld, J., Puijk, W. C., Meloen, R. H. Rapid and quantitative cyclization of multiple peptide loops onto synthetic scaffolds for structural mimicry of protein surfaces. ChemBioChem. 6 (5), 821-824 (2005).
  14. Muppidi, A., Wang, Z., Li, X., Chen, J., Lin, Q. Achieving cell penetration with distance-matching cysteine cross-linkers: a facile route to cell-permeable peptide dual inhibitors of Mdm2/Mdmx. Chemical Communications. 47 (33), 9396-9398 (2011).
  15. Schafmeister, C. E., Po, J., Verdine, G. L. An all-hydrocarbon cross-linking system for enhancing the helicity and metabolic stability of peptides. Journal of the American Chemical Society. 122 (24), 5891-5892 (2000).
  16. Osapay, G., Taylor, J. W. Multicyclic polypeptide model compounds. 1. synthesis of a tricyclic amphiphilic alpha-helical peptide using an oxime resin, segment-condensation approach. Journal of the American Chemical Society. 112 (16), 6046-6051 (1990).
  17. Lau, Y. H., Andrade, dP., Wu, Y., Spring, D. R. Peptide stapling techniques based on different macrocyclisation chemistries. Chemical Society Reviews. 44 (1), 91-102 (2015).
  18. Spokoyny, A. M., Zou, Y., Ling, J. J., Yu, H., Lin, Y. S., Pentelute, B. L. A perfluoroaryl-cysteine S(N)Ar chemistry approach to unprotected peptide stapling. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 5946-5949 (2013).
  19. Lautrette, G., Touti, F., Lee, H. G., Dai, P., Pentelute, B. L. Nitrogen arylation for macrocyclization of unprotected peptides. Journal of the American Chemical Society. 138 (27), 8340-8343 (2016).
  20. Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photoinduced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
  21. Chang, Y. S., et al. Stapled α-helical peptide drug development: a potent dual inhibitor of MDM2 and MDMX for p53-dependent cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (36), 3445-3454 (2013).
  22. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  23. Leshchiner, E. S., et al. Direct inhibition of oncogenic KRAS by hydrocarbon-stapled SOS1 helices. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1761-1766 (2015).
  24. Wang, D., Qin, X., Zhao, H., Li, Z. N-cap helix nucleation: methods and their applications. Science China Chemistry. 60 (6), 689-700 (2017).
  25. Zorzi, A., Deyle, K., Heinis, C. Cyclic peptide therapeutics: past, present and future. Current Opinion in Chemical Biology. 38, 24-29 (2017).
  26. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  27. Lin, H., Jiang, Y., Zhang, Q., Hu, K., Li, Z. An in-tether sulfilimine chiral center induces helicity in short peptides. Chemical Communications. 52 (68), 10389-10391 (2016).
  28. Zhao, B., Zhang, Q., Li, Z. Constructing thioether-tethered cyclic peptides via on-resin intra-molecular thiol-ene reaction. Journal of Peptide Science. 22 (8), 540-544 (2016).
  29. Dondoni, A., Massi, A., Nanni, P., Roda, A. A new ligation strategy for peptide and protein glycosylation: photoinduced thiol-ene coupling. Chemistry. 15 (43), 11444-11449 (2009).
  30. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  31. Shi, X., Jiang, Y., Yang, D., Zhao, H., Tian, Y., Li, Z. Reversibly switching the conformation of short peptide through in-tether chiral sulfonium auxiliary. Chinese Chemical Letters. , In Press (2017).
  32. Jiang, Y., et al. Switching substitution groups on the in-tether chiral centre influences backbone peptides' permeability and target binding affinity. Organic & Biomolecular Chemistry. 15 (3), 541-544 (2017).
  33. Aimetti, A. A., Shoemaker, R. K., Lin, C. C., Anseth, K. S. On-resin peptide macrocyclization using thiol-ene click chemistry. Chemical Communications. 46 (23), 4061-4063 (2010).
  34. Wang, Y. X., Chou, D. H. C. A thiol-ene coupling approach to native peptide stapling and macrocyclization. Angewandte Chemie International Edition. 54 (37), 10931-10934 (2015).
  35. Wang, Y., et al. Application of thiol-yne/thiol-ene reactions for peptide and protein macrocyclizations. Chemistry. 23 (29), 7087-7092 (2017).
  36. Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
  37. Ozyurek, M., Baki, S., Gungor, N., Celik, S. E., Guclu, K., Apak, R. Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection. Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).
  38. Zhang, Q. Z., et al. Chiral sulfoxide-induced single turn peptide α-helicity. Scientific Reports. 6, 38573 (2016).
  39. Lin, H., et al. An in-tether sulfilimine chiral center induces beta-turn conformation in short peptides. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (42), 9993-9999 (2016).
  40. Hu, K., Li, W., Yu, M., Sun, C., Li, Z. Investigation of cellular uptakes of the in-tether chiral-center-induced helical pentapeptides. Bioconjugate Chemistry. 27 (12), 2824-2827 (2016).
  41. Hu, K., et al. A precisely positioned chiral center in an i, i + 7 tether modulates the helicity of the backbone peptide. Chemical Communications. 53 (50), 6728-6731 (2017).
  42. Li, J., et al. An in-tether chiral center modulates the proapoptotic activity of the KLA peptide. Chemical Communications. 53 (75), 10452-10455 (2017).
  43. Zhao, B., et al. A thioether-stabilized-D-proline-L-proline-induced β-hairpin peptide of defensin segment increases its anti-Candida albicans ability. ChemBioChem. 17 (15), 1416-1420 (2016).
  44. Tian, Y., Yang, D., Ye, X., Li, Z. Thioether-derived macrocycle for peptide secondary structure fixation. The Chemical Record. 17 (9), 874-885 (2017).
  45. Hu, K., Yin, F., Yu, M., Sun, C., Li, J., Liang, Y., Li, W., Xie, M., Lao, Y., Liang, W., Li, Z. G. In-tether chiral center induced helical peptide modulators target p53-MDM2/MDMX and inhibit tumor growth in stem-like cancer cell. Theranostics. 7 (18), 4566-4576 (2017).
  46. Tian, Y., Jiang, Y., Li, J., Wang, D., Zhao, H., Li, Z. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: a comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).

Tags

Kjemi problemet 138 deg selv Thio-ene/yne reaksjon foto-indusert cystein thioether stabilisering spiralformede peptider protein-protein interaksjoner
Opprette Thioether/Vinyl Sulfide-bundet spiralformede peptider Via Foto-indusert Thiol-ene/yne Hydrothiolation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shi, X., Liu, Y., Zhao, R., Li, Z.… More

Shi, X., Liu, Y., Zhao, R., Li, Z. Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation. J. Vis. Exp. (138), e57356, doi:10.3791/57356 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter