Summary
Foreløpig er immunofluorescent flekker på fast celler metoden for valg for fastsettelse av protein uttrykk nivå når morfologiske informasjonen er også nødvendig. Denne protokollen presenteres her gir en alternativ metode for immunocytochemistry på parafin-embedded celleblokker.
Abstract
Immunofluorescent flekker er metoden for valg for fastsettelse av protein uttrykk nivå i cellekultur systemer når morfologiske informasjonen er også nødvendig. Protokollen for immunocytochemical flekker på parafin-embedded celleblokker, presenteres her, er et utmerket alternativ for immunofluorescent flekker på ikke-parafin-embedded fast celler. I denne protokollen, en parafin cellen blokk fra HeLa celler ble utarbeidet med metoden thromboplastin-plasma, og immunocytochemistry ble utført for vurdering av to spredning markører, CKAP2 og Ki-67. Kjerner og cytoplasmatiske morfologi av HeLa cellene var godt bevart i cellen blokk lysbildene. På samme tid var CKAP2 og Ki-67 flekker mønstre i immunocytochemistry ganske lik de i immunohistochemical farging i parafin kreft vev. Med endrede cellekultur betingelser, inkludert pre-inkubering HeLa celler under serum-free forhold kunne effekten vurderes samtidig bevare arkitektoniske informasjon. Avslutningsvis er immunocytochemistry på parafin-embedded celleblokker et utmerket alternativ for immunofluorescent flekker.
Introduction
I de fleste laboratorier brukes parafin-embedded celleblokker vanligvis ikke. Snarere er fast kulturperler celler, ikke parafin-innebygd celler, ansatt i subcellular lokalisering studier. For de faste kulturperler celler, er fluorescens i stedet for chromogen brukt. Derfor er immunofluorescent flekker metoden for valg for fastsettelse av protein uttrykk i forskning ansette celle kulturer1. Lysbilder forberedt immunofluorescent flekker, men kan observeres under immunofluorescent mikroskopi, som kan vise bilder helt annerledes enn angitt under flyet mikroskopi2. I tillegg bevaring av lysbilder til immunofluorescent farging krever beskyttelse fra lys og fluorescerende signaler blir svakere med gjentatt eksponering for bildebehandling på grunn av lysstoffrør signal3. Resultater fra immunocytochemistry på parafin-embedded celleblokker er ganske lik de fra immunohistochemistry på parafin-embedded vev4, og de kan lett oversettes til klinisk informasjon. Immunocytochemistry kan derfor være et utmerket alternativ. Men er cellen-blokk forberedelse ikke populær i grunnleggende forskningslaboratorier. I denne protokollen, deretter er cellen-blokk forberedelse og immunocytochemical flekker forutsatt for å fremme bruk av denne metoden i feltet i celle-kulturstudier.
Celle-blokk forberedelse og immunocytochemistry er ikke unike metoder, og de er allerede utlignet fra klinisk diagnose til grunnleggende forskning4,5. Selv om ulike celle-blokk forberedelse metoder har vært rapportert4,er6 thromboplastin-plasma metoden enkel, kostnadseffektiv og lett tilpasses. Derfor, i protokollen presentert i dette papiret, thromboplastin-plasma metode4,5,6,7,8 brukes for utarbeidelse av parafin-embedded celleblokker.
I studien, ble detaljerte prosedyrer for utarbeidelse av thromboplastin-plasma celleblokker og immunocytochemistry metode ansette to spredning markører vist. En markør er cytoskeleton-assosiert protein 2 (CKAP2), som nylig har blitt rapportert som en mitotisk markør9,10,11; den andre er Ki-67, som er de mest kjente spredning markør12. Representant ordningen er vist i figur 1.
Protocol
Studien protokollen ble godkjent av de institusjonelle gjennomgang styret av National Cancer Center, Korea (NCCNCS-12-630).
1. sample forberedelse (30 minutter)
- For kultur HeLa celler (CCL-2, ATCC), bruker du 10 mL komplett DMEM medium (10% fosterets bovin serum, 1% penn-strep) i en 100 mm kultur parabol. For å forberede serum-sultet HeLa celler, ruge confluent HeLa celler i DMEM uten fosterets bovin serum i 48 timer, som beskrevet i en tidligere studie11.
- Hvis du vil koble cellene, vaske dem med 2 mL fosfat-bufret saltvann (PBS), og legge 2 mL 0,25% EDTA trypsin per 100 mm kultur parabol. Deretter ruge i 2-3 min i en CO2 inkubator på 37 ° C.
- Legge til 5 mL av komplett DMEM medium kultur parabol deaktivere trypsin og overføre frittstående cellene til en 15 mL tube. Deretter sentrifuge cellene på 300 x g i 10 min å danne pellets.
- Fjerne nedbryting, og vask pellet to ganger med 2 mL kaldt PBS med sentrifugering 300 x g i 10 min.
- Etter fjerning av nedbryting, Legg 1 mL av 95% etanol til celle-pellets, og bland celle pellets med etanol ved vortexing. Holde fast cellene på is til celle-blokk utarbeidelse.
2. cell-blokk forberedelse (1 h 30 min)
- For utarbeidelse av frosne plasma dele, samle EDTA plasma fra frisk donor blod sentrifuge 13.000 x g for 10 min. samle supernatant plasma og aliquot 200-400 µL hver i microfuge rør. Lagre dele ved-80 ° C før bruk. Når de frosne plasma dele er klar, hente dem og tine plasma av inkubasjon ved 37 ° C i 5 minutter.
- Sentrifuge fast cellene på 700 x g i 10 min og deretter kaste nedbryting.
- Bland celle pellets med 2 dråper (ca 200 µL) plasma, 2 dråper av thromboplastin og 2 dråper av 0.025 M veisalt. Så, blande dem av pipettering.
- La blandingen danner en celle blodpropp ved romtemperatur for 10 min, som vist i figur 2A. Deretter vaskes celle blodpropp med PBS to ganger ved å helle og fjerne PBS av pipette. Representant hvite blodlegemer blodpropp vises i figur 2B.
- Fukt filter papir med formalin og bryte celle blodpropp med pre-fuktet filter papiret. Deretter plassere clotted blandingen med en pincette i en vev kassett som vist i figur 2C.
- Sted vev kassetten i en glasskrukke med 50 mL av bufrede formalin (10% formalin i PBS) over natten ved 4 ° C i formalin fiksering.
3. vev behandling og parafin innebygging (overnatting)
- Laste vev kassetten som inneholder formalin-fast celle blodpropp i en vevsprosessor overnatting som beskrevet tidligere11. Vev behandling er vann flytting og condition fast celler før parafinen innebygging. For forskning uten vev behandling, utføre vev behandling prosedyre som vist i tabell 1.
- Slå på den oppvarmede innebygging station og 60 minutter senere, sjekken at det er flytende parafin i metall mold der (figur 2D).
- Ta dannet celle blodpropp fra vev kassetten og plassere det i den flytende parafinen i metall mold.
- Plasser nye vev kassetten uten lokket i metall mold som inneholder cellen blodpropp i den flytende parafinen, og helle mer flytende parafin i vev kassetten og på metall mold. Så, la parafinen stivne i kjøleplaten for 30-60 sekunder.
- Skille vev kassetten fra metall mold. Parafin cellen blokk er klar for immunocytochemistry. Innebygd celle blodpropp i parafin-embedded cellen blokk er angitt med pilen i figur 2E.
4. forberedelse lysbilder til Immunocytochemistry (1 h)
- Kontroller området for cellen blodpropp i parafin cellen blokk og skivet cellen blokk med tykkelser på 3-4 µm ved hjelp av en mikrotom. Sette parafinsnitt på silane-belagt glass lysbilder, som vist i figur 2F.
- Sted delen lysbilder i 37 ° C ovn i 30 min å lage delene overholder lysbildene.
5. Immunocytochemistry av celleblokker (6 h)
Merk: Immunocytochemical flekker på celle-blokk deler, ulike kits kan brukes (se Tabell for materiale). Alle slike kits har ulike følsomhet og særegenheter avhengig av deres modifiseringer.
- Inkuber avsnittene i 50 mL av xylen for 4 min til de paraffinize.
- Inkuber lysbildene i 100% etanol i 2 minutter for dehydrering, og to ganger 95% etanol og i 80% etanol i 2 minutter. Deretter Fjern etanol i rennende vann i 10 minutter.
- For henting av antigen, plassere lysbildene i en krukke med 40 mL Tris-EDTA henting buffer pH 9.0, og kok i en komfyr i 30 min.
- Vask lysbildene under rennende vann og ruge dem i 95% etanol i 10 min på 4 ° C. Deretter Merk celle flekker området på lysbildene med en Pap for enkel identifikasjon.
- Vask lysbildene i Tris-bufret saltvann 0,2 prosent mellom 20 (TBS-T), og Inkuber i hydrogenperoksid blokken (se Tabell for materiale) i romtemperatur i 15 min å fjerne enhver rest peroxidase aktivitet. Deretter vaske lysbildene i TBS-T tre ganger i 2 minutter hver.
- Klargjør utvannet antistoff løsning ved å fortynne primære antistoff protein blokken (se Tabell for materiale). For eksempel utvannet CKAP2 primære antistoff kan bli 1: 100, og Ki-67 antistoff 1:500. Deretter ruge lysbildene i 100 µL av utvannet antistoff løsning for 1t.
- Etter vask i TBS-T fem ganger i 2 minutter hver, ruge lysbildene i den primære antistoff enhancer i kit i 15 min ved romtemperatur i mørket.
- Etter vask i TBS-T fire ganger i 2 minutter hver, legger 2 dråper av HRP polymer (en sekundær antistoff merket med pepperrotperoksidase) og ruge lysbildene ved romtemperatur for 30 min.
- Etter vask i TBS-T fem ganger i 2 minutter hver, legger du til 100 µL diaminobenzidine (DAB) løsning (se Tabell for materiale), og Inkuber lysbilder for 3 min.
- Etter vask i TBS-T to ganger, legger 100 µL Hematoxylin løsning (blanding av 100 µL av Hematoxylin og 600 µL destillert vann) og ruge lysbilder for 1 min.
- Etter vask tørke lysbildene i TBS-T en gang, av incubating inne 95% etanol i 2 minutter, dyppe i 95% etanol gang og dyppe i 100% etanol to ganger. Deretter ruge lysbildene i 40 mL xylen i en glasskrukke i 5 min.
- Når lysbildene er tørr fra xylen, montere den respektive coverslips.
- Observere flekker mønstre bruker * lys.
Representative Results
I et hematoxylin-og-eosin-farget lysbilde fra parafin-embedded cellen blokk (figur 3AB) er de fleste av kjerner og cytoplasma cellene intakt, antyder at morfologiske bevaring er utmerket med den gjeldende protokollen ( Figur 3A). I immunocytochemical farging, ble positiv CKAP2 flekker observert i kondensert chromatin, mitotisk spindel og cytoplasma (Figur 4), som tidligere rapporterte10. KI-67 flekker ble observert i cellen kjerner, som forventet (Figur 4). Bare cellene med CKAP2 farging i kondensert chromatin (se pilene i figur 4AB) var mitotisk celler. Mange CKAP2-positive celler ble vist i svært mitotisk HeLa cellene hadde utarbeidet etter en inkubasjon i fullstendig medium (figur 4A). Til sammenligning var det CKAP2-positive cellene i serum-sultet HeLa cellene (figur 4B). De fleste av svært mitotisk HeLa cellene var Ki-67 positive (figur 4C). Contrastingly, Ki-67-positiv ofte i serum-sultet HeLa cellene var så høyt som ~ 50% (Figur 4 d). Disse resultatene er helt sammenlignbare med en tidligere rapport11, som antyder at CKAP2 er en mer pålitelig spredning markør i kreftcellene enn Ki-67.
I dårlig forberedt celleblokker, kjerner er atskilt fra cytoplasma og det er også, resultantly, dårlig morfologiske bevaring. Lengre enn overnatting inkubasjonstiden for fast celler i et kjøleskap kan forårsake så dårlige resultater. En annen viktig problem er at cellene ikke er flekket godt av immunocytochemistry, til tross for utmerket morfologi. Dette problemet oppstår oftere når de celle koagulere er liten. Vanligvis er flekker intensiteten uregelmessig som vist i figur 3B; men når de celle koagulere er større, det er mye mindre sjanse for uregelmessig flekker. Derfor i denne protokollen økt vi volum av plasma, thromboplastin og veisalt for å danne en stor celle blodpropp.
Figur 1: Cell-blokk forberedelse ordningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: illustrasjon av parafin celle-blokk forberedelse. (A) thromboplastin-plasma celle blodpropp i rør. (B) TP celle blodpropp etter PBS vask. (C) cellen blodpropp på fuktet filter papir. (D) vev-embedding stasjon med flytende voks. Metall mold (pil) har smeltet voks for herding. (E) parafin-embedded celle blodpropp (pil) innebygd i parafin eller parafin-embedded cell blokk. (F) tynne parafin delen på den midtre delen av et belagt lysbilde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Cell-blokk forberedelse og bekreftelse av kvaliteten av hematoxylin og eosin og immunostai-. (A) hematoxylin-og-eosin-farget bilde av HeLa celler i en parafin-embedded celle-blokk-delen. (B) uregelmessig farging av Ki-67 i immunocytochemistry på en dårlig forberedt parafin-embedded celle-block delen. Skala barer er (A) 100 og (B) 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Immunocytochemical flekker på parafin-embedded cellen blokk for HeLa celler. (A) CKAP2 flekker under svært mitotisk forhold. (B) CKAP2 flekker under serum-sultet forhold. (C) Ki-67 flekker under svært mitotisk forhold. (D) Ki-67 flekker under serum-sultet forhold. 100 μm skala barer vises. Pilhodene angir CKAP2-positive celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Prosedyre | Trinn | Løsning | Tid/temperatur |
| Dehydrering | 1 | 70% alkohol | 15 min/RT |
| 2 | 80% alkohol | 15 min/RT | |
| 3 | 95% alkohol | 15 min/RT | |
| 4 | 100% alkohol | 15 min/RT | |
| Fjerne | 1 | Xylen | 60 min/4 ° C |
| 2 | Xylen | 10 min/RT | |
| 3 | Xylen | 10 min/RT | |
| 4 | Xylen | 10 min/RT | |
| * RT, romtemperatur |
Tabell 1. Vev behandling prosedyre.
Discussion
Immunofluorescent flekker på fast kulturperler celler er metoden for valg for fastsettelse av protein uttrykk nivå i cellene samtidig bevare morfologiske informasjon1. Immunocytochemistry på parafin-embedded celleblokker kan imidlertid være et utmerket alternativ. Detaljerte prosedyrer for utarbeidelse av parafin-embedded celleblokker og immunocytochemistry er beskrevet i denne protokollen, og vi håper det kan lette anvendelse av immunocytochemistry i celle studier.
Immunocytochemistry har flere fordeler fremfor immunofluorescent flekker. Immunofluorescent flekk for cellene vanligvis krever fersk kulturperler celler, men parafin celleblokker kan oppbevares ved romtemperatur for flere år13. I tillegg kan immunocytochemistry på celleblokker utforske intracellulær uttrykk mønstre ved hjelp av samme antistoffer i rutinemessige immunohistochemistry på menneskelig vev4. Videre kan det utforske endringene i protein nivå eller posttranslational modifikasjoner enten ved pre rugende celler med ulike stoffer eller under ulike kultur forhold11.
I motsetning til fordelene ved immunocytochemical flekker, utarbeidelse av parafin-embedded celleblokker tar tid og er kostbare14. Også de fleste forskningslaboratorier mangler erfaring i denne teknikken, og tekniske feil under slike omstendigheter er vanlig. De vanligste feilene er dårlig bevaring av celle morfologi og dårlig eller uregelmessig immunocytochemical flekker på parafinsnitt cellen blokk. Disse og de fleste andre kan unngås ved å gjøre celleblokker under beste celle betingelser og bruke nok løsning for å danne celle clots.
Som en demonstrasjon av nåværende protokollen, celleblokker var forberedt HeLa celler, og immunocytochemical flekker ble utført for to spredning markører, CKAP2 og Ki-67, som tidligere rapportert11. Cellene ble manipulert av inkubasjon i media med og uten fosterets bovin serum immunocytochemistry, og effekten av serum sult kunne observeres. Disse forberedt parafin-embedded celleblokker kan brukes til en rekke antistoffer, fordi mange lysbilder kan tilberedes fra en celle blokk med bare en 4-5 µm tykke celle-block delen per lysbilde. Derfor kan uttrykket mønstre tilsvarer to ulike forhold evalueres med flere forskjellige antistoffer. Immunostaining mønstre for CKAP2 Ki-67 i kreft vev allerede har rapportert9,10,11,12og immunocytochemical fargeresultatene kunne lett vurderes, fordi den farging mønstrene var ganske lik de fra immunohistochemistry.
Avslutningsvis kan immunocytochemical flekker på parafin celleblokker være et utmerket alternativ for immunofluorescent flekker; Videre, det kan være enkelt og pålitelig ansatt i grunnleggende forskning for expression profilering i linjer samtidig bevare morfologiske informasjon.
Disclosures
Alle forfattere har erklært ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler til K.-M.H. fra National Cancer Center, Korea (1510121) og National Research Foundation, Korea (nei. NRF-2015R1A2A2A04007432).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HeLa Cells | ATCC | HeLa (ATCC CCL-2) | |
| Ki-67 Antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9106-S1 | |
| Paraffin | Leica | 39601006 | |
| Xylene | Fisher SCientific | 1330-20-7,100-41-4 | |
| Ethenol | GD Chem | DJ16016 | |
| Hematoxylin | Agilent | 10118581 | |
| DAB Quanto Kit | Thermo Fisher Scientific | TA-125-QHDX, QHCX 170405 | |
| Ultravision LP detection Kit | Thermo Fisher Scientific | PBQ141209, LPB141209, LPH141210 | Kit for immunocytochemistry; contains protein block |
| TintoRetriever Pressure Cooker | Bio SB Corporation | BSB 7008 | |
| Tris-buffered saline | iNtRON Biotechnology | IBS-BT008 | |
| Tween 20 | USB Corporation | 115106 | |
| Thromboplastin | Neoplastin Cl Plus | NC0591432 | |
| Tris-EDTA retrival Buffer | Dignostic Biosystem | E625-A | |
| Trypsin EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone Laboratories Inc | SH30910.03 | |
| DMEM | Hyclone Laboratories Inc | SH30243.01 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Ultra vision peroxide block H2O2 | Thermo Fisher Scientific | 02Q141212 | |
| Mounting Medium | Thermo Fisher Scientific | 363313 | |
| Pap-Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Filter Paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-0155 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 21115-100ml | |
| Phosphate-buffered saline | PAA Laboratories | H21-002 | |
| Formalin | Daejung | 50-00-0 | |
| 15 ml tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| tissue processing cassette | Simport | M492-5 | |
| 100 mm culture dishes | BD Biosciences | 08-772E | |
| Glass Slide | Muto Pure Chemicals | 140712 | |
| Cover Glass | Marienfeld | 2262817 | |
| Glass Zar | Hyunil Lab-Mate | HIP-1027 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Class II Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series A2 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | Series A2 | |
| Tissue Processor | Leica BioSystem | TP1020 | |
| Microtome | Thermo Fisher Scientific | HM340E | |
| Microscope | Olympus | CX-21 | |
| Paraffin embedding station | Thermo Fisher Scientific | EC 350-1, EC 350-2 | |
| Tissue Section Bath (Round) | CellPath | HCP-JAW-0100-00AEU | |
| Fume Hood | Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd. | FH-150 |
References
- Bhattacharyya, D., Hammond, A. T., Glick, B. S. High-quality immunofluorescence of cultured cells. Methods Mol Biol. 619, 403-410 (2010).
- Brown, C. M. Fluorescence microscopy - Avoiding the pit falls. J Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).
- Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. J Invest Dermatol. 133, e4 (2013).
- Kulkarni, M. B., Desai, S. B., Ajit, D., Chinoy, R. F. The utility of the thromboplastin-plasma cell-block technique for fine-needle aspiration and serous effusions. Diagn Cytopathol. 37 (2), 86-90 (2009).
- Shivakumarswamy, U., Arakeri, S. U., Karigowdar, M. H., Yelikar, B. Diagnostic utility of the cell block method versus the conventional smear study in pleural fluid cytology. J Cytol. 29 (1), 11-15 (2012).
- Nathan, N. A., Narayan, E., Smith, M. M., Horn, M. J. Cell block cytology: Improved preparation and its efficacy in diagnostic cytology. Am J Clin Pathol. 114 (4), 599-606 (2000).
- Keyhani-Rofagha, S., Vesey-Shecket, M. Diagnostic value, feasibility, and validity of preparing cell blocks from fluid-based gynecologic cytology specimens. Cancer. 96, 204-209 (2002).
- Young, N. A., Naryshkin, S., Katz, S. M. Diagnostic value of electron microscopy on paraffin-embedded cytologic material. Diagn Cytopathol. 9, 282-290 (1993).
- Jin, Y., Murakumo, Y., Ueno, K., Hashimoto, M., Watanabe, T., Shimoyama, Y., et al. Identification of a mouse cytoskeleton-associated protein, CKAP2, with microtubule-stabilizing properties. Cancer Sci. 95 (10), 815-821 (2004).
- Hong, K. U., Choi, Y. -B., Lee, J. -H., Kim, H. -J., Kwon, H. -R., Seong, Y. -S., et al. Transient phosphorylation of tumor associated microtubule associated protein (TMAP)/cytoskeleton associated protein 2 (CKAP2) at Thr-596 during early phases of mitosis. Exp Mole Med. 40, 377-386 (2008).
- Sim, S. H., Bae, C. D., Kwon, Y., Hwang, H. -L., Poojan, S., Hong, H. -I., et al. CKAP2 (cytoskeleton-associated protein2) is a new prognostic marker in HER2-negative luminal type breast cancer. PLoS ONE. 12 (8), e0182107 (2017).
- Inwald, E. C., Klinkhammer-Schalke, M., Hofstadter, F., Zeman, F., Koller, M., Gerstenhauer, M., et al. Ki-67 is a prognostic parameter in breast cancer patients: results of a large population-based cohort of a cancer registry. Breast Cancer Res Treat. 139 (2), 539-552 (2013).
- Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods Mol Biol. 784, 155-167 (2011).
- Beutner, E. H. Immunofluorescent staining: The fluorescent antibody method. Microbiol Mol Biol Rev. 25 (1), 49-76 (1961).
