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Cancer Research

आयल-एम्बेडेड सेल ब्लॉक्स पर Immunocytochemistry द्वारा कल्चरल सेल में प्रोटीन एक्सप्रेशन लेवल का निर्धारण

Published: May 20, 2018 doi: 10.3791/57369
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Omics Core Lab, Research Institute, National Cancer Center, 2Department of Pathology, Inje University Ilsan Paik Hospital

Summary

वर्तमान में, immunofluorescent स्थिर कोशिकाओं पर दाग प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के निर्धारण के लिए पसंद की विधि है जब रूपात्मक जानकारी भी आवश्यक है । इस के साथ प्रस्तुत प्रोटोकॉल आयल पर immunocytochemistry की एक वैकल्पिक पद्धति के लिए प्रदान करता है-सेल ब्लॉक एंबेडेड ।

Abstract

Immunofluorescent धुंधला वर्तमान में सेल में प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के निर्धारण के लिए पसंद की विधि-संस्कृति प्रणालियों जब रूपात्मक जानकारी भी आवश्यक है । immunocytochemical आयल पर दाग-एंबेडेड सेल ब्लॉकों के प्रोटोकॉल, यहां प्रस्तुत, गैर पर धुंधला immunofluorescent के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प है-आयल-एंबेडेड फिक्स्ड सेल । इस प्रोटोकॉल में, हेला कोशिकाओं से एक आयल सेल ब्लॉक thromboplastin-प्लाज्मा विधि का उपयोग कर तैयार किया गया था, और immunocytochemistry दो प्रसार मार्करों, CKAP2 और Ki-६७ के मूल्यांकन के लिए प्रदर्शन किया गया था । कक्ष-अवरोधित स्लाइड्स में हेला कक्षों की नाभिक और cytoplasmic आकृतियां अच्छी तरह से संरक्षित की गई हैं । एक ही समय में, CKAP2 और Ki-६७ immunocytochemistry में धुंधला पैटर्न immunohistochemical में उन लोगों के लिए काफी समान थे आयल कैंसर के ऊतकों में धुंधला । संशोधित कोशिका-संस्कृति शर्तों के साथ, सीरम मुक्त शर्तों के तहत हेला कोशिकाओं की पूर्व-मशीन सहित, वास्तु जानकारी के संरक्षण के दौरान प्रभाव का मूल्यांकन किया जा सकता है । अंत में, आयल पर immunocytochemistry-एंबेडेड सेल ब्लॉकों immunofluorescent धुंधला करने के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प है ।

Introduction

अधिकांश प्रयोगशालाओं में, आयल-एंबेडेड सेल ब्लॉक आमतौर पर इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं । बल्कि, फिक्स्ड प्रसंस्कृत कोशिकाओं, नहीं आयल-एंबेडेड कोशिकाओं, उपसेलुलर स्थानीयकरण अध्ययन में कार्यरत हैं । उन निश्चित प्रसंस्कृत कोशिकाओं के लिए, chromogen के बजाय प्रतिदीप्ति इस्तेमाल किया गया है. इसलिए, immunofluorescent धुंधला वर्तमान में अनुसंधान सेल संस्कृतियों को रोजगार में प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के निर्धारण के लिए पसंद की विधि है1। immunofluorescent धुंधला के लिए तैयार स्लाइड, तथापि, केवल immunofluorescent माइक्रोस्कोपी के तहत देखा जा सकता है, जो विमान माइक्रोस्कोपी2के तहत संकेत उन लोगों से काफी अलग छवियों को दिखा सकता है. इसके अतिरिक्त, immunofluorescent धुंधला के लिए स्लाइड का संरक्षण चमकदार रोशनी से सुरक्षा की आवश्यकता है, और फ्लोरोसेंट संकेतों फ्लोरोसेंट संकेत के नुकसान के कारण इमेजिंग के लिए दोहराया प्रदर्शन के साथ कमजोर हो3। आयल-एंबेडेड सेल ब्लॉक पर immunocytochemistry से परिणाम काफी immunohistochemistry से तेल पर एंबेडेड ऊतकों को उन लोगों के समान है4, और वे आसानी से नैदानिक जानकारी में अनुवाद किया जा सकता है । इसलिए, immunocytochemistry एक उत्कृष्ट विकल्प हो सकता है । हालांकि, सेल-ब्लॉक की तैयारी बुनियादी अनुसंधान प्रयोगशालाओं में लोकप्रिय नहीं हुई है । इस प्रोटोकॉल में, फिर, सेल-ब्लॉक तैयारी और immunocytochemical धुंधला सेल-संस्कृति अध्ययन के क्षेत्र में इस पद्धति के उपयोग को बढ़ावा देने के लिए प्रदान की जाती हैं ।

सेल-ब्लॉक तैयारी और immunocytochemistry अद्वितीय तरीके नहीं हैं, और वे पहले से ही नैदानिक निदान से बुनियादी अनुसंधान के लिए लागू किया गया है4,5. हालांकि विभिंन सेल-ब्लॉक तैयारी तरीकों4रिपोर्ट किया गया है,6 thromboplastin-प्लाज्मा विधि सरल, लागत प्रभावी है, और आसानी से अनुकूलनीय है । इसलिए, इस पत्र में प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, thromboplastin-प्लाज्मा विधि4,5,6,7,8 आयल-एंबेडेड सेल ब्लॉकों की तैयारी के लिए प्रयोग किया जाता है ।

वर्तमान अध्ययन में, thromboplastin-प्लाज्मा सेल ब्लॉकों और दो प्रसार मार्करों को रोजगार immunocytochemistry विधि की तैयारी के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया । एक मार्कर cytoskeleton-जुड़े प्रोटीन 2 (CKAP2) है, जो हाल ही में एक mitotic मार्कर9,10,11के रूप में सूचित किया गया है; दूसरे एक है Ki-६७, जो सबसे प्रसिद्ध प्रसार मार्कर12है । प्रतिनिधि योजना चित्रा 1में दिखाई गई है ।

Protocol

अध्ययन प्रोटोकॉल राष्ट्रीय कैंसर केंद्र, कोरिया (NCCNCS-12-630) के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. नमूना तैयारी (30 मिनट)

  1. हेला कोशिकाओं की संस्कृति के लिए (CCL-2, ATCC), १०० मिमी संस्कृति डिश में 10 मिलीलीटर पूरा DMEM मध्यम (10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेन-strep) का उपयोग करें । सीरम भूखे हेला कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, ४८ घंटे के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम के बिना DMEM में धाराप्रवाह हेला कोशिकाओं गर्मी, एक पिछले अध्ययन में वर्णित के रूप में11.
  2. कोशिकाओं को अलग करने के लिए, उन्हें 2 एमएल फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के साथ धो लें, और १०० mm कल्चरल डिश के अनुसार 2 मिलीलीटर ०.२५% EDTA trypsin जोड़ें । फिर, ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक सह2 मशीन में 2-3 मिनट के लिए मशीन ।
  3. trypsin को निष्क्रिय करने के लिए संस्कृति डिश के लिए पूरा DMEM मध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें, और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए अलग कोशिकाओं हस्तांतरण । फिर, 10 मिनट के लिए एक गोली फार्म के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक ।
  4. supernatant निकालें, और दो बार 10 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा 2 मिलीलीटर ठंडे पंजाबियों के साथ गोली धो लो ।
  5. supernatant को हटाने के बाद, सेल गोली करने के लिए ९५% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और भंवर से इथेनॉल के साथ सेल गोली मिश्रण । सेल-ब्लॉक की तैयारी होने तक बर्फ पर फिक्स्ड सेल रखें ।

2. सेल-ब्लॉक तैयारी (1 ज 30 मिनट)

  1. जमे हुए प्लाज्मा aliquots की तैयारी के लिए, स्वस्थ दाता रक्त से EDTA प्लाज्मा इकट्ठा और 10 मिनट के लिए १३,००० x g पर केंद्रापसारक । लीजिए supernatant प्लाज्मा, और aliquot २००-४०० µ एल microfuge ट्यूबों में प्रत्येक । aliquots पर-८० ° c का उपयोग करें जब तक स्टोर । जब जमे हुए प्लाज्मा aliquots तैयार हैं, उंहें पुनः प्राप्त करने और 5 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन द्वारा प्लाज्मा गल ।
  2. 10 मिनट के लिए ७०० x g पर स्थिर कोशिकाओं के केंद्रापसारक, तो supernatant त्यागें ।
  3. 2 बूंदें (प्लाज्मा के बारे में २०० µ एल), thromboplastin के 2 बूंदें, और ०.०२५ मीटर कैल्शियम क्लोराइड के 2 बूंदें के साथ सेल गोली मिक्स । फिर, उंहें pipetting द्वारा मिश्रण ।
  4. मिश्रण को 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक सेल थक्का बनाने की अनुमति दें, जैसा कि चित्र 2aमें दिखाया गया है । फिर, पिपेट द्वारा पंजाबियों के साथ सेल थक्का दो बार डालना और हटाने के द्वारा । प्रतिनिधि सफेद सेल थक्का चित्रा बीमें दिखाया गया है ।
  5. formalin के साथ फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा गीला है, और पूर्व गीला फिल्टर कागज के साथ सेल थक्का लपेट । फिर, पका हुआ मिश्रण को एक pincette के साथ एक टिशू कैसेट में रखें जैसा कि चित्र2c में दिखाया गया है ।
  6. formalin निर्धारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात बफर formalin के ५० मिलीलीटर (पंजाब में 10% formalin) युक्त एक गिलास जार में ऊतक कैसेट रखें ।

3. ऊतक प्रसंस्करण और आयल embedding (रातोंरात)

  1. पहले11वर्णित के रूप में एक ऊतक प्रोसेसर में formalin-फिक्स्ड सेल थक्का युक्त ऊतक कैसेट लोड । ऊतक प्रसंस्करण पानी हटाने और तेल embedding से पहले तय कोशिकाओं के कंडीशनिंग के लिए है । ऊतक प्रसंस्करण के बिना अनुसंधान के लिए, के रूप में ऊतक प्रसंस्करण प्रक्रिया प्रदर्शन तालिका 1में दिखाया गया है ।
  2. गरम एंबेडिंग स्टेशन चालू करें, और ६० मिनट बाद, जांचें कि वहां धातु मोल्ड में पिघला हुआ तेल है (चित्र 2d) ।
  3. ऊतक कैसेट से बनाई गई कोशिका थक्का ले लो और यह धातु मोल्ड के भीतर पिघला हुआ तेल में जगह है ।
  4. धातु मिट्टी पिघला हुआ तेल के बीच में कोशिका थक्का मोल्ड में ढक्कन के बिना नए ऊतक कैसेट प्लेस, और ऊतक कैसेट में और धातु मोल्ड पर अधिक पिघला हुआ तेल डालना । तो, 30-60 सेकंड के लिए ठंडी थाली में तेल जमना चलो ।
  5. धातु मोल्ड से ऊतक कैसेट अलग । फिर, आयल सेल ब्लॉक immunocytochemistry के लिए तैयार है । आयल-एंबेडेड सेल ब्लॉक में एंबेडेड सेल थक्का चित्रा 2Eमें तीर द्वारा दर्शाया गया है ।

4. Immunocytochemistry के लिए स्लाइड तैयार करना (1 h)

  1. आयल सेल ब्लॉक में सेल थक्का के लिए क्षेत्र की जांच करें, और एक microtome का उपयोग कर 3-4 µm की मोटाई के साथ स्लाइस में सेल ब्लॉक में कटौती । silane-लेपित काँच स्लाइडों पर आयल सेक्शन रखो, जैसा कि चित्र 2Fमें दिखाया गया है ।
  2. अनुभाग स्लाइड्स का पालन करने के लिए 30 मिनट के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस ओवन में खंड स्लाइड रखें ।

5. सेल ब्लॉक के Immunocytochemistry (6 एच)

नोट: सेल ब्लॉक वर्गों पर धुंधला immunocytochemical के लिए, विभिन्न किट ( सामग्री की तालिकादेखें) इस्तेमाल किया जा सकता है । ऐसे सभी किट उनके संशोधनों के आधार पर विभिंन संवेदनशीलता और विशिष्टताओं है ।

  1. de-paraffinize के लिए 4 मिनट के लिए xylene के ५० मिलीलीटर में वर्गों मशीन ।
  2. निर्जलीकरण के लिए 2 मिनट के लिए १००% इथेनॉल में स्लाइड गर्मी, और ९५% इथेनॉल में दो बार, और 2 मिनट के लिए ८०% इथेनॉल में । फिर, 10 मिनट के लिए पानी में चलाने इथेनॉल निकालें ।
  3. प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के लिए, एक जार में स्लाइड प्लेस ४० मिलीलीटर Tris-EDTA पुनर्प्राप्ति बफर, पीएच ९.०, और 30 मिनट के लिए एक कुकर में फोड़ा ।
  4. पानी रनिंग के तहत स्लाइड धो, और उंहें ९५% इथेनॉल में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मशीन । फिर, आसान पहचान के लिए एक पीएपी पेन के साथ स्लाइड पर सेल धुंधला क्षेत्र निशान ।
  5. ०.२% के बीच 20 (टीबीएस-टी) युक्त Tris-बफर खारा में स्लाइड धो लें, और हाइड्रोजन पेरोक्साइड ब्लॉक में मशीन ( सामग्री की तालिकादेखें) 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर किसी भी अवशेष peroxidase गतिविधि को दूर करने के लिए. फिर, टीबीएस-T में स्लाइड को 2 मिनट के लिए तीन बार धोएं ।
  6. प्रोटीन ब्लॉक में कमजोर प्राथमिक एंटीबॉडी द्वारा पतला एंटीबॉडी समाधान तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें) । उदाहरण के लिए, CKAP2 प्राथमिक एंटीबॉडी 1:100 पतला किया जा सकता है, और ६७ की एंटीबॉडी 1:500 । फिर, १०० µ में स्लाइड के लिए पतला एंटीबॉडी समाधान के एल 1 एच ।
  7. टीबीएस-टी में धोने के बाद 2 मिनट प्रत्येक के लिए पांच बार, गर्मी अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए किट में प्राथमिक एंटीबॉडी बढ़ाने में स्लाइड ।
  8. टीबीएस-टी में धोने के बाद 2 मिनट प्रत्येक के लिए चार बार, एचआरपी बहुलक के 2 बूंदें (एक माध्यमिक सहिजन peroxidase के साथ लेबल एंटीबॉडी) जोड़ें, और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइड की मशीन ।
  9. टीबीएस-टी में धोने के बाद 2 मिनट प्रत्येक के लिए पांच बार, जोड़ें १०० µ एल के diaminobenzidine (ढाब) समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें), और 3 मिनट के लिए स्लाइड की मशीन ।
  10. दो बार टीबीएस-टी में धोने के बाद, Hematoxylin समाधान के १०० µ एल जोड़ें (आसुत जल के Hematoxylin और ६०० µ एल के १०० µ एल का मिश्रण), और 1 मिनट के लिए स्लाइड की मशीन ।
  11. टीबीएस में स्लाइड धोने के बाद टी एक बार, 2 मिनट के लिए ९५% इथेनॉल में मशीन द्वारा निर्जलीकरण, ९५% इथेनॉल में एक बार डूबा, और १००% इथेनॉल में सूई दो बार । फिर, 5 मिनट के लिए एक ग्लास जार में ४० मिलीलीटर xylene में स्लाइड की मशीन ।
  12. जब स्लाइड xylene से शुष्क हैं, तो संबंधित coverslips माउंट करें ।
  13. प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर धुंधला पैटर्न का निरीक्षण ।

Representative Results

में एक hematoxylin-और-eosin-सना हुआ स्लाइड से आयल एंबेडेड सेल ब्लॉक (चित्र 3ए, बी), नाभिक और कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य के अधिकांश बरकरार हैं, सुझाव है कि रूपात्मक संरक्षण वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ उत्कृष्ट है ( चित्र 3ए) । immunocytochemical धुंधला में, सकारात्मक CKAP2 धुंधला गाढ़ा क्रोमेटिन, mitotic धुरी में मनाया गया था, और कोशिका द्रव्य (चित्रा4), के रूप में पहले 10 की सूचना दी । Ki-६७ धुंधला सेल नाभिक में मनाया गया था, के रूप में (चित्रा 4) की उंमीद है । केवल CKAP2 के साथ कोशिकाओं को गाढ़ा क्रोमेटिन में दाग ( चित्र 4aमें तीर देखें, ख) mitotic कोशिकाओं थे । कई CKAP2-सकारात्मक कोशिकाओं को उच्च mitotic हेला कोशिकाओं है कि पूरा मध्यम (चित्रा 4a) में एक मशीन के बाद तैयार किया गया था में दिखाया गया था । इसकी तुलना में सीरम-भूखे हेला कोशिकाओं (फिगर 4B) में कुछ CKAP2-पॉजिटिव कोशिकाएँ थीं. अत्यधिक mitotic हेला कोशिकाओं में से अधिकांश Ki-६७ पॉजिटिव (फिगर 4c) थे. विषम रूप से, Ki-६७-सीरम भूखे हेला कोशिकाओं में सकारात्मक दर के रूप में के रूप में उच्च रहे ~ ५०% (चित्रा 4d). ये परिणाम एक पिछले रिपोर्ट11के उन लोगों के लिए काफी तुलना कर रहे हैं, जो पता चलता है कि CKAP2 एक अधिक विश्वसनीय है कैंसर कोशिकाओं में प्रसार मार्कर की तुलना में Ki-६७ है ।

खराब तैयार कोशिका ब्लॉकों में नाभिक को कोशिका द्रव्य से अलग कर दिया जाता है, और वहाँ भी, resultantly, गरीब सुघड़ रक्षण करते हैं. अब एक फ्रिज में निर्धारित कोशिकाओं की तुलना में रात भर की गर्मी ऐसे गरीब परिणाम हो सकता है । एक अंय महत्वपूर्ण समस्या यह है कि कोशिकाओं immunocytochemistry द्वारा अच्छी तरह से दाग नहीं हैं, उत्कृष्ट आकृति विज्ञान के बावजूद । सेल का थक्का छोटा होने पर यह समस्या अधिक बार उत्पन्न होती है । आमतौर पर, धुंधला तीव्रता चित्र बीमें दिखाए गए के रूप में अनियमित है; लेकिन जब कोशिका का थक्का बड़ा होता है तो अनियमित दाग की संभावना काफी कम होती है । इसलिए, इस प्रोटोकॉल में, हम एक बड़े सेल थक्का बनाने के क्रम में प्लाज्मा, thromboplastin, और कैल्शियम क्लोराइड की मात्रा में वृद्धि हुई ।

Figure 1
चित्र 1: सेल-ब्लॉक तैयारी योजना. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: आयल सेल-ब्लॉक तैयारी का चित्रण । (क) Thromboplastin-ट्यूब में प्लाज्मा कोशिका थक्का. (ख) पंजाबियों धोने के बाद टी. पी. सेल थक्क. (ग) गीला फिल्टर कागज पर सेल थक्का । (घ) ऊतक पिघला हुआ मोम के साथ स्टेशन embedding । धातु मोल्ड (तीर) solidification के लिए पिघला हुआ मोम रखती है । (ङ) आयल-एंबेडेड कोशिका थक्का (arrow) आयल या आयल-एंबेडेड सेल ब्लॉक में एंबेडेड । (च) एक लेपित स्लाइड के मध्य भाग पर अविरल आयल अनुभाग । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सेल ब्लॉक तैयारी और गुणवत्ता की पुष्टि hematoxylin और eosin और immunostaining द्वारा । (क) Hematoxylin-और-eosin-एक आयल-एंबेडेड कोशिका-खंड में हेला कोशिकाओं के दाग छवि । (ख) एक खराब तैयार आयल-एंबेडेड सेल-ब्लॉक खंड पर immunocytochemistry में Ki-६७ की अनियमित धुंधलाना । स्केल बार्स (A) १०० और (B) २०० माइक्रोन हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: हेला कोशिकाओं के लिए आयल-एंबेडेड सेल ब्लॉक पर Immunocytochemical धुंधला । (क) अत्यधिक mitotic स्थितियों के अंतर्गत CKAP2 दाग. (ख) सीरम भूखे शर्तों के तहत CKAP2 दाग । (C) Ki-६७ अत्यधिक mitotic स्थितियों के तहत धुंधला । (D) Ki-६७ सीरम भूखे शर्तों के तहत दाग । १०० माइक्रोन स्केल सलाखों के दिखाए जाते हैं । ऐरोहेड CKAP2-धनात्मक कक्षों को इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्रक्रिया चरणों समाधान समय तापमान/
निर्जलीकरण 1 ७०% अल्कोहल 15 min/RT
2 ८०% अल्कोहल 15 min/RT
3 ९५% अल्कोहल 15 min/RT
4 १००% अल्कोहल 15 min/RT
समाशोधन 1 Xylene ६०/4 डिग्री सेल्सियस
2 Xylene 10 min/RT
3 Xylene 10 min/RT
4 Xylene 10 min/RT
* आरटी, कमरे के तापमान

तालिका 1. ऊतक प्रसंस्करण प्रक्रिया ।

Discussion

Immunofluorescent स्थिर प्रसंस्कृत कोशिकाओं पर दाग वर्तमान में कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर के निर्धारण के लिए विकल्प की विधि है, जबकि रूपात्मक जानकारी1संरक्षण । हालांकि, आयल-एंबेडेड सेल ब्लॉकों पर immunocytochemistry एक उत्कृष्ट विकल्प हो सकता है । आयल एंबेडेड सेल ब्लॉक और immunocytochemistry की तैयारी के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं इस प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया है, और हमें उंमीद है कि यह सेल अध्ययन में immunocytochemistry के आवेदन की सुविधा कर सकते हैं ।

Immunocytochemistry immunofluorescent धुंधला पर कई फायदे हैं । कोशिकाओं के लिए Immunofluorescent धुंधला आम तौर पर नए सिरे से प्रसंस्कृत कोशिकाओं की आवश्यकता है, लेकिन आयल सेल ब्लॉक कई साल13के लिए कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है । इसके अतिरिक्त, सेल ब्लॉकों पर immunocytochemistry मानव ऊतकों पर दिनचर्या immunohistochemistry में इस्तेमाल किया एक ही एंटीबॉडी को रोजगार के द्वारा intracellular अभिव्यक्ति पैटर्न का पता लगाने कर सकते हैं4. इसके अलावा, यह प्रोटीन के स्तर या posttranslational संशोधनों में या तो विभिन्न दवाओं के साथ या विभिन्न संस्कृति शर्तों के तहत पूर्व-मशीनिंग के द्वारा परिवर्तन का पता लगाने कर सकते हैं11.

immunocytochemical धुंधला के फायदों के विपरीत, आयल एंबेडेड सेल ब्लॉकों की तैयारी में समय लगता है और14महंगा है । इसके अलावा, सबसे अनुसंधान प्रयोगशालाओं इस तकनीक में अनुभव की कमी है, और ऐसी परिस्थितियों के तहत तकनीकी त्रुटियों आम हैं । सबसे आम त्रुटियों सेल आकृति विज्ञान और गरीब या अनियमित immunocytochemical आयल सेल ब्लॉक वर्गों पर दाग के गरीब संरक्षण कर रहे हैं । इन और सबसे दूसरों को सेल ब्लॉक सबसे अच्छा सेल शर्तों के तहत बनाने और पर्याप्त समाधान का उपयोग करने के लिए सेल थक्के फार्म से बचा जा सकता है ।

वर्तमान प्रोटोकॉल के एक प्रदर्शन के रूप में, सेल ब्लॉकों हेला कोशिकाओं के लिए तैयार थे, और immunocytochemical धुंधला दो प्रसार मार्करों, CKAP2 और Ki-६७ के लिए प्रदर्शन किया गया था, के रूप में पहले11की सूचना दी । immunocytochemistry के लिए, कोशिकाओं के साथ और भ्रूण गोजातीय सीरम के बिना मीडिया में मशीन द्वारा हेरफेर किया गया, और सीरम भुखमरी के प्रभाव को देखा जा सकता है. इन तैयार आयल-एंबेडेड सेल ब्लॉक एंटीबॉडी की एक बड़ी संख्या के लिए नियोजित किया जा सकता है, क्योंकि कई स्लाइड स्लाइड प्रति केवल एक 4-5 µm-मोटी सेल ब्लॉक खंड का उपयोग कर एक सेल ब्लॉक से तैयार किया जा सकता है । इसलिए, अभिव्यक्ति दो विभिंन स्थितियों के अनुरूप पैटर्न कई अलग एंटीबॉडी के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है । CKAP2 और कैंसर के ऊतकों में ६७ के लिए immunostaining पैटर्न पहले से ही सूचित किया गया है9,10,11,12, और immunocytochemical धुंधला परिणाम आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है, क्योंकि धुंधला पैटर्न काफी immunohistochemistry से उन लोगों के समान थे ।

अंत में, immunocytochemical आयल सेल ब्लॉकों पर धुंधला दाग immunofluorescent के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प हो सकता है; इसके अलावा, यह आसानी से और मज़बूती से किया जा सकता है रूपात्मक जानकारी के संरक्षण जबकि सेल लाइनों में अभिव्यक्ति की रूपरेखा के लिए बुनियादी अनुसंधान में कार्यरत ।

Disclosures

सभी लेखकों ने हितों का टकराव नहीं घोषित किया है ।

Acknowledgments

यह काम K.-M.H. राष्ट्रीय कैंसर केंद्र, कोरिया (१५१०१२१) और नेशनल रिसर्च फाउंडेशन, कोरिया (सं. के लिए अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । एनआरएफ-2015R1A2A2A04007432) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa Cells ATCC HeLa (ATCC CCL-2)
Ki-67 Antibody Thermo Fisher Scientific RM-9106-S1
Paraffin Leica 39601006
Xylene Fisher SCientific 1330-20-7,100-41-4
Ethenol GD Chem DJ16016
Hematoxylin Agilent 10118581
DAB Quanto Kit Thermo Fisher Scientific TA-125-QHDX, QHCX 170405
Ultravision LP detection Kit Thermo Fisher Scientific PBQ141209, LPB141209, LPH141210 Kit for immunocytochemistry; contains protein block
TintoRetriever Pressure Cooker Bio SB Corporation BSB 7008
Tris-buffered saline iNtRON Biotechnology IBS-BT008
Tween 20 USB Corporation 115106
Thromboplastin Neoplastin Cl Plus NC0591432
Tris-EDTA retrival Buffer Dignostic Biosystem E625-A
Trypsin EDTA Thermo Fisher Scientific 25200056
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone Laboratories Inc SH30910.03
DMEM Hyclone Laboratories Inc SH30243.01
Antibiotic-Antimycotic, 100X Thermo Fisher Scientific 15240062
Ultra vision peroxide block H2O2 Thermo Fisher Scientific 02Q141212
Mounting Medium Thermo Fisher Scientific 363313
Pap-Pen Vector Laboratories H-4000
Filter Paper GE Healthcare Life Sciences 1001-0155
Calcium Chloride Sigma-Aldrich 21115-100ml
Phosphate-buffered saline PAA Laboratories H21-002
Formalin Daejung 50-00-0
15 ml tube SPL Life Sciences 50015
tissue processing cassette Simport M492-5
100 mm culture dishes BD Biosciences 08-772E
Glass Slide Muto Pure Chemicals 140712
Cover Glass Marienfeld 2262817
Glass Zar Hyunil Lab-Mate HIP-1027
Centrifuge Eppendorf 5810R
Class II Laminar Flow Hood Thermo Fisher Scientific 1300 series A2
CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific Series A2
Tissue Processor Leica BioSystem TP1020
Microtome Thermo Fisher Scientific HM340E
Microscope Olympus CX-21
Paraffin embedding station Thermo Fisher Scientific EC 350-1, EC 350-2
Tissue Section Bath (Round) CellPath HCP-JAW-0100-00AEU
Fume Hood Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd. FH-150

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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कैंसर अनुसंधान अंक १३५ Immunocytochemistry immunofluorescent धुंधला सेल ब्लॉक आयल embedding आयल ब्लॉक thromboplastin-प्लाज्मा Cytoskeleton-जुड़े प्रोटीन 2 KI-६७
आयल-एम्बेडेड सेल ब्लॉक्स पर Immunocytochemistry द्वारा कल्चरल सेल में प्रोटीन एक्सप्रेशन लेवल का निर्धारण
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Poojan, S., Kim, H. S., Yoon, J. W., … More

Poojan, S., Kim, H. S., Yoon, J. W., Sim, H. W., Hong, K. M. Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks. J. Vis. Exp. (135), e57369, doi:10.3791/57369 (2018).

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