Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En multi godt Format polyakrylamid-baserte analysen for å studere effekten av ekstracellulær Matrix stivhet på bakteriell infeksjon av tilhenger celler

Published: July 5, 2018 doi: 10.3791/57361
Automatic Translation
1, 1, 2, 3
1Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine, 2Department of Mechanical and Aerospace Engineering, University of California San Diego, 3Departments of Biochemistry, Microbiology and Immunology and Howard Hughes Medical Institute, Stanford University School of Medicine

Summary

Vi har utviklet en multi godt format polyakrylamid-baserte analysen for utprøvende effekten av ekstracellulær matrix stivhet på bakteriell infeksjon tilhenger celler. Denne analysen er kompatibel med flowcytometri og immunostai-trekkraft force mikroskopi, tillater for kvantitative mål biomekaniske interaksjonene mellom celler, ekstracellulær matrix og patogene bakterier.

Abstract

Ekstracellulær matrix stivhet består av ett av flere miljømessige mekanisk stimuli som er kjent for å påvirke mobilnettet atferd, funksjon og skjebne generelt. Selv om stadig mer tilhenger celletyper Svar å matrix stivhet har vært preget, hvordan tilhenger cellenes mottakelighet for bakteriell infeksjon er avhengig av matrix stivhet er stort sett ukjent, som er effekten av bakteriell infeksjon på den Biomekanikk av verten cellene. Vi hypothesize at mottakelighet av verten endotelceller til en bakteriell infeksjon, avhenger av stivhet av matrisen som disse cellene bor, og at infeksjon av verten cellene med bakterier vil endre deres biomekanikk. For å teste disse to hypoteser, ble endotelceller brukt som modell verter og Listeria monocytogenes som en modell patogen. Ved å utvikle en roman flere godt format analysen, viser vi at effekten av matrix stivhet på infeksjon av endotelceller av L. monocytogenes kan vurderes kvantitativt gjennom flowcytometri og immunostai-etterfulgt av mikroskopi. I tillegg kan bruker trekkraft force mikroskopi, effekten av L. monocytogenes infeksjon på verten endothelial celle biomekanikk studeres. Den foreslåtte tillater for analyse av effekten av vev-relevante mekanikere på bakteriell infeksjon av tilhenger celler, som er et viktig skritt mot å forstå biomekaniske samspillet mellom celler, deres ekstracellulær matrix, og patogene bakterier. Denne metoden gjelder også en rekke andre typer studier på cellen biomekanikk og respons på underlaget stivhet hvor det er viktig å kunne utføre mange gjentak parallelt i hvert eksperiment.

Introduction

Cellene i de fleste dyr vev er vanligvis tilhenger, feste både til nabokommunene cellene og deres ekstracellulær matrix (EFM). Celleområdet til deres ECM er avgjørende for mange mobilnettet prosesser fra cellen motilitet til celle spredning og overlevelse1,2. Mobilnettet anchorage til ECM avhenger både ECM komposisjon og stivhet. Celler reagere på endringer i sistnevnte av dynamisk re-arrangere deres cytoskjelett, celle-ECM og celle-celle adhesjon, som i sin tur kritisk endre cellen biomekanikk og funksjoner3,4,5,6 . ECM stivhet kan variere i rommet (dvs., anatomisk plassering) gang (dvs., aldring) og patofysiologiske prosesser (f.eks, arteriosklerose, kreft, infeksjoner, etc.). For eksempel, det er allment akseptert at endothelial bor på stivere-sammenlignet med mykere-matriser utøve økt styrker deres ECM og hverandre og viser økt motilitet og spredning7,8. Likeledes fibroblaster bosatt på stivere matriser formidle høy kontraktile styrker til deres ECM og Vis økt spredning, motilitet og ECM produksjon9,10,11. Selv om cellen mekanikk og respons på ECM stivhet har vært studert i ulike celletyper, forholdet mellom tilhenger vertsceller, er stivhet ECM og bakterielle infeksjoner fortsatt hovedsakelig ubekjent.

For å studere rollen til ECM stivhet i bakterier-verten celle interaksjoner, ble L. monocytogenes (Lm) valgt som modell patogen. Lm er en allestedsnærværende matbårne bakterie som kan føre til systemisk infeksjon i en rekke pattedyr verter. Denne facultative intracellulær patogen kan flytte fra intestinal epitel å fjerne organer av traversering ulike typer vaskulær endothelia. Hvis det bryter blod - hjerne barrieren, Lm kan forårsake hjernehinnebetennelse, og når den krysser placenta, kan det forårsake spontan abort12,13. Lm kan infisere andre celletyper, og kan gjøre det ved hjelp av forskjellige patogene strategier. Lm infeksjon har vært studert mest i sammenheng med epitelceller, mens vi vet mye mindre om hvordan Lm kan infisere og omkjøringsvei endotelceller fôr lumen blodkar14,15,16. Videre er det fortsatt stort sett ukjent hvordan stivhet av ECM hvor endotelceller bor modulerer Månelandingsfartøyets muligheten til å invadere disse verten cellene og deretter spredt. Lm og flere ekstra bakteriell arter (dvs. Rickettsia parkeri) dra nytte av utgangen cytoskeleton på verten cellene de infisere både invadere i deres cytoplasma og lette celle til celle spredning17 , 18 , 19. de oppnå gjennom uttrykket av proteiner at forstyrre vert begrepsordbok polymerisasjon veier og produsere begrepsordbok kometen hale som letter deres videresende fremdrift16,20. Som følge av infeksjon trenger vert cellenes begrepsordbok cytoskjelett å dynamisk endre på en måte som er fortsatt ikke helt preget, potensielt påvirke biomekanikk du verten cellene de fysiske kreftene de utøve sine ECM og hver andre. For å undersøke disse prosessene, menneskelige mikrovaskulær endotelceller (HMEC-1) ble valgt som modell vertsceller for tre grunner: 1. endotelceller er kjent for å være svært mechanosensitive som de er stadig utsatt for ulike fysiske signaler21; 2. strategier Lm sysselsetter for å infisere endotelceller er fortsatt hovedsakelig ukjent22; og 3. HMEC-1 kan, er en udødeliggjort cellen og derfor lett kultivert og utsatt for genetisk manipulasjon.

Bakteriell infeksjon i verten cellene vært meste studert i vitro av seeding celler i glass eller polystyren underlag som er betydelig stivere enn fysiologiske ECM de fleste celler12,14,23. Undersøke infeksjon av celler seeded på en matrise som stivhet er fysiologisk relevant og belyse rollen ECM stivhet på infeksjon av celler av bakteriell patogener, fulgte vi en innovativ tilnærming basert på fabrikere tynn microbead-innebygd polyakrylamid hydrogels av tunable stivhet på flere bra plater. Nyheten av den foreslåtte tilnærmingen ligger ved at den tillater overvåking flere vilkår samtidig på grunn av sitt multi vel format og at den er kompatibel med flere teknikker på grunn av bestemt måten substrater er bygget. HMEC-1 celler ble sådd på disse protein-belagt hydrogels og deretter infisert med ulike Lm stammer som blir fluorescerende på internalisering eller er constitutively fluorescerende. Rollen av ECM stivhet på infeksjon mottakelighet celleområde vert HMEC-1 ble evaluert av flowcytometri. I tillegg immunostai- og fluorescens mikroskopi ble brukt til å skille mellom overholde og internalisert. Til slutt, trekkraft Force mikroskopi (TFM) ble utført betegner effekten av Lm infisert trekkraft stress som verten endotelceller øve på deres matriser under infeksjon. Presentert analysen kan enkelt endres for å aktivere videre studier av effekten av ECM stivhet på infeksjon mottakelighet av tilhenger celler ved hjelp av forskjellige linjer eller patogener.

Protocol

1. produksjon tynn to lag polyakrylamid (PA) Hydrogels på flere bra plater

  1. Oppløse ammonium persulfate (APS) i destillert ultrapure vann for å oppnå en siste konsentrasjon av 10 g/mL. Aliquot og lager løsningen på 4 ° C for kortvarig bruk (3 uker).
    Merk: Ovennevnte løsningen kan være forberedt før hydrogel fabrikasjon.
  2. Glass aktivering av 24-vel retter
    1. Inkuber 24-vel glass bunnplater med 13 mm-diameter brønner (se Tabell for materiale) 1t med 500 µL av 2 M NaOH per brønn ved romtemperatur.
    2. Skyll brønnene 1 x med ultrapure vann og legg deretter til 500 µL av 2% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (se Tabell for materiale) i 95% etanol hver godt for 5 min.
    3. Skyll brønnene 1 x igjen med vann og legge 500 µL av 0,5% glutaraldehyde i hver brønn for 30 min. skyll brønnene 1 x med vann og tørk dem på 60 grader med lokket.

Figure 1
Figur 1 : Bakteriell infeksjon analysen av verten cellene er bosatt på tynn to lag fluorescerende perle-embedded polyakrylamid (PA) hydrogels av varierende stivhet. A. Glass coverslips er kjemisk endret for å aktivere hydrogel vedlegg. B. 3,6 µL PA blandinger er avsatt på glassbunn. C. blandingen er dekket med en 12 mm rund glass dekkglassvæske å aktivere polymerisasjon. D. dekkglassvæske fjernes med en p-sprøyte. E. 2,4 µL av en PA løsning med microbeads er lagt til på det nederste laget og avsluttes med en sirkulær glass dekkglassvæske. F. en buffer legges i godt og dekkglassvæske fjernes. G. UV bestråling 1t sikrer sterilisering. H. en Sulfo-SANPAH-som inneholder løsning er lagt på geleer, som deretter plasseres under UV for 10 min. jeg. Hydrogels er vasket med en buffer og deretter inkubert natten med kollagen I. J. Hydrogel er equilibrated med cellen media. K. verten cellene er sådd. L. Lm bakterier legges til løsningen og infeksjon er synkronisert via sentrifugering. M. 1t etter infeksjon bakterier i løsningen er vasket bort, og media supplert med et antibiotikum legges. N. 4 h etter infeksjon, starter Lm (JAT985) fluorescing. O. HMEC-1 celler er løsrevet fra deres matrise og løsningene overføres til rør utføre flyt cytometri målinger. Merk at dager og omtrentlig tidspunkt for hvert trinn i analysen er også angitt. Dette tallet er endret fra Bastounis og Theriot59. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Polyakrylamid hydrogel fabrikasjon
    Merk: Se figur 1.
    1. Forberede vandige løsninger som inneholder 3-10% av 40% lager akrylamid løsning (se Tabell for materiale) og 0,06 - 0,6% 2% bis-akrylamid lagerløsning (se Tabell of Materials) til å produsere hydrogels av tunable stivhet fra 0,6 kPa til 70 kPa. Se tabell 1.
      1. 0,6 kPa hydrogels, blande 3% akrylamid med 0,045% bis-akrylamid. 3 kPa hydrogels, blande 5% akrylamid med 0.074% bis-akrylamid. 10 kPa hydrogels, blande 10% akrylamid med 0.075% bis-akrylamid. 20 kPa hydrogels, blande 8% akrylamid med 0.195% bis-akrylamid. 70 kPa hydrogels, blande 10% akrylamid med 0.45% bis-akrylamid.
        Merk: Nærmere om å oppnå ønskelig PA hydrogel stivhet kan finnes andre steder24,25,26,27.
    2. Forberede to vandige løsninger for hver ønskelig hydrogel stivhet. Forberede løsning 1 for å være perle-fri og løsning 2 inneholder 0,03% 0.1-µm diameter fluorescerende mikro-perler (se Tabell for materiale).
    3. Degas løsninger 1 og 2 av vakuum i 15 min for å eliminere oksygen som kan hemme av løsningene.
    4. Legge til 0,6% 10 g/mL APS løsning og 0.43% tetramethylethylenediamine (TEMED) i løsning 1 for å aktivere en polymerisering innvielse. Handle raskt.
    5. Legge til 3,6 µL løsning 1 i midten av hver brønn av 24-og retten (se trinn 1.2 for utarbeidelse).
    6. Umiddelbart dekke brønner med 12 mm ubehandlet sirkulære coverslips og la løsning 1 sitte for 20 min slik at det helt polymerizes.
    7. Forsiktig Tapp en sprøyte nål til en overflate å lage en liten krok på spissen sin å lette fjerning av coverslips. Løft coverslips med sprøytenålen.
    8. Legge til 0,6% 10 g/mL lager APS løsningen og 0.43% TEMED til løsning 2. Innskudd 2,4 µL av blandingen over det første laget i hver brønn på 24-vel parabolen.
    9. Dekke løsning 2 med 12 mm rund glass coverslips, forsiktig trykke nedover med en tang slik tykkelsen på det andre laget er minimal. La løsning 2 danner for 20 min.
    10. Legge til 500 µL av 50 mM HEPES pH 7.5 hver av brønnene og fjern glass coverslips med sprøyte nål og tang.
  2. Sterilisering, kollagen belegg og balanse av polyakrylamid hydrogels
    1. UV-utsett hydrogels 1t i vev kultur panseret tillate sterilisering.
    2. Forbered en blanding av 0,5% vekt/volum sulfosuccinimidyl 6-(4-azido-2 '-nitrophenylamino) hexanoate (Sulfo-SANPAH, se Tabellen for materiale) i 1% DMSO og 50 mM HEPES pH = 7.5.
    3. Legge til 200 µL av denne løsningen i den øvre overflaten av hydrogels. Handle raskt, utsette dem for UV (302 nm) i 10 min å aktivere dem.
    4. Vask hydrogels to ganger med 1 mL av 50 mM HEPES pH = 7.5. Gjenta fjernes om nødvendig å sikre at eventuelle overskytende crosslinker.
    5. Protein-coat hydrogels med 200 µL av 0,25 mg/mL rotte hale kollagen jeg (se Tabell for materiale) i 50 mM HEPES. Inkuber hydrogels, med kollagen løsning på toppen, over natten i romtemperatur.
      Merk: For å unngå dehydration/fordampning, plassere flere godt platene i en sekundær containment og legge laboratorium rengjøring vev dynket i vann i indre utkanten av kontroll.
    6. Bruke et epifluorescence eller AC confocal mikroskop med en 40 X mål for å måle tykkelsen på hydrogels. Ved å finne z posisjonene til bunnen (der glassoverflaten er) og topp fly av hydrogel (der fluorescerende perlene intensitet er maksimal). Deretter trekk z posisjoner å bestemme høyden.
      Merk: Vi brukte en invertert epifluorescence mikroskop og en 40 X-målet med numerisk blenderåpning 0,65 for å måle tykkelsen på hydrogels. Atomic Force mikroskopi målinger (AFM) kan også utføres på dette punktet for å bekrefte nøyaktig stivhet av hydrogels (se figur 2).
    7. Før såing cellene i renter på hydrogels, Legg 1 mL av medier på hydrogels og ruge dem på 37 grader i 30 minutter til 1 h å sikre balanse.
      Merk: Vi lagt MCDB-131 full media fordi det er media der modell verten cellene (HMEC-1) ble kultivert i (se trinn 2.1 for detaljer).

Figure 2
Figur 2: AFM målinger av PA hydrogel stivhet og perler distribusjon. A. Data viser de forventede unge modulus (mål av stivhet) av PA hydrogels, gitt mengden av akrylamid og bis-akrylamid brukt kontra den unge modulus målt gjennom AFM (N = 5-6). De horisontale barene skildrer gjennomsnittet. Stivhet av 0,6 kPa-hydrogels kunne ikke måles fordi hydrogels var veldig myk og overholdt AFM spissen. B. Dette er en fase av confluent HMEC-1 celler og tilhørende bildet av perlene innebygd på en myk 3 kPa-PA hydrogel øverste overflate. HMEC-1 ble sådd 24 h i en konsentrasjon av 4 x 105 celler per brønn. C. dette bildet er den samme som figur 2B men bor på en stiv 70-kPa PA hydrogel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. menneskets mikrovaskulær Endothelial cellekultur og Seeding på Hydrogels

  1. Kultur HMEC-1 (menneskelige, mikrovaskulær endothelial) celler i MCDB-131 full mediet som inneholder MCDB-131 media med 10% fosterets bovin serum, 10 ng/mL av epidermal vekstfaktor, 1 µg/mL av hydrocortisone og 2 mM av L-glutamin (se tabell for materiale ).
  2. Delt confluent kulturer 1:6 hver 3-4 dager og holde cellene før passering 40.
  3. Én dag før eksperimentet, koble cellene fra deres kultur fartøy bruker 0,25% trypsin/EDTA. Først vaske cellene og deres kultur fartøy 1 x med sterilt fosfat bufret saltvann (PBS), og deretter legge riktig mengde 0,25% trypsin/EDTA (2 mL per 100 mm parabolen eller 75 cm kolbe, 1 mL per 60 mm parabolen eller 25 cm kolbe), rugende kolbe på 37 ° C i 5-10 min å tillate brøkdel av cellene fra deres substrat.
  4. Nøytralisere trypsin ved å legge til ønsket antall MCDB-131 full media, Pipetter forsiktig å bryte opp klumper av celler, og deretter plassere løsningen i en konisk sentrifuge rør.
  5. Forsiktig swirl løsning av cellene slik at cellene er jevnt fordelt og tar ut 20 µL av løsningen og svært forsiktig Fyll ut kinesere under dekkglassvæske av et glass hemocytometer.
  6. Pellets ned løsningen celler i konisk sentrifuge røret med sentrifugering for 10 min 500 x g.
  7. Under 10 min venter perioden telle celler ved hjelp av en hemocytometer. Bruke et mikroskop, fokusere på rutenettlinjene i hemocytometer med en 10 X målet og deretter bruke en hånd telleapparat teller for å telle antall celler i en 1 x 1 mm firkantet.
  8. Flytte til hemocytometer til en annen 1 x 1 mm, telle celler det, og gjenta deretter prosessen to ganger. Beregne gjennomsnittet av de fire målene og deretter multiplisere gjennomsnittet av 104. Den siste verdien er antall levedyktig celler/mL i cellen suspensjon som er å være centrifuged.
  9. Fjern væsken ut av koniske sentrifuge slangen samtidig at pellet cellen ikke forstyrres. Resuspend cellene i MCDB-131 full media i en konsentrasjon av 4 x 105 celler/mL.
  10. Ætt cellene i suspensjon på hydrogels media som hydrogels ble inkubert og deretter legge til 1 mL av cellen suspensjon på hver hydrogel.

3. infeksjon av menneskelig mikrovaskulær endotelceller med L. monocytogenes

  1. Forhånd forberedelser
    Merk: Forberede følgende løsninger på forhånd.
    1. Streptomycin, chloramphenicol og gentamicin aksjer
      1. Klargjør 50 mg/mL streptomycin lager løsninger ved veiing 0,5 g streptomycin sulfate og oppløsning det helt inn 10 mL ultrapure vann.
      2. Klargjør 7.5 mg/mL chloramphenicol lager løsninger ved veiing 75 mg chloramphenicol og oppløsning det helt inn 10 mL av 100% etanol.
      3. Klargjør 20 mg/mL gentamicin lager løsninger ved veiing 0.2 g gentamicin sulfate og oppløsning det helt inn 10 mL ultrapure vann.
      4. Filter-sterilisere alle lager løsninger med filtere 0,2-µm sprøyten og lagre dem på 20 ° C for langsiktig bruk (1-2 måneder).
    2. Hjernen hjertet infusjon (BHI) media og agar plater
      1. Finn to 1-L flasker og legge til en magnetic røre stolpe inne hver kolbe.
      2. For BHI media, Legg 37 g BHI pulver i en flasken og Legg ultrapure vann opp 1 L. blanding løsningen kraftig ved å plassere kolbe på en magnetic røre plate til pulveret er oppløst.
      3. BHI agar plater, legge 37 g BHI pulver og 15 g granulert agar (se Tabell for materiale) i andre flasken og Legg ultrapure vann opptil 1 L. blanding løsningen kraftig ved å plassere kolbe på en magnetic røre plate til pulveret er oppløst.
      4. Skru lokkene på kolber ikke for hardt og autoklav løsninger ved hjelp av væsken innstilling eller ifølge autoclave's spesifikasjoner.
      5. Fjern løsningen fra autoclave og kjøle ned agar-BHI løsningen 55 ° C. Hvis BHI media i 1 L kolbe holdes sterilt, den kan brukes opptil en måned.
      6. For å forberede bakterier agar-BHI plater, legge til antibiotika, eventuelt til kolbe som inneholder BHI og agar (avhengig av bakteriell påkjenninger som skal dyrkes). Kort sett kolbe på en magnetic røre plate å tillate rask miksing.
        Merk: Antibiotika som brukes her er spesifikke for Lm påkjenningen brukes, men alle nødvendige antibiotika kan brukes i BHI-agar plater. Vi lagt streptomycin til en konsentrasjon av 200 µg/mL og chloramphenicol til en konsentrasjon av 7,5 µg/mL fordi 10403S Lm stammer er motstandsdyktig mot streptomycin. Disse stammer er konjugert med en plasmider som inneholder chloramphenicol acetyltransferase åpent lesing rammen, derfor motstanden mot chloramphenicol.
      7. Hell blandingen i 10 cm polystyren bakterier kultur plater (ca 20 mL per plate). For å kvitte seg med bobler, flamme den øvre overflaten av platene kort. Kul plater over natten i romtemperatur.
      8. Neste dag, forsegle tørr platene og lagre dem på 4 ° C.
  2. Infeksjon av menneskelig mikrovaskulær endotelceller med L. monocytogenes
    1. Tre dager før infeksjon, strek ut Lm stamme skal brukes fra en glyserol lager (lagret på-80 ° C) på en BHI-agar plate som inneholder 7,5 µg/mL chloramphenicol og 200 µg/mL streptomycin, hvis aktuelt.
      Merk: Belastning å bli stripete ut kan være en vill-type eller mutant, constitutively uttrykke fluorescens (for immunostaining JAT1045 ble brukt) eller uttrykke fluorescens under ActA arrangøren (for flyt cytometri eller trekkraft force mikroskopi JAT983 eller JAT985 ble brukt)22.
    2. Inkuber plater på 37 ° C før diskret koloniene er dannet (1-2 dager).
    3. Dagen før infeksjon, vokse ønsket belastningen over natten, riste den 150 RPM på 30 ° C i BHI medier med 7,5 µg/mL chloramphenicol (hvis aktuelt).
      1. Sted 5 mL BHI medium i en 15-mL konisk sentrifuge tube, Legg 7,5 µg/mL chloramphenicol (hvis aktuelt), og deretter vaksinere en enkelt koloni fra agar platen bruker et sterilt 10 µL tips.
    4. Neste dag, rett før infeksjon, måle den optiske densitet for bakterier løsningen på 600 nm (OD600) ved å fortynne eksempel 1:5; bruke søppel som inneholder BHI alene for å tjene som en tom.
    5. Fortynne overnatting kulturen til en OD600 0,1 og ruge, rister for 2t ved 30 ° C, i BHI medier med 7,5 µg/mL chloramphenicol (eventuelt) for å tillate bakterier å nå Logg-fase vekst.
    6. Måle OD600 av bakteriell løsningen, som er ventet å være rundt 0,2 - 0,3. Hvis OD600 er høyere, fortynne den til 0,2 - 0,3 med BHI alene.
    7. Ta 1 mL av bakteriell løsning i et microcentrifuge rør. Spinne den ned i 4 min 2000 x g bruker sentrifugering ved romtemperatur. Fjern nedbryting og resuspend bakteriell pellet i 1 mL av vev kultur-grade PBS, i vev kultur panseret. Vask bakterier to ganger mer ved å spinne dem ned i 4 min 2000 x g ved romtemperatur. Fjern nedbryting og resuspend bakterier i 1 mL av PBS.
    8. Klargjør infeksjon blandingen ved å blande 10 eller 50 µL av bakterier resuspended på PBS med 1 mL av MCDB-131 full medier for et mangfold av infeksjon (MOI; dvs, hvor mange bakterier per vert celle) av ca 50 bakterier per vert cellen eller 10 bakterier per vert celle.
    9. Fjern utskriftsmaterialet fra brønnene av 24-vel platene, forsiktig for ikke å forstyrre hydrogels eller celler. Vask cellene 1 x med 1 mL av MCDB-131 full media og tilsett 1 mL av bakterier i hver brønn.
    10. Holde noen infeksjon blanding (minst 100 µL) for fastsettelse av MOI (se trinn 3.3).
    11. Dekk platen med sin lokket og bryte platene med polyetylen maten brytes for å unngå. Sett platene i sentrifugen og spinne prøvene i 10 min 200 x g synkronisere invasjonen. Flytte platene til vev kultur inkubator og Inkuber dem i 30 min på 37 ° C.
    12. Vask prøvene 4 x med MCDB-131 full media og flytte dem til vev kultur inkubator. Etter en ytterligere 30 min, erstatte media med medier med 20 µg/mL gentamicin.
  3. Fastsettelse av mangfoldet av infeksjon (MOI)
    1. Under første 30-min incubation verten cellene med bakterier, forberede 10 ganger føljetong fortynninger av infeksjon mix å avgjøre MOI. Lage 10 ganger fortynninger ved å blande 100 µL av infeksjon blandingen med 900 µL av 1 x PBS (10-1 fortynning). Så, blande 100 µL av 10-1 fortynning med 900 µL av PBS (10-2 fortynning).
    2. Fortsett til en 10-5 fortynning hentes.
      Merk: Alle løsninger må blandes godt før fortynne dem, og frisk ren pipette-spisser skal brukes på hvert trinn.
    3. Når fortynninger foretas, plassere 100 µL av den 10-2 - 10-5 fortynninger på midten av BHI/agar/chloramphenicol/streptomycin plater (hvis aktuelt).
    4. Gjøre en sprederen fra en glass pipette med brann for å bøye pipette for å opprette en krok. Dypp Pipetter i 100% etanol for sterilisering og deretter brenne av etanol med en flamme.
    5. Når sprederen har avkjølt, spre bakteriell fortynninger homogent på plater fra 10-5 fortynning og flytte til mer konsentrert mikser. Inkuber platene opp ned på 37 ° C i 2 dager.
    6. Avhengig av kolonien tetthet, avgjøre antall kolonier av enten den 10-3 og 10-4 eller de 10-4 og 10-5 fortynning plater. Beregn MOI som følger:
      antall kolonier × fortynning faktor ÷ volum første lagt = antall CFU per µL
      antall CFU per µL × volum av bakterier blanding per brønn = antall CFU per brønn
      antall CFU per godt × volum av celler per brønn = antall bakterier per celle
      Merk: CFU står for colony-forming enheter.
    7. Gjennomsnittlig MOIs fra to plater for å få de endelige MOIs.

4. flowcytometri å kvantifisere ekstracellulær matrix-stivhet avhengige mottakelighet av verten cellene til infeksjon

  1. Veie 5 mg collagenase og plassere den i et 15-mL konisk sentrifuge rør. Tilsett 10 mL av 0,25% trypsin-EDTA og bland dem godt.
  2. 8 timer etter infeksjon, fjerne media fra brønnene av 24-vel plate og vask brønnene 1 x med vev kultur PBS. Fjern PBS fra brønnene og legge 200 µL av trypsin-EDTA/collagenase blandingen i hver brønn. Sett dette i vev kultur inkubator for 10 min å tillate full avdeling av cellene.
  3. Bruk en frisk pipette for hver brønn og Pipetter blanding opp og ned 8 x. Være forsiktig for å ikke skade cellene. Legge til 200 µL av full media hver brønn å nøytralisere trypsin.
  4. Overføre 400-µL celle løsning av hver brønn til et 5-mL polystyren rør med en 35-µm celle sil cap (se Tabell for materiale).
  5. Analysere 10.000-20.000 celler per utvalg av flowcytometri. Utføre datainnsamling via flowcytometri og finne ut prosentandelen av infiserte celler per brønn benytter en relevant kommersielt tilgjengelig programvare. Bruk fremover scatter versus siden scatter tomter til gate mesteparten av fordelingen av cellen teller.
    Merk: Dette vil sikre analyse av enkeltceller og eliminere avfall eller celle doublets eller trillinger.
    1. Måle fluorescens signalet fra kontroll-infisert celler og gate befolkningen av infiserte celler unntatt autofluorescence.

5. Immunostaining ekstracellulære bakterier, mikroskopi og bildebehandling

Merk: Denne metoden følges for å skille mellom ECM-stivhet avhengige bakteriell vedheft på verten celleoverflaten mot bakteriell internalisering (invasjonen) innen vertene.

Figure 4
Figur 4 : Immunostaining av HMEC-1 Lm-infiserte celler ligger på hydrogels av varierende stivhet å skille bakteriell vedheft mot invasjonen. Bildene viser et representativt eksempel på differensial immunostaining viser A. cellen kjerner (DAPI), B. alle bakterier (GFP), og C. utenfor bakterier (Alexa-546). HMEC-1 cellene var bosatt på en myk 3-kPa hydrogel. Pilene peker på bakterier som har blitt internalisert, så vises på den grønne kanalen bare. Data i D-F se N = 20 bilder tatt for infiserte HMEC-1 cellene bosatt på myke 3-kPa og stiv 70-kPa hydrogels ogVis D. total bakterier per kjerner; E. internalisert bakterier per kjerner; og F. invasjonen effektiviteten (forholdet mellom internalisert bakterier total bakterier). De horisontale barene skildrer dataenes betyr. P-verdi ble beregnet med ikke-parametriske Diversified rang Sum test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. 30 min etter infeksjon, vask HMEC-1 cellene infisert med JAT1045 (Lm som uttrykker constitutively grønne fluorescerende protein (GFP)) 4 x med media.
  2. Etter fjerde vask, bland 1 µL av 1 mg/mL Hoechst fargestoff med 1 mL av MCDB-131 full media og legge den til hver brønn stain cellenes kjerner. Plasser cellene i vev kultur inkubator for 10 min.
  3. Vask cellene 1 x med PBS. Fikse dem med et ikke-permeabilizing bindemiddel for differensial immunostaining etter 20 min på romtemperatur28.
    Merk: Bindemiddel inneholder 0.32 M sukrose, 10 mM MES pH 6.1, 138 mM KCl, 3 mM MgCl2, 2 mM EGTA, og 4% formaldehyd (elektronmikroskop grad).
  4. Vask cellene 1 x med PBS. Blokkere prøvene i 30 min med 5% bovin serum albumin (se Tabell for materiale) i PBS.
  5. Inkuber prøvene 1t med en anti-Lmprimære antistoff (se Tabell for materiale) utvannet 1: 100 i PBS som inneholder 2% BSA.
  6. Vaske prøvene i PBS 3 x og deretter Inkuber dem 1t med en AlexaFluor-546 geit-anti-kanin sekundære antistoff (se Tabell for materiale) fortynnet 1:250 i PBS som inneholder 2% BSA. Vask prøvene 3 x i PBS. Lagre prøvene i 1 mL av PBS for bildebehandling.
  7. Bilde og analysere mer enn 1000 celler per tilstand.
    1. Bildebehandling, bruker et omvendt epifluorescence mikroskop med CCD kamera (se Tabell for materiale) og en 40 X air plan fluoritt luft målet med 0,6 numeriske blenderåpning (NA).
      Merk: Makt er satt til 25% og eksponeringstid til 100 ms. mikroskop filtrene brukes for mCherry er 470/525 nm, GFP 530/645 nm og DAPI 395/460 nm, eksitasjon og utslipp henholdsvis. Mikroskopet vi brukte ble kontrollert av en åpen kildekode mikroskopi programvare pakke29.
    2. For differensial immunostaining, telle alle 'grønne' bakterier assosiert med enkeltceller som tilhenger. Telle bakterier som er både 'grønne' og ' red' (på grunn av antistoff bindende) som ikke er internalisert.
      Merk: Vi identifisert hvor kjerner ved å kjøre et spesiallaget skript og programmet CellC (se Tabell for materiale) for opplisting av bakterier30.

6. flere godt trekkraft Force mikroskopi og Monolayer Stress mikroskopi

Figure 5
Figur 5: HMEC-1 Lm-infiserte celler redusere omfanget av trekkraft krefter de øve på deres ECM under infeksjon. Panelet A viser fase bildet, B viser feltet deformasjon, C viser trekkraft stress feltet og D viser feltet intracellulær spenning infisert HMEC-1 cellene ligger på en 20-kPa hydrogel. Farge barer deformasjon kart (µm) av trekkraft stress kart (Pa) og av intracellulær spenning vises kart (nNµm-1) på den øvre delen av varme kart. Kolonnene viser tre representant tidspunkt: 3, 8 og 18 h etter infeksjon. Eh. Samme som paneler A-D , men for cellene infisert med Lm på en MOI 300. Bilder av bakterier (rød kanal) er superimposed på fase bilder av cellene. TFM innspillinger ble utført av imaging flere brønner samtidig. Vindusstørrelse for PIV var 32 piksler med en overlapping av 16. Skala baren er 32 µm. Dette tallet er endret fra Bastounis og Theriot59. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Forberede PA hydrogels på en 24-vel plate (se trinn 1). Frø HMEC-1 celler (se trinn 2) og infisere dem med JAT983 som beskrevet ovenfor (se trinn 3).
  2. Forbered en live-mikroskopi medium ved supplere Leibovitz's L-15 med 10% fosterets bovin serum og 10 ng/mL av epidermal vekstfaktor 1 μg/mL hydrocortisone.
    Merk: L-15 allerede inneholder 2 mM L-glutamin, så det ikke er nødvendig å legge ekstra som i tilfelle av MCDB-131 media.
  3. 4 h etter infeksjon (når den internalisert JAT983 starter fluorescing), bland 1 μL 1 mg/mL Hoechst fargestoff med 1 mL av L-15 sin helhet media og legge den til hver brønn stain cellenes kjerner. Plasserer cellene i vev kultur inkubator for 10 min og deretter erstatte i hver brønn L-15 full media med 1 mL av L-15 sin helhet media med 20 µg/mL gentamicin.
  4. Dekk platen med lokket og sted det i et mikroskop miljømessige kammer (se Tabell for materiale) equilibrated å 37 grader.
    Merk: For bildebehandling, bruker et omvendt epifluorescence mikroskop med CCD kamera (se Tabell for materiale) og en 40 X air plan fluoritt luft målet med 0,6 NA.
  5. Erverve flerkanals time-lapse bilder av fluorescerende perler og fluorescerende bakterier, og fase kontrast bilder av verten cellene, hvert 10 min 4 til 12 h.
    Merk: For avbilding, makt var satt til 25% og eksponeringstid til 100 ms. mikroskop filtre (eksitasjon/utslipp) brukes for mCherry og GFP er 470/525 nm og 530/645 nm henholdsvis.
  6. På slutten av innspillingen, legge 500 µL av 10% natrium dodecyl sulfate (SDS) i vann i hver av brønnene.
    Merk: Cellene vil være løsrevet fra hydrogel og hydrogel kommer tilbake til opprinnelig undeformed status siden det er elastisk.
  7. Ta et bilde av hydrogel og bruke den som referanse undeformed bildet.
  8. Bestemme todimensjonal deformasjon av hydrogel på hvert øyeblikk av tid med partikkel bilde velocimetry (PIV)31, sammenligne hvert bilde av time-lapse serien med referansebildet av den undeformed hydrogel. Bruk passende vindusstørrelsene og overlapper avhengig av eksperimentet.
    Merk: Vi brukt windows 32 piksler med overlapping mellom 16 piksler.
  9. Beregne 2D trekkraft understreker at celler øve på hydrogel som beskrevet andre steder32,33.
  10. Beregne monolayer spenningen fra trekkraft påkjenninger som tidligere beskrevet34 ved å løse ligninger av mekanisk likevekt for en tynn elastisk plate kan reaksjonsstyrker som er opprettet av PA-hydrogel på monolayer, som er av en Snu fortegn til målt trekkraft spenninger.
    Merk: Se tilleggsmateriale 1.

7. kvantitativ Time-lapse mikroskopi å vurdere Extracellular-matrix-stivhet avhengige L. monocytogenes spredning gjennom endotelceller

Figure 6
Figur 6: Time-lapse kvantitative mikroskopi data Lm spredning gjennom HMEC-1 monolayers plantet på underlag med 3-kPa og 70-kPa stivhet. A. dette panelet viser fortsatt bilder fra to representant infeksjon fokus på 0, 200, 400 og 600 min. Fase kanalen viser HMEC-1 celle monolayers, og den røde kanalen viser intracellulær Lm (se trinn 7 av protokollen). B. dette panelet viser området konveks skrog omfatter infeksjon fokus skal tegnes som en funksjon av tid. Fokusområdet av 3-kPa tilstanden (rød) vokser raskere enn 70-kPa (grønn). C. dette panelet viser den radielle avstanden fra midten til kanten av infeksjon fokus skal tegnes som en funksjon av tid for representant infeksjon foci vokser i HMEC-1 monolayers seeded på PA underlag av 3-kPa (rød) og 70-kPa (grønn) stivhet. Radial hastigheten (dr/dt) er konstant for 3-kPa betingelsen, men bifasisk for 70-kPa betingelsen. D. disse data viser hastigheten på radial første 200 min i ti uavhengig infeksjon fokus. Den røde (3-kPa) og grønn (70-kPa) datapunkter avbilder av to fokuspunktene beskrevet i forrige panelene. De horisontale barene skildrer dataenes betyr. P-verdi ble beregnet med ikke-parametriske Diversified rang Sum test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Forberede PA hydrogels på en 24-vel plate (se trinn 1), frø HMEC-1 celler (se trinn 2), og vokser overnatting JAT983 kulturer som beskrevet ovenfor (se trinn 3).
  2. Dagen for infeksjon, klargjør infeksjon blandingen ved å blande 10 µL av bakteriell pellet per mL av MCDB-131 full media. Nøye fjerne mediet fra brønnene av 24-vel platene, og legge 1,9 mL av MCDB-131 full media og 0,1 mL bakteriell blandingen i hver brønn.
    NOTE Det lavere MOI brukes i denne analysen er nødvendig å analysere formidling hendelser som starter fra en enkelt bakterie invadere en vert celle.
  3. Dekk platen med sin lokket og forsegle den med en plast brytes for å unngå. Sett platene i sentrifugen og spinne prøvene i 10 min 200 x g synkronisere invasjonen.
  4. Flytte platene til vev kultur inkubator og ruge dem i 5 min.
  5. Vask prøvene 4 x med medier og flytte dem til vev kultur inkubator. Etter en ekstra 5-7 min, erstatte media med medier med 20 µg/mL gentamicin.
  6. Inkuber platen i inkubator for en ekstra 5 h for å tillate actA arrangøren å slå og drive uttrykk for mTagRFP åpne lesing ramme35.
  7. Forbered en live-mikroskopi medium ved supplere Leibovitz's L-15 med 10% fosterets bovin serum og 10 ng/mL av epidermal vekstfaktor 1 µg/mL hydrocortisone.
    Merk: L-15 allerede inneholder 2 mM L-glutamin, så det ikke er nødvendig å legge ekstra som i tilfelle av MCDB-131 media.
  8. Mix 1 μL 1 mg/mL Hoechst farge med 1 mL av L-15 sin helhet media og legge den til hver brønn stain cellenes kjerner. Plasserer cellene i vev kultur inkubator for 10 min og deretter erstatte i hver brønn L-15 full media med 1 mL av L-15 sin helhet media med 20 µg/mL gentamicin. Dekk platen med lokket og sted det i et mikroskop miljømessige kammer (se Tabell for materiale) equilibrated å 37 grader.
    Merk: For imaging, en omvendt epifluorescence mikroskop ble brukt med CCD kamera (se Tabell for materiale) og en 20 X air plan fluoritt luft målet med 0,75 NA. Kraften var satt til 50% og eksponeringstid til 50 ms. mikroskop filtrene brukes for mCherry er 470/525 nm for eksitasjon og utslipp henholdsvis.
  9. Bilde flere posisjoner hver 5 min med en autofokus-funksjon til å overvåke hvordan Lm spres gjennom HMEC-1 monolayers seeded på varierende stivhet hydrogels.
    Merk: L-15 er bufret med HEPES, så det ikke er nødvendig å bruke CO2 under avbilding.

Representative Results

ECM stivhet-avhengige mottakelighet av HMEC-1 celler for Lm infeksjon:
PA hydrogels av varierende stivhet, alle overflaten-belagt med kollagen jeg, ble bygget på flere godt glass bunnplater som beskrevet i trinn 1 av protokollen (se figur 1). AFM målinger ble utført for å bekrefte nøyaktig stivhet av hydrogels, som beskrevet tidligere26,27 (se figur 2). Tidligere studier har vist at lokale etterlevelse av kjelleren membranen av endotelceller kan variere fra 1 kPa (f.eks, hjernevev) til 70 kPa (f.eks, aorta)36,37,38, 39 , 40. Derfor valgte vi å teste infeksjon av HMEC-1-celler som er bosatt på matriser med følgende stivhet: 0,6 kPa, 3 kPa, 20 kPa og 70 kPa. For hver hydrogel stivhet, ble seks hydrogels laget for å vurdere reproduserbarhet resultatene.

Flowcytometri ble brukt til å vurdere ECM stivhet-avhengige mottakelighet celleområde HMEC-1 Lm infeksjon (se fig. 3). HMEC-1 celler var infisert med en Lm stamme (JAT985) som uttrykker fluorescerende merketråd etter internalisering (actAp::mTagRFP), slik at påvisning av intracellulære bakterier bare (se figur 1 L - 1N). JAT985 mangler også ActA, deaktivere bakteriene sprer seg fra celle til celle, siden ActA er nødvendig for dannelsen av utgangen kometen hale og påfølgende bakteriell formidling. 7 - 8 timer etter infeksjon, HMEC-1 cellene infeksjon ble vurdert ved hjelp av flowcytometri. Slik analyse av enkeltceller, var mesteparten av fordelingen av celletall gated bruker fremover mot siden spredningsdiagram, og deretter andre gating trinnet ble utført for å utelate celler som viser autofluorescence (se tallene 3A - 3 C ). De foreløpige resultatene avbildet i Figur 3 viser at HMEC-1-infeksjon med Lm er omtrent to ganger større for HMEC-1-celler som er bosatt på de stive 70 kPa hydrogels i forhold til celler som er bosatt på de myke 0,6 kPa hydrogels (se tallene 3B - 3D). økt Lm infeksjon mottakelighet av HMEC-1 cellene er bosatt på stiv i forhold til myke matriser kan være grunn: 1. økt Lm vedheft på HMEC-1; 2. økt Lm invasjonen i HMEC-1; eller 3. begge de ovennevnte co-oppstår. For å teste hypotesen som holder, var HMEC-1 celler seeded myk (3 kPa) og stiv (70 kPa) hydrogels og infisert med constitutively GFP uttrykke Lm (se tallene 4A - 4 C). Prøvene ble fast etter infeksjon og eksterne (overholde) bakterier var farget med antistoffer. Bruker kvantitative mikroskopi, fant vi at det er betydelig mer bakterier overholder HMEC-1 når verten cellene ligger på stiv sammenlignet med myk gelé (se Figur 4D). Samsvar med flyt cytometri dataene, det er betydelig mer bakterier internalisert HMEC-1 når verten cellene ligger på stiv sammenlignet med myk gelé (se Figur 4E). Imidlertid invasjonen effektiviteten (bakterier internalisert/totalt antall bakterier) av Lm i HMEC-1 celler er tilsvarende, uansett substrat stivhet (se Figur 4F).

Trekkraft tvinge mikroskopi Lm-infiserte HMEC-1 celler:
Lm infeksjon av HMEC-1 celler kan endre biomekanikk av infiserte verten cellene, inkludert styrken av vedlegg til deres ECM eller hverandre, påvirker deres barriere integritet. Vi søkte å vurdere om det kan være tilfelle ved hjelp av trekkraft Force mikroskopi32 å beregne celle-ECM trekkraft styrker og Monolayer Stress mikroskopi41 beregne intracellulær tensional krefter. Figur 5 viser kart av deformasjon feltet, trekkraft stress feltet og intracellulær spenning feltet av HMEC-1 cellene er bosatt på 20-kPa hydrogels på ulike tidspunkt poeng etter infeksjon. Tallene 5A - 5 D refererer til uninfected kontroll HMEC-1 celler mens tallene 5E - 5 H refererer til HMEC-1 celler infisert med Lm på et mangfold av smitte til 300 bakterier/mobiltelefon. Dette forarbeidet antyder at infiserte HMEC-1 celler redusere omfanget av sin celle-ECM og intracellulær påkjenninger i løpet av en infeksjon med Lm, mens det ikke blir observert for infisert kontroll celler.

ECM stivhet-avhengige Lm formidling på tvers av HMEC-1 monolayers:
Time-lapse mikroskopi ble brukt til å undersøke effekten matrix stivhet har på Lm spredning gjennom HMEC-1 monolayers. Som Lm sprer seg gjennom monolayer, opprette bakterier fokus for infeksjon som vokser som en funksjon av tid (se figur 6A og Video tall 1 og 2). Området infeksjon fokus ble målt ved å tegne en konveks skrog, den minste konvekse polygonen som omfatter en rekke steder, rundt bakterier42. Det er ingen standard metriske i feltet for å måle effektiviteten av L. monocytogenes celle til celle spredning gjennom en monolayer på verten cellene. For å vurdere spredning effektivitet, noen har talt antall vertsceller i en infeksjon fokus41, og andre har trukket grenser manuelt rundt gruppen med infeksjon verten cellene43. Vi valgte å trekke en konveks polygon rundt bakterier, fordi det er en automatisert, konsekvent og beregningsmessig rimelig prosess å måle effektiviteten av L. monocytogenes spredning. Dermed fant vi en liten nedgang i fokusområdet infeksjon i HMEC-1 cellene seeded på 70 kPa hydrogels i forhold til de seeded på 3 kPa matriser (se figur 6B og Video tall 1 og 2). For å bestemme hastigheten av vekst av infeksjon fokus, den radielle avstanden var skal tegnes som en funksjon av tid ved å ta kvadratroten av infeksjon fokus og dele dette med pi. Denne matematiske transformasjonen forutsetter at formen på infeksjon fokus er omtrentlig sirkulær44. For å måle hastigheten på veksten fokus, ble graden av endring (dvs., skråningen) av den radielle avstanden for begge 3 - og 70-kPa matriser målt. Denne tilnærmingen belyst at infeksjon fokus vokste raskere og monotonically i HMEC-1 celler seeded på 3-kPa matriser. Men vokste fokus betydelig lavere (første 200 min) og litt tregere (200 til 600 min) i cellene seeded på 70-kPa matriser (se figur 6C). Faktisk analyse av ytterligere data bekreftet at infeksjon fokus vokste, i gjennomsnitt to ganger tregere i 70-kPa matriser, spesielt i de første 200 min (se figur 6D).

Figure 3
Figur 3 : ECM stivhet-avhengige mottakelighet celleområde HMEC-1 Lm invasjon målt ved hjelp av flowcytometri .  HMEC-1 celler var infisert med Lm (JAT985) og infeksjon ble analysert av flowcytometri. A. dette panelet viser en side kontra frem spredningsdiagram for representant HMEC-1 cellene kommer fra en enkelt brønn. Hovedtyngden distribusjon av celler ble valgt via gating for å utelukke rusk (venstre) og celle doublets eller trillinger (høyre). B. denne grafen viser et histogram for logaritmen til Lm fluorescens intensiteten per celle for HMEC-1 belagt på myke 0,6 kPa. C. denne grafen viser et histogram for logaritmen til Lm fluorescens intensiteten per celle for HMEC-1 belagt på stiv 70 kPa hydrogels. Histogrammer for N = 4-6 gjentak vises i forskjellige farger. Kontroll infisert cellene histogrammet er lilla. Porten brukes til å definere hva er infisert vises i rødt. MOI er 100 infeksjonen var vurdert 8 timer etter infeksjon. D. Data viser prosentandelen av infiserte HMEC-1 celler mot hydrogel stivhet (N = 5). De horisontale barene skildrer dataenes betyr. P-verdi ble beregnet med ikke-parametriske Diversified rang Sum test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Video Figure 1
Video figur 1: spredning av intracellulær Lm (rød kanal) gjennom en HMEC-1 celle monolayer (fase) seeded på et 3-kPa substrat. Cellene ble avbildet i Leibovitz's L-15 media (10% FBS, 20 µg/mL gentamicin) inne en miljømessig kammer equilibrated å 37 grader. Bildene ble samlet hver 5 min. Filmen hastigheten er 15 rammer/s. Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video Figure 2
Video figur 2: formidling av intracellulær Lm (rød kanal) gjennom en HMEC-1 celle monolayer (fase) seeded på en 70-kPa substrat. Cellene ble avbildet i Leibovitz's L-15 media (10% FBS, 20 µg/mL gentamicin) inne en miljømessig kammer equilibrated til 37 ° C. Bildene ble samlet hver 5 min. Filmen hastigheten er 15 rammer/s. Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Youngs modul (E, kPa) Akrylamid % (fra 40% aksjer) Bisacrylamide % (fra 2% aksjer)
0,6 3 0,045
3 5 0.075
10 10 0.075
20 8 0.195
70 10 0.45

Tabell 1. Sammensetningen av polyakrylamid (PA) hydrogels av varierende stivhet. i denne tabellen andelen lager 40% akrylamid løsning og andelen av lager 2% bis-akrylamid løsning å oppnå en gitt stivhet (Youngs modul, E) angis i forskjellige kolonner.

Supplemental Material
Supplerende materiale 1. Beregning av intracellulær spenningen fra beregnet trekkraft påkjenninger. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Cellene kan forstand en rekke fysiske miljømessige signaler, som kan påvirke ikke bare cellenes morfologi, men også deres genet uttrykk og protein aktivitet, noe som påvirker kritiske celle funksjoner og atferd45,46. Stivhet av ECM celler er stadig mer verdsatt som en viktig modulator mobilnettet motilitet, differensiering, spredning, og til slutt cellen skjebne47,48,49. Selv om det har vært mange nylige fremskritt i å forstå komplekse biomekaniske samspillet mellom celler og deres ECM, er lite kjent om hvordan de miljømessige stivheten påvirker mottakelighet av celler til bakteriell infeksjon. For å lette slike studier, utviklet vi denne romanen flere godt analysen basert på veletablerte fabrikasjon av polyakrylamid hydrogels av tunable stivhet som er kompatibel med infeksjon analyser50. Tradisjonelt, har en bakteriell infeksjon i celler i vev kultur vært studert på glass eller polystyren overflater som er ca 1-3 størrelsesordener stivere enn naturlig ECM av mest tilhenger celler8,51. Analysen beskrevet her åpner nye motorveier av muliggjør studiet av bakterier vert interaksjoner i en fysiologisk relevante miljømessige stivhet regime.

Konseptbeviskode til presentert analysen, ble HMEC-1 celler valgt som modell tilhenger vertsceller og Lm som en modell bakteriell patogen. Imidlertid kan analysen forlenges for ytterligere studier hvis hensiktsmessig endret. Slike studier kan innebære infeksjon av ulike pattedyr tilhenger vert celletyper av flere patogener, som bakterier og virus. For denne spesielle analysen, gels ble protein-belagt med kollagen jeg, men avhengig verten celle, er det mulig å bruke en annen ECM protein-belegg, som laminin eller fibronectin, for å forenkle feste verten cellene rundt på hydrogel 52. tas som avhenger verten celle er hydrogel stivhet området studier. Utvalget av stivhet bør avhenge av hva er fysiologisk relevant for den bestemte verten celle og hvor godt den verten festes danner en monolayer til en gitt stivhet hydrogel. Tilsvarende avhengig av modell patogen ønsket undersøkes, må liten modifikasjoner implementeres på infeksjon analysen beskrevet her.

Innovasjonen av analysen i forhold til forrige metoder for produksjon polyakrylamid hydrogels24,50,53 ligger i visse unike funksjoner integrert i foreslåtte infeksjon analysen. Først, hydrogels er bygd på flere godt glass bunnplater, som gjør screening av flere vilkår samtidig, samt automatisering av bestemte prosedyrer. Overvåke flere betingelser på samme tid eller undersøke flere gjentak er avgjørende siden utfallet av en slik tilnærming kan påvirkes av faktorer som verten celle passering og hvor mange bakterier lagt til infisere vertene, som ofte endres mellom uavhengige eksperimenter. En unik tilleggsfunksjon for denne analysen er at hydrogels har en høyde på ca 40 µm, som er tynne nok til å bilde ved hjelp av konvensjonelle mikroskopi. Vi viste at vi kan utføre både levende celle mikroskopi og celle fiksering og immunostai-etterfulgt av bildebehandling, uten introdusere høye fluorescens. Til slutt, hydrogels er laget av to lag, med den øvre har innebygd fluorescerende microbeads, i en enkelt fokalplanet. Attributten sikrer at det blir ingen ut-av-fokusere lys konflikt under bildebehandling. Tilstedeværelsen av perlene kan både undersøkelse av overflaten topografien geléer å sikre at de ensartet og forbedrer TFM og MSM24,32,41. Med TFM og MSM er det mulig å beregne celle-ECM og celle-celle styrkene av cellene er bosatt på varierende stivhet matriser. Bruker denne romanen analysen, er det mulig å foreta slike målinger av fysiske krefter ved å sammenligne begge bidrag av miljømessige stivhet og infeksjon samtidig. Etter en slik tilnærming har effekten infeksjonen på verten celle mekanikk gjennom kurs kan bestemmes. Dessuten utviklingen av intracellulær stresset celler kan beregnes ved hjelp av MSM og kan brukes som et mål på barriere integriteten til monolayer. Til slutt er gitt flere godt natur analysen, det mulig å samtidig innføre farmakologiske og genetiske forstyrrelser med en bakteriell infeksjon, å undersøke grundigere det komplekse samspillet mellom verten celle mekanikk og infeksjon.

En iboende begrensning av teknikken ligger i effekt substrat stivhet kan ha på spredningen rate av celler. Vanligvis i infeksjon analyser må vi sikre at verten celle tetthet under ulike forhold er den samme. Det er fordi cellen tetthet av seg selv kan ha en effekt på mottakelighet av verter til infeksjon. HMEC-1 cellene som ble brukt som verten cellene viser ikke en betydelig forskjell i deres tall når seeded 24 h på hydrogels. Imidlertid kan forskjellige celletyper utstilling differensial spredning, avhengig av hydrogel stivhet, som kan lede infeksjon studier. Tilsvarende kan infeksjon skjevhet oppstå når celler utgjør ikke monolayers eller ikke feste på hydrogels, som oppstår når visse celletyper er seeded på myke matriser (f.eks, menneskelige navlestreng endotelceller eller Madin-Darby hjørnetann nyre epitelceller seeding på 0,6-kPa hydrogels54,55). Såvidt patogener er bekymret, visse bakterier (f.eks Borrelia burdgorferi) kan koble til verten cellene og invadere dem, men kan også transmigrate gjennom dem56. Vi har ennå ikke testet Hvis denne analysen vil arbeide for patogen transmigration studier, men det synes mulig siden tidligere studier på nøytrofile transmigrating endotelceller seeded på PA hydrogels er dokumentert for å lykkes57. Det har vært mange studier viser hvordan produksjon polyakrylamid hydrogels av en gitt ung modulus ved å blande de aktuelle konsentrasjonene av akrylamid og bis-akrylamid24,25,26 ,27. Imidlertid, spesielt når man ønsker å utføre TFM eksperimenter på bor på hydrogels av varierende stivhet, er det viktig å bekrefte forventede stivhet av hydrogels enten gjennom AFM eller andre innrykk teknikker58. Avvik fra forventet verdi kan forekomme et annet løsemiddel brukes eller en alderen akrylamid lager løsning, eller måtene AFM målinger er utført (f.eksform av AFM spissen). Til slutt er tilnærmingen som presenteres her basert på seeding verten cellene i 2D matriser, som kan variere fra en mer realistisk og fysiologisk relevante 3D. Men omfatter produksjon 3D gels med tunable stivhet, såing dem med verten cellene og deretter infiserer dem med patogener, fortsatt visse tekniske problemer. Likevel forventer vi at i nær framtid vi vil være i stand til å utvide gjeldende analysen for å studere infeksjon i 3D omgivelser.

For å oppsummere, beskrevet protokollen sammen med de foreløpige resultatene gir bevis for at denne romanen analysen kan bli et svært nyttig verktøy for å studere infeksjon tilhenger vert celler med patogene bakterier i en kvantitativ mote og mye mer fysiologisk relevante miljøet enn tidligere undersøkt. Kraften i fabrikere polyakrylamid hydrogels i foreslåtte oppsettet ligger i at analysen er kompatibel med resultatene av flere teknikker som flowcytometri, immunostai-etterfulgt av * lys, og trekkraft tvinge mikroskopi. Analysen kan brukes for studier som involverer infeksjon av annen tilhenger vert celletyper av patogener, som vi forventer vil ha en betydelig innvirkning både unraveling strategier som patogener infisere verter og tilrettelegge for utvikling av terapeutiske tiltak mot infeksjoner.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vår takk til M. bunntekst, R. Lamason, M. Rengaranjan og medlemmer av det Theriot for diskusjoner og eksperimentell støtte. Dette arbeidet ble støttet av NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), HHMI Gilliam fellesskap for avanserte studier (F.E.O.), Stanford Graduate Fellowship (F.E.O.) og American Heart Association (E.E.B.). Flowcytometri ble utført ved Stanford deles FACS anlegget.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Sodium hydroxide pellets Fisher S318-500
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma A3648
25% gluteraldehyde Sigma G6257-100ML
40% Acrylamide Sigma A4058-100ML
Bis-acrylamide solution (2%w/v) Fisher Scientific BP1404-250
Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) Invitrogen F8803
Ammonium Persulfate Fisher BP17925
TEMED Sigma T9281-25ML
Sulfo-SANPAH Proteochem c1111-100mg
Collagen, Type I Solution from rat Sigma C3867-1VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO) J.T. Baker 9224-01
HEPES, Free acid J.T. Baker 4018-04
Leibovitz's L-15 medium, no phenol red Thermofischer 21083027
MCDB 131 Medium, no glutamine Life technologies 10372019
Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A Gemini Bio-Prod 900108 500ml
Epidermal Growth Factor, EGF Sigma E9644
Hydrocortisone Sigma H0888
L-Glutamine 200mM Fisher SH3003401
DPBS 1X Fisher SH30028FS
Gentamicin sulfate MP biomedicals 194530
Cloramphenicol Sigma C0378-5G
DifcoTM Agar, Granulated BD 214530
BBL TM Brain-heart infusion BD 211059
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water Invitrogen H3570
Formaldehyde 16% EM grade Electron microscopy 15710-S
Anti-Listeria monocytogenes antibody Abcam ab35132
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 546 conjugate Thermofischer A-11035
0.25% trypsin-EDTA , phenol red Thermofischer 25200056
COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC Sigma C8051
Streptomycin sulfate Fisher Scientific 3810-74-0
Sucrose Calbiochem 8510
Sodium dodecyl sulfate Thermofischer 28364
MES powder Sigma M3885
KCl J.T. Baker 3040-05
MgCl2 J.T. Baker 2444-1
EGTA Acros 40991
Disposable lab equipment
12 mm circular glass coverslips Fisherbrand 12-545-81 No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated
Glass bottom 24 well plates Mattek P24G-1.5-13-F
5 ml polystyrene tubes with a 35 μm cell strainer cap  Falcon 352235
T-25 flasks Falcon 353118
50 ml conical tubes Falcon 352070
15 ml conicals tubes Falcon 352196
Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) Falcon 357551
Pasteur Glass Pipettes VWR 14672-380
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) Denville P1122, P1126
Powder Free Examination Gloves Microflex XC-310
Cuvettes bacteria Sarstedt 67.746
Razors VWR 55411-050
Syringe needle BD 305167
0.2um sterilizng bottles Thermo Scientific 566-0020
20 ml syringes BD 302830
0.2um filters Thermo Scientific 723-2520
wooden sticks Grainger 42181501
Saran wrap Santa Cruz Biotechnologies sc-3687
Plates bacteria Falcon 351029
Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood Baker SG504
Hemacytometer Sigma Z359629
Bacteria incubator Thermo Scientific IGS180
Tissue culture Incubator NuAire NU-8700
Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope Nikon NIKON-DIAPHOT-200
Cage Incubator Haison Custom
Scanford FACScan analyzer  Stanford and Cytek upgraded FACScan Custom
Pipette Aid Drummond 4-000-110
Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul) Gilson F144802, F123601, F123602
pH meter Mettler Toledo 30019028
forceps FST 11000-12
1 L flask Fisherbrand FB5011000 
Autoclave machine Amsco 3021
Stir magnet plate Bellco 7760-06000
Magnet stirring bars Bellco 1975-00100
Spectrophotometer Beckman DU 640
Scanford FACScan analyzer Cytek Biosciences Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan
Software
Microscope Software (μManager) Open Imaging
Matlab Matlab Inc
Flowjo FlowJo, LLC
Automated image analysis software, CellC https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
  2. Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: a dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
  3. Trepat, X., Lenormand, G., Fredberg, J. J. Universality in cell mechanics. Soft Matter. 4 (9), 1750-1759 (2008).
  4. Maruthamuthu, V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. Cell-ECM traction force modulates endogenous tension at cell-cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4708-4713 (2011).
  5. Fujiwara, I., Suetsugu, S., Uemura, S., Takenawa, T., Ishiwata, S. Visualization and force measurement of branching by Arp2/3 complex and N-WASP in actin filament. Biochemical and Biophysical Research Communications. 293, 1550-1555 (2002).
  6. Ingber, D. E. Tensegrity-based mechanosensing from macro to micro. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 97 (2-3), 163-179 (2008).
  7. LaValley, D. J., Zanotelli, M. R., Bordeleau, F., Wang, W., Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness enhances VEGFR-2 internalization, signaling, and proliferation in endothelial cells. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 044001 (2017).
  8. Mason, B. N., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Matrix stiffness: a regulator of cellular behavior and tissue formation. Engineering Biomaterials for Regenerative Medicine: Novel Technologies for Clinical Applications. Bhatia, S. K. , Springer. New York, NY. 19-37 (2012).
  9. El-Mohri, H., Wu, Y., Mohanty, S., Ghosh, G. Impact of matrix stiffness on fibroblast function. Materials Science and Engineering: C. 74, Supplement C 146-151 (2017).
  10. Asano, S., et al. Matrix stiffness regulates migration of human lung fibroblasts. Physiological Reports. 5 (9), (2017).
  11. Burgess, J. K., Mauad, T., Tjin, G., Karlsson, J. C., Westergren-Thorsson, G. The extracellular matrix: the under-recognized element in lung disease. The Journal of Pathology. 240 (4), 397-409 (2016).
  12. Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
  13. Jackson, K. A., Iwamoto, M., Swerdlow, D. Pregnancy-associated listeriosis. Epidemiology and Infection. 138 (10), 1503-1509 (2010).
  14. Theriot, J., Rengarajan, M. Exploitation of host cell processes for bacterial cell-to-cell spread. The FASEB Journal. 28, 1 Supplement (2014).
  15. Pollard, T. D., Beltzner, C. C. Structure and function of the Arp2/3 complex. Current Opinion in Structural Biology. 12 (6), 768-774 (2002).
  16. Pollard, T. D. Cellular motility powered by actin filament assembly and disassembly. Harvey Lectures. 98, 1-17 (2002).
  17. Reed, S. C., Lamason, R. L., Risca, V. I., Abernathy, E., Welch, M. D. Rickettsia actin-based motility occurs in distinct phases mediated by different actin nucleators. Current Biology. 24 (1), 98-103 (2014).
  18. Gerbal, F., Chaikin, P., Rabin, Y., Prost, J. An elastic analysis of Listeria monocytogenes propulsion. Biophysical Journal. 79 (5), 2259-2275 (2000).
  19. Weber, I. Is there a pilot in a pseudopod. European Journal of Cell Biology. 85 (9-10), 915-924 (2006).
  20. Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76 (3), 505-517 (1994).
  21. Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
  22. Rengarajan, M., Hayer, A., Theriot, J. A. Endothelial cells use a formin-dependent phagocytosis-like process to internalize the bacterium Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 12 (5), 1005603 (2016).
  23. Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11 (10), 1212-1218 (2009).
  24. Bastounis, E., et al. Both contractile axial and lateral traction force dynamics drive amoeboid cell motility. The Journal of Cell Biology. 204 (6), 1045-1061 (2014).
  25. Georges, P., Miller, W., Meaney, D., Sawyer, E., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
  26. Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
  27. Engler, A., Bacakova, L., Newman, C., Hategan, A., Griffin, M., Discher, D. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
  28. Yam, P. T., Theriot, J. A. Repeated cycles of rapid actin assembly and disassembly on epithelial cell phagosomes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5647-5658 (2004).
  29. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), (2014).
  30. Selinummi, J., Seppala, J., Yli-Harja, O., Puhakka, J. A. Software for quantification of labeled bacteria from digital microscope images by automated image analysis. BioTechniques. 39 (6), 859-863 (2005).
  31. Gui, L., Wereley, S. T. A correlation-based continuous window-shift technique to reduce the peak-locking effect in digital PIV image evaluation. Experimental Fluids. 32, 506-517 (2002).
  32. del Alamo, J. C., et al. Spatio-temporal analysis of eukaryotic cell motility by improved force cytometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13343-13348 (2007).
  33. Hur, S. S., et al. Roles of cell confluency and fluid shear in 3-dimensional intracellular forces in endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11110-11115 (2012).
  34. Banerjee, I., et al. Cyclic stretch of embryonic cardiomyocytes increases proliferation, growth, and expression while repressing Tgf-β signaling. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 79, 133-144 (2015).
  35. Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathogens. 7 (3), 1002005 (2011).
  36. Wood, J. A., Liliensiek, S. J., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Biophysical cueing and vascular endothelial cell behavior. Materials. 3 (3), 1620-1639 (2010).
  37. Kohn, J. C., Lampi, M. C., Reinhart-King, C. A. Age-related vascular stiffening: causes and consequences. Frontiers in Genetics. 6, 112 (2015).
  38. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
  39. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).
  40. Onken, M. D., Mooren, O. L., Mukherjee, S., Shahan, S. T., Li, J., Cooper, J. A. Endothelial monolayers and transendothelial migration depend on mechanical properties of the substrate. Cytoskeleton (Hoboken). 71 (12), 695-706 (2014).
  41. Lamason, R. L., et al. Rickettsia Sca4 reduces vinculin-mediated intercellular tension to promote spread. Cell. 167 (3), 670-683 (2016).
  42. Wu, T. -C., Belteton, S., Pack, J., Szymanski, D. B., Umulis, D. LobeFinder: a convex hull-based method for quantitative boundary analyses of lobed plant cells. Plant Physiology. 171 (4), 2331-2342 (2016).
  43. Czuczman, M. A., et al. Listeria monocytogenes exploits efferocytosis to promote cell-to-cell spread. Nature. 509 (7499), 230-234 (2014).
  44. Liebhold, A. M., Tobin, P. C. Population ecology of insect invasions and their management. Annual Reviews in Entomology. 53, 387-408 (2008).
  45. Miller, C. J., Davidson, L. The interplay between cell signaling and mechanics in developmental processes. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 733-744 (2013).
  46. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), Cambridge, England. 1407-1420 (2010).
  47. Yeh, Y. T., et al. Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9. PLoS One. 7 (10), 46889 (2012).
  48. Ali, M. Y., Chuang, C. Y., Saif, M. T. Reprogramming cellular phenotype by soft collagen gels. Soft Matter. 10 (44), 8829-8837 (2014).
  49. Tse, J., Engler, A. Stiffness gradients mimicking in vivo tissue variation regulate mesenchymal stem cell fate. PLoS ONE. 6 (1), 15978 (2011).
  50. Ananthakrishnan, R., Ehrlicher, A. The forces behind cell movement. International Journal of Biological Sciences. 3, 303-317 (2007).
  51. Kolahi, K. S., et al. Effect of substrate stiffness on early mouse embryo development. PLoS ONE. 7 (7), 41717 (2012).
  52. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  53. Kiener, H. P., Lee, D. M., Agarwal, S. K., Brenner, M. B. Cadherin-11 induces rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes to form lining layers in vitro. American Journal of Pathology. 168, 1486-1499 (2006).
  54. Kaliman, S., Jayachandran, C., Rehfeldt, F., Smith, A. -S. Novel growth regime of MDCK II model tissues on soft substrates. Biophysical Journal. 106 (7), 25-28 (2014).
  55. Saunders, R. L., Hammer, D. A. Assembly of human umbilical vein endothelial cells on compliant hydrogels. Cellular and Molecular Bioengineering. 3 (1), 60-67 (2010).
  56. Wu, J., Weening, E. H., Faske, J. B., Hook, M., Skare, J. T. Invasion of eukaryotic cells by Borrelia burgdorferi requires β1 integrins and Src kinase activity. Infection and Immunity. 79 (3), 1338-4138 (2011).
  57. Stroka, K. M., Aranda-Espinoza, H. Endothelial cell substrate stiffness influences neutrophil transmigration via myosin light chain kinase-dependent cell contraction. Blood. 118 (6), 1632 (2011).
  58. Keer, L. M. Stress distribution at the edge of an equilibrium crack. Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 12 (3), 149-163 (1964).
  59. Bastounis, E. E., Theriot, J. A. A highly quantitative multi-well format assay for studying the effect of extracellular matrix mechanics on the bacterial infection of endothelial cells. Athens Journal of Sciences. 4 (1), 7-20 (2017).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 137 tilhenger pattedyrceller bakteriell infeksjon endotelet flowcytometri trekkraft force mikroskopi polyakrylamid hydrogels immunostai- substrat stivhet
En multi godt Format polyakrylamid-baserte analysen for å studere effekten av ekstracellulær Matrix stivhet på bakteriell infeksjon av tilhenger celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bastounis, E. E., Ortega, F. E.,… More

Bastounis, E. E., Ortega, F. E., Serrano, R., Theriot, J. A. A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells. J. Vis. Exp. (137), e57361, doi:10.3791/57361 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter