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Immunology and Infection

Un ensayo de base poliacrilamida formato multi-bien para estudiar el efecto de la rigidez de la matriz extracelular en la infección bacteriana de las células adherentes

Published: July 5, 2018 doi: 10.3791/57361
Automatic Translation
1, 1, 2, 3
1Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine, 2Department of Mechanical and Aerospace Engineering, University of California San Diego, 3Departments of Biochemistry, Microbiology and Immunology and Howard Hughes Medical Institute, Stanford University School of Medicine

Summary

Hemos desarrollado un ensayo de base poliacrilamida formato multi-bien para sondear el efecto de la rigidez de la matriz extracelular en la infección bacteriana de las células adherentes. Este análisis es compatible con citometría de flujo, inmunotinción y microscopía de fuerza de tracción, lo que permite mediciones cuantitativas de las interacciones biomecánicas entre las células y su matriz extracelular, las bacterias patógenas.

Abstract

Rigidez de la matriz extracelular constituye uno de los múltiples estímulos ambientales mecánicos que son bien conocidos para influir en comportamiento celular, la función y el destino en general. Aunque las respuestas cada vez más tipos de células adherentes a tiesura de la matriz se han caracterizado, como adherente de susceptibilidad de las células a la infección bacteriana depende de la rigidez de la matriz es en gran medida desconocido, como es el efecto de la infección bacteriana en el Biomecánica de las células del huésped. Presumimos que la susceptibilidad de las células endoteliales del huésped a una infección bacteriana depende de la rigidez de la matriz en la que estas células residen, y que la infección del huésped células con bacterias que cambiará su biomecánica. Para poner a prueba estas dos hipótesis, las células endoteliales fueron utilizadas como modelo hosts y Listeria monocytogenes como un patógeno de modelo. Mediante el desarrollo de un ensayo de novela formato multi-bien, nos muestran que el efecto de la rigidez de la matriz sobre la infección de células endoteliales por L. monocytogenes puede evaluarse cuantitativamente a través de citometría de flujo y el immunostaining seguido por microscopia. Además, utilizando microscopía de fuerza de tracción, el efecto de la infección por L. monocytogenes en la biomecánica de la célula endotelial de host puede estudiarse. El método propuesto permite el análisis del efecto de la mecánica de tejido relevante sobre infección bacteriana de las células adherentes, que es un paso decisivo hacia la comprensión de las interacciones biomecánicas entre las células, la matriz extracelular, y bacterias patógenas. Este método también es aplicable a una amplia variedad de otros tipos de estudios en biomecánica celular y respuesta a la rigidez del sustrato donde es importante ser capaz de realizar muchas repeticiones en paralelo en cada experimento.

Introduction

Las células en los tejidos más animales son típicamente adherentes, fijación a células vecinas y a su matriz extracelular (ECM). El anclaje de las células para su ECM es crítico para muchos procesos celulares que van desde la movilidad de la célula a la célula de la proliferación y supervivencia de1,2. Celular anclaje al ECM depende de la composición del ECM y la rigidez. Las células responden a los cambios en el último por reordenación dinámicamente su citoesqueleto, adherencias de ECM de la célula y célula, que a su vez críticamente alteran celulares funciones y biomecánica3,4,5,6 . Rigidez del ECM puede variar en el espacio (es decir, localización anatómica) en tiempo (es decir, envejecimiento) y en procesos fisiopatológicos (p. ej., arteriosclerosis, cáncer, infecciones, etc.). Por ejemplo, está ampliamente aceptado que endothelial las células que residen en más rígido-en comparación con matrices más suave ejercen fuerzas mayores a la ECM y uno al otro y exhiben mayor motilidad y proliferación7,8. Asimismo, fibroblastos residentes en matrices más imparten altas fuerzas contráctiles a lo ECM y aumento de la proliferación, movilidad y ECM producción9,10,11. Aunque mecánica celular y respuesta a la rigidez de la ECM han sido estudiados ampliamente para diversos tipos de células, la relación entre las células del huésped adherente, la rigidez de su ECM y las infecciones bacterianas es aún desconocida.

Para estudiar el papel de la rigidez de la ECM en las interacciones de célula de bacterias-host, L. monocytogenes (Lm) fue elegido como el patógeno de la modelo. LM es una bacteria ubicua transmitidas por los alimentos que puede causar infección sistémica en una amplia variedad de hospedadores mamíferos. Este patógeno intracelular facultativo puede mover desde el epitelio intestinal a órganos distantes por atravesar diferentes tipos de endothelia vascular. Si se practica una abertura la barrera blood - brain, Lm puede causar meningitis, y cuando cruza la placenta, puede causar aborto espontáneo12,13. LM puede infectar a tipos diferentes host de la célula y puede hacerlo mediante el uso de estrategias diferentes de patógenos. Infección de la LM se ha estudiado sobre todo en el contexto de las células epiteliales, mientras que mucho menos se sabe acerca de cómo puede infectar a Lm y derivación de células endoteliales recubren el lumen de los vasos sanguíneos14,15,16. Por otra parte, se desconoce todavía en gran parte cómo la rigidez de la ECM donde residen las células endoteliales modula la capacidad de Lm para invadir las células del huésped y luego se extendió. LM y varias otras especies bacterianas (es decir, Rickettsia parkeri) tomar ventaja del citoesqueleto de actina del huésped que infectan tanto células invaden en su citoplasma y facilitan la diseminación de célula a célula17 , 18 , 19. que alcanzan a través de la expresión de proteínas que puedan interferir con vías de polimerización de actina host y producir colas de cometa de actina que facilitan su propulsión16,20. Como resultado de infección, el citoesqueleto de actina de la célula huésped necesita cambiar dinámicamente de manera que no se caracteriza, podrían afectar la biomecánica de las células del anfitrión como las fuerzas físicas que ejercen en su ECM y en cada uno otros. Para examinar estos procesos, las células endoteliales microvasculares humanas (juego 1) fueron elegidas como las células del huésped modelo por tres razones: 1. las células endoteliales son conocidas por ser altamente mechanosensitive como están constantemente expuestos a las diversas señales físicas21; 2. las estrategias que emplea a Lm para infectar las células endoteliales son todavía en gran parte desconocido22; y 3. JUEGO-1 son una línea celular inmortalizada y puede, por lo tanto, ser fácilmente cultivados y sometidos a manipulación genética.

Infección bacteriana de las células del huésped ha sido sobre todo estudiado en vitro por la siembra de células en vidrio o poliestireno sustratos que son significativamente más rígidos que el ECM fisiológico de la mayoría células12,14,23. Examinar la infección de las células sembradas en una matriz cuya rigidez es fisiológicamente relevante y aclarar el papel de la rigidez de la ECM en la infección de células por bacterias patógenas, seguimos un enfoque innovador basado en la fabricación de finas hidrogeles de poliacrilamida del microbead incrustado de rigidez ajustable en placas de varios pocillos. La novedad de la propuesta radica en que permite un monitoreo varias condiciones simultáneamente debido a su formato y bien y que es compatible con múltiples técnicas debido a la forma particular que los sustratos se construyen. JUEGO-1 células fueron sembradas en estos hidrogeles recubierto de proteína y luego infectadas con diferentes cepas de Lm que son constitutivamente fluorescentes o ser fluorescente sobre internalización. El papel de la rigidez de la ECM en la susceptibilidad de la infección de las células del huésped puede-1 se evaluó por citometría de flujo. Además, inmunotinción y fluorescencia microscopía fueron utilizados para distinguir entre bacterias adherentes e internalizadas. Por último, microscopia de fuerza de tracción (TFM) fue realizada con éxito para caracterizar el efecto de la infección de la Lm en las tensiones de tracción que ejercen las células endoteliales del huésped en sus matrices durante la infección. El ensayo presentado puede modificarse fácilmente para permitir más estudios sobre el efecto de la rigidez de la ECM en la susceptibilidad de la infección de células adherentes utilizando diferentes líneas celulares o patógenos.

Protocol

1. fabricación de hidrogeles de poliacrilamida de dos capas delgadas (PA) en las placas de varios pocillos

  1. Persulfato de amonio (APS) se disuelven en agua destilada ultrapura para alcanzar una concentración final de 10 g/mL. Alícuota y tienda la solución a 4 ° C para uso a corto plazo (3 semanas).
    Nota: La solución anterior puede ser preparada antes de la fabricación de hidrogel.
  2. Activación del cristal de 24 pocillos platos
    1. Incubar las placas inferiores de 24 pocillos de vidrio con 13 pozos de mm de diámetro (véase Tabla de materiales) durante 1 h con 500 μl de 2 M NaOH por bien a temperatura ambiente.
    2. Lave los pocillos 1 x con agua ultrapura y luego agregar 500 μl de trietoxisilano 2% (3-aminopropil) (véase Tabla de materiales) en etanol al 95% para cada bien durante 5 minutos.
    3. Lave los pocillos 1 x otra vez con agua y agregar 500 μl de glutaraldehído al 0.5% a cada pocillo para 30 minutos enjuagar los pozos 1 x con agua y secar a 60 ° c con la tapa.

Figure 1
Figura 1 : Ensayo de una infección bacteriana de las células del huésped que reside en hidrogeles de fina dos capas fluorescentes embebido en grano poliacrilamida (PA) de rigidez variable. A. cubreobjetos de vidrio químicamente se modifican para permitir el accesorio de hidrogel. B. 3.6 μl de mezclas de PA se depositan en los fondos de cristal. C. la mezcla se cubre con un cubreobjetos de vidrio circular de 12 mm para permitir la polimerización. D. cubreobjetos se extrae con una jeringa de aguja. E. 2.4 μL de una solución de PA con microesferas se añade encima de la capa de fondo y tapa con un cubreobjetos de vidrio circular. F. se añade un buffer en el pozo y se retira el cubreobjetos. G. la irradiación UV de 1 h asegura esterilización. H. una solución que contiene el Sulfo-SANPAH se añade en los geles, que se colocan debajo de UV por 10 minutos . Los hidrogeles son lavados con un tampón y luego se incubaron toda la noche con colágeno I. J. El hidrogel es equilibrado con los medios de comunicación de la célula. K. se siembran las células hospedadoras. L. Las bacterias de la LM se agregan a la solución y la infección se sincroniza mediante centrifugación. M. bacterias de infección después de 1 h en la solución se lavaron y se añade los medios suplementados con un antibiótico. N. infección después de 4 h, Lm (JAT985) comienza fluorescentes. O. juego-1 células se desprende de su matriz y las soluciones se transfieren a tubos para realizar mediciones de citometría de flujo. Tenga en cuenta que también se indican los tiempos aproximados para cada paso del análisis. Esta figura ha sido modificada de Bastounis y Theriot59. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Fabricación del hidrogel de poliacrilamida
    Nota: Vea figura 1.
    1. Preparar soluciones acuosas que contienen 3-10% de solución stock de acrilamida al 40% (véase Tabla de materiales) y 0.06 - bis-acrilamida solución de stock de 0,6% del 2% (véase Tabla de materiales) para la fabricación de los hidrogeles de rigidez ajustable desde 0.6 kPa kPa 70. Vea la tabla 1.
      1. Para 0,6 kPa hidrogeles, mezcla 3% acrilamida con 0.045% bis-acrilamida. Para 3 kPa hidrogeles, mezclar 5% de acrilamida con 0.074% bis-acrilamida. Para 10 kPa hidrogeles, mezcla 10% acrilamida con bis-acrilamida de 0.075%. Para 20 kPa hidrogeles, mezcla 8% acrilamida con 0.195% bis-acrilamida. Para 70 kPa hidrogeles, mezclar 10% de acrilamida con 0.45% bis-acrilamida.
        Nota: Más información en el logro de la deseable rigidez de hidrogel PA puede encontrarse en otra parte24,25,26,27.
    2. Prepare dos soluciones acuosas de cada hidrogel deseable rigidez. Preparar la solución 1 para ser libre de grano y 2 de solución que contiene 0.03% 0.1 μm de diámetro fluorescente micro cuentas (véase Tabla de materiales).
    3. Degas soluciones 1 y 2 de vacío durante 15 min para eliminar el oxígeno que se sabe que inhiben la polimerización de las soluciones.
    4. Añadir 0,6% de la bolsa de 10 g/mL solución APS y tetramethylethylenediamine de 0,43% (TEMED) a solución 1 para permitir una iniciación de polimerización. Actuar con rapidez.
    5. Añadir 3,6 μl de solución 1 para el centro de cada pocillo de la placa de 24 pocillos (ver paso 1.2 para su preparación).
    6. Inmediatamente cubrir los pocillos con cubreobjetos circulares no tratada de 12 mm y deje solución 1 durante 20 min para que polimeriza completamente.
    7. Golpee suavemente una aguja de jeringa a una superficie para crear un pequeño gancho en su extremo para facilitar la eliminación de los cubreobjetos. Levantar el cubreobjetos usando la aguja de la jeringa.
    8. Añadir 0,6% de la solución madre de APS de 10 g/mL y 0.43% TEMED a la solución 2. Depósito 2.4 μL de la mezcla sobre la primera capa en cada pocillo de la placa de 24 pocillos.
    9. Solución 2 la cubierta con cubreobjetos de vidrio circular de 12 mm, suavemente presionando hacia abajo con un par de pinzas para asegurar el espesor de la segunda capa es mínima. Deje que la solución 2 polimerice durante 20 minutos.
    10. Agregar 500 μl de pH HEPES 50 mM 7,5 a cada uno de los pozos y luego retire los cubreobjetos de vidrio con la aguja de la jeringuilla y pinzas.
  2. Esterilización, capa de colágeno y equilibrado de hidrogeles de poliacrilamida
    1. UV-exponga los hidrogeles para 1 h en la campana de cultivo de tejidos para permitir la esterilización.
    2. Preparar una mezcla de 0.5% peso/volumen sulfosuccinimidyl 6-(4′-azido-2 '-nitrophenylamino) hexanoato (Sulfo-SANPAH, véase Tabla de materiales) en pH de 1% DMSO y 50 mM HEPES = 7.5.
    3. Añadir 200 μL de esta solución a la superficie superior de los hidrogeles. Actuar rápido, exponerlos a los rayos UV (302 nm) durante 10 min activarlas.
    4. Lavar los hidrogeles dos veces con 1 mL de pH HEPES 50 mM = 7.5. Repetir si es necesario para asegurarse de que cualquier exceso crosslinker se retira.
    5. Capa de la proteína los hidrogeles con 200 μL de rata de 0.25 mg/mL cola colágeno I (véase Tabla de materiales) en 50 mM de HEPES. Incubar los hidrogeles, con la solución de colágeno en la parte superior, durante la noche a temperatura ambiente.
      Nota: Para evitar la deshidratación/evaporación, coloque las placas de varios pocillos en una contención secundaria y añadir laboratorio limpieza tejidos empapados en agua en la periferia interna de la contención.
    6. Use un epifluorescencia o confocal microscopio con objetivo 40 X para medir el grosor de los hidrogeles. Hacerlo ubicando las posiciones z de la parte inferior (donde es la superficie de vidrio) y encima planos de hidrogel (donde es máxima la intensidad fluorescente de los granos). Luego reste las posiciones z para determinar la altura.
      Nota: Se utilizan un microscopio de epifluorescencia invertida y un objetivo de 40 X con apertura numérica de 0.65 para medir el grosor de los hidrogeles. Mediciones de microscopía de fuerza atómicas (AFM) se pueden realizar también en este punto para confirmar la rigidez exacta de los hidrogeles (ver figura 2).
    7. Antes de sembrar las células de los intereses de los hidrogeles, añadir 1 mL de medios de comunicación en los hidrogeles e incubar a 37 ° c por 30 min a 1 h para conseguir el equilibrio.
      Nota: Hemos añadido MCDB 131 completo medios de comunicación ya es el medio donde las células del anfitrión del modelo (juego 1) fueron cultivadas en (ver paso 2.1 para más detalles).

Figure 2
Figura 2: medidas de AFM de PA hidrogel rigidez y distribución de granos. A. módulo de Young esperado (medida de la rigidez) de la PA los datos muestran hidrogeles, dados la cantidad de acrilamida y bis-acrilamida utilizada frente a módulo de Young medido a través de AFM (N = 5-6). Las barras horizontales representan la media. La rigidez de los 0,6 kPa hidrogeles no se podía medir ya que los hidrogeles fueron muy suave y adherido a la punta AFM. B. esta es una imagen de la fase de células confluentes de juego-1 y la imagen correspondiente de los granos incrustados en la superficie superior de un hidrogel suave 3 kPa-PA. El juego-1 fueron sembradas por 24 h a una concentración de 4 x 105 células por pocillo. C. esta imagen es la misma como figura 2B pero las células que residen en un hidrogel de PA dura 70-kPa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. cultura de célula endotelial Microvascular humana y siembra en hidrogeles

  1. 1 juego de la cultura (humanos, microvasculares endoteliales) células MCDB 131 completo medios que contienen medio MCDB 131 suplementado con suero bovino fetal 10%, 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico, 1 μg/mL de hidrocortisona y 2 mM de L-glutamina (véase tabla de materiales de ).
  2. Dividir las culturas confluyentes 1:6 cada 3-4 días y mantener las células hasta paso 40.
  3. Un día antes del experimento, separar las células de la nave de cultura utilizando 0.25% tripsina/EDTA. Primero lavar las células y su nave de cultura 1 x con fosfato estéril tamponada con solución salina (PBS) y agregue la cantidad apropiada de 0.25% tripsina/EDTA (2 mL por 100 mm plato o 75 cm matraz, 1 mL por 60 mm plato o matraz de 25 cm), incubando el frasco a 37 ° C durante 5-10 min. para permitir la separación de las células de su substrato.
  4. Neutralizar la tripsina agregando el volumen deseado de MCDB 131 completo los medios de comunicación, pipetee suavemente para dispersar los grumos de células y luego coloque la solución en un tubo de centrífuga cónico.
  5. Agitar la solución de las células para que las células se distribuyen uniformemente y después saque 20 μl de la solución y muy suavemente llenar las dos cámaras bajo el cubreobjetos del hemocitómetro de un vidrio.
  6. De pellets a la solución de células contenidas en el tubo de centrífuga cónico mediante centrifugación durante 10 minutos a 500 x g.
  7. Durante el período de espera de 10 min, contar las células usando un hemocitómetro. Utilizar un microscopio, se centran en las líneas de la rejilla del hemocitómetro con el objetivo 10 X y luego use un contador de mano cuenta para contar el número de células en un 1 x 1 mm cuadrada.
  8. Hacia el hemocitómetro de otro cuadrado de 1 x 1 mm, contar las células allí y luego repetir el proceso dos veces más. Calcular el promedio de las cuatro mediciones y luego multiplique el promedio por 104. El valor final es el número de células viable/mL en la suspensión de células que se se centrifuga.
  9. Retire el líquido del tubo de centrífuga cónico asegurando que no se interrumpa el sedimento celulares. Resuspender las células en los medios de comunicación completo de MCDB 131 a una concentración de 4 x 105 células/mL.
  10. Las células en suspensión en los hidrogeles de la semilla retirando primero los medios con los cuales se incubaron los hidrogeles y luego agregar 1 mL de la suspensión celular en cada hidrogel.

3. infección de células endoteliales microvasculares humanas con L. monocytogenes

  1. Preparación
    Nota: Preparar las siguientes soluciones de antemano.
    1. Acción de la estreptomicina, cloranfenicol y gentamicina
      1. Preparar 50 mg/mL de estreptomicina soluciones pesar 0.5 g de sulfato de estreptomicina y disolver completamente en 10 mL de agua ultrapura.
      2. Prepare los 7,5 mg/mL de cloranfenicol soluciones pesando 75 mg de cloranfenicol y disolverse completamente en 10 mL de etanol al 100%.
      3. Preparar 20 mg/mL de gentamicina soluciones madre pesa 0,2 g de sulfato de gentamicina y disolver completamente en 10 mL de agua ultrapura.
      4. Filtro-esterilizar todas las soluciones stock con un filtro de jeringa de 0,2 μm y almacenar a-20 ° C para uso a largo plazo (1-2 meses).
    2. Cerebro corazón infusión (BHI) medios agar las placas y
      1. Localice dos matraces de 1 L y agregar una barra de agitación magnética dentro de cada matraz.
      2. Para los medios de comunicación BHI, 37 g de polvo BHI en un matraz y añadir agua ultrapura hasta 1 L. mezclar la solución vigorosamente por colocar el matraz sobre una placa de agitación magnética hasta que se disuelva el polvo.
      3. Para las placas de agar BHI, añadir 37 g de polvo BHI y 15 g de agar granulado (véase Tabla de materiales) en el segundo frasco y agregar agua ultrapura hasta 1 L. mezclar la solución vigorosamente por colocar el matraz sobre una placa de agitación magnética hasta que se disuelva el polvo.
      4. Atornille las tapas de los frascos no demasiado apretado y autoclave las soluciones usando el líquido ajuste o según las especificaciones de la autoclave.
      5. Retire la solución de la autoclave, a continuación, enfriar la solución de agar BHI a 55 ° C. Si los medios BHI en el matraz de 1 L se mantienen estéril, puede ser utilizado por hasta un mes.
      6. Para preparar las bacterias de las placas de agar BHI, primero añadir antibióticos, si procede, en el matraz que contiene BHI y agar (dependiendo de las cepas bacterianas para ser cultivada). Brevemente poner el matraz sobre una placa de agitación magnética para permitir una mezcla rápida.
        Nota: Los antibióticos usados aquí son específicos a las Lm las cepas utilizadas, pero algún antibiótico necesario puede ser utilizado en placas de BHI agar. Añadimos estreptomicina a una concentración de 200 μg/mL y el cloramfenicol a una concentración de 7.5 μg/mL porque 10403S Lm cepas son resistentes a estreptomicina. Estas cepas han sido conjugados con un plásmido que contiene el cloranfenicol acetiltransferasa marco abierto de lectura, por lo tanto la resistencia al cloranfenicol.
      7. Vierta la mezcla en bacterias de poliestireno de 10 cm de las placas de cultivo (aproximadamente 20 mL por placa). Para eliminar burbujas, llama brevemente la superficie superior de las placas. Placas de frío durante la noche a temperatura ambiente.
      8. Al día siguiente, sellar las placas secas y almacenar a 4 ° C.
  2. Infección de células endoteliales microvasculares humanas con L. monocytogenes
    1. Tres días antes de la infección, raya al Lm tensión para ser utilizado de un stock de glicerol (almacenado a-80 ° C) sobre una placa de agar BHI que contiene 7,5 μg/mL de cloranfenicol y 200 μg/mL de estreptomicina, si procede.
      Nota: La cepa para ser rayado hacia fuera puede ser un tipo salvaje o mutante, constitutivamente expresan fluorescencia (para la inmunotinción que se utilizó JAT1045) o expresión de fluorescencia bajo el promotor del ActA (por flujo citometría o tracción microscopía de fuerza JAT983 o JAT985 se utilizaron)22.
    2. Incube las placas a 37 ° C hasta que las colonias discretas se forman (1-2 días).
    3. El día antes de la infección, crecer la cepa deseada durante la noche, agitación a 150 rpm a 30 ° C en medio BHI con 7,5 μg/mL de cloranfenicol (si procede).
      1. Lugar 5 mL de medio BHI en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL, añadir 7,5 μg/mL de cloranfenicol (si procede) y luego inocular una sola Colonia de la placa de agar utilizando un estéril 10 μl.
    4. Al día siguiente, justo antes de la infección, medir la densidad óptica de la solución de las bacterias a 600 nm (OD600) diluyendo la muestra 1:5; utilizar una cubeta que contiene BHI solo para servir como un espacio en blanco.
    5. Diluir la cultura durante la noche a una OD600 de 0,1 e incubar, agitándolo durante 2 h a 30 ° C en medio BHI con 7,5 μg/mL de cloranfenicol (si procede) para permitir que las bacterias alcanzar fase logarítmica de crecimiento.
    6. Medir la OD600 de la solución bacteriana, que se espera que sea alrededor de 0.2 - 0.3. Si la OD600 es superior, diluirla a 0.2 - 0.3 con BHI solo.
    7. Tomar 1 mL de la solución bacteriana en un tubo de microcentrífuga. Desactivación por 4 min a 2.000 x g utilizando centrifugación a temperatura ambiente. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado bacteriano en 1 mL de PBS de cultivo de tejidos-grado, en la campana de cultivo de tejidos. Lave las bacterias dos veces más girando por 4 min a 2.000 x g a temperatura ambiente. Quite el sobrenadante y resuspender las bacterias en 1 mL de PBS.
    8. Preparar la mezcla de infección mediante la mezcla de 10 o 50 μl de las bacterias suspendidas en PBS con 1 mL de medio completo MCDB 131 para una multiplicidad de infección (MOI; es decir, el número de bacterias por célula huésped) de aproximadamente 50 bacterias por célula huésped o 10 bacterias por la célula huésped.
    9. Retire los medios de comunicación de los pozos de las placas de 24 pocillos, cuidadosos de no interrumpir los hidrogeles y las células. Lavar las células 1 x con 1 mL de MCDB 131 completo de los medios de comunicación y luego añadir 1 mL de la bacteria a cada pocillo.
    10. Mantener cierta mezcla de infección (al menos 100 μL) para la determinación de MOI (vea el paso 3.3).
    11. Cubra la placa con su tapa y envolver las placas con una envoltura de alimentos de polietileno para evitar fugas. Coloque las placas en la centrífuga y centrifugar las muestras durante 10 min a 200 x g para sincronizar la invasión. Las placas en la incubadora de cultivo de tejidos e incubar durante 30 min a 37 ° C.
    12. Lavar las muestras 4 x con MCDB 131 completo medios y muévalas a la incubadora de cultivo de tejidos. Después de una 30 min adicional, sustituir los medios de comunicación con los medios suplementados con 20 μg/mL de gentamicina.
  3. Determinación de la multiplicidad de infección (MOI)
    1. Durante la incubación de 30 min inicial de las células del anfitrión con la bacteria, se preparan diluciones seriadas 10 veces de la mezcla de la infección para determinar el MOI. Realizar diluciones 10 veces al mezclar 100 μl de la mezcla de infección con 900 μl de PBS 1 x (dilución 10-1 ). Luego, mezclar 100 μl de la dilución 10-1 con 900 μl de PBS (dilución 10-2 ).
    2. Continuar hasta obtener una dilución 10-5 .
      Nota: Todas las soluciones deben mezclarse bien antes de diluirlos, y las puntas de pipeta limpia fresca se deben utilizar en cada paso.
    3. Una vez que se hacen las diluciones, colocar 100 μl de la 10-2 - 10-5 diluciones en el centro de las placas BHI/agar/cloranfenicol/estreptomicina (si procede).
    4. Hacer un separador de una pipeta de vidrio mediante el uso de fuego para doblar la pipeta para crear un gancho. Sumerja la pipeta en etanol al 100% para la esterilización y luego quemar el etanol con una llama.
    5. Una vez se haya enfriado el separador, difundir las diluciones bacterianas homogéneamente en las placas a partir de la dilución 10-5 y pasar a la mezcla más concentrada. Incubar las placas boca abajo a 37 ° C durante 2 días.
    6. Dependiendo de la densidad de la Colonia, determinar el número de colonias de la 10-3 y 10-4 o el 10-4 y placas de dilución de 10-5 . Calcular el MOI como sigue:
      número de colonias x dilución factor ÷ volumen inicial añadido = número de UFC por μl
      número de UFC por μl × de volumen de la mezcla de bacterias por pozo = número de UFC por pocillo
      número de UFC por bien × volumen de células por pocillo = número de bacterias por célula
      Nota: UFC está parado para la formación de colonias unidades.
    7. El MOIs de dos placas para obtener la humedad final del media.

4. citometría de flujo para cuantificar tiesura de matriz extracelular susceptibilidad dependiente de las células del huésped a la infección

  1. Pesan 5 mg de colagenasa y colocar en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL. Añadir 10 mL de 0.25% tripsina-EDTA y mezclar bien.
  2. 8 h post-infección, eliminar los medios de comunicación de los pozos de la placa de 24 pocillos y lavar los pocillos 1 x con el cultivo de tejidos PBS. Retirar el PBS de los pozos y añadir 200 μL de la mezcla de tripsina-EDTA/colagenasa a cada pocillo. Coloque esto en la incubadora de cultivo de tejido por 10 min permitir la separación completa de las células.
  3. Utilice una pipeta nueva para cada pozo y pipetee la mezcla arriba y abajo de 8 x. Ser suave para no dañar las células. Añadir 200 μL de medios completos para cada bien para neutralizar la tripsina.
  4. Transferir la solución celular de 400 μL de cada pocillo a un tubo de poliestireno de 5 mL con una tapa de tamiz de 35 μm celular (véase Tabla de materiales).
  5. 10.000-20.000 células por cada muestra a analizar mediante citometría de flujo. Realizar adquisición de datos a través de citometría de flujo y determinar el porcentaje de células infectadas por pozo utilizando un software disponible comercialmente relevante. Utilizar la dispersión hacia delante frente a lado diagramas de dispersión para la mayor parte de la distribución de los recuentos de células de la puerta.
    Nota: Esto asegura la análisis de las células y eliminar desechos o dobletes de célula o trillizos.
    1. Medir la señal de fluorescencia de las células control no infectados y la población de las células infectadas, excluyendo la autofluorescencia de la puerta.

5. Immunostaining de las bacterias extracelulares, microscopía y procesamiento de imágenes

Nota: Este enfoque es seguido para diferenciar adherencia bacteriana dependiente de ECM-rigidez en la superficie de la célula anfitrión versus internalización bacteriana (invasión) dentro de los anfitriones.

Figure 4
Figura 4 : Inmunotinción de Lm-infectados puede-1 células que residen en hidrogeles de rigidez variable para diferenciar adherencia bacteriana versus invasión. Estas imágenes muestran un ejemplo representativo de immunostaining diferencial muestra A. los núcleos celulares (DAPI), B. todas las bacterias (GFP) y C. las bacterias exterior (Alexa-546). Las células de juego-1 residían en un hidrogel suave 3-kPa. Las flechas señalan a las bacterias que han sido internalizadas, por lo que se muestran en sólo el canal verde. Datos en D-F se refieren a N = 20 imágenes captadas por las células infectadas de juego-1 que residen en suave 3-kPa y dura 70-kPa hidrogeles ymuestran D. el total de bacterias por núcleos; E. las bacterias internalizadas por núcleos; y F. la eficiencia de la invasión (la proporción de bacterias internalizadas para bacterias totales). Las barras horizontales representan la media de los datos. El P-valor se calculó con la prueba no paramétrica de Wilcoxon Rank Sum. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. 30 minutos post-infección, lave el juego-1 células infectadas con JAT1045 (Lm que expresa constitutivamente la proteína verde fluorescente (GFP)) x 4 con los medios de comunicación.
  2. Después del cuarto lavado, 1 μl de 1 mg/mL de la mezcla colorante Hoechst con 1 mL de medio completo MCDB 131 y añadir a cada pocillo para teñir los núcleos de las células. Colocar las células en la incubadora de cultivo de tejido por 10 min.
  3. Lavar las células 1 x con PBS. Fijar con un fijador no permeabilizing de immunostaining diferencial por 20 min a temperatura ambiente28.
    Nota: El fijador contiene 0,32 M de sacarosa, pH de 10 mM MES 6.1, 138 mM KCl, 3 mM MgCl2, 2 mM EGTA y 4% formaldehído (grado de microscopia electrónica).
  4. Lavar las células 1 x con PBS. Bloquear las muestras durante 30 minutos con 5% albúmina de suero bovino (véase Tabla de materiales) en PBS.
  5. Incubar las muestras durante 1 h con un anti-Lmanticuerpo primario (ver Tabla de materiales) diluido 1: 100 en PBS con BSA 2%.
  6. Las muestras de lavado en PBS 3 x y luego los Incube por 1 h con un AlexaFluor-546 anticuerpo secundario de cabra anti-conejo (véase Tabla de materiales) diluido 1: 250 en PBS con BSA 2%. Lavar las muestras 3 x en PBS. Almacenar las muestras en 1 mL de PBS para la proyección de imagen.
  7. La imagen y analizar más de 1.000 células por condición.
    1. Para la proyección de imagen, usar un microscopio de epifluorescencia invertida con una cámara CCD (véase Tabla de materiales) y un 40 X objetivo de aire aire plan de Fluorita con 0,6 apertura numérica (NA).
      Nota: El poder se establece en 25% y el tiempo de exposición a 100 ms. los filtros del microscopio utilizados para mCherry son 470/525 nm, GFP 530/645 nm y DAPI 395/460 nm, de excitación y emisión respectivamente. El microscopio que fue controlado por un código abierto software microscopía paquete29.
    2. Para diferencial immunostaining, cuenta todas las 'verdes' bacterias asociadas a células individuales como adherente. Cuenta de bacterias que son 'verdes' y 'rojo' (debido a la Unión de anticuerpos) como no internalizado.
      Nota: Identificamos el número de núcleos mediante la ejecución de un script a medida y el software CellC (véase Tabla de materiales) para la enumeración de las bacterias30.

6. microscopia de fuerza de tracción varios pocillos y monocapa estrés microscopía

Figure 5
Figura 5: las células infectadas por Lm juego-1 disminuir la magnitud de las fuerzas de tracción que ejercen sobre su ECM durante la infección. Panel A muestra la imagen de fase, B el campo de deformación, C muestra el campo de tensión de tracción y D muestra el campo de tensión intracelular de las células no infectadas de juego-1 que residen en un hidrogel de 20 kPa. Las barras de color de la deformación de los mapas (μm), de la tracción estrés mapas (Pa) y de la tensión intracelular mapas (nNµm-1) se muestran en la parte superior de los mapas de calor. Las columnas muestran tres momentos representativos: 3, 8 y 18 h post-infección. E-H. Igual que los paneles A-D pero para células infectadas con Lm en una MOI de 300. Las imágenes de las bacterias (canal rojo) se superponen a las imágenes de fase de las células. Se realizaron grabaciones de TFM por proyección de imagen pozos múltiples simultáneamente. El tamaño de la ventana para PIV fue 32 pixeles con una superposición de 16. La barra de escala es 32 μm. Esta figura ha sido modificada de Bastounis y Theriot59. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Preparar los hidrogeles de PA en una placa de 24 pocillos (ver paso 1). JUEGO-1 de semilla (ver paso 2) de las células e infectarlos con JAT983 como se describe arriba (véase paso 3).
  2. Preparar un medio de vivir-microscopía por suplir L-15 de Leibovitz con 10% suero fetal bovino, 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico y 1 hidrocortisona μg/mL.
    Nota: El L-15 ya contiene 2 mM L-glutamina, por lo que no es necesario agregar extra como en el caso de los medios de comunicación MCDB 131.
  3. 4 h post-infección (cuando el JAT983 interiorizado comienza fluorescentes), 1 μL de 1 mg/mL de la mezcla colorante Hoechst con 1 mL de medio completo L-15 y añadir a cada pocillo para teñir los núcleos de las células. Colocar las células en la incubadora de cultivo de tejido por 10 min y luego reemplazar en cada pozo la prensa completo L-15 con 1 mL de medio completo L-15 complementado con 20 μg/mL de gentamicina.
  4. Cubierta de la placa con su tapa y coloque en la cámara de un microscopio (véase Tabla de materiales) equilibrado a 37 ° c.
    Nota: Para la proyección de imagen, utilice un microscopio de epifluorescencia invertida con una cámara CCD (véase Tabla de materiales) y un 40 X aire plan Fluorita aire objetivo con 0.6 na
  5. Adquirir múltiples canales imágenes Time-lapse de las perlas fluorescentes y las bacterias fluorescentes e imágenes de contraste de fase de las células hospedadoras, cada 10 minutos durante 4 a 12 h.
    Nota: Para la proyección de imagen, el poder se estableció en 25% y el tiempo de exposición a 100 ms. los filtros del microscopio (excitación/emisión) utilizados para mCherry y GFP son 470/525 nm y 530/645 nm respectivamente.
  6. Al final de la grabación, agregar 500 μl de 10% sodio dodecil sulfato (SDS) en agua en cada uno de los pozos.
    Nota: Las células que se desprende el hidrogel y el hidrogel volverá a su estado inicial indeformado ya que es elástico.
  7. Tomar una imagen del hidrogel y usarlo como la imagen de referencia indeformado.
  8. Determinar la deformación bidimensional de la hidrogel en cada instante de tiempo usando partículas imagen velocimetry (PIV)31, comparando cada imagen de la serie Time-lapse con la imagen de referencia de hidrogel indeformado. Utilice los tamaños de ventana adecuado y se superponen según el experimento.
    Nota: Utilizamos ventanas de 32 pixeles con una superposición de 16 píxeles.
  9. Calcular las tensiones de tracción 2D que ejercen las células sobre el hidrogel como se describe en otra parte32,33.
  10. Calcular la tensión de la monocapa de las tensiones de tracción como describió anteriormente34 resolviendo las ecuaciones de equilibrio mecánico para una placa elástica delgada sujeta a las fuerzas de reacción por el hidrogel de PA en la monocapa, que son de un enfrente el signo de las tensiones de tracción medido.
    Nota: Ver Material complementario 1.

7. cuantitativa microscopia Time-lapse para evaluar Extracellular matriz de rigidez depende de L. monocytogenes difusión a través de las células endoteliales

Figure 6
Figura 6: datos de microscopia cuantitativa Time-lapse de la difusión de Lm a través de monocapas de juego-1 semillas en sustratos con rigidez 3 kPa y 70 kPa. A. este panel aún muestra imágenes de dos focos de infección representante a 0, 200, 400 y 600 min. El canal de fase representa a monocapas de células de juego-1, y el canal rojo representa Lm intracelular (vea el paso 7 del Protocolo). B. este panel muestra el área del casco convexo que abarca el foco de infección trazado como una función del tiempo. El área de enfoque de la condición de 3 kPa (rojo) crece más rápido que el de lo 70 kPa (verde). C. este panel muestra que la distancia radial desde el centro hasta el borde del foco de infección trazada como una función del tiempo para representante de rigidez 70-kPa (verde) y focos de infección que crecen en monocapas de juego-1 cabeza de serie en los substratos de PA de 3 kPa (rojo). La velocidad radial (dr/dt) es constante para la condición 3 kPa, pero bifásica para la condición de 70 kPa. D. estos datos muestran la velocidad radial para los primeros 200 minutos de diez focos de infección independiente. El rojo (3 kPa) y verde (70 kPa) puntos de datos representan las laderas de los dos focos se describe en los grupos anteriores. Las barras horizontales representan la media de los datos. El P-valor se calculó con la prueba no paramétrica de Wilcoxon Rank Sum. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Preparar los hidrogeles de PA en una placa de 24 pocillos (ver paso 1), células de juego-1 (ver paso 2) de la semilla y crecen durante la noche JAT983 culturas como se describió anteriormente (ver paso 3).
  2. El día de la infección, preparar la mezcla de infección mezclando 10 μl del pellet bacteriano por mL de medio completo MCDB 131. Con cuidado retire los medios de comunicación de los pozos de las placas de 24 pocillos y añadir 1,9 mL de los medios de comunicación de MCDB 131 completo y 0,1 mL de la mezcla bacteriana a cada pocillo.
    Nota: El MOI inferior utilizado en este ensayo es necesario analizar los eventos de difusión que a partir de una sola bacteria invadir una célula huésped.
  3. Cubra la placa con su tapa y sellar con una envoltura de plástico para evitar fugas. Coloque las placas en la centrífuga y centrifugar las muestras durante 10 min a 200 x g para sincronizar la invasión.
  4. Mover las placas en la incubadora de cultivo de tejidos e incúbelos durante 5 minutos.
  5. Lavar las muestras 4 x con los medios de comunicación y trasladarlos a la incubadora de cultivo de tejidos. Después de un minuto adicional de 5-7, sustituir los medios de comunicación con los medios suplementados con 20 μg/mL de gentamicina.
  6. Incube la placa en la incubadora para un extra de 5 h para permitir que el promotor de actA encender y conducir a la expresión de la mTagRFP open reading frame35.
  7. Preparar un medio de vivir-microscopía por suplir L-15 de Leibovitz con 10% suero fetal bovino, 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico y 1 hidrocortisona μg/mL.
    Nota: El L-15 ya contiene 2 mM L-glutamina, por lo que no es necesario agregar extra como en el caso de los medios de comunicación MCDB 131.
  8. Mezclar 1 μL de 1 mg/mL Hoechst teñir con 1 mL de medio completo L-15 y añadir a cada pocillo para teñir los núcleos de las células. Colocar las células en la incubadora de cultivo de tejido por 10 min y luego reemplazar en cada pozo la prensa completo L-15 con 1 mL de medio completo L-15 complementado con 20 μg/mL de gentamicina. Cubierta de la placa con su tapa y coloque en la cámara de un microscopio (véase Tabla de materiales) equilibrado a 37 ° c.
    Nota: Para la proyección de imagen, un microscopio de epifluorescencia invertida fue utilizado con una cámara CCD (véase Tabla de materiales) y 20 X aire plan Fluorita aire objetivo con 0.75 na El poder se estableció al 50% y el tiempo de exposición a 50 ms. los filtros del microscopio utilizados para mCherry son 470/525 nm de excitación y emisión respectivamente.
  9. Imagen de múltiples posiciones cada 5 min con una función de enfoque automático para supervisar cómo Lm difundir a través de monocapas de juego-1 sembradas en diferentes hidrogeles de rigidez.
    Nota: L-15 es tamponado con HEPES, por lo que no es necesario utilizar CO2 durante la proyección de imagen.

Representative Results

Susceptibilidad del dependiente de la rigidez de ECM de juego-1 células a la infección de la Lm:
PA los hidrogeles de rigidez diferente, todos recubrir en su superficie con colágeno I, fueron construidos en placas de varios pocillos de vidrio inferior como se describe en el paso 1 del Protocolo (ver figura 1). Se realizaron mediciones de AFM para confirmar la rigidez exacta de los hidrogeles, como se describió anteriormente26,27 (ver figura 2). Estudios anteriores han demostrado que el cumplimiento local de la membrana basal de las células endoteliales puede fluctuar de 1 kPa (p. ej., tejido fino del cerebro) a 70 kPa (p. ej., aorta)36,37,38, 39 , 40. por lo tanto, decidimos probar la infección de las células de juego-1 que residen en las matrices con la siguiente rigidez: 0,6 kPa, 3 kPa, 20 kPa y 70 kPa. Para cada rigidez de hidrogel, seis hidrogel fueron fabricados para evaluar la reproducibilidad de los resultados.

Citometría de flujo se utilizó para evaluar la susceptibilidad de dependiente de la rigidez de ECM de juego-1 células a la infección de la Lm (ver figura 3). JUEGO 1 las células fueron infectadas con una cepa de Lm (JAT985) que expresa un marcador fluorescente después de internalización (actAp::mTagRFP), permitiendo la detección de bacterias intracelulares solamente (véase figuras 1 L - 1N). JAT985 también carece de ActA, desactivar las bacterias que se separa de célula a célula, ya que ActA es necesario para la formación de colas de cometa de la actinia y posterior difusión bacteriana. 7 - infección después de 8 h, infección de las células de juego-1 se evaluó mediante citometría de flujo. Para garantizar el análisis de las células, la mayor parte de la distribución de los recuentos de células fue cerrada usando el delantero frente a diagrama de dispersión lateral, y luego un segundo paso bloquea fue realizado para excluir las células que presentan Autofluorescencia (ver figuras 3A - 3C ). Los resultados preliminares, representados en la figura 3 muestran que la infección de 1 juego con Lm es aproximadamente dos veces mayor para juego-1 células residentes en los hidrogeles de kPa 70 rígida en comparación con las células que residen en los hidrogeles de kPa 0,6 suave (ver figuras 3B - 3D). la mayor susceptibilidad de infección de Lm de juego-1 células residentes en rigidez en comparación con matrices suaves podría ser debido a: 1. mayor adherencia de la Lm en juego-1; 2. creciente invasión de Lm en juego-1; o 3. tanto de la anterior colaboración que ocurre. Para probar que hipótesis sostiene, juego-1 células fueron sembradas en suave (3 kPa) y rígido (kPa 70) hidrogeles e infectadas con GFP constitutivamente expresan Lm (ver figuras 4A - 4C). Las muestras se fijaban poco después de la infección y las bacterias (adherentes) externas fueron teñidas con anticuerpos. Usando microscopia cuantitativa, encontramos que hay significativamente más bacterias adhiriéndose al juego 1 cuando las células hospedadoras residen en rigidez en comparación con los geles suaves (véase la figura 4D). De acuerdo con los datos de la citometría de flujo, hay bacterias más internalizados por el juego 1 cuando las células hospedadoras residen en rigidez en comparación con los geles suaves (ver figura 4E). Sin embargo, la eficiencia de la invasión (bacterias internalizadas/número total de bacterias) de Lm en las células puede-1 es similar, independientemente de su rigidez de substrato (ver figura 4F).

Microscopia de fuerza de tracción de las células infectadas por Lm juego-1:
Infección de LM de las células puede-1 podría alterar la biomecánica de las células del huésped infectadas, incluyendo la fuerza del apego a su ECM o entre sí, afectando la integridad de la barrera. Se intentó evaluar si podría ser el caso mediante el uso de microscopia de fuerza de tracción32 para calcular las fuerzas de tracción celular ECM y monocapa estrés microscopia41 para calcular las fuerzas tensionales intracelulares. Figura 5 muestra los mapas del campo de deformación, campo de tensión de tracción y tensión intracelular campo de juego-1 células residentes en hidrogeles de 20 kPa en tiempo diferentes puntos post infección. Figuras 5A - 5D se refieren a las células control no infectado puede-1 mientras que de figuras 5E - 5 H consulte juego-1 células infectadas con Lm en una multiplicidad de infección igual al celular 300 bacterias. Este trabajo preliminar sugiere que células infectadas 1 puede reducen la magnitud de su célula ECM y estrés intracelulares durante el curso de una infección con Lm, mientras no se observa para las células control no infectado.

Difusión a través de monocapas de 1 juego en ECM dependiente de la rigidez Lm:
Microscopía de lapso de tiempo fue utilizado para investigar el efecto de rigidez de la matriz tiene en la difusión de Lm a través de monocapas de juego-1. Como Lm se propaga a través de la monocapa, las bacterias crean un foco de infección que crece como una función del tiempo (ver figura 6A y Video las figuras 1 y 2). La zona del foco de infección se midió mediante la elaboración de un casco convexo, el polígono convexo más pequeño que abarca un conjunto de puntos, alrededor de las bacterias42. Hay no hay métricas estándar en el campo para medir la eficiencia de la diseminación de célula a célula de L. monocytogenes a través de una monocapa de células hospedadoras. Evaluar la eficiencia de la propagación, algunos han contado el número de las células del huésped en un foco de infección41, y otros tienen límites dibujados manualmente alrededor del grupo de infección host células43. Elegimos dibujar un polígono convexo alrededor de las bacterias, porque es un proceso automatizado consistente y cómputo barato para medir la eficiencia de la diseminación de L. monocytogenes . Al hacerlo, encontramos un leve descenso en el área de foco de infección en las células de juego-1 sembradas a 70 kPa hidrogeles en comparación con las sembradas en 3 matrices kPa (ver figura 6B y Video las figuras 1 y 2). Para determinar la tasa de crecimiento de los focos de infección, la distancia radial fue trazada como una función del tiempo tomando la raíz cuadrada del área del foco de infección y dividiendo esto por pi. Esta transformación matemática se supone que la forma del foco de infección es áspero circular44. Para medir la velocidad de crecimiento de la atención, se midió la tasa de cambio (es decir, la pendiente) de la distancia radial de dos matrices 3 y 70 kPa. Este enfoque esclareció que el foco de infección creció más rápido y monótonamente en juego-1 células sembradas sobre matrices de 3 kPa. Sin embargo, el enfoque creció significativamente más lento (primeros 200 min) y un poco más lento (200 a 600 min) en las células sembradas sobre matrices de 70 kPa (ver figura 6C). De hecho, el análisis de datos más confirmó que el foco de infección creció en promedio, dos veces más lento en matrices de 70 kPa, especialmente durante los primeros 200 minutos (ver figura 6D).

Figure 3
Figura 3 : Susceptibilidad dependiente de la rigidez de ECM de juego-1 células invasión Lm medida usando citometría de flujo .  JUEGO 1 las células fueron infectadas con Lm (JAT985) y la infección fue analizada por citometría de flujo. A. este panel muestra un lado frente a parcela de dispersión hacia adelante para células de juego-1 representante procedente de un solo pozo. La distribución a granel de células fue seleccionada a través de compuerta para excluir residuos (izquierda) y la célula dobletes o tripletes (derecha). B. este gráfico muestra un histograma del logaritmo de la intensidad de fluorescencia de Lm por la célula para juego-1 plateado en suave 0,6 kPa. C. este gráfico muestra un histograma del logaritmo de la intensidad de fluorescencia de Lm por la célula para juego-1 plateado en rígido 70 kPa hidrogeles. Los histogramas para N = 4-6 repeticiones se presentan en diferentes colores. Histograma de las células control no infectado es de color púrpura. En rojo se muestra la puerta utilizada para definir lo que está infectado. El MOI es 100 y la infección se evaluaron 8 h post-infección. D. los datos muestran el porcentaje de células infectadas puede-1 versus rigidez de hidrogel (N = 5). Las barras horizontales representan la media de los datos. El P-valor se calculó con la prueba no paramétrica de Wilcoxon Rank Sum. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video Figure 1
Video figura 1: difusión de Lm intracelular (canal rojo) a través de una monocapa de células de juego-1 (fase) sembradas en un sustrato 3 kPa. Las células se reflejada en los medios de comunicación L-15 de Leibovitz (10% FBS, 20 μg/mL de gentamicina) dentro de una cámara ambiental equilibrada a 37 ° c. Las imágenes fueron recogidas cada 5 min. La velocidad de película es de 15 fotogramas/s. por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Video Figure 2
Video figura 2: difusión de Lm intracelular (canal rojo) a través de una monocapa de células de juego-1 (fase) sembradas en un sustrato de 70 kPa. Las células se reflejada en los medios de comunicación L-15 de Leibovitz (10% FBS, 20 μg/mL de gentamicina) dentro de una cámara ambiental equilibrada a 37 ° C. Las imágenes fueron recogidas cada 5 min. La velocidad de película es de 15 fotogramas/s. por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Módulo de Young (E, kPa) % De acrilamida (de 40% de acciones) % Bisacrilamida (de 2% de acciones)
0.6 3 0.045
3 5 0.075
10 10 0.075
20 8 0.195
70 10 0.45

Tabla 1. Composición de hidrogeles de poliacrilamida (PA) de rigidez diferente. En esta tabla, el porcentaje de solución stock acrilamida del 40% y el porcentaje de stock bis-acrilamida solución al 2% para alcanzar una determinada rigidez (módulo de Young, E) se indican en columnas diferentes.

Supplemental Material
Material suplementario de 1. Cálculo de tensión intracelular de tensiones de tracción calculada. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Las células pueden sentir una variedad de señales ambientales físicos, que puede afectar no sólo la morfología de las células, sino también su actividad de expresión y proteína los genes, afectando células críticas funciones y comportamientos de45,46. La rigidez de la ECM de células es cada vez más apreciada como un importante modulador de la motilidad celular, diferenciación, proliferación y en última instancia celular destino47,48,49. Aunque ha habido muchos avances recientes en la comprensión de la interacción biomecánica compleja entre las células y su ECM, poco se sabe sobre cómo ambiental rigidez afecta la susceptibilidad de las células a la infección bacteriana. Para facilitar este tipo de estudios, hemos desarrollado este análisis múltiples bien nuevo basado en la fabricación bien establecida de hidrogeles de poliacrilamida de rigidez ajustable compatible con infección ensayos50. Tradicionalmente, una infección bacteriana de las células en cultivo de tejidos ha sido estudiada en cristal o poliestireno que son aproximadamente 1-3 órdenes de magnitud más rígidas que el ECM natural más adherente células8,51. El ensayo descrito aquí abre nuevas carreteras al permitir el estudio de las interacciones bacterias-host en un régimen de rigidez ambiental fisiológicamente relevantes.

Para prueba de concepto del ensayo presentado, juego-1 células fueron elegidas como las células del huésped adherente modelo y Lm como un patógeno bacteriano de modelo. Sin embargo, el análisis puede ampliarse para continuar sus estudios si apropiadamente modificada. Este tipo de estudios puede implicar infección host adherente mamíferos diferentes tipos de células por más patógeno, incluyendo bacterias y virus. Para este análisis particular, geles fueron proteína-recubierta de colágeno I, pero dependiendo del tipo de la célula huésped, es posible utilizar una proteína diferente ECM-capa, como fibronectina, laminina, para facilitar la fijación de las células hospedadoras de interés sobre el hidrogel 52. una consideración adicional que depende del tipo de la célula huésped es el rango de rigidez de hidrogel a estudiar. La gama de rigidez debe depender de lo que es fisiológicamente relevante para el tipo de la célula huésped específica y cómo ese host une formando una monocapa en un hidrogel rigidez determinada. Del mismo modo, dependiendo del patógeno modelo desea examinarse, ligeras modificaciones deba aplicarse en el ensayo de infección descrito.

La innovación del ensayo en comparación con los métodos anteriores para la fabricación de poliacrilamida hidrogel24,50,53 radica en ciertas características integradas en el análisis propuesto de la infección. En primer lugar, los hidrogeles están construidos en placas de varios pocillos de vidrio inferior, que permite la proyección de varias condiciones simultáneamente, así como la automatización de algunos procedimientos. Monitoreo varias condiciones al mismo tiempo o examinar múltiples repeticiones es fundamental ya que el resultado de este enfoque puede ser influenciado por factores como el paso de célula de host y el número exacto de bacterias añadido para infectar a los anfitriones, que a menudo cambian entre experimentos independientes. Una característica única adicional de este ensayo es que los hidrogeles tienen una altura de aproximadamente 40 μm, que es lo suficientemente delgada como para obtener imágenes mediante microscopía convencional. Hemos demostrado que podemos realizar con éxito tanto microscopía de células vivas y fijación de células y el immunostaining seguido de proyección de imagen, sin la introducción de la fluorescencia de fondo alta. Por último, los hidrogeles están hechos de dos capas, con el superior habiendo integrado microesferas fluorescentes, confinados en un solo plano focal. Este atributo se asegura que no habrá ninguna luz fuera de enfoque interferir durante proyección de imagen. La presencia de los granos permite tanto el examen de la topografía superficial de los geles que son uniformes y mejora el rendimiento de TFM y MSM24,32,41. Con TFM y MSM, es posible calcular las fuerzas ECM de célula y célula de las células que residen en diferentes matrices de rigidez respectivamente. Usando este nuevo análisis, es posible hacer estas mediciones de fuerzas físicas comparando simultáneamente tanto la contribución de rigidez ambiental y de la infección. Siguiendo este enfoque, la infección del efecto tiene en la célula huésped puede determinarse mecánica a lo largo de su curso. Además, la evolución de las tensiones intracelulares de las células puede ser calculada utilizando MSM y puede ser utilizada como una medida de la integridad de la barrera de la monocapa. Finalmente, dada la naturaleza multi-bien el ensayo, es posible simultáneamente introducir perturbaciones genéticas y farmacológicas con una infección bacteriana, para investigar más a fondo la compleja interacción entre el anfitrión célula mecánica y la infección.

Una limitación inherente de la técnica radica en la rigidez de sustrato de efecto puede tener sobre la tasa de proliferación de las células. Por lo general, en ensayos de infección, necesitamos asegurar que la densidad celular de host bajo diferentes condiciones es el mismo. Eso es porque la densidad de la célula por sí mismo puede tener un efecto sobre la susceptibilidad de los ejércitos a la infección. Las células de juego-1 que fueron utilizadas como las células del huésped no muestran una diferencia significativa en su número cuando sembradas durante 24 h en los hidrogeles. Sin embargo, diferentes tipos de células pudieron exhibir la proliferación diferencial, dependiendo de la rigidez de hidrogel, que puede sesgar los estudios de la infección. Del mismo modo, sesgo de infección puede presentarse cuando las células no forman monocapas o no se fije bien en los hidrogeles, como ocurre cuando ciertos tipos de células se siembran en matrices muy suaves(por ejemplo, las células endoteliales de cordón umbilical humano o riñón canino Madin-Darby las células epiteliales sembradas en 0,6 kPa hidrogeles54,55). En cuanto a los agentes patógenos, pueden adjuntar ciertas bacterias (por ejemplo, Borrelia burdgorferi) en sede de las células e invaden pero también puede transmigrada a través de ellos56. Todavía no hemos probado si este ensayo funcionaría para estudios de la transmigración de los patógenos, pero parece posible ya que los estudios anteriores en neutrófilos células endoteliales sembradas en hidrogeles de PA de transmigrating han sido documentados para trabajar con éxito57. Ha habido muchos estudios que muestran cómo fabricar hidrogeles de poliacrilamida de módulo de Young de un determinado mediante la mezcla de las adecuadas concentraciones de acrilamida y bis-acrilamida24,25,26 ,27. Sin embargo, especialmente cuando se quiere realizar experimentos TFM en las células que residen en hidrogeles de rigidez variable, es fundamental para confirmar la rigidez esperada de los hidrogeles ya sea a través de AFM u otras técnicas de indentación58. Leve desviación del valor esperado puede presentarse debido a un diferente solvente utilizado o una solución stock de acrilamida, o por las maneras AFM mediciones son realizadas (por ejemplo, la forma de la punta AFM). Finalmente, el enfoque aquí presentado se basa en la siembra de las células del huésped en las matrices 2D, que pueden diferir de un escenario 3D más realista y fisiológicamente relevante. Sin embargo, fabricación de geles 3D con rigidez sintonizable, siembra con las células del huésped y entonces infectándolos con patógenos, todavía abarca ciertas dificultades técnicas. Sin embargo, prevemos que en un futuro cercano seremos capaces de extender el ensayo actual para el estudio de infección en un entorno 3D.

En definitiva, el protocolo descrito junto con los resultados preliminares evidencian que este ensayo novela puede convertirse en una herramienta extremadamente útil para el estudio de la infección de las células del huésped adherente con bacterias patógenas de forma cuantitativa y de una manera mucho más ambiente fisiológico relevante que anteriormente examinados. El poder de fabricar poliacrilamida hidrogel en la configuración de la propuesta radica en que el ensayo es compatible con el desempeño de varias técnicas como la citometría de flujo, immunostaining seguido por microscopía óptica y microscopia de la fuerza de tracción. El ensayo puede ser utilizado para estudios que incluyeron la infección de los tipos de células diferentes host adherente por patógenos, que prevemos tendrá un impacto significativo en ambas desentrañar las estrategias por los cuales patógenos infectan a anfitriones y en facilitar el desarrollo de intervenciones terapéuticas contra las infecciones.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nuestro agradecimiento a M. pie, R. Lamason, M. Rengaranjan y miembros del laboratorio de Theriot para sus discusiones y soporte experimental. Este trabajo fue apoyado por NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), las becas Gilliam de HHMI para estudio avanzado (F.E.O.), la beca postgrado de Stanford (F.E.O.) y la Asociación Americana de corazón (E.E.B.). Citometría de flujo se realizó en las instalaciones de FACS compartido de Stanford.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Sodium hydroxide pellets Fisher S318-500
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Sigma A3648
25% gluteraldehyde Sigma G6257-100ML
40% Acrylamide Sigma A4058-100ML
Bis-acrylamide solution (2%w/v) Fisher Scientific BP1404-250
Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) Invitrogen F8803
Ammonium Persulfate Fisher BP17925
TEMED Sigma T9281-25ML
Sulfo-SANPAH Proteochem c1111-100mg
Collagen, Type I Solution from rat Sigma C3867-1VL
Dimethyl sulfoxide (DMSO) J.T. Baker 9224-01
HEPES, Free acid J.T. Baker 4018-04
Leibovitz's L-15 medium, no phenol red Thermofischer 21083027
MCDB 131 Medium, no glutamine Life technologies 10372019
Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A Gemini Bio-Prod 900108 500ml
Epidermal Growth Factor, EGF Sigma E9644
Hydrocortisone Sigma H0888
L-Glutamine 200mM Fisher SH3003401
DPBS 1X Fisher SH30028FS
Gentamicin sulfate MP biomedicals 194530
Cloramphenicol Sigma C0378-5G
DifcoTM Agar, Granulated BD 214530
BBL TM Brain-heart infusion BD 211059
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 mg/ul solution in water Invitrogen H3570
Formaldehyde 16% EM grade Electron microscopy 15710-S
Anti-Listeria monocytogenes antibody Abcam ab35132
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 546 conjugate Thermofischer A-11035
0.25% trypsin-EDTA , phenol red Thermofischer 25200056
COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC Sigma C8051
Streptomycin sulfate Fisher Scientific 3810-74-0
Sucrose Calbiochem 8510
Sodium dodecyl sulfate Thermofischer 28364
MES powder Sigma M3885
KCl J.T. Baker 3040-05
MgCl2 J.T. Baker 2444-1
EGTA Acros 40991
Disposable lab equipment
12 mm circular glass coverslips Fisherbrand 12-545-81 No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated
Glass bottom 24 well plates Mattek P24G-1.5-13-F
5 ml polystyrene tubes with a 35 μm cell strainer cap  Falcon 352235
T-25 flasks Falcon 353118
50 ml conical tubes Falcon 352070
15 ml conicals tubes Falcon 352196
Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) Falcon 357551
Pasteur Glass Pipettes VWR 14672-380
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) Denville P1122, P1126
Powder Free Examination Gloves Microflex XC-310
Cuvettes bacteria Sarstedt 67.746
Razors VWR 55411-050
Syringe needle BD 305167
0.2um sterilizng bottles Thermo Scientific 566-0020
20 ml syringes BD 302830
0.2um filters Thermo Scientific 723-2520
wooden sticks Grainger 42181501
Saran wrap Santa Cruz Biotechnologies sc-3687
Plates bacteria Falcon 351029
Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood Baker SG504
Hemacytometer Sigma Z359629
Bacteria incubator Thermo Scientific IGS180
Tissue culture Incubator NuAire NU-8700
Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope Nikon NIKON-DIAPHOT-200
Cage Incubator Haison Custom
Scanford FACScan analyzer  Stanford and Cytek upgraded FACScan Custom
Pipette Aid Drummond 4-000-110
Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul) Gilson F144802, F123601, F123602
pH meter Mettler Toledo 30019028
forceps FST 11000-12
1 L flask Fisherbrand FB5011000 
Autoclave machine Amsco 3021
Stir magnet plate Bellco 7760-06000
Magnet stirring bars Bellco 1975-00100
Spectrophotometer Beckman DU 640
Scanford FACScan analyzer Cytek Biosciences Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan
Software
Microscope Software (μManager) Open Imaging
Matlab Matlab Inc
Flowjo FlowJo, LLC
Automated image analysis software, CellC https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/

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Inmunología e infección número 137 de células de mamífero adherente infección bacteriana endotelio citometría de flujo microscopía de fuerza de tracción hidrogeles de poliacrilamida immunostaining rigidez de sustrato
Un ensayo de base poliacrilamida formato multi-bien para estudiar el efecto de la rigidez de la matriz extracelular en la infección bacteriana de las células adherentes
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Bastounis, E. E., Ortega, F. E.,… More

Bastounis, E. E., Ortega, F. E., Serrano, R., Theriot, J. A. A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells. J. Vis. Exp. (137), e57361, doi:10.3791/57361 (2018).

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