Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Assay מבוססי לזיהוי עיצוב רב טוב ללמוד את ההשפעה של מטריצה חוץ-תאית נוקשות על זיהום חיידקי של תאים חסיד

Published: July 5, 2018 doi: 10.3791/57361
Automatic Translation
1, 1, 2, 3
1Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine, 2Department of Mechanical and Aerospace Engineering, University of California San Diego, 3Departments of Biochemistry, Microbiology and Immunology and Howard Hughes Medical Institute, Stanford University School of Medicine

Summary

פיתחנו assay מבוססי לזיהוי של עיצוב רב טוב עבור בודק את ההשפעה של מטריצה חוץ-תאית נוקשות על זיהום חיידקי של תאים חסיד. Assay הזה הוא תואם cytometry זרימה immunostaining, מיקרוסקופ כוח המתיחה, המאפשרות מדידות כמותיים של אינטראקציות biomechanical בין תאים, מטריצה חוץ-תאית, לבין חיידקים פתוגניים.

Abstract

מטריצה חוץ-תאית נוקשות כוללת אחת של גירויים מרובים מכני הסביבה כי הם כידוע להשפיע על התנהגות הסלולר פונקציה, גורל באופן כללי. למרות התגובות של סוגי תאים חסיד ויותר מטריצת קשיחות מאפינים, כמה מחסידי הרגישות התאים לזיהום חיידקי תלוי מטריצת קשיחות אינו ידוע במידה רבה, כמו היא ההשפעה של זיהום חיידקי על ביומכניקה של התאים המארחים. אנו משערים כי הרגישות של תאי אנדותל מארח זיהום חיידקי תלוי הנוקשות של המטריקס שבו שוכנים תאים אלה, כי הזיהום של המחשב המארח תאים עם חיידקים ישתנה ביומכניקה שלהם. כדי לבדוק את ההשערות שני אלה, תאי אנדותל שימשו מודל hosts ו ליסטריה חיידק מודל. על ידי פיתוח וזמינותו של הרומן עיצוב רב טוב, אנו מראים כי להיות מוערך באופן כמותי ההשפעה של מטריקס נוקשות על זיהום של תאי אנדותל מאת ל' monocytogenes דרך cytometry זרימה, immunostaining ואחריו מיקרוסקופ. בנוסף, באמצעות מיקרוסקופ כוח המתיחה, ההשפעה של זיהום monocytogenes ל' על המארח תא אנדותל ביומכניקה יכול להילמד. השיטה המוצעת מאפשרת הניתוח של ההשפעה של מכניקה רקמות רלוונטיות על זיהום חיידקי של תאים חסיד, וזה צעד קריטי להבנת יחסי גומלין ביו-מכני תאים, שלהם מטריצה חוץ-תאית, ו חיידקים פתוגניים. שיטה זו ישימה גם מגוון רחב של סוגים אחרים של מחקרים על ביומכניקה תא והתגובה קשיחות המצע איפה זה חשוב להיות מסוגל לבצע משכפל רבים במקביל ניסוי.

Introduction

תאים ברקמות בעלי חיים ביותר הם בדרך כלל חסיד, הצמדת התאים הסמוכים וגם כדי שלהם מטריצה חוץ-תאית (ECM). המעגנה תאים ECM שלהם הוא קריטי עבור תהליכים תאיים רבים החל תנועתיות תא לתא1,התפשטות והישרדות2. Anchorage הסלולר ל ECM תלוי ECM הרכב והן נוקשות. התאים מגיבים לשינויים האחרונים על ידי באופן דינמי סידור מחדש שלהם שלד התא, התא-ECM ו תא-cell הדבקויות, אשר בתורו אנושות לשנות תא ביומכניקה ופונקציות3,4,5,6 . ECM נוקשות יכול להשתנות בחלל (קרי, מיקום אנטומי), זמן (כלומר, הזדקנות), וכן התהליכים הקשורים pathophysiological (למשל, טרשת עורקים, סרטן, זיהומים, וכו '). למשל, מקובל כי אנדותל תאים המתגוררים על נוקשה-לעומת רך-מטריצות להפעיל כוחות מוגברת שלהם ECM, אחד את השני ולגלות מוגברת תנועתיות והתפשטות7,8. באופן דומה, fibroblasts המתגוררים על מטריצות נוקשה להקנות את כוחות כויץ גבוהה שלהם ECM ולהראות התפשטות מוגברת, תנועתיות ו- ECM ייצור9,10,11. למרות תא מכניקה והתגובה ECM נוקשות נחקרו בהרחבה עבור סוגי תאים שונים, הקשר בין התאים המארחים חסיד, הנוקשות של שלהם ECM, זיהומים חיידקיים הוא עדיין אינו מודע לקיומם.

ללמוד את התפקיד של נוקשות ECM באינטראקציות תא חיידקים-מארח, ל' monocytogenes (Lm) נבחר את הפתוגן מודל. Lm הוא חיידק נפוץ המועבר במזון שיכולים לגרום זיהום סיסטמי במגוון רחב של מחשבים מארחים יונקים. זה פתוגן תאיים עיצוב גבות ניתן להעביר האפיתל במעי לאיברים מרוחקים באמצעות חציית סוגים שונים של כלי הדם endothelia. אם זה מפרה את מחסום דם - מוח, Lm עלולה לגרום לדלקת קרום המוח, כאשר יחצה את השליה, זה יכול לגרום הפלה ספונטנית12,13. Lm יכול להדביק מארח שונים סוגי תאים, באפשרותך לעשות זאת באמצעות אסטרטגיות פתוגניים ברורים. Lm זיהום נחקרה בעיקר בהקשר של תאי אפיתל, בעוד הרבה פחות ידוע על איך יכול להדביק Lm ו מעקף התאים אנדותל המצפים לומן של כלי הדם14,15,16. יתר על כן, לא ידוע עדיין במידה רבה איך הנוקשות של ECM שבו שוכנות תאי אנדותל מודולציה היכולת של Lm לפלוש אלה בתאי המארח להתפשט. באימות Lm ומספר נוסף מינים חיידקי (קרי, parkeri ריקטסיה) לנצל שלד התא אקטין של המחשב המארח תאים הם הדביקו לשניהם לפלוש לתוך הציטופלסמה שלהם וכדי להקל על הפצת לתא17 , 18 , 19. הם להשיג את זה דרך הביטוי של חלבונים המאפשרים להם להתערב עם מסלולים פלמור אקטין מארח וליצור זנבות כוכב השביט אקטין המאפשרים16,שלהם הנעה קדימה20. בעקבות זיהום, שלד התא אקטין של התא המארח צריך לארגן מחדש באופן דינמי באופן מתאפיין עדיין לא לגמרי, פוטנציאל להשפיע על ביומכניקה של התאים מארח כולל את הכוחות הפיזיקליים שהם מפעילים על ECM שלהם ועל כל אחרים. לבחון תהליכים אלה, תאי אנדותל microvascular אדם (HMEC-1) נבחרו כתאי מארח מודל שלוש סיבות: 1. תאי אנדותל ידועים להיות מאוד mechanosensitive כפי שהם נחשפים כל הזמן משתנה סימנים פיזיים21; 2. אסטרטגיות ש-lm מעסיקה להדביק תאי אנדותל הם עדיין אינו מודע לקיומם22; ו- 3. HMEC-1 הם קו תא מונצחים, יכול, לפיכך, להיות בקלות תרבותי ונחשפו לבצע מניפולציות גנטיות.

זיהום חיידקי של התאים המארחים בעיקר למד כבר במבחנה על-ידי זריעת תאי זכוכית או מצעים פוליסטירן הנמצאים באופן משמעותי נוקשה מאשר ה-ECM פיזיולוגיים של רוב התאים12,14,23. כדי לבחון את הזיהום של תאים נזרע על מטריצה נוקשות אשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית וכדי להבהיר את התפקיד של ECM נוקשות על הזיהום של תאים על ידי פתוגנים חיידקיים, עקבנו אחר גישה חדשנית המבוססת על בדיית דק hydrogels microbead-מוטבע לזיהוי של נוקשות tunable על רב טוב צלחות. החידוש של הגישה המוצעת טמון בכך שהיא מאפשרת ניטור תנאים מרובים בו זמנית עקב תבנית רב טוב שלה, כי הוא תואם עם טכניקות מרובות בשל אופן מסוים שסובסטרטים בנויות. HMEC-1 התאים היו נזרע על אלה hydrogels מצופים חלבון, אז נגוע זנים Lm להפוך פלורסנט על הפנמה או הם צורונים פלורסנט. תפקידו של ה-ECM נוקשות על זיהום הרגישות של התאים HMEC-1 המארחים הוערך על ידי cytometry זרימה. בנוסף, מיקרוסקופ immunostaining, קרינה פלואורסצנטית שימשו כדי להבדיל בין חיידקים למביטה והקפדה. לבסוף, מיקרוסקופ כוח המתיחה (TFM) בוצעה בהצלחה כדי לאפיין את ההשפעה של Lm חדירתו הלחצים המתיחה זה תאי אנדותל מארח להפעיל על מטריצות שלהם במהלך זיהום. וזמינותו שהוצגו ניתן לשנות בקלות כדי לאפשר יותר מחקרים על ההשפעה של ECM נוקשות על זיהום הרגישות של תאים חסיד באמצעות שורות תאים שונים או פתוגנים.

Protocol

1. ייצור Hydrogels לזיהוי דו שכבתי דק (PA) על רב טוב צלחות

  1. להמיס קירור (APS) מים מזוקקים הנדסה גנטית כדי להשיג ריכוז סופי של 10 גרם/mL. Aliquot, חנות הפתרון ב 4 ° C לשימוש לטווח קצר (3 שבועות).
    הערה: הפתרון שלעיל ניתן להכין מראש הידרוג פבריקציה נוספת.
  2. זכוכית ההפעלה של מנות 24-ובכן
    1. תקופת דגירה לוחות זכוכית 24-ובכן עם 13 מ מ קוטר וולס (ראה טבלה של חומרים) של h 1 עם µL 500 של NaOH M 2 לכל טוב בטמפרטורת החדר.
    2. לשטוף את הבארות 1 x עם הנדסה גנטית מים ולאחר מכן להוסיף 500 µL של 2% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (ראה טבלה של חומרים) אתנול 95% לכל אחד טוב במשך 5 דקות.
    3. לשטוף את הבארות 1 x שוב עם מים ולהוסיף 500 µL של 0.5% גלוטראלדהיד מכל קידוח עבור 30 דקות לשטוף את הבארות 1 x עם מים, לייבש אותם ב 60 הלעפה תרוטרפמט עם המכסה.

Figure 1
איור 1 : זיהום חיידקי וזמינותו של התאים המארחים המתגוררים על hydrogels דק דו שכבתי פלורסנט חרוז-מוטבע לזיהוי (PA) של נוקשות בדרגות שונות. א coverslips זכוכית דקה עוברות שינוי כימי כדי לאפשר הידרוג המצורף. B. µL 3.6 של הרשות הפלסטינית תערובות מופקדים על תחתית זכוכית. ג. התערובת מכוסה coverslip זכוכית עגול 12 מ מ כדי לאפשר הפילמור. D. coverslip מוסר עם מזרק המחט. E-µL 2.4 של פתרון הרשות הפלסטינית עם גרגרי הוסיף על גבי השכבה התחתונה, כתרים עם coverslip זכוכית עגול. F. מאגר נוסף בתוך הבאר, coverslip מוסר. G. הקרנת UV עבור 1 h מבטיח עיקור. H. Sulfo SANPAH-המכילים פתרון נוסף על ג'לים, אשר ממוקמות מכן מתחת UV עבור 10 דקות אני. Hydrogels עם מאגר שטופים ואז מתפשט בין לילה עם קולגן אני J. הידרוג הוא equilibrated עם תא מדיה. K. התאים מארח הם נזרע. ל' Lm חיידקים נוספים לפתרון, הזיהום מסונכרן באמצעות צנטריפוגה. ז. 1 h חיידקים לאחר הפגיעה בפתרון נשטפו, הוספת מדיה בתוספת אנטיביוטיקה. N. ב- 4 שעות לאחר הפגיעה, Lm (JAT985) מתחיל ואזוריט. O. HMEC-1 תאים ינותקו מעמוד מטריקס שלהם ואת הפתרונות של העברת צינורות כדי לבצע מדידות cytometry זרימה. שימו לב בימים ובשעות המשוער עבור כל שלב של וזמינותו מסומנות גם. איור זה השתנה מ Bastounis ו- Theriot59. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. ייצור הידרוג לזיהוי
    הערה: ראה איור 1.
    1. להכין פתרונות מימית המכילים 3-10% של 40% מניות אקרילאמיד פתרון (ראה טבלה של חומרים) ו 0.06 - 0.6% 2% במניה bis-אקרילאמיד פתרון (ראה טבלה של חומרים) כדי לייצר hydrogels של נוקשות tunable החל 0.6 kPa ל 70 kPa. ראה טבלה 1.
      1. עבור 0.6 kPa hydrogels, מערבבים אקרילאמיד 3% עם 0.045% bis-אקרילאמיד. עבור 3 kPa hydrogels, מערבבים אקרילאמיד 5% עם 0.074% bis-אקרילאמיד. עבור 10 kPa hydrogels, מערבבים אקרילאמיד 10% עם 0.075% bis-אקרילאמיד. עבור 20 kPa hydrogels, מערבבים אקרילאמיד 8% עם 0.195% bis-אקרילאמיד. עבור 70 kPa hydrogels, מערבבים אקרילאמיד 10% עם 0.45% bis-אקרילאמיד.
        הערה: פרטים נוספים על השגת הקשיחות הידרוג הרשות הפלסטינית רצוי ניתן למצוא במקום אחר24,25,26,27.
    2. להכין שני פתרונות מימית כל נוקשות הידרוג רצוי. להכין פתרון 1 להיות ללא חרוז פתרון 2 להכיל 0.03% 0.1-מיקרומטר קוטר ניאון מיקרו-חרוזים (ראה טבלה של חומרים).
    3. דגה פתרונות 1 ו- 2 על ידי ואקום למשך 15 דקות כדי לחסל את החמצן הידוע לעכב פלמור של הפתרונות.
    4. להוסיף פתרון 1 כדי לאפשר חניכה פלמור של 0.6% של 10 גרם/mL במלאי פתרון APS, 0.43% tetramethylethylenediamine (TEMED). לפעול מהר.
    5. להוסיף µL 3.6 של פתרון 1 למרכז של כל טוב של המנה 24-טוב (ראה צעד 1.2 עבור הכנתה).
    6. מיד לכסות את הבארות עם 12-מ מ לא מטופל coverslips מעגלית ולתת פתרון 1 לשבת 20 דקות כך זה באופן מלא polymerizes.
    7. טפח בעדינות מחט מזרק על משטח כדי ליצור קרס קטנה בקצהו כדי להקל על הסרת coverslips. הרם את coverslips באמצעות מחט מזרק.
    8. להוסיף 0.6% של הפתרון APS מניות 10 g/mL ו- 0.43% TEMED פתרון 2. רשת אלחוטית 2.4 µL של התערובת על גבי השכבה הראשונה בכל טוב של המנה 24-. טוב.
    9. לכסות 2 פתרון עם coverslips זכוכית עגול 12-מ מ דקה, בעדינות לחיצה כלפי מטה בעזרת זוג מלקחיים כדי להבטיח עובי השכבה השנייה היא מזערית. תן פתרון 2 פולימריזציה כעשרים דקות.
    10. להוסיף 500 µL של 50 מ מ HEPES pH 7.5 לכל אחד מן הבארות ולהסיר את coverslips זכוכית דקה עם מחט מזרק, מלקחיים.
  2. עיקור, ציפוי קולגן ו equilibration של hydrogels לזיהוי
    1. UV-וחושפים hydrogels עבור h 1 בשכונה תרביות רקמה כדי לאפשר עיקור.
    2. להכין תערובת של 0.5% משקל/נפח sulfosuccinimidyl 6-(4 ′-azido-2 ′-nitrophenylamino) hexanoate (Sulfo-SANPAH, ראה טבלה של חומרים) ב 1% דימתיל סולפוקסיד ו-50 מ"מ HEPES pH = 7.5.
    3. להוסיף 200 µL של פתרון זה על פני השטח העליון של hydrogels. משחק מהיר, חושפים אותם בפני UV (302 ננומטר) למשך 10 דקות להפעיל אותם.
    4. לשטוף את hydrogels פעמיים עם 1 מ"ל של 50 מ מ HEPES pH = 7.5. אני חוזר במידת הצורך להבטיח כי כל crosslinker עודף מוסר.
    5. חלבון-hydrogels עם µL 200 של 0.25 מ"ג/מ"ל עכברוש זנב קולגן אני (ראה טבלה של חומרים) ב- 50 מ מ של HEPES. דגירה של hydrogels, עם הפתרון קולגן עליון, ללילה בטמפרטורת החדר.
      הערה: כדי למנוע התייבשות/אידוי, למקם את הלוחות רב טוב בלימה משני ולהוסיף מעבדה ניקוי רקמות ספוגה במים בפריפריה הפנימי של הבלימה.
    6. להשתמש epifluorescence או מיקרוסקופ קונפוקלי עם יעד X 40 למדידת עובי hydrogels. לעשות זאת על ידי איתור עמדות z התחתון (כאשר הוא משטח זכוכית), מובילים רבדי הידרוג (כאשר בעוצמה החרוזים פלורסנט הוא המרבי). ואז לחסר את העמדות z כדי לקבוע את הגובה.
      הערה: השתמשנו במיקרוסקופ epifluorescence הפוכה, מטרה X 40 עם מפתח נומרי 0.65 למדידת עובי hydrogels. ניתן גם לבצע מדידות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) בשלב זה כדי לאשר את הנוקשות המדויק של hydrogels (ראה איור 2).
    7. לפני זריעה התאים של ריבית על hydrogels, להוסיף 1 מ"ל של המדיה על hydrogels, דגירה אותם ב 37 הלעפה תרוטרפמט למשך 30 דקות כדי 1 h כדי להבטיח equilibration.
      הערה: הוספנו MCDB-131 לסיקור כי זה התקשורת שבו התאים מארח מודל (HMEC-1) היו תרבותי (ראה צעד 2.1 לפרטים).

Figure 2
איור 2: AFM מדידות של הרשות הפלסטינית הידרוג נוקשות והפצה של חרוזים. א. הנתונים מראים הצפוי האלסטיות (מידת קשיחות) של הרשות הפלסטינית hydrogels, בהתחשב בכמות של אקרילאמיד bis-אקרילאמיד בשימוש לעומת האלסטיות נמדד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (N = 5-6). אופקיות מתארים את הממוצע. לא ניתן למדוד את הנוקשות של hydrogels kPa 0.6 כי hydrogels היו מאוד רך, מודבקת לקצה AFM. B. זוהי תמונת שלב של תאים HMEC-1 confluent ומוטבעים התמונה המתאימה של החרוזים על פני מעייניו הידרוג רכה 3 kPa-PA. ה-HMEC-1 היו נזרע במשך 24 שעות ביממה-ריכוז של 4 x 105 תאים לכל טוב. ג. הדמות הזאת היא אותו הדבר כמו באיור 2B אבל התאים השוכנים במחשב הידרוג הרשות הפלסטינית 70 נוקשה-kPa. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

2. האדם Microvascular תא אנדותל תרבות, זריעה על Hydrogels

  1. תרבות HMEC-1 (אנושי, microvascular אנדותל) בתאים MCDB-131 מלא המדיה המכילה MCDB-131 מדיה בתוספת 10% סרום שור עוברית, 10 ננוגרם למ"ל של גורם הגדילה באפידרמיס, 1 µg/mL של הידרוקורטיזון, ו- 2 מ מ של L-גלוטמין (ראה טבלה של חומרים ).
  2. לפצל את התרבויות confluent 1:6 כל 3-4 ימים ולשמור את התאים עד מעבר 40.
  3. יום אחד לפני הניסוי, לנתק את התאים שלהם כלי התרבות באמצעות 0.25% טריפסין/EDTA. קודם לשטוף את התאים שלהם כלי תרבות 1 x עם פוספט סטרילי buffered תמיסת מלח (PBS), ולאחר מכן להוסיף את הכמות המתאימה של 0.25% טריפסין/EDTA (2 מ"ל לכל מנה 100-מ מ או 75 ס מ מבחנה 1 מ"ל לכל מאכל 60 מ מ או הבקבוק 25 ס מ), המקננת את הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות כדי לאפשר התנתקות של תאים מן המצע שלהם.
  4. לנטרל את טריפסין על-ידי הוספת האחסון הרצוי של מדיה מלא MCDB-131, pipet בעדינות כדי לפרק את גושים של תאים, ולאחר מכן מקם את הפתרון לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט.
  5. בעדינות מערבולת הפתרון של תאים כדי להבטיח כי התאים מופצים בצורה שווה, אז תוציא µL 20 של הפתרון, למלא בעדינות את שני תאים מתחת coverslip של hemocytometer זכוכית.
  6. גלולה למטה הפתרון של תאים הכלול הצינור צנטריפוגה חרוט באמצעות צנטריפוגה 10 דקות ב 500 x g.
  7. במהלך תקופת ההמתנה 10 דקות, לספור את התאים באמצעות hemocytometer. שימוש במיקרוסקופ, להתמקד קווי הרשת של hemocytometer עם יעד X 10 ולאחר מכן השתמש מונה טלי יד כדי לספור את מספר התאים אחד 1 מ"מ x 1 מ"מ מרובע.
  8. להעביר את hemocytometer עוד ריבוע 1 מ"מ x 1 מ"מ, לספור את התאים שם, לחזור על התהליך פעמיים נוספות. חישוב ממוצע המדידות ארבע, ואז להכפיל את הממוצע 104. הערך הסופי הוא המספר של קיימא תאים למ"ל ההשעיה תא זה הוא להיות centrifuged.
  9. הסר את הנוזלים הצינור צנטריפוגה חרוט תוך הקפדה כי בגדר תא לא מופרת. Resuspend התאים בתקשורת מלאה MCDB-131-ריכוז של 4 x 105 תאים/מ ל....
  10. הזרע התאים ההשעיה-hydrogels על ידי קודם הסרת המדיה שבה hydrogels היו מתפשט, ולאחר מכן הוספת 1 מ"ל של התא השעיה על כל הידרוג.

3. זיהום של תאי אנדותל Microvascular אדם עם ל' monocytogenes

  1. הכנה מראש
    הערה: להכין מראש את הפתרונות הבאים.
    1. סטרפטומיצין, כלורמפניקול, גנטמיצין מניות
      1. הכן 50 מ"ג/מ"ל של סטרפטומיצין פתרונות מניות על ידי שקילה 0.5 גר' סטרפטומיצין סולפט, המסת זה לחלוטין לתוך 10 מ"ל מים הנדסה גנטית.
      2. הכן 7.5 מ"ג/מ"ל כלוראמפניקול פתרונות מניות על ידי שקילה 75 מ ג כלורמפניקול, המסת זה לחלוטין לתוך 10 מ"ל אתנול 100%.
      3. להכין 20 מ"ג/מ"ל של גנטמיצין מלאי פתרונות שקילה 0.2 גר' גנטמיצין סולפט, המסת זה לחלוטין לתוך 10 מ"ל מים הנדסה גנטית.
      4. מסנן-לעקר כל הפתרונות מניות עם מסנן מזרק 0.2-מיקרומטר ואחסן אותם ב-20 ° C לשימוש ארוך טווח (1-2 חודשים).
    2. המוח הלב אינפוזיה (BHI) פלטות אגר ומדיה
      1. אתר שתי המבחנות 1-L ולאחר להוסיף פס מגנטי מערבבים פנימה את הבקבוק כל.
      2. למדיה BHI, מוסיפים 37 גרם אבקת BHI בקבוק אחד, להוסיף מים הנדסה גנטית עד 1 ל' לערבב את הפתרון נמרצות על ידי הצבת את הבקבוק על צלחת מגנטית מערבבים עד האבקה היא התפרקה.
      3. עבור לוחות אגר BHI, להוסיף 37 גרם של אבקת BHI, 15 גר' אגר מגורען (ראה טבלה של חומרים) ב. הבקבוק השני להוסיף מים הנדסה גנטית 1 ל' מיקס הפתרון נמרצות על ידי הצבת את הבקבוק על צלחת מגנטית מערבבים עד האבקה היא התפרקה.
      4. לדפוק את המכסים של המבחנות לא חזק מדי ולא אוטוקלב הפתרונות בעזרת הנוזל הגדרה או לפי המפרט של החיטוי.
      5. הסר את הפתרון של החיטוי, ואז לקרר את הפתרון אגר-BHI 55 מעלות צלזיוס. אם המדיה BHI הבקבוקון 1 ליטר נשמרת סטרילית, ניתן להשתמש עבור עד חודש.
      6. כדי להכין החיידקים פלטות אגר-BHI, תחילה להוסיף אנטיביוטיקה, אם מתאים, הבקבוקון המכילה BHI, אגר (בהתאם זני חיידקים גדל). בקצרה לשים את הבקבוק על צלחת מגנטית מערבבים כדי לאפשר ערבוב מהיר.
        הערה: האנטיביוטיקה המשמש כאן ספיציפית זנים Lm בשימוש, אך הצורך אנטיביוטיקה יכולה לשמש BHI-אגר צלחות. הוספנו סטרפטומיצין ריכוז של µg/mL 200 ו כלורמפניקול כדי ריכוז של 7.5 µg/mL-מכיוון 10403S Lm זנים עמידים בפני סטרפטומיצין. זנים אלו היו מצומדת עם פלסמיד המכיל כלורמפניקול acetyltransferase קריאה פתוחה המסגרת, ומכאן ההתנגדות כלורמפניקול.
      7. שופכים את התערובת לתוך החיידקים פוליסטירן ס מ-10 תרבות צלחות (כ 20 מ"ל לכל צלחת). כדי להיפטר בועות, להבה המשטח העליון של הלוחות בקצרה. צלחות מגניב ללילה בטמפרטורת החדר.
      8. למחרת, לאטום את הצלחות יבש ואחסן אותם ב 4 º C.
  2. זיהום של תאי אנדותל microvascular אדם עם ל' monocytogenes
    1. שלושה ימים לפני הזיהום, פס החוצה Lm להתאמץ כדי לשמש של מניה גליצרול (מאוחסן ב- 80 ° C) על צלחת אגר-BHI שמכיל 7.5 µg/mL כלוראמפניקול, 200 µg/mL של סטרפטומיצין, במידת הצורך.
      הערה: המתח כדי להיות רץ בעירום החוצה יכול להיות פראי-סוג או מוטציה, צורונים לבטא קרינה פלואורסצנטית (עבור immunostaining ש-jat1045 שימש) ולהבעת פלורסצנטיות תחת האמרגן ActA (עבור לזרום cytometry או המתיחה מיקרוסקופ כוח JAT983 או JAT985 שימשו)22.
    2. דגירה צלחות ב 37 ° C עד מושבות דיסקרטית נוצרות (ימים 1-2).
    3. יום לפני הזיהום, לגדול המתח הרצוי בין לילה, מנענע ב 150 סל ד ב 30 ° C בתקשורת BHI עם 7.5 µg/mL כלוראמפניקול (במידת הצורך).
      1. מקום 5 מ"ל של התקשורת BHI שפופרת צנטרפוגה חרוט 15-mL, להוסיף 7.5 µg/mL כלוראמפניקול (במידת הצורך), ואז לחסן מושבה בודדת מהצלחת אגר באמצעות טיפ µL 10 סטרילי.
    4. למחרת היום, בדיוק לפני זיהום, למדוד את הצפיפות האופטית של הפתרון חיידקים על 600 nm (OD600) על ידי דילול דוגמה 1:5; השתמש cuvette המכיל BHI לבד כדי לשמש מקום ריק.
    5. לדלל את תרבות לילה OD600 של 0.1, דגירה, רועד עבור 2 h ב- 30 מעלות צלזיוס, BHI בתקשורת עם 7.5 µg/mL כלוראמפניקול (במידת הצורך) כדי לאפשר לחיידקים להגיע יומן-שלב הצמיחה.
    6. למדוד את OD600 של הפתרון חיידקי, אשר צפוי להיות בסביבות 0.2 - 0.3. אם OD600 גבוהה, למהול אותו כדי 0.2 - 0.3 עם BHI לבד.
    7. קח 1 מ"ל של פתרון חיידקיים לתוך צינור microcentrifuge. . תסובב את זה למטה במשך 4 דקות ב g 2,000 x באמצעות צנטריפוגה בטמפרטורת החדר הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר חיידקי ב 1 מ"ל של PBS תרביות רקמה-כיתה, בשכונה תרביות רקמה. לשטוף את החיידקים עוד פעמיים על ידי מסובב אותם למטה במשך 4 דקות ב g x 2,000 בטמפרטורת החדר. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend החיידק ב 1 מ"ל ל- PBS.
    8. להכין את תערובת זיהום על ידי ערבוב µL 10 או 50 של החיידק resuspended ב- PBS עם 1 מ"ל של MCDB-131 מדיה מלאה עבור ריבוי של זיהום (MOI; כלומר, מספר חיידקים לכל התא המארח) של-50 חיידקים לכל התא המארח או חיידקים 10 לכל התא המארח.
    9. הסר את המדיה הבארות של הצלחות 24-ובכן, כדי לשבש את hydrogels או את התאים. לשטוף את התאים 1 x 1 מ של MCDB-131 מלא מדיה ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של החיידקים מכל קידוח.
    10. להמשיך לערבב כמה זיהום (לפחות 100 µL) מצפני MOI (ראה שלב 3.3).
    11. כיסוי לצלחת עם המכסה ועוטפים את הצלחות באריזת מזון פוליאטילן כדי למנוע דליפה. מקם את הצלחות בצנטריפוגה ולסובב את הדגימות 10 דקות ב- 200 גרם x כדי לסנכרן את הפלישה. להעביר את הצלחות לתוך החממה תרביות רקמה, דגירה אותם למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
    12. לשטוף את הדגימות 4 x עם MCDB-131 מלא מדיה, להעביר אותם לתוך החממה תרביות רקמה. לאחר 30 דקות נוספות, החלף את המדיה מדיה בתוספת 20 µg/mL של גנטמיצין.
  3. הנחישות של הריבוי של זיהום (MOI)
    1. במהלך הדגירה 30-מין הראשונית של התאים מארח עם החיידקים, להכין 10-fold דילולים טורי של המיקס זיהום כדי לקבוע למשרד הפנים. הפוך דילולים 10-fold על ידי ערבוב µL 100 של המיקס זיהום עם µL 900 ל- PBS 1 x (דילול 10-1 ). לאחר מכן, מערבבים 100 µL של דילול 10-1 עם µL 900 ל- PBS (דילול 10-2 ).
    2. המשך עד 10-5 לדילול מתקבל.
      הערה: כל הפתרונות צריכים להיות מעורב לפני דילול אותם, טיפים פיפטה נקי טרי אמור לשמש בכל שלב.
    3. ברגע דילולים נעשים, במקום 100 µL של 10-2 - 10 דילולים-5 על המרכז הלוחיות BHI/אגר/כלורמפניקול/סטרפטומיצין (במידת הצורך).
    4. לבצע מפזר מ פיפטה מזכוכית באמצעות אש לכופף את פיפטה ליצירת קרס. טובלים את פיפטה אתנול 100% עבור עיקור, ואז לשרוף האתנול עם להבה.
    5. ברגע מפזר יש מקורר, מורחים את דילולים חיידקי homogeneously על לוחות החל מ- 10-5 הדילול ועובר לגור תערובות מרוכז יותר. דגירה הלוחות הפוך ב 37 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
    6. בהתאם צפיפות המושבה, לקבוע את מספר מושבות או את 10-3 , 10-4 10-4 , או 10 צלחות דילול-5 . לחשב למשרד הפנים כדלקמן:
      מספר מושבות × דילול גורם ÷ נפח הראשונית הוסיף = מספר CFU לכל µL
      מספר CFU לכל אמצעי אחסון × µL של תערובת חיידקים לכל טוב = מספר CFU לאדם טוב
      מספר CFU לכל טוב × אמצעי אחסון של תאים לכל טוב = מספר חיידקים בכל תא
      הערה: CFU עומד על המושבה יוצרי יחידות.
    7. ממוצע MOIs מ שתי צלחות כדי להשיג את MOIs הסופי.

4. לזרום Cytometry לכמת נוקשות מטריצה חוץ-תאית הרגישות התלויים של התאים המארחים לזיהום

  1. שוקל 5 מ"ג של collagenase ומניחים אותו בתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 15-mL. להוסיף 10 מ של 0.25% טריפסין-EDTA ומערבבים אותם היטב.
  2. 8 שעות לאחר הפגיעה, מסיר את המדיה מן הבארות של צלחת 24-ובכן ולשטוף הבארות 1 x עם תרביות רקמה PBS. הסר את PBS הבארות ולהוסיף 200 µL של המיקס טריפסין-EDTA/collagenase כל טוב. מקום זה החממה תרביות רקמה 10 דקות לאפשר ניתוק מלא של התאים.
  3. השתמש פיפטה טריים כל טוב, pipet המיקס לאורך 8 x. להיות עדין כדי לא לפגוע בתאים. להוסיף 200 µL של התקשורת מלאה בכל טוב כדי לנטרל את טריפסין.
  4. העברת הפתרון תא 400-µL של מכל קידוח לתוך צינור פוליסטירן 5-mL עם כובע מסננת תא 35-מיקרומטר (ראה טבלה של חומרים).
  5. לנתח 10,000-20,000 תאים עבור דגימה על-ידי cytometry זרימה. לבצע רכישת נתונים דרך cytometry זרימה, לקבוע את אחוזי תאים נגועים לכל טוב באמצעות תוכנה הזמינים בשוק הרלוונטי. שימוש הפיזור קדימה לעומת הצד פיזור מתווה לשער את עיקר חלוקת התא סופרת.
    הערה: זה להבטיח ניתוח של תאים בודדים, לסלק פסולת או תא doublets או שלישיות.
    1. למדוד את האות פלורסצנטיות מתאי uninfected-שליטה, שער אוכלוסיית תאים נגועים למעט autofluorescence.

5. Immunostaining של חיידקים חוץ-תאית, מיקרוסקופ, עיבוד תמונה

הערה: גישה זו מלווה כדי להבדיל בין ECM-נוקשות אדהזיה חיידקי התלויים על גבי המשטח התא המארח נגד חיידקי הפנמה (הפלישה) בתוך המחשבים המארחים.

Figure 4
איור 4 : Immunostaining של Lm נגועה HMEC-1 תאים המתגוררים על hydrogels של נוקשות משתנות כדי להבדיל אדהזיה חיידקי נגד הפלישה. תמונות אלה להראות דוגמה ייצוגית דיפרנציאלי immunostaining מציג A. תא גרעינים (דאפי), B. כל החיידקים (GFP), ו- C. החיידקים מבחוץ (אלקסה-546). התאים HMEC-1 היו השוכנים במחשב הידרוג 3-kPa רך. החצים הצבע על חיידקים כי כבר הפנימו, כך מוצגים בלבד לערוץ הצבע הירוק. הנתונים ב- D-F מתייחסים N = 20 תמונות שנלכדו עבור התאים HMEC-1 נגוע המתגוררים על 3 רך-kPa ו 70 נוקשה-kPa hydrogelsלהראות D. החיידק הכולל לכל הגרעינים; E. החיידק למביטה לכל הגרעינים; ו F. היעילות הפלישה (היחס בין חיידקים למביטה הכולל חיידקים). אופקיות מתארים ממוצע של הנתונים. P-ערך מחושב עם הבדיקה Wilcoxon דרגה סכום שאינו פרמטרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. 30 דקות לאחר הפגיעה, תשטוף התאים HMEC-1 נגוע JAT1045 (Lm המבטאת צורונים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)) x 4 עם המדיה.
  2. לאחר לשטוף את הרביעי, לערבב את µL 1 של 1 מ"ג/מ"ל Hoechst לצבוע עם 1 מ"ל של מדיה מלא MCDB-131, להוסיף את כל טוב כתם גרעינים התאים. מקם את התאים בחממה תרביות רקמה למשך 10 דקות.
  3. לשטוף את התאים 1 x עם PBS. לתקן אותם מקבע permeabilizing עבור immunostaining דיפרנציאלי עבור 20 דקות-בטמפרטורת החדר28.
    הערה: מקבע מכיל 0.32 M סוכרוז, 10 מ מ MES pH 6.1, 138 מ"מ אשלגן כלורי, 3 מ מ MgCl2, 2 מ מ EGTA, ו- 4% פורמלדהיד (מיקרוסקופ אלקטרונים כיתה).
  4. לשטוף את התאים 1 x עם PBS. לחסום את הדגימות למשך 30 דקות עם אלבומין שור 5% (ראה טבלה של חומרים) ב- PBS.
  5. דגירה בדגימות לשעה אנטי-קשה להביןנוגדן ראשוני (ראה טבלה של חומרים) מדולל בטחונות ב- PBS המכיל 2% BSA.
  6. לשטוף את הדגימות ב- PBS 3 x ואז דגירה אותם עבור h 1 עם AlexaFluor-546 נוגדנים משניים עז-נגד-ראביט (ראה טבלה של חומרים) מדולל 1:250 ב- PBS המכיל 2% BSA. לשטוף את הדגימות 3 x ב- PBS. אחסן את הדגימות 1 מ"ל של PBS עבור הדמיה.
  7. תמונה ולנתח תאים למעלה מאלף לכל תנאי.
    1. עבור הדמיה, להשתמש במיקרוסקופ epifluorescence הפוכה עם מצלמת CCD (ראה טבלה של חומרים) בן 40 X אוויר תוכנית פלואוריט אוויר המטרה עם מפתח נומרי 0.6 (NA).
      הערה: הכוח נקבע על 25% ויש זמן חשיפה 100 גב המסננים מיקרוסקופ המשמש mCherry 470/525 nm, nm GFP 530/645, ולכל nm דאפי 395/460, עירור, פליטה בהתאמה. המיקרוסקופ השתמשנו היה בשליטת של קוד פתוח מיקרוסקופ תוכנה חבילת29.
    2. עבור immunostaining דיפרנציאלית, לספור כל החיידקים 'ירוק' המשויכים תאים בודדים כמו חסיד. לספור חיידקים כי הן 'ירוק' 'אדום' (בגלל קשירה נוגדנים) כמו שאינם הפנימו.
      הערה: זיהינו מספר גרעינים על-ידי הפעלת קובץ script בהזמנה אישית, התוכנה CellC (ראה טבלה של חומרים) עבור ספירה של חיידקים30.

6. מיקרוסקופ כוח המתיחה רב טוב, מיקרוסקופיה מתח חד שכבתי

Figure 5
איור 5: תאים הנגועים Lm HMEC-1 להקטין את סדר הגודל של הכוחות המתיחה הם מפעילים על ECM שלהם במהלך זיהום. פאנל A מראה את התמונה שלב, B מראה השדה דפורמציה, ג מראה המתיחה מתח שדה, ומראה D בתחום המתח תאיים של התאים HMEC-1 נגוע השוכנים במחשב הידרוג 20-kPa. סרגלי הצבע של דפורמציה מפות (מיקרומטר), של המתיחה מתח (Pa), ומפות של המתח תאיים מפות (nNµm-1) מוצגים על החלק העליון של מפות חום. העמודות להראות בשלוש נקודות זמן נציג: 3, 8, 18 שעות לאחר הפגיעה. E-H. אותו הדבר כמו לוחות A-D , אבל עבור תאים נגועים Lm-MOI 300. התמונות של החיידק (ערוץ אדום) הם יונחו על הדימויים שלב של התאים. הקלטות TFM נוהלו על ידי הדמיה בארות מרובים בו-זמנית. גודל החלון עבור PIV היה 32 פיקסלים עם חפיפה בין 16. סרגל קנה מידה הוא 32 מיקרומטר. איור זה השתנה מ Bastounis ו- Theriot59. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. להכין את hydrogels הרשות הפלסטינית על צלחת 24-טוב (ראו שלב 1). זרעי HMEC-1 תאים (ראה שלב 2), להדביק אותם עם JAT983 כפי שתואר לעיל (ראה שלב 3).
  2. הכן מדיום מיקרוסקופיה-לחיות על ידי שכשהם L-15 של ליבוביץ עם סרום שור עוברית 10%, 10 ננוגרם למ"ל של גורם הגדילה באפידרמיס של הידרוקורטיזון 1 μg/mL.
    הערה: L-15 כבר מכילה 2 מ מגלוטמין, כך שאין צורך להוסיף תוספת כמו במקרה של מדיה MCDB-131.
  3. 4 שעות לאחר הפגיעה (כאשר JAT983 למביטה מתחיל ואזוריט), מערבבים את μL 1 של 1 מ"ג/מ"ל Hoechst לצבוע עם 1 מ"ל של מדיה מלא L-15 ולהוסיף אותו מכל קידוח כתם גרעינים התאים. המקום התאים בחממה תרביות רקמה למשך 10 דקות ולאחר מכן להחליף היטב כל התקשורת מלאה L-15 1 מ"ל של L-15 מדיה מלא בתוספת 20 µg/mL של גנטמיצין.
  4. כיסוי לצלחת עם המכסה שלה, המקום אותו בתא סביבתי של מיקרוסקופ (ראה טבלה של חומרים) equilibrated כדי הלעפה תרוטרפמט 37.
    הערה: עבור הדמיה, השתמש במיקרוסקופ epifluorescence הפוכה עם מצלמת CCD (ראה טבלה של חומרים) בן 40 X אוויר תוכנית פלואוריט אוויר המטרה עם 0.6 הערך לא ישים
  5. רכוש רב ערוצית תמונות בצילום מואץ של החרוזים פלורסנט החיידק פלורסנט ולאחר שלב תמונות חדות של תאי הפונדקאי, כל 10 דקות עבור h 4 עד 12.
    הערה: עבור ההדמיה, הכוח היה מוגדר 25% ויש זמן חשיפה 100 גב המסננים מיקרוסקופ (עירור/פליטה) המשמש mCherry של GFP 470/525 nm ו 530/645 nm בהתאמה.
  6. בסוף ההקלטה, להוסיף 500 µL של 10% נתרן dodecyl סולפט (מרחביות) במים בכל אחד מן הבארות.
    הערה: התאים להיות מנותקת את הידרוג, הידרוג יחזור למצבו הראשוני undeformed מאז הוא אלסטי.
  7. לקחת תמונה של הידרוג ולהשתמש בו כתמונה להתייחסות undeformed.
  8. לקבוע את מימדי דפורמציה של הידרוג בכל רגע ורגע של זמן באמצעות חלקיקים תמונה velocimetry (PIV)31, השוואת כל תמונה של הסדרה בצילום מואץ עם תמונה הפניה של הידרוג undeformed. השתמש את מידות החלון המתאים, חופפים בהתאם הניסוי.
    הערה: השתמשנו windows של 32 פיקסלים עם חפיפה בין 16 פיקסלים.
  9. לחשב את הלחצים 2D המתיחה זה התאים להפעיל על הידרוג כמתואר32,33.
  10. לחשב המתח טפט מהמתחים המתיחה כאמור תיאר34 על ידי פתירת המשוואות של שיווי משקל מכני לצלחת אלסטיים דקים על כוחות תגובה שיצרו את הרשות הפלסטינית הידרוג על טפט, שהן של מול סימן כדי הלחצים נמדד המתיחה.
    הערה: ראה חומר משלים 1.

7. כמותיים מיקרוסקופ זמן לשגות לתאים להעריך Extracellular-מטריקס-נוקשות התלויים ל' monocytogenes הפצתו דרך אנדותל

Figure 6
איור 6: נתוני זמן לשגות מיקרוסקופ כמותית של Lm הפצתו דרך monolayers HMEC-1 נזרע על מצעים עם 3-kPa ו- 70-kPa נוקשות. א לוח זה מציג עדיין תמונות של שני מוקדים נציג זיהום ב- 0, 200, 400, 600 דקות. הערוץ שלב מתארת monolayers תא HMEC-1, ומתאר הערוץ האדום Lm תאיים (ראה שלב 7 לפרוטוקול). B. חלונית זו מציגה אזור קמור המקיף את המוקד זיהום המותווים כפונקציה של הזמן. אזור המיקוד של המצב 3-kPa (אדום) גדל מהר יותר מזה של 70-kPa (ירוק). ג. לוח זה מראה שהמרחק רדיאלי ממרכז לקצה של המוקד זיהום המותווים כפונקציה של זמן עבור נציג foci זיהום גדל (אדום) monolayers HMEC-1 נזרע על הרשות הפלסטינית סובסטרטים של 3-kPa וקשיחות 70-kPa (ירוק). מהירות רדיאלית (ד ר/dt) הוא קבוע עבור התנאי 3-kPa, אבל biphasic עבור התנאי 70-kPa. ד. נתונים אלה מראים המהירות רדיאלית מינימום 200 הראשון של עשר מוקדים זיהום עצמאית. אדום (3-kPa) וירוק (70-kPa) נקודות נתונים מתארים מורדות שני מוקדים שמתואר הלוחות הקודמים. אופקיות מתארים ממוצע של הנתונים. P-ערך מחושב עם הבדיקה Wilcoxon דרגה סכום שאינו פרמטרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. להכין את hydrogels הרשות הפלסטינית על צלחת 24-טוב (ראה שלב 1), זרע תאים HMEC-1 (ראה שלב 2), ולגדול תרבויות JAT983 לילה כפי שתואר לעיל (ראה שלב 3).
  2. היום של זיהום, להכין את תערובת זיהום על ידי ערבוב 10 µL של חיידקי גלולה לכל מיליליטר מדיה מלא MCDB-131. בזהירות להסיר את המדיה הבארות של הלוחות 24-ובכן, ולהוסיף 1.9 מ של התקשורת מלאה MCDB-131 ו- 0.1 מ"ל של המיקס חיידקי מכל קידוח.
    הערה: למשרד הפנים התחתון המשמשים assay הזה יש צורך לנתח אירועים הפצתו להפעיל מן חיידק בודד פולשים בתא המארח.
  3. מכסה את הצלחת עם המכסה, לאטום אותו בניילון כדי למנוע דליפה. מקם את הצלחות בצנטריפוגה ולסובב את הדגימות 10 דקות ב- 200 גרם x כדי לסנכרן את הפלישה.
  4. להעביר את הצלחות לתוך החממה תרביות רקמה, דגירה אותם במשך 5 דקות.
  5. לשטוף את הדגימות 4 x עם מדיה ולהעביר אותם אל החממה תרביות רקמה. לאחר דקות נוספות 5-7, החלף את המדיה מדיה בתוספת 20 µg/mL של גנטמיצין.
  6. דגירה את הצלחת בחממה, בתוספת 5 שעות כדי לאפשר את המקדם actA להדליק ולנסוע הביטוי של mTagRFP פתיחת קריאה מסגרת35.
  7. הכן מדיום מיקרוסקופיה-לחיות על ידי שכשהם L-15 של ליבוביץ עם סרום שור עוברית 10%, 10 ננוגרם למ"ל של גורם הגדילה באפידרמיס של הידרוקורטיזון 1 µg/mL.
    הערה: L-15 כבר מכילה 2 מ מגלוטמין, כך שאין צורך להוסיף תוספת כמו במקרה של מדיה MCDB-131.
  8. לערבב 1 μL של 1 מ"ג/מ"ל Hoechst לצבוע עם 1 מ"ל של מדיה מלא L-15 ולהוסיף אותו מכל קידוח כתם גרעינים התאים. המקום התאים בחממה תרביות רקמה למשך 10 דקות ולאחר מכן להחליף היטב כל התקשורת מלאה L-15 1 מ"ל של L-15 מדיה מלא בתוספת 20 µg/mL של גנטמיצין. כיסוי לצלחת עם המכסה שלה, המקום אותו בתא סביבתי של מיקרוסקופ (ראה טבלה של חומרים) equilibrated כדי הלעפה תרוטרפמט 37.
    הערה: עבור הדמיה, מיקרוסקופ epifluorescence הפוכה שימש עם מצלמת CCD (ראה טבלה של חומרים) ו- 20 X אוויר תוכנית פלואוריט אוויר המטרה עם 0.75 הערך לא ישים הכוח נקבע ל- 50% ויש זמן חשיפה 50 גב המסננים מיקרוסקופ המשמש mCherry 470/525 nm עירור, פליטה בהתאמה.
  9. תמונה מספר עמדות כל 5 דקות באמצעות תכונת פוקוס אוטומטי כדי לפקח על איך Lm התפשטה monolayers HMEC-1 נזרע על משתנה נוקשות hydrogels.
    הערה: L-15 נאגרת עם HEPES, כך שאין צורך להשתמש CO2 במהלך ההדמיה.

Representative Results

ECM תלויי-נוקשות הרגישות של תאים HMEC-1 לזיהום Lm:
הרשות hydrogels של נוקשות בדרגות שונות, כל משטח מצופה עם קולגן אני, נבנו על לוחות זכוכית רב טוב כפי שמתואר שלב 1 של הפרוטוקול (ראה איור 1). AFM מדידות בוצעו כדי לאשר את הנוקשות המדויק של hydrogels, כפי שתואר לעיל26,27 (ראה איור 2). מחקרים שנעשו בעבר הראו כי הציות המקומי של קרום המרתף של תאי אנדותל יכול לנוע בין 1 kPa (למשל, רקמת המוח) עד 70 kPa (למשל, אבי העורקים)36,37,38, 39 , 40. לכן, בחרנו לבחון את הזיהום של תאים HMEC-1 המתגוררים על מטריצות עם הקשיחות הבאים: 0.6 kPa, 3 kPa, 20 kPa ו 70 kPa. עבור כל הידרוג נוקשות, שש hydrogels היו מפוברק כדי להעריך את הפארמצבטית של התוצאות.

Cytometry זרימה שימש כדי להעריך את הרגישות תלויי-נוקשות ECM של תאים HMEC-1 לזיהום Lm (ראה איור 3). תאים HMEC-1 נדבקו בנגיף זן Lm (JAT985) המבטאת סמן פלורסנט לאחר הפנמה (actAp::mTagRFP), המאפשר זיהוי חיידקים תאיים היחידה (ראה דמויות 1 L - 1N). JAT985 חסרה גם ActA, הפיכת החיידק להתפשט מתא לתא, מאז ActA הכרחי להיווצרות זנב השביט אקטין והפצה חיידקי עוקבות. 7 - 8 שעות לאחר הפגיעה, זיהום התאים HMEC-1 הוערכה באמצעות cytometry זרימה. כדי להבטיח הניתוח של תאים בודדים, היה עיקר חלוקת תא ספירת מגודרת באמצעות פארווערטס לעומת הצד פיזור מגרש, ולאחר מכן צעד המגביל השני היה ביצע כדי לא לכלול תאים כי התערוכה autofluorescence (ראה דמויות 3A - 3 C ). תוצאות ראשוניות מתואר באיור 3 מראים כי זיהום HMEC-1 עם Lm הוא כ כפולה גדולה יותר עבור תאים HMEC-1 המתגוררים על נוקשות hydrogels kPa 70 לעומת התאים השוכנים במחשב hydrogels kPa 0.6 רך (ראה דמויות 3B - תלת-ממד). הרגישות לזיהום Lm מוגברת של תאים HMEC-1 המתגוררים על נוקשות לעומת מטריצות רך יכול להיות בשל: 1. גדל Lm אדהזיה על גבי HMEC-1; 2. Lm מוגבר, פלישת HMEC-1; או 3. שני הנ ל שיתוף המתרחשים. כדי לבדוק חסימות איזה השערה, היו תאים HMEC-1 נזרע על רך (3 kPa) ו hydrogels (70 kPa) נוקשות, נגוע צורונים GFP לבטא Lm (ראה דמויות 4A - 4 C). הדגימות תוקנו זמן קצר לאחר זיהום, החיידקים (adhering) חיצוני היו מוכתמים נוגדנים. באמצעות מיקרוסקופ כמותית, מצאנו כי ישנם חיידקים באופן משמעותי יותר הקפדה על HMEC-1 כאשר התאים מארח שוכנים על נוקשות לעומת ג'ל רך (ראה איור 4D). בקנה אחד עם הנתונים cytometry זרימה, יש חיידקים באופן משמעותי לנחלתו של HMEC-1 כאשר התאים מארח שוכנים על נוקשות לעומת ג'ל רך (ראה איור 4E). אולם, הפלישה היעילות (חיידקים הפנימו/סה כ מספר חיידקים) של Lm לתוך תאים HMEC-1 הוא דומה, ללא התחשבות קשיחות המצע (ראה איור 4F).

מיקרוסקופ כוח המתיחה של תאים הנגועים Lm HMEC-1:
Lm זיהום של תאים HMEC-1 יכול לשנות את ביומכניקה של תאים נגועים המארח, כולל הכוח המצורף ECM שלהם או אחד לשני, המשפיעים על תקינותם מכשול. אנחנו ביקשו להעריך זה יכול להיות המקרה באמצעות מיקרוסקופ כוח המתיחה32 כדי לחשב את כוחות המתיחה תא-ECM ומיקרוסקופיה מתח חד שכבתי41 כדי לחשב את הכוחות tensional תאיים. איור 5 מציג מפות של דפורמציה שדה, שדה מאמץ המתיחה, המתח תאיים שדה של תאים HMEC-1 המתגורר hydrogels 20-kPa-נקודות זמן שונות לאחר הפגיעה. דמויות 5A - 5 D להפנות לתאים נגוע השליטה HMEC-1 ואילו דמויות 5E - 5 שעות יש לפנות HMEC-1 תאים נגועים Lm-ריבוי של זיהום שווה ל- 300 תא חיידקים. עבודה ראשונית זו מרמזת כי תאים נגועים HMEC-1 להפחית את סדר הגודל של התא-ECM שלהם מדגיש תאיים במהלך זיהום עם Lm, ואילו זה לא נצפית עבור תאים נגוע השליטה.

ECM תלויי-נוקשות Lm הפצתו ברחבי monolayers HMEC-1:
מיקרוסקופ זמן לשגות שימש לחקור את האפקט מטריצת קשיחות יש ב- Lm הפצתו דרך monolayers HMEC-1. כמו Lm מתפשט דרך טפט, החיידקים ליצור מוקד הזיהום הגדל כפונקציה של הזמן (ראה איור 6A ואת הסרטונים דמויות 1 ו- 2). האזור של המוקד זיהום נמדד על ידי ציור של קמור, מהקטן לגדול קמורה המצולע שמקיף את ערכה של נקודות, סביב חיידקים42. יש מדד סטנדרטי אין בשדה כדי למדוד את היעילות של ל' monocytogenes התפשטות לתא דרך טפט של התאים המארחים. כדי להעריך את יעילות כפולה, כמה יש לספור את מספר התאים המארחים המוקד זיהום41, לאחרים יש גבולות מצוירות באופן ידני סביב הקבוצה של זיהום מארח תאים43. בחרנו לצייר מצולע קמור סביב החיידקים, כי זה תהליך אוטומטי, התמדה שהמפתחות זול כדי למדוד את היעילות של התפשטות monocytogenes ל' . בעשותם כך, מצאנו ירידה קלה באזור המיקוד זיהום בתאים HMEC-1 נזרע על 70 hydrogels kPa בהשוואה לאלה נזרע על מטריצות kPa 3 (ראה איור 6B ואת הסרטונים דמויות 1 ו- 2). כדי לקבוע את קצב הצמיחה של המוקד זיהום, המרחק רדיאלי הייתה להתוות כפונקציה של הזמן על-ידי לקיחת השורש הריבועי של האזור של המוקד זיהום חילוק זה פאי. טרנספורמציה מתמטית זו מניחה כי הצורה של המוקד זיהום הוא בערך מעגלית44. כדי למדוד את המהירות של הגידול המוקד, קצב השינוי (קרי, המדרון) של המרחק רדיאלי עבור שתי מטריצות 3 - ו 70-kPa נמדדה. גישה זו מבואר כי המוקד זיהום גדל מהר יותר מונוטוני בתאים HMEC-1 נזרע על גבי 3-kPa מטריצות. עם זאת, המוקד גדל איטי באופן משמעותי (הראשון 200 דקות), מעט איטי יותר (200 עד 600 דקות) בתאים נזרע על 70-kPa מטריצות (ראה איור 6C). אכן, ניתוח של נתונים נוספים אישר כי המוקד זיהום גדל, בממוצע, כפולה לאט יותר ב- 70-kPa מטריצות, בעיקר בזמן מינימום 200 הראשונה (ראה איור 6D).

Figure 3
איור 3 : הרגישות תלויי-נוקשות ECM של תאים HMEC-1 Lm לפלישה נמדד באמצעות cytometry זרימה .  תאים HMEC-1 נדבקו בנגיף Lm (JAT985), הזיהום נותחה על ידי cytometry זרימה. א. לוח זה מראה צד לעומת פיזור קדימה מגרש עבור תאים HMEC-1 נציג מגיע לבאר בודדת. התפלגות בכמות גדולה של תאים נבחר באמצעות gating כדי לא לכלול פסולת (משמאל) ותא doublets או שלישיות (מימין). B. גרף זה מראה היסטוגרמה של הלוגריתם של עוצמת קרינה פלואורסצנטית Lm בכל תא עבור HMEC-1 מצופה ב kPa 0.6 רך. ג. גרף זה מראה היסטוגרמה של הלוגריתם של עוצמת קרינה פלואורסצנטית Lm בכל תא HMEC-1 מצופה על נוקשות hydrogels kPa 70. היסטוגרמות עבור N = 4-6 משכפל מוצגים בצבעים שונים. היסטוגרמה התאים בקרה uninfected הוא סגול. השער משמש להגדרת מה נגוע מוצגים באדום. למשרד הפנים הוא 100, הזיהום היה המוערך 8 שעות לאחר הפגיעה. ד. הנתונים מראים אחוז תאים נגועים HMEC-1 לעומת הנוקשות הידרוג (N = 5). אופקיות מתארים ממוצע של הנתונים. P-ערך מחושב עם הבדיקה Wilcoxon דרגה סכום שאינו פרמטרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Video Figure 1
וידאו איור 1: ההפצה של Lm תאיים (ערוץ אדום) דרך חד שכבתי תא HMEC-1 (שלב) נזרע על מצע 3-kPa. התאים היו עם תמונה של ליבוביץ L-15 מדיה (10% FBS, µg/mL 20 של גנטמיצין) בתוך תא סביבתיים equilibrated כדי הלעפה תרוטרפמט 37. התמונות נאספו כל 5 דקות. מהירות הסרט היא 15 מסגרות/ס אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Video Figure 2
סרטון איור 2: הפצת Lm תאיים (ערוץ אדום) דרך חד שכבתי תא HMEC-1 (שלב) נזרע על מצע 70-kPa. התאים היו עם תמונה של ליבוביץ L-15 מדיה (10% FBS, µg/mL 20 של גנטמיצין) בתוך תא סביבתיים equilibrated ל- 37 מעלות צלזיוס. התמונות נאספו כל 5 דקות. מהירות הסרט היא 15 מסגרות/ס אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

מודול האלסטיות (E, kPa) אקרילאמיד % (מ- 40% מניות) Bisacrylamide % (מ- 2% מניות)
0.6 3 0.045
3 5 0.075
10 10 0.075
20 8 0.195
70 10 0.45

טבלה 1. ההרכב של לזיהוי (PA) hydrogels של קשיות שונות. בטבלה זו, האחוז של פתרון אקרילאמיד 40% מניות, ואת האחוז במניה 2% פתרון bis-אקרילאמיד להשגת מנדנד נתון (האלסטיות, E) הם הצביעו על עמודות שונות.

Supplemental Material
חומר משלים 1. חישוב של מתח תאיים מדגיש המתיחה מחושב. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

התאים יכולים לחוש מגוון הפיזי רמזים סביבתיים, אשר יכולים להשפיע לא רק מורפולוגיה התאים, אלא גם גנים ביטוי וחלבון הפעילות שלהם, ובכך משפיע על התא קריטי פונקציות והתנהגויות45,46. הנוקשות של ה-ECM של תאים מוערכת יותר ויותר כמו אפנן חשוב של תנועתיות תאית התמיינות, התפשטות, בסופו של דבר תא גורל47,48,49. אמנם היו רבים ההתקדמות בהבנת biomechanical האינטראקציה המורכבת בין התאים שלהם ECM, מעט מאוד ידוע על נוקשות איך הסביבה משפיעה על הרגישות של תאים זיהום חיידקי. כדי להקל על מחקרים כאלה, פיתחנו assay רב טוב הרומן הזה מבוסס על הזיוף ומבוססת של hydrogels לזיהוי של נוקשות tunable אשר תואם עם זיהום מבחני50. באופן מסורתי, זיהום חיידקי של תאים בתרביות רקמה נחקרה על זכוכית או משטחים פוליסטירן המהווים כ 1-3 סדרי גודל נוקשה מאשר ה-ECM. טבעי של תאים חסיד ביותר8,51. וזמינותו המתוארים כאן נפתח כבישים מהירים חדשים על-ידי הפעלת חקר חיידקים-פונדקאי אינטראקציות במשטר נוקשות הסביבתיים הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.

להוכחת הרעיון של וזמינותו שהוצגו, HMEC-1 תאים נבחרו וגם התאים המארחים חסיד מודל Lm בתור מודל פתוגן חיידקי. עם זאת, ניתן להאריך וזמינותו עבור מחקרים נוספים אם משתנה בהתאם. מחקרים כאלה יכול לכלול זיהום של סוגי תאים מארח חסיד יונקים שונים על ידי פתוגנים נוספים, כולל חיידקים ווירוסים. עבור assay המסוים הזה, ג'לים היו חלבון מצופה עם קולגן אני, אך בהתאם לסוג התא המארח, זה אפשרי לשימוש שונה ECM חלבון-ציפוי, כגון laminin או fibronectin, כדי להקל על ההחזקה של התאים מארח ריבית על הידרוג 52. שיקול נוסף זה תלוי בסוג התא המארח הוא הטווח נוקשות הידרוג שילמדו. הטווח של נוקשות תלויה מבחינה פיזיולוגית רלוונטי עבור סוג התא המארח ספציפי ומצרף כמה טוב המארח ויוצרים על טפט-הידרוג נתון נוקשות. באופן דומה, בהתאם הפתוגן דגם רצוי להיבדק, שינויים קלים ייתכן שיהיה עליך ליישם וזמינותו זיהום כפי שיתואר בהמשך.

החידוש של וזמינותו לעומת שיטות קודמות עבור ייצור לזיהוי hydrogels24,50,53 טמון תכונות ייחודיות מסוימת השתלב וזמינותו זיהום המוצע. קודם כל, hydrogels בנויים על לוחות זכוכית רב טוב, המאפשרת הקרנת הסרט תנאים מרובים בו זמנית, כמו גם האוטומציה של תהליכים מסוימים. ניטור תנאים מרובים באותו הזמן או בחינת משכפל מרובים חיוני כיוון התוצאה של גישה כזו יכול להיות מושפע מגורמים כגון המעבר התא המארח, מספרם המדויק של חיידקים נוספים כדי להדביק את המארחים, אשר לעתים קרובות לשנות בין הניסויים עצמאית. תכונה ייחודית נוספת של זה וזמינותו היא hydrogels בגובה של-40 מיקרומטר, אשר הוא דק מספיק כדי התמונה באמצעות מיקרוסקופ רגיל. הראינו כי אנחנו יכול לבצע בהצלחה תא חי מיקרוסקופ, קיבוע תא וגם immunostaining ואחריו הדמיה, ללא היכרות עם רקע זריחה. לבסוף, hydrogels עשויים משתי שכבות, עם אחד העליון שיש מוטבע גרגרי פלורסנט, כלוא בתוך מטוס מוקד בודד. תכונה זו מבטיחה כי יהיה אור out-of-להתמקד לא להתערב במהלך דימות. הנוכחות של החרוזים מאפשר לשני בדיקת הטופוגרפיה עיליים של ג'לים כדי להבטיח כי הם אחידים, משפר את הביצועים של TFM ו- MSM24,32,41. TFM, MSM, אפשרי לחשב את הכוחות תא-ECM תא-תא בהתאמה של תאים המתגוררים על משתנה מטריצות קשיחות. שימוש assay הרומן הזה, זה ניתן לבצע מדידות כאלה כוחות פיזיים על-ידי השוואת שני התרומה של נוקשות הסביבה ושל זיהום בעת ובעונה אחת. בעקבות גישה כזו, יש הזיהום השפעה על התא המארח מכניקה לכל אורכו יכול להיקבע. בנוסף, האבולוציה של הלחצים תאיים של תאים ניתן לחשב באמצעות MSM והוא יכול לשמש כאמצעי של המכשול בשלמות טפט. בסופו של דבר, בהתחשב באופי רב טוב של וזמינותו, זה אפשרי להכיר בו זמנית לפליטת תרופתי ו גנטי עם זיהום חיידקי, לחקור לעומק הגומלין המורכבים בין מכניקת התא המארח זיהום.

אחד הגבלה הטבועה של הטכניקה טמון את קשיחות המצע אפקט ייתכן על קצב התפשטות של תאים. בדרך כלל, במבחני זיהום, עלינו להבטיח כי הצפיפות התא המארח בתנאים שונים הוא זהה. זה בגלל צפיפות תא בפני עצמו יכול להשפיע על הרגישות של המארחים לזיהום. התאים HMEC-1 שימשו התאים המארחים אל תראה הבדל משמעותי במספר שלהם כאשר נזרע במשך 24 שעות ביממה-hydrogels. עם זאת, לסוגי תאים שונים עלול להפגין התפשטות דיפרנציאלי, בהתאם הקשיחות הידרוג זה יכול הטיה זיהום מחקרים. באופן דומה, הטיה זיהום יכול להיווצר כאשר התאים לא בצורת monolayers או אל תצרף גם על hydrogels, כפי מתרחשת כאשר סוגי תאים מסוימים הם נזרע על מטריצות רך מאוד (למשל, תאי אנדותל הטבור אנושי או מדין טומי הכלבי כליות תאים אפיתל נזרע על 0.6-kPa-hydrogels-54,-55). למיטב ידיעתם פתוגנים, חיידקים מסוימים (למשל, Borrelia burdgorferi) באפשרותך לצרף אל לארח תאים, לפלוש אותם אבל יכול גם transmigrate דרכם56. לא עוד בדקנו אם וזמינותו הזה יעבוד ללימודי גלגול הפתוגן, אבל זה נראה אפשרי מאז מחקרים קודמים על נויטרופילים transmigrating תאי אנדותל נזרע על הרשות הפלסטינית hydrogels תועדו לעבודה בהצלחה57. היו הרבה מחקרים שנערכו המדגימה את ייצור לזיהוי hydrogels של האלסטיות נתון על ידי ערבוב את ריכוזי המתאים אקרילאמיד ו- bis-אקרילאמיד24,25,26 ,27. עם זאת, במיוחד כאשר אחד רצונות לביצוע ניסויים TFM על תאים המתגוררים על hydrogels של נוקשות בדרגות שונות, חיוני כדי לאשר את הנוקשות הצפוי של hydrogels או באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי או בטכניקות אחרות כניסה58. סטיות קטן מהערך צפוי יכולה לנבוע עקב של הממס שונים בשימוש או פתרון מניות אקרילאמיד בגילאי, או על ידי הדרכים AFM מדידות שבוצעו (למשל, הצורה של קצה AFM). בסופו של דבר, הגישה שהוצגו במסמך זה מבוסס על זריעת התאים המארחים על מטריצות 2D, שיכול להיות שונה משער תרחיש 3D מציאותית יותר ורלוונטי פיזיולוגית. עם זאת, ייצור ג'לים 3D עם נוקשות tunable, seeding אותם עם התאים המארחים, ואז מדביקים אותם עם פתוגנים, עדיין כוללת קשיים טכניים מסוימים. עם זאת, אנו צופים כי בעתיד הקרוב נוכל להרחיב את הבדיקה הנוכחית ללמוד זיהום סביבה תלת-ממד.

לסיכום, הפרוטוקול המתואר יחד עם תוצאות ראשוניות לספק ראיות כי assay הרומן הזה יכול להיות כלי שימושי ביותר ללמוד זיהום של התאים המארחים חסיד עם חיידקים פתוגניים בצורה כמותית, הרבה יותר סביבת רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מאשר בעבר שנבדקו. הכוח של בדיית לזיהוי hydrogels בכיוונון המוצע שקרים וזמינותו היא תואמת הביצועים של טכניקות מרובות כגון cytometry זרימה, immunostaining ואחריו מיקרוסקופ אור, וכוח המתיחה מיקרוסקופ. וזמינותו יכול לשמש עבור מחקרים שכללו הזיהום של סוגי תאים חסיד מארח שונים על ידי פתוגנים, אשר אנו צופים תהיה בעלת השפעה משמעותית בשני להתיר את האסטרטגיות שלפיו פתוגנים להדביק מחשבים מארחים, הקלה על הפיתוח של התערבויות טיפוליות נגד זיהומים.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודות מ תחתונה, ר' Lamason, מ Rengaranjan, חברי המעבדה Theriot שלהם לדיונים ותמיכה ניסיוני. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), לאחווה גילהם HHMI מחקר מתקדם (F.E.O.), את סטנפורד בוגר אחווה (F.E.O.) של איגוד הלב האמריקאי (E.E.B.). Cytometry זרימה בוצעה במתקן סטנפורד משותפים FACS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Sodium hydroxide pellets Fisher S318-500
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma A3648
25% gluteraldehyde Sigma G6257-100ML
40% Acrylamide Sigma A4058-100ML
Bis-acrylamide solution (2%w/v) Fisher Scientific BP1404-250
Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) Invitrogen F8803
Ammonium Persulfate Fisher BP17925
TEMED Sigma T9281-25ML
Sulfo-SANPAH Proteochem c1111-100mg
Collagen, Type I Solution from rat Sigma C3867-1VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO) J.T. Baker 9224-01
HEPES, Free acid J.T. Baker 4018-04
Leibovitz's L-15 medium, no phenol red Thermofischer 21083027
MCDB 131 Medium, no glutamine Life technologies 10372019
Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A Gemini Bio-Prod 900108 500ml
Epidermal Growth Factor, EGF Sigma E9644
Hydrocortisone Sigma H0888
L-Glutamine 200mM Fisher SH3003401
DPBS 1X Fisher SH30028FS
Gentamicin sulfate MP biomedicals 194530
Cloramphenicol Sigma C0378-5G
DifcoTM Agar, Granulated BD 214530
BBL TM Brain-heart infusion BD 211059
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water Invitrogen H3570
Formaldehyde 16% EM grade Electron microscopy 15710-S
Anti-Listeria monocytogenes antibody Abcam ab35132
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 546 conjugate Thermofischer A-11035
0.25% trypsin-EDTA , phenol red Thermofischer 25200056
COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC Sigma C8051
Streptomycin sulfate Fisher Scientific 3810-74-0
Sucrose Calbiochem 8510
Sodium dodecyl sulfate Thermofischer 28364
MES powder Sigma M3885
KCl J.T. Baker 3040-05
MgCl2 J.T. Baker 2444-1
EGTA Acros 40991
Disposable lab equipment
12 mm circular glass coverslips Fisherbrand 12-545-81 No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated
Glass bottom 24 well plates Mattek P24G-1.5-13-F
5 ml polystyrene tubes with a 35 μm cell strainer cap  Falcon 352235
T-25 flasks Falcon 353118
50 ml conical tubes Falcon 352070
15 ml conicals tubes Falcon 352196
Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) Falcon 357551
Pasteur Glass Pipettes VWR 14672-380
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) Denville P1122, P1126
Powder Free Examination Gloves Microflex XC-310
Cuvettes bacteria Sarstedt 67.746
Razors VWR 55411-050
Syringe needle BD 305167
0.2um sterilizng bottles Thermo Scientific 566-0020
20 ml syringes BD 302830
0.2um filters Thermo Scientific 723-2520
wooden sticks Grainger 42181501
Saran wrap Santa Cruz Biotechnologies sc-3687
Plates bacteria Falcon 351029
Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood Baker SG504
Hemacytometer Sigma Z359629
Bacteria incubator Thermo Scientific IGS180
Tissue culture Incubator NuAire NU-8700
Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope Nikon NIKON-DIAPHOT-200
Cage Incubator Haison Custom
Scanford FACScan analyzer  Stanford and Cytek upgraded FACScan Custom
Pipette Aid Drummond 4-000-110
Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul) Gilson F144802, F123601, F123602
pH meter Mettler Toledo 30019028
forceps FST 11000-12
1 L flask Fisherbrand FB5011000 
Autoclave machine Amsco 3021
Stir magnet plate Bellco 7760-06000
Magnet stirring bars Bellco 1975-00100
Spectrophotometer Beckman DU 640
Scanford FACScan analyzer Cytek Biosciences Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan
Software
Microscope Software (μManager) Open Imaging
Matlab Matlab Inc
Flowjo FlowJo, LLC
Automated image analysis software, CellC https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
  2. Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: a dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
  3. Trepat, X., Lenormand, G., Fredberg, J. J. Universality in cell mechanics. Soft Matter. 4 (9), 1750-1759 (2008).
  4. Maruthamuthu, V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. Cell-ECM traction force modulates endogenous tension at cell-cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4708-4713 (2011).
  5. Fujiwara, I., Suetsugu, S., Uemura, S., Takenawa, T., Ishiwata, S. Visualization and force measurement of branching by Arp2/3 complex and N-WASP in actin filament. Biochemical and Biophysical Research Communications. 293, 1550-1555 (2002).
  6. Ingber, D. E. Tensegrity-based mechanosensing from macro to micro. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 97 (2-3), 163-179 (2008).
  7. LaValley, D. J., Zanotelli, M. R., Bordeleau, F., Wang, W., Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness enhances VEGFR-2 internalization, signaling, and proliferation in endothelial cells. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 044001 (2017).
  8. Mason, B. N., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness: a regulator of cellular behavior and tissue formation. Engineering Biomaterials for Regenerative Medicine: Novel Technologies for Clinical Applications. Bhatia, S. K. , Springer. New York, NY. 19-37 (2012).
  9. El-Mohri, H., Wu, Y., Mohanty, S., Ghosh, G. Impact of matrix stiffness on fibroblast function. Materials Science and Engineering: C. 74, Supplement C 146-151 (2017).
  10. Asano, S., et al. Matrix stiffness regulates migration of human lung fibroblasts. Physiological Reports. 5 (9), (2017).
  11. Burgess, J. K., Mauad, T., Tjin, G., Karlsson, J. C., Westergren-Thorsson, G. The extracellular matrix: the under-recognized element in lung disease. The Journal of Pathology. 240 (4), 397-409 (2016).
  12. Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
  13. Jackson, K. A., Iwamoto, M., Swerdlow, D. Pregnancy-associated listeriosis. Epidemiology and Infection. 138 (10), 1503-1509 (2010).
  14. Theriot, J., Rengarajan, M. Exploitation of host cell processes for bacterial cell-to-cell spread. The FASEB Journal. 28, 1 Supplement (2014).
  15. Pollard, T. D., Beltzner, C. C. Structure and function of the Arp2/3 complex. Current Opinion in Structural Biology. 12 (6), 768-774 (2002).
  16. Pollard, T. D. Cellular motility powered by actin filament assembly and disassembly. Harvey Lectures. 98, 1-17 (2002).
  17. Reed, S. C., Lamason, R. L., Risca, V. I., Abernathy, E., Welch, M. D. Rickettsia actin-based motility occurs in distinct phases mediated by different actin nucleators. Current Biology. 24 (1), 98-103 (2014).
  18. Gerbal, F., Chaikin, P., Rabin, Y., Prost, J. An elastic analysis of Listeria monocytogenes propulsion. Biophysical Journal. 79 (5), 2259-2275 (2000).
  19. Weber, I. Is there a pilot in a pseudopod. European Journal of Cell Biology. 85 (9-10), 915-924 (2006).
  20. Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76 (3), 505-517 (1994).
  21. Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
  22. Rengarajan, M., Hayer, A., Theriot, J. A. Endothelial cells use a formin-dependent phagocytosis-like process to internalize the bacterium Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 12 (5), 1005603 (2016).
  23. Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11 (10), 1212-1218 (2009).
  24. Bastounis, E., et al. Both contractile axial and lateral traction force dynamics drive amoeboid cell motility. The Journal of Cell Biology. 204 (6), 1045-1061 (2014).
  25. Georges, P., Miller, W., Meaney, D., Sawyer, E., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
  26. Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
  27. Engler, A., Bacakova, L., Newman, C., Hategan, A., Griffin, M., Discher, D. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
  28. Yam, P. T., Theriot, J. A. Repeated cycles of rapid actin assembly and disassembly on epithelial cell phagosomes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5647-5658 (2004).
  29. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), (2014).
  30. Selinummi, J., Seppala, J., Yli-Harja, O., Puhakka, J. A. Software for quantification of labeled bacteria from digital microscope images by automated image analysis. BioTechniques. 39 (6), 859-863 (2005).
  31. Gui, L., Wereley, S. T. A correlation-based continuous window-shift technique to reduce the peak-locking effect in digital PIV image evaluation. Experimental Fluids. 32, 506-517 (2002).
  32. del Alamo, J. C., et al. Spatio-temporal analysis of eukaryotic cell motility by improved force cytometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13343-13348 (2007).
  33. Hur, S. S., et al. Roles of cell confluency and fluid shear in 3-dimensional intracellular forces in endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11110-11115 (2012).
  34. Banerjee, I., et al. Cyclic stretch of embryonic cardiomyocytes increases proliferation, growth, and expression while repressing Tgf-β signaling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 79, 133-144 (2015).
  35. Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 7 (3), 1002005 (2011).
  36. Wood, J. A., Liliensiek, S. J., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Biophysical cueing and vascular endothelial cell behavior. Materials. 3 (3), 1620-1639 (2010).
  37. Kohn, J. C., Lampi, M. C., Reinhart-King, C. A. Age-related vascular stiffening: causes and consequences. Frontiers in Genetics. 6, 112 (2015).
  38. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
  39. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).
  40. Onken, M. D., Mooren, O. L., Mukherjee, S., Shahan, S. T., Li, J., Cooper, J. A. Endothelial monolayers and transendothelial migration depend on mechanical properties of the substrate. Cytoskeleton (Hoboken). 71 (12), 695-706 (2014).
  41. Lamason, R. L., et al. Rickettsia Sca4 reduces vinculin-mediated intercellular tension to promote spread. Cell. 167 (3), 670-683 (2016).
  42. Wu, T. -C., Belteton, S., Pack, J., Szymanski, D. B., Umulis, D. LobeFinder: a convex hull-based method for quantitative boundary analyses of lobed plant cells. Plant Physiology. 171 (4), 2331-2342 (2016).
  43. Czuczman, M. A., et al. Listeria monocytogenes exploits efferocytosis to promote cell-to-cell spread. Nature. 509 (7499), 230-234 (2014).
  44. Liebhold, A. M., Tobin, P. C. Population ecology of insect invasions and their management. Annual Reviews in Entomology. 53, 387-408 (2008).
  45. Miller, C. J., Davidson, L. The interplay between cell signaling and mechanics in developmental processes. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 733-744 (2013).
  46. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), Cambridge, England. 1407-1420 (2010).
  47. Yeh, Y. T., et al. Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9. PLoS One. 7 (10), 46889 (2012).
  48. Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. 10 (44), 8829-8837 (2014).
  49. Tse, J., Engler, A. Stiffness gradients mimicking in vivo tissue variation regulate mesenchymal stem cell fate. PLoS ONE. 6 (1), 15978 (2011).
  50. Ananthakrishnan, R., Ehrlicher, A. The forces behind cell movement. International Journal of Biological Sciences. 3, 303-317 (2007).
  51. Kolahi, K. S., et al. Effect of substrate stiffness on early mouse embryo development. PLoS ONE. 7 (7), 41717 (2012).
  52. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  53. Kiener, H. P., Lee, D. M., Agarwal, S. K., Brenner, M. B. Cadherin-11 induces rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes to form lining layers in vitro. American Journal of Pathology. 168, 1486-1499 (2006).
  54. Kaliman, S., Jayachandran, C., Rehfeldt, F., Smith, A. -S. Novel growth regime of MDCK II model tissues on soft substrates. Biophysical Journal. 106 (7), 25-28 (2014).
  55. Saunders, R. L., Hammer, D. A. Assembly of human umbilical vein endothelial cells on compliant hydrogels. Cellular and Molecular Bioengineering. 3 (1), 60-67 (2010).
  56. Wu, J., Weening, E. H., Faske, J. B., Hook, M., Skare, J. T. Invasion of eukaryotic cells by Borrelia burgdorferi requires β1 integrins and Src kinase activity. Infection and Immunity. 79 (3), 1338-4138 (2011).
  57. Stroka, K. M., Aranda-Espinoza, H. Endothelial cell substrate stiffness influences neutrophil transmigration via myosin light chain kinase-dependent cell contraction. Blood. 118 (6), 1632 (2011).
  58. Keer, L. M. Stress distribution at the edge of an equilibrium crack. Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 12 (3), 149-163 (1964).
  59. Bastounis, E. E., Theriot, J. A. A highly quantitative multi-well format assay for studying the effect of extracellular matrix mechanics on the bacterial infection of endothelial cells. Athens Journal of Sciences. 4 (1), 7-20 (2017).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 137 מחסידי בתרבית של תאים זיהום חיידקי אנדותל cytometry זרימה מיקרוסקופ כוח המתיחה לזיהוי hydrogels immunostaining קשיחות המצע
Assay מבוססי לזיהוי עיצוב רב טוב ללמוד את ההשפעה של מטריצה חוץ-תאית נוקשות על זיהום חיידקי של תאים חסיד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bastounis, E. E., Ortega, F. E.,… More

Bastounis, E. E., Ortega, F. E., Serrano, R., Theriot, J. A. A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells. J. Vis. Exp. (137), e57361, doi:10.3791/57361 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter