Summary
Intrarachidienne de recombinase dépendant adeno-associated virus recombinant (rAAV) peut être utilisée pour manipuler n’importe quel type de cellules génétiquement marquées dans la moelle épinière. Ici, nous décrivons comment transmettre des neurones de la corne dorsale de la moelle épinière lombaire. Cette technique permet d’interrogatoire fonctionnelle du sous-type neurone manipulé.
Abstract
Manipulation sélective des sous-populations de neurones spinale réalisée principalement par deux méthodes différentes : 1) génétique intersectionnelle, auquel cas doubles ou triples les souris transgéniques sont générés afin d’obtenir une expression sélective d’un journaliste ou un effecteur gène (par exemple, du locus Rosa26) dans la population souhaitée de la colonne vertébrale. 2) intrarachidienne de virus adeno-associé de recombinante de Cre-dépendante (rAAV) ; ici, des vecteurs d’AAV Cre-dépendante codant pour le gène reporter ou effecteur de choix sont injectées dans la moelle épinière des souris exprimant la recombinase Cre dans la sous-population neuronale désirée. Ce protocole décrit comment générer des vecteurs rAAV Cre-dépendante et comment transmettre les neurones de la corne dorsale de la moelle épinière lombaire segments L3-L5 avec rAAVs. Comme les segments de la colonne vertébrale lombaires L3-L5 sont innervés par ces neurones sensoriels périphériques qui transmettent l’information sensorielle provenant des membres postérieurs, comportement spontané et réponses à des tests sensoriels, appliqués pour le postérieur homolatéral du côté d’injection peuvent être analysées afin d’interroger la fonction des neurones manipulés de traitement sensoriel. Nous fournissons des exemples de comment cette technique peut être utilisée pour analyser génétiquement définies des sous-ensembles des neurones spinaux. Les principaux avantages d’expression du transgène induite par le virus chez les souris transgéniques Cre par rapport à l’expression classique journaliste induite par la souris transgénique sont les suivants : 1) rAAVs Cre-dépendante différents codant des protéines différentes de reporter ou d’effecteur peut être injecté dans une seule lignée transgénique Cre, surmontant ainsi la nécessité de créer plusieurs souris transgénique plusieurs lignes. 2) intrarachidienne limite manipulation de cellules exprimant le Cre au site d’injection et à l’heure après l’injection. Les inconvénients principaux sont : 1) expression du gène rapporteur de rAAVs est plus variable. 2) chirurgie est nécessaire pour transmettre les neurones spinaux d’intérêt. Laquelle des deux méthodes est la plus appropriée dépend de la question de population et de la recherche de neurone à traiter.
Introduction
La moelle épinière dorsale est essentielle pour l’échange d’informations entre la périphérie du corps et le cerveau. Des stimuli sensoriels comme la chaleur, le froid, le toucher, ou des stimuli nociceptifs sont détectés par les neurones périphériques spécialisés, qui transmettent cette information aux neurones de la corne dorsale de la moelle épinière. Ici, un réseau complexe des interneurones inhibiteurs et excitateurs module et finit par relais l’information sensorielle par l’intermédiaire des neurones spinaux projection supraspinales sites1,2. Les calculs effectués par la moelle inter- et neurones de projection porte l’information sensorielle, ainsi déterminer quelle information est supprimée ou relayée à quelle intensité. Changements dans l’intégration des stimuli sensoriels, comme un équilibre altéré entre l’inhibition et excitation, peuvent provoquer des dysfonctionnements sensoriels tels que l’hypersensibilité ou allodynie (sensations douloureuses après une stimulation normalement non douloureuse). Ces changements sont considérés comme la cause sous-jacente de la douleur chronique divers États3,4. Ainsi, les circuits spinaux sont d’une grande importance au traitement sensoriel et par conséquent dans la perception de l’environnement de l’organisme et soi. Avec l’avènement récent et combinaison de moléculaire, génétique et des techniques chirurgicales qui permettent la manipulation précise de sous-populations génétiquement identifiés neurone spinal, les scientifiques commencent à comprendre les circuits de la colonne vertébrale sous-jacente responsable du traitement des différentes modalités sensorielles.
Intrarachidienne de rAAV chez des souris transgéniques ou de type sauvage a grandement contribué à la manipulation, l’analyse et la compréhension de la fonction des sous-ensembles spécifiques de neurones spinaux5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. cette technique permet la livraison de protéines marqueur (tels que GFP / protéines de fusion de GFP), protéines de journaliste (comme GCaMP), ou protéines effectrices (tels que les toxines bactériennes, channelrhodopsin ou récepteurs pharmacogénétiques) dans un spatialement manière limitée aux neurones spinaux. Injection locale de rAAVs Cre-dépendante dans des souris transgéniques exprimant une recombinase Cre dans un sous-ensemble spécifique des neurones spinaux permet l’analyse spécifique de la population neuronale respectif. Nous avons utilisé cette technique pour étiqueter, ablation, inhiber ou activer la colonne vertébrale glycinergic neurones démontrant qu’ils sont une partie essentielle de la porte de la colonne vertébrale contrôler la douleur et démangent transmission7. Dans ces expériences, intrarachidienne de Cre-dépendant du rAAV GlyT2::Cre chez la souris a permis la manipulation sélective des neurones glycinergic dans la moelle lombaire. Ainsi, la manipulation simultanée des circuits supraspinal qui contiennent glycinergic neurones essentiels à la survie de l’animal peut être évitée.
Alors que l’administration intrarachidienne de rAAVs limite infection au site d’injection, transduction virale peut se produire non seulement dans les neurones les, mais aussi dans les neurones qui se connectent au site d’injection via projections axonales. Ce dernier est souvent utilisé pour les zones de CNS trace apport neuronale d’un noyau particulier dans le cerveau. L’infection des projections axonales possible, toutefois, également être un facteur de confusion quand une population définie de neurones doit être étudiée dans un site donné. Pour résoudre ces problèmes, nous avons récemment effectué une analyse complète des sérotypes d’AAV et cassettes d’expression pour identifier des sérotypes et des promoteurs qui peuvent servir à minimiser ou maximiser transduction rétrograde. Dans le cadre de cette recherche spécifique dans les circuits de la colonne vertébrale, nous avons analysé la capacité des promoteurs et des sérotypes différents de transduce marqués des neurones dans le cortex somatosensoriel les ganglions de la racine dorsale (GRD) et la moelle ventro rostrale (RVM) 12. la technique décrite dans le présent protocole peut donc servir à analyser les neurones spinaux au site d’injection ou d’analyser des neurones de projection que formuler des commentaires sur le site d’injection de la moelle épinière. Dans le protocole décrit ici, trois injections du rAAV dans le côté gauche de la colonne vertébrale lombaire sont réalisées pour permettre la transduction des neurones dans les trois segments lombaires (L3-L5). Les segments de L3-L5 reçoivent la majorité de l’information sensorielle du postérieur homolatéral au site d’injection. Nous démontrons que la manipulation fonctionnelle des neurones génétiquement marquées en L3-L5 est suffisante pour susciter des changements de comportement robustes, fournissant ainsi la preuve fonctionnelle pour la fonction de circuit de telle un sous-type de neurone génétiquement marquées.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les expériences animales ont été approuvés par l’office vétérinaire cantonal Suisse (Zurich) et sont en conformité et le respect de toutes les directives réglementaires et institutionnels.
Remarque : Tous les matériaux ainsi que des fabricants respectifs et/ou vendeurs sont répertoriés dans la Table des matières.
1. génération des vecteurs d’AAV Cre-dépendante
Remarque : Une variété de vecteurs de Cre-dépendante avec des promoteurs différents peut être achetée (voir Table des matières) ou, si la construction de l’expression souhaitée n’est pas disponible, il peut être généré en modifiant des constructions existantes de VAA. À noter, le promoteur et le sérotype peuvent avoir un impact sur la propagation de la transduction virale (voir 12). La première partie du présent protocole décrit brièvement la génération de deux des différents vecteurs d’AAV Cre-dépendante adaptés pour le gain et la perte d’expériences de fonction, respectivement.
-
Pharmacogénétique Activation (Gain de fonction)
- Commander pAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq)-mCherry (voir la Table des matières) pour designer récepteurs activés exclusivement par designer drugs (DREADD)-médiation activation.
- À la réception de la culture bactérienne stab, strie les bactéries sur plaques LB (qualité bactériologique agar dissous dans un milieu liquide Luria-Bertani) additionné de l’antibiotique approprié. Incuber pendant la nuit à 37 ° C et prélever une colonie unique sur le lendemain.
NOTE : Plasmides contenant AAV vecteur génomes peuvent être instables et recombinaison du génome viral, surtout dans l’aérogare inversé virale répète (RIR), peut se produire au cours de l’amplification chez e. coli. Nous suggérons à l’aide de recA-deficient/étouffées souches telles que MDS42 ou Stbl3 pour éviter de recombinaison dans le plasmide contenant le génome de l’AAV. - Amplifier les bactéries en suivant les instructions fournies par le vendeur de l’Elu ADN-Maxi-Kit et préparer l’ADN de plasmide de haute qualité avec un ADN-Maxi-Kit disponible dans le commerce (par exemple, voir la Table des matières). Effectuer un contrôle de la qualité de la préparation d’ADN plasmidique en vérifiant l’intégrité et l’identité de l’ADN de plasmide par Sommaire de restriction d’une aliquote de l’ADN de plasmide.
Remarque : Il existe des sites de reconnaissance pour l’endonucléase de restriction SmaI dans le RTI. Inclure un "Digest" SmaI dans le contrôle de la qualité pour vérifier l’intégrité de l’ITRs. - Envoyer l’ADN à une installation de base de vecteur viral afin de produire le rAAV de haute qualité.
NOTE : Titre élevé, préparations virales de haute qualité sont indispensables pour éviter la confusion causées par des contaminations dans la préparation virale des phénotypes. Nous recommandons donc dont le rAAV de choix produite dans une installation de base vectorielle établie, à moins que la production de l’AAV est bien établie dans le laboratoire.
-
Ablation (perte de fonction)
Remarque : Les toxines bactériennes ou des récepteurs de la toxine peuvent servir à médiation ablation cellulaire ou silencieux neuronale. Nous avons généré pAAV.EF1α.flex.DTA fragment de toxine diphtérique express A (CDI) en fonction de la Cre.- Pour générer un vecteur viral Cre-dépendante, choisir un vecteur de Cre-dépendante avec un promoteur approprié (par exemple, pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP). Amplifier la séquence codante de choix (p. ex., DTA) par PCR avec des amorces qui incluent des asques et des NheI ou des sites de reconnaissance de l’endonucléase de restriction compatible dans leur porte-à-faux (voir Foster et al. 7)
- En utilisant des techniques standard de biologie moléculaire, effectuer des condensés de restriction de l’ADN du vecteur (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) et de la PCR amplifiés insérer (NheI-DTA-AscI) avec les endonucléases de restriction asques et NheI. Ligaturer les fragments purifiés.
- Transformer la réaction de ligature en bactéries appropriés, selon le protocole donné par le fournisseur des bactéries compétentes de choix et blanc sur plaque de bactéries sur des plaques de LB. Utilisez recA-deficient/étouffées souches, comme MDS42 ou Stbl3, pour le clonage et ultérieure amplification de l’ADN de plasmide.
- Le jour après transformation, sélectionner les clones et leur inoculer dans LB additionné à la nuit antibiotique appropriée à 37 ° C. Le lendemain, extraire l’ADN de plasmide de bactéries cultivées. Vérifiez le clonage de restriction digestion réussie et le séquençage de l’ADN de plasmide extraite.
- Amplifier l’ADN de plasmide bactérien de haute qualité (Voir l’étape 1.1.3). Envoyer de l’ADN amplifié à un laboratoire central de vecteurs viraux pour la production de virus.
2. transduction des cellules de la colonne vertébrale
- Préparation de la Solution antivirus
ATTENTION : Les virus sont infectieuses réactifs et doivent être manipulés conformément aux lignes directrices pertinentes. Dans la plupart des cas, les rAAVs peuvent être gérés au niveau de biosécurité 1 (BSL1).- Le jour de l’injection, une partie aliquote de stocks du virus purifié désiré sur la glace de dégivrage et gardez-le sur la glace jusqu'à ce que juste avant l’injection. Éviter le gel-dégel-cycles répétés, car il réduira le titre efficace du virus.
NOTE : Si nécessaire, le virus décongelé aliquot peuvent être conservé à 4 ° C jusqu'à 3 jours. - Diluer les particules virales en stérile 0,9 % NaCl ou phosphate buffered saline (PBS).
NOTE : Le titre approprié dépend des objectifs expérimentaux et doit être déterminé expérimentalement. Une bonne charge virale totale est de commencer avec 3 x 109 copies de génome (3.33x1012 GC/mL, 3 x 300 nL injecté). Prise excessive et quelques pertes pendant le chargement du capillaire en comptent, il faudra environ 2,5 µL de solution antivirus pour chaque souris.
- Le jour de l’injection, une partie aliquote de stocks du virus purifié désiré sur la glace de dégivrage et gardez-le sur la glace jusqu'à ce que juste avant l’injection. Éviter le gel-dégel-cycles répétés, car il réduira le titre efficace du virus.
- Préparation des Micropipettes pour Injections intramédullaires
- « Pull » capillaires en verre à paroi mince (diamètre extérieur 1 mm) sur un de micropipettes pour créer un longueur de ~5.5 mm, tige en eau peu profonde. Utiliser un filament chauffant de 3,0 mm et paramètres de programme 00 avec p adapté comme dans le tableau 1.
Remarque : Tirant peut s’effectuer à l’avance. Les capillaires élongations doivent être stockés dans un récipient fermé sur modeler pour éviter la poussière qui pourrait obstruer plus tard de la micropipette. Autoclave de micropipettes n’est pas nécessaire. - Couper la tige du capillaire extraite avec une pince de laminectomie à une longueur d’environ 4,5 à 5 mm pour créer une pointe d’ouverture dont le diamètre intérieur de 25 à 35 μm. À l’aide d’un microscope avec une échelle du micromètre, mesurer le diamètre intérieur des micropipettes plusieurs à avoir une idée de quelle taille l’ouverture devrait être, ou mesurer pour chaque micropipette.
NOTE : Une petite astuce peut conduire à obstruction ; un plus gros pourboire peut entraîner des lésions tissulaires et difficultés à pénétrer dans la moelle épinière.
- « Pull » capillaires en verre à paroi mince (diamètre extérieur 1 mm) sur un de micropipettes pour créer un longueur de ~5.5 mm, tige en eau peu profonde. Utiliser un filament chauffant de 3,0 mm et paramètres de programme 00 avec p adapté comme dans le tableau 1.
- Préparation d’outils et d’installation chirurgicale
- S’assurer que l’équipement soit propre et prêt à être utilisé. Désinfecter la zone de travail en l’essuyant avec l’éthanol à 70 % et stériliser les outils par autoclave ou leur désinfection. Ne laissez pas n’importe quel désinfectant sur la seringue de microlitre qui nuirait à la vecteur viral à utiliser.
- Préparation de l’Animal pour la chirurgie et l’anesthésie
Remarque : La durée totale de la chirurgie est de 60 à 90 min.- Choisir 6 - à 10 - semaine souris âgées pour faciliter la procédure chirurgicale.
Remarque : Si le protocole expérimental l’exige, l’injection d’animaux plus jeunes ou plus âgés est possible. Toute souche et des deux sexes peuvent être utilisés en principe, mais utilisent la même souche de fond (p. ex., C57BL/6J) pour la comparaison des comportements entre les lignées de souris transgéniques différents. Si les différences entre les sexes sont attendus ou à étudier, analyser des mâles et des femelles dans des groupes séparés. - Induire l’anesthésie à l’isoflurane ~ 5 %. Placer l’animal dans le cadre stéréotaxique sur un tapis de chaleur et de maintenir l’anesthésie à l’isoflurane 1 à 2,5 % (taux de débit d’air 900 mL/min). Surveiller le taux de respiration tout au long de la chirurgie.
- Appliquer un onguent lubrifiant pour éviter le dessèchement cornée au cours de la chirurgie.
- Raser le dos de l’animal et enlever les cheveux soigneusement avec des tissus humides. Désinfecter la peau rasée avec la solution d’iode et laisser la peau sécher.
- Accorder un traitement analgésique (p. ex., 0,1 à 0,2 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée).
- Choisir 6 - à 10 - semaine souris âgées pour faciliter la procédure chirurgicale.
- Exposition de la colonne vertébrale au niveau de la moelle épinière lombaire
Remarque : En raison du développement différencié de la moelle épinière et la colonne vertébrale, les niveaux respectifs ne sont pas alignées, mais le segment de la moelle épinière lombaire L4 est au même niveau que la vertèbre thoracique T13.- Trouver la paire de côtes plus caudale en palpant le long de la colonne vertébrale. À l’aide d’un scalpel, faites une coupe longitudinale de 1,5 à 2,5 cm dans la peau à partir de seulement rostrale à la paire de côtes plus caudale.
- Soulever la peau avec une pince et retirez-le du muscle sous-jacent avec des ciseaux. Tout au long de l’opération, garder les tissus exposés humide avec stérile 0,9 % NaCl.
- À l’aide de pinces fines et des petits ciseaux, faire une incision dans la prochaine couche membraneuse mince juste à côté de la ligne médiane et la couper des apophyses épineuses. Il est séparé du muscle paraspinous sous-jacente, mais attaché aux apophyses épineuses.
- Identification des vertèbres au niveau de la moelle épinière lombaire
Remarque : Une fois que la colonne vertébrale est exposée, les ligaments intertransverse et les apophyses dorsales doivent être visibles. Plusieurs repères anatomiques peuvent aider à identifier la vertèbre correcte de cible (Figure 1 b).- Tirer la peau vers l’arrière pour exposer la crête iliaque. Au même niveau, la paire plus caudale des ligaments intertransverse visibles a rejoint l’apophyse L6. Rebours dans une caudale à direction rostrale d’identifier la vertèbre d’intérêt.
- Palper le long de la colonne vertébrale. La paire de côtes plus caudale se trouve juste rostrale à la vertèbre T13 et l’os iliaque au niveau des hanches est au niveau de la vertèbre L6.
- Retrouver l’endroit où le tendon le long du côté de la colonne vertébrale est plus blanc et plus médiale. La vertèbre T13 se trouve juste rostrale. Le segment de la moelle épinière lombaire L4 est situé au sein de cette vertèbre.
- Fixation de la colonne vertébrale et l’exposition de la moelle épinière lombaire
- Placez l’animal sur un coussin de tissus enroulés à élever sur les bornes de la colonne vertébrale du cadre stéréotaxique.
- Difficulté la vertèbre cible pour éviter les mouvements de la colonne vertébrale en raison de la respiration. Pour cet objectif, aligner les attaches adjacentes à la vertèbre de cible, fixer un collier en position et maintenir la colonne vertébrale avec une pince Adson tandis que la deuxième pince de fixation.
Remarque : La colonne doit être perpendiculaire au plan de l’injection et solidement fixé afin qu’il ne se déplace pas à la pression par le haut. Si nécessaire, une deuxième paire de pinces peut être fixée à la colonne vertébrale. Dans ce cas, il est utile de fixer les deux paires de pinces sur les deux vertèbres adjacentes à la vertèbre de cible. - Enlever le muscle paraspinous au-dessus de la vertèbre d’intérêt. À l’aide d’un scalpel, faire une incision parallèle seulement médiale pour les tendons qui sont parallèles à la colonne vertébrale, ainsi que des incisions perpendiculaires rostral et caudale de la vertèbre de cible. Veillez à ne pas couper trop profondément. Larme/cut away le muscle à l’aide de pinces-gouges. Utiliser la pince au besoin pour enlever les tissus restant sur la vertèbre ou au-dessus de la dure-mère dans l’espace intervertébral.
- Dans l’espace intervertébral, le vaisseau dorsal doit être visible de marquage de la ligne médiane de la moelle épinière. Pour les injections unilatérales, effectuer une laminectomie partielle en forant un trou dans le milieu du côté de la cible de la vertèbre. Utiliser une fine art dentaire appareil avec une fraise sphérique de 0,5 mm de perçage et forage particulièrement prudent lorsque vous approchez de la moelle épinière. Retirer des fragments d’os restant avec une aiguille biseautée de 26G d’exposer la moelle épinière.
- À l’aide d’une aiguille biseautée de 26G, perforer la dura dans le trou percé et dans l’espace intervertébral rostral et caudale à la vertèbre de la cible, tout environ 200 µm latérale au vaisseau sanguin dorsal. Le liquide céphalorachidien devrait être fuyant les trous et la moelle épinière devrait être légèrement exorbités.
- Préparation de la seringue d’Injection
Remarque : La seringue d’injection doit être préparée immédiatement avant le début de l’injection pour réduire le risque de colmatage de la micropipette de particules de poussière.- Monter le capillaire de verre sur une seringue de microlitre en utilisant la compression aiguille amovible, kit de fixation. Serrer l’écrou fermement pour assurer un ajustement serré et sûr.
- Remplir la seringue de microlitre avec de l’eau distillée stérile et démarrer en appuyant avec le piston.
Remarque : S’il y a aussi beaucoup de résistance pour que l’eau ne sort pas facilement de la pointe, la micropipette est probablement bloquée et doit être changée. - Montez la seringue sur un micromanipulateur relié à une commande électronique microinjector. Veillez à ne pas toucher quoi que ce soit avec une micropipette.
- À l’aide de la microinjector, dresser environ 1 µL d’air pour créer une bulle entre l’eau et le virus.
- Placez une goutte de 2,5 µL de solution de virus sur un morceau de pellicule de paraffine, déplacer délicatement l’extrémité de la micropipette dans la goutte en utilisant le cadre stéréotaxique et tirez-le vers le haut. Ensuite soigneusement presse diluer jusqu'à ce qu’un peu de solution antivirus émerge à la pointe.
- Retirer la seringue et, à l’aide d’un crayon, marquer la micropipette avec une échelle et noter le niveau de la solution de virus ; Cela facilitera le suivi de la question de savoir si l’infusion se poursuit tel que programmé.
- Injections intramédullaires
- Déplacer l’extrémité de la micropipette au-dessus d’un des trous de la dure-mère et puis vers le bas jusqu'à ce qu’une légère bosse est notée dans la dure-mère. Pour cibler l’injection de la corne dorsale spinale, déplacer vers le bas de 500 µm par incréments de 100 µm consécutives (vitesse 1 mm/s) et ensuite 200 µm vers le haut permettre une stabilisation mécanique du tissu.
NOTE : La profondeur finale de la pointe est de 300 µm dans ce cas, mais peut être adaptée en fonction de la zone cible.- Si le tissu est résistant à la pénétration, la micropipette pourrait être la capture sur la dure-mère. Dans ce cas, retirer et passer légèrement à recouvrent le trou, ou réutiliser l’aiguille pour perforer la dure-mère correctement avant de répéter la tentative de pénétration.
- Programmer la pompe pour un volume d’injection cible de 300 nL à une vitesse d’injection de 50 nL/min et appuyez sur la touche start pour commencer la perfusion.
- Une fois l’injection terminée, vérifier l’échelle pour voir si le niveau de virus a chuté et laissez la micropipette en place pour un 3 min supplémentaire permettre à la pression de s’équilibrer avant de lentement se retirer la seringue.
- Répétez l’étape 2.9.1.-2.9.3. pour les autres sites de deux injection.
- Déplacer l’extrémité de la micropipette au-dessus d’un des trous de la dure-mère et puis vers le bas jusqu'à ce qu’une légère bosse est notée dans la dure-mère. Pour cibler l’injection de la corne dorsale spinale, déplacer vers le bas de 500 µm par incréments de 100 µm consécutives (vitesse 1 mm/s) et ensuite 200 µm vers le haut permettre une stabilisation mécanique du tissu.
- Suture et récupération
- Retirer les pinces de la colonne vertébrale et le coussin sous la souris.
- Refermer la plaie en couches avec des points de suture interrompus, suture de la peau et les couches de tissu superficiel avec des sutures résorbables avec sutures non résorbables. Appliquer le désinfectant de l’iode sur la plaie suturée.
- Fin de l’anesthésie et laisser l’animal sur le tapis de chaleur jusqu'à ce qu’il récupère avant de retourner à sa cage maison.
- Soins post-opératoires
- Surveiller la santé de l’animal sur le jour de l’opération, le lendemain et puis tous les 2-3 jours. Veiller à ce que l’animal a une démarche normale, une apparence saine (poids, yeux, fourrure et le comportement), et que la cicatrisation.
- Poursuivre le traitement analgésique (p. ex., 0,1 à 0,2 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée) si nécessaire, trois fois par jour.
3. comportementales et morphologiques des Analyses
-
Analyse du comportement
NOTE : Permettre aux animaux de s’adapter à la configuration respectif pendant au moins 30 min avant le début des mesures afin de leur permettre de s’adapter au nouvel environnement expérimental.-
Test de von Frey
- Placez les animaux individuellement dans des compartiments individuels d’environ 10 cm x 10 cm sur un sol de grille métallique.
- Stimuler la surface plantaire de la hindpaw homolatéral au site d’injection avec un filament de von Frey dynamique. Noter la force au cours de laquelle l’animal retire sa patte de stimulus.
- Répéter cinq fois et calculer le seuil de retrait moyen des six mesures pour chaque animal.
-
Pin Prick Test
- Placer les animaux dans des compartiments individuels d’environ 10 cm x 10 cm sur un sol de grille métallique.
- Stimuler la surface plantaire de la hindpaw homolatéral au site d’injection avec une aiguille de 26-G atténuée sans pénétration de la peau. Score de comportement sous zéro (aucune réaction) ou un (réaction).
- Répéter 9 fois avec des intervalles de 3 min entre les stimulations et calculer le pourcentage de réponse de 10 mesures pour chaque animal.
-
Injection de DREADD-ligand clozapine-N-oxyde (ONC)
- Dissoudre ONC dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) pour créer une solution mère de 0,2 mg/µL, qui peut être stocké à température ambiante.
- Le jour de l’expérience, diluer la solution mère stérile 0,9 % NaCl à 0,2 µg/µL et injecter 10 µL/g de poids de corps par voie intrapéritonéale. Injecter des animaux témoins avec véhicule (DMSO de 0,2 % à 0,9 % NaCl).
NOTE : Selon expérience, effets maximaux sur les comportements peuvent être attendu 1-3 h après l’injection, et les effets devraient s’estomper complètement après 24h. Dans le cas de l’activation des neurones glycinergic, observé les comportements incluent les réponses réduits la douleur et la démangeaison. Comportements, évoquées par l’activation induite par la DREADD des neurones dépendra le sous-ensemble ciblé des neurones spinaux.
-
Injection de Pruritogens pour provoquer des démangeaisons
- Dissoudre pruritogens 0,9 % NaCl à des solutions de 8 mg/mL (chloroquine) ou 10 mg/mL (histamine). 2 h après l’administration de l’ONC, injecter 10 µL de solution de pruritogen ou d’un véhicule par voie sous-cutanée dans la surface plantaire de la hindpaw ipsilatéral à la colonne vertébrale point d’injection. Alternativement, injecter la pruritogen par voie intradermique dans le mollet, ce qui a été rasé un jour avant pour réduire le comportement aversif causée par le rasage lui-même.
-
Enregistrement vidéo pour analyser Nocifensive spontanée ou induite par le Pruritogen Itch comportements
- Placer animaux individuellement dans des compartiments transparents (environ 10 cm de diamètre) avec un peu de litière de leur cage maison respectif sur le sol.
- Filmer les animaux pendant 5 min à enregistrement spontané et pendant 30 min pour enregistrer les comportements induits par pruritogen. Analyser les vidéos off-line dans les bacs de 5 min.
-
Douleur par rapport aux comportements des démangeaisons
- Observer et noter broncher, lécher et mordre les comportements.
NOTE : Broncher et lécher du site incriminé sont considérées comme réponses à la douleur, tandis que mordre est associé à démangeaisons. - Analyser des vidéos à une vitesse normale, mesurer le temps que la souris passé lécher ou de mordre le site incriminé ou de mesurer au ralenti pour une distinction plus précise entre lécher et mordre les réflexes. Sinon, comptez le nombre de bouts de léchage/mordre/broncher.
- Observer et noter broncher, lécher et mordre les comportements.
-
Test de von Frey
-
Analyse morphologique
- Effectuer des analyses morphologiques d’une à trois semaines après l’injection du virus ou à la fin d’une expérience comportementale.
NOTE : Nous avons détecté eGFP expression dès que 48 h après l’injection, mais aussi trouvé qu’expression augmente de façon significative dans les prochains jours et même semaines. Pour les cellules avec l’expression du Rapporteur forte, une semaine d’incubation (d’intrarachidienne jusqu’en perfusion) peut être suffisant. Pour les cellules avec faible transgene expression, virus avec faibles promoteurs ou des fluorophores plus faibles, il faudra une expression plus longue afin d’assurer des niveaux détectables. -
Fixation du tissu
- Perfuse chaque transcardially de souris, tout d’abord avec 20 ml de solution glacée artificielle le liquide céphalorachidien (FSCA) (NaCl 125 mM, NaHCO3 25 mM, NaH2PO4 1,25 mM, 20 mM, KCl 2,5 mM et CaCl2 2 mM MgSO4 1 mM de D-glucose), puis avec 100 mL de 4 % le paraformaldéhyde glacée (dans un tampon phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,4).
ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique et doit être manipulé avec soin. - Disséquer la moelle lombaire et fixer le tissu pendant 2 h avec 4 % de paraformaldéhyde sur la glace. Brièvement de laver le tissu après fixe avec tampon de phosphate de sodium 0,1 M (pH 7,4) et puis il incuber dans une solution de saccharose de 25 % (dans un tampon phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,4) durant la nuit à 4 ° C.
- Couper le tissu cryoprotected à 30 μm sur un cryostat et monter les sections sur lames de microscope.
- Perfuse chaque transcardially de souris, tout d’abord avec 20 ml de solution glacée artificielle le liquide céphalorachidien (FSCA) (NaCl 125 mM, NaHCO3 25 mM, NaH2PO4 1,25 mM, 20 mM, KCl 2,5 mM et CaCl2 2 mM MgSO4 1 mM de D-glucose), puis avec 100 mL de 4 % le paraformaldéhyde glacée (dans un tampon phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,4).
-
Immunofluorescence souillant
- Après brèves lavages en PBS, appliquer 300 μL de la solution de blocage (10 % de sérum Normal âne dans 0,3 % Triton-PBS) sur les sections pendant 1 h à température ambiante.
- Incuber les lames avec 300 μL des combinaisons respectifs des anticorps primaires en bloquant la solution (voir la Table des matières) toute la nuit à 4 ° C. Laver les sections 3 fois pendant 5 min chacun dans du PBS.
- Incuber les lames avec les combinaisons respectifs des anticorps secondaires dans la solution de saturation pendant 1 h à température ambiante. Laver les sections 3 fois pendant 5 min chacun dans du PBS.
- Brièvement rincer les lames à FD2O, puis fixer les lamelles à l’aide du milieu de montage fluorescent.
- Acquisition d’images fluorescentes à l’aide d’un microscope confocal, équipé d’un 20 x et un objectif 40 x.
- Effectuer des analyses morphologiques d’une à trois semaines après l’injection du virus ou à la fin d’une expérience comportementale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Afin d’illustrer les niveaux d’expression qui peuvent être obtenues par l’administration intrarachidienne du rAAV codant pour une protéine marqueur, nous avons tout d’abord injecté AAV1. CAG.eGFP dans la moelle épinière lombaire de souris de type sauvage. Trois injections espacées de 1 mm environ produit une infection quasi continue des segments de la colonne vertébrale lombaires L3 à L5 (Figure 1 a-C). Injection de virus à une profondeur de 300 µm de la surface de la colonne vertébrale mène à une infection prédominante des cellules dans la corne dorsale de la moelle épinière. Cependant, les cellules infectées pourraient se retrouve dans la corne ventrale (Figure 1). Ensuite, l’objectif était d’illustrer la différence dans l’expression induite par le rAAV quand injecter un rAAV Cre-dépendante dans une souris transgénique Cre. Donc, nous avons injecté le AAV1 Cre-dépendante. CAG.flex.eGFP vecteur dans la moelle épinière de souris transgéniques GlyT2::Cre. Comme avant, expression eGFP a été observée dans la corne dorsale et ventrale. Toutefois, comme prévu, l’expression d’eGFP devint plus restreinte, ce qui reflète la distribution de GlyT2 + neurones, c'est-à-dire l’expression relativement éparse dans la corne dorsale superficielle et expression dense dans la corne dorsale profonde (Figure 1E).
Ensuite, pour démontrer la faisabilité d’aborder le fonctionnement des sous-populations neuronales spinales, deux différents Cre-dépendante AAVs codant pour des protéines effectrices différents (DTA et hM3Dq) ont été injectées dans des souris transgéniques GlyT2::Cre. Analogue à l’expression virale observée après trois injections de AAV1. CAG.eGFP dans les souris de type sauvage, il y avait ablation robuste de neurones inhibiteurs (Pax2 +) dans les segments lombaires L3-L5 après l’injection de AAV1. EF1a.Flex.DTA chez la souris Glyt2::Cre (Figure 2 aC). Perte de neurones inhibiteurs glycinergic dans ces segments évoquée par une hypersensibilité marquée mécanique (Figure 2D) et comportement aversif spontanée dirigée vers le membre postérieur homolatéral (Figure 2E). Le comportement agressif a conduit à des lésions auto-infligées, qui pourraient être observées sur les pattes, mollet et cuisse (pour les données, voir Foster et al. 7) effets opposés ont été observés lors de l’activation des neurones glycinergic par injection de AAV1.hSyn.flex.hM3Dq et ultérieure injection intrapéritonéale de l’ONC (Figure 2 b). Souris est devenue désensibilisées nociceptive mécanique (Figure 2F) et autres stimuli nocifs (voir Foster et al. 7) en outre, lorsque les traités avec le pruritogens l’histamine ou la chloroquine, induite par le hM3Dq activation des neurones glycinergic supprimée efficacement prurifensive réponses (Figure 2). Ces résultats démontrent que trois injections du rAAV dans la moelle épinière lombaire sont capables de transmettre une région de la moelle lombaire suffisante pour observer des changements de comportement robustes évoqués par stimulation des membres postérieurs correspondants.
Dans une dernière série d’expériences, nous avons voulu démontrer les différences potentielles en utilisant des souris de journaliste Cre par rapport aux virus journaliste Cre. Par conséquent, un gène de pilote Cre a été choisi qui a précédemment été décrit comme un modèle d’expression restreinte d’affichage dans la moelle épinière de souris. Le gène RORβ a été suggéré de s’exprimer principalement dans des interneurones inhibiteurs de la corne dorsale profonde13,14. Cette étude utilisé RORβCre souris knock-in et a traversé les Rosa26lox-STOP-lox-tdTomato (R26Tom) Cre journaliste chez la souris, qui conduisent à l’expression de tdTomato dans toutes les cellules affichant Cre expression à n’importe quel point de temps avant () analyse Figure 3 a). Caractérisation de cellules tdTomato + à RORβCre; R26Tom souris ont révélé l’expression dans les neurones et les astrocytes de la corne dorsale (Figure 3 bC). En fait, quantification des cellules tdTomato + a suggéré que la majorité des cellules subissant la recombinaison Cre-mediated (58 %) étaient non neuronales. Nous avons ensuite injecté une Cre-dependent tdTomato journaliste rAAV (AAV1. CAG.flex.tdTomato) dans la moelle épinière des souris P40 RORβCre (Figure 3D). Contrairement à la R26Tom-mediated expression du rapporteur, nous avons trouvé tous les tdTomato + cellules marquées par le virus de la journaliste neurones (Figure 3EF). Enfin, l’identité des neurones tdTomato + a été analysée dans les deux ensembles de souris (RORβCre; R26Tom et RORβCre injecté avec AAV1. CAG.flex.tdTomato). dans les deux cas, la plupart des neurones est inhibitrice (> 85 %) et la minorité des neurones excitateurs (< 20 %) (Figure 3 G-I), qui est en accord avec les évaluations précédentes de l’identité de RORβ + neurones13,,14.
Figure 1 : Intrarachidienne de AAV1-eGFP/AAV1-flex-eGFP
(A) illustration schématique d’un intrarachidienne d’un AAV1. CAG.eGFP (AAV1-eGFP) dans la moelle lombaire, qui est innervée de membres postérieurs. (B) la localisation anatomique des segments de la moelle épinière lombaire L3-L4 peut être vu dans un top-down vue du dos d’une souris. La peau a été ouvert pour exposer la colonne vertébrale. Processus de la colonne vertébrale des vertèbres T13-L6 sont colorés en tant que références anatomiques et une flèche indique la crête iliaque. (C) image représentative d’une monture toute la moelle épinière lombaire. Fluorescence verte indique les zones transduites-virus de la moelle épinière. (D) l’image représentative d’une coupe transversale à travers un AAV1-eGFP-transduites moelle lombaire d’une souris de type sauvage. Image de représentant (E) d’une section transversale d’un AAV1. CAG.flex.eGFP-transduites moelle épinière de souris GlyT2::Cre. Lignes pointillées représentent les grandes lignes de la matière grise et superficielle corne dorsale de la moelle épinière. Échelle des barres C = 1 mm, D = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Manipulation fonctionnelle de la colonne vertébrale de Cre-exprimer les neurones Glycinergic
(A + B) Illustration schématique d’un intrarachidienne d’un AAV1. EF1a.Flex.DTA (A) ou un AAV1. EF1a.Flex.hM3Dq (B) dans la moelle épinière lombaire. Expression de cre-dépendante du fragment de toxine diphtérique A (DTA) conduira à l’ablation neurones (GlyT2 +) glycinergic (A), tandis que l’expression de Cre-dépendante de la pharmacogénétique récepteur concepteur hM3Dq rendra GlyT2 neurones activable par clozapine-N-oxyde (ONC) (B). (C) trois injections de AAV1. EF1a.Flex.DTA dans les segments de L3-L5 de souris GlyT2::Cre a conduit à une perte nette de neurones inhibiteurs dans les segments respectifs de l’ipsilatéral, mais pas du côté controlatéral. (D) perte de GlyT2 neurones évoquée par une hypersensibilité de longue durée à la stimulation mécanique de von Frey dans la patte arrière ipsilatérale de GlyT2::Cre souris injectées avec AAV1. EF1a.Flex.DTA, mais aucun changement n’a été observé si négatif Cre souris ont été injectées. (E) perte de GlyT2 neurones évoquée par spontanée comportement aversif qui rappelle de démangeaisons chroniques. (F) induite par l’hM3Dq d’activation des neurones GlyT2 atténué une douleur mécanique nocive évoquée par la stimulation de la piqûre. (G) hM3Dq-mediated activation des neurones GlyT2 réduit pruritogen (chloroquine ou l’histamine)-évoquée par le comportement agressif. Données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM. *** p < 0,001 ; p < 0,01. L’échelle bar C = g 1 mm = grammes. Images sont ré-utilisés et modifiés de Foster et al. 7 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : étiquetage génétique et induite par le Virus des cellules exprimant le RORβ. (A) diagramme montrant la stratégie pour l’expression de Cre-dépendante du reporter tdTomato fluorescent en RORβCre; Rosa26lox-STOP-lox-tdTomato (R26Tom) souris. (B) immunomarquage sur des coupes de moelle épinière de laCreRORβ ; R26Tom souris ont révélé que les neurones NeuN + RORβ-Tom se retrouve dans les limbes I-IV. (C) expression Cre-dépendante des tdTomato s’observe également dans les cellules GFAP + de RORβCre; R26Tom souris, ce qui suggère que les RORβ s’exprime dans les astrocytes au cours du développement. Pointes de flèches indiquent marqués au double des astrocytes dans lame III. (D) schéma montrant intrarachidienne de virus AAV-flex-Tom (rAAV1.CAG.flex.tdTomato) chez la souris RORβCre à l’expression de Cre-dépendante locale lecteur de tdTomato. (E) immunomarquage sur des coupes de moelle épinière de RORβCre souris injectées avec virus AAV-flex-Tom. Les neurones RORβ-Tom ont été localisés dans les limbes superficielles de la corne dorsale de la colonne vertébrale et l’expression de tdTomato était absente des astrocytes. (F) des cellules de pourcentage de RORβ-Tom exprimant le marqueur neuronal NeuN dans les sections la colonne vertébrale de laCreRORβ ; R26Tom souris et RORβCre souris injectées avec virus AAV-flex-Tom. (G.-h.) Immunohistochimie sur des sections de la moelle épinière de (G) RORβCre; R26Tom souris et (H) RORβCre souris injectées avec virus AAV-flex-Tom montrant la colocalisation entre neurones RORβ-Tom et le marqueur inhibitrice Pax2 ou le marqueur excitateurs Lmx1b. (I) pourcentage de RORβ-Tom neurones exprimant Lmx1b et Pax2 dans RORβCre; R26Tom souris et RORβCre souris injectées avec virus AAV-Tom. Données sont représentées sous la moyenne ± SEM. données proviennent des souris 2-3 et 1-3 sections par souris. Barres d’échelle représentent 100 µm (B, E) et 20 µm (C, E en images de fort grossissement, G et H). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Variable | Valeur de consigne | Unité |
| chaleur (H) | 450 | -(valeur proportionnelle à la puissance de la chaleur rayonnée) |
| force de traction préliminaire (F(TH)) | 20 | -(valeur proportionnelle à la tension appliquée pour forcer la bobine) |
| seuil (s(TH)) de la distance | 25 | 0,12 mm |
| heatstop retard (t(H)) | 30 | 0,5 ms |
| distance heatstop (s(H)) | 0 | 0,12 mm |
| retarder la traction 1 (t(F1)) | 200 | 0,5 ms |
| force de traction 1 (F1) | 300 | -(valeur proportionnelle à la tension appliquée pour forcer la bobine) |
| Tirez 2 (s(F2)) de la distance | 30 | 0,12 mm |
| force de traction 2 (F2) | 600 | -(valeur proportionnelle à la tension appliquée pour forcer la bobine) |
| ajuster (AD) | 0 | - |
Tableau 1 : Paramètres d’extracteur
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intrarachidienne de AAVs peut devenir une technique puissante dans un laboratoire de recherche, qui permet l’analyse des cellules de la colonne vertébrale avec une solution spatiale et temporelle élevée. Ce protocole permet la transduction des trois segments spinaux principales innervés par des neurones sensoriels s’étendant leurs axones périphériques aux membres postérieurs. Transduction de trois segments produit des données comportementales robustes et reproductibles. Il permet aussi l’essai d’une plus grande surface sensorielle que possible après une seule injection intraspinale. Par exemple, le même régime d’injection permet de tester la patte (von Frey, Hargreaves, etc.) et la cuisse (injections intradermiques, stimulation des mécano-récepteurs), élargissant ainsi les modalités sensorielles qui peuvent être abordées.
Étapes essentielles :
Il y a plusieurs étapes essentielles pour l’obtention des données morphologiques et comportementales fiables et pour éviter les artéfacts. La conception du vecteur viral et le choix du promoteur et du sérotype peuvent avoir un fort impact sur l’efficacité de la transduction et étendue de la zone transduite et par conséquent des résultats comportementaux (pour plus d’informations sur la propagation virale et de l’efficacité de la transduction, voir 12). les préparations virales de haute qualité sont nécessaires pour réduire au minimum les effets secondaires de l’injection de virus, qui peut se produire si contaminants ou cellule débris sont présents dans la solution de virus. La chirurgie qui sert à injecter de la moelle épinière doit être effectuée avec soin afin d’éviter les artefacts morphologiques et comportementales, introduits par la chirurgie. Une attention particulière est nécessaire dans le traitement de la moelle épinière, en particulier pendant la laminectomie et la perforation de la dure-mère avec l’aiguille. Dommages à la moelle épinière pourraient nuire à des sensations somatiques et coordination motrice de la souris, ce qui compromet d’expériences comportementales prévues. En outre, il est important d’assembler la seringue avec soin. Un montage incorrect ou l’obstruction de la micropipette peut nuire à l’expérience. Tissu spinal au site d’injection doit être examinée à la fin de l’expérience afin de vérifier l’injection réussie et la transduction de la région injectée et à exclure les dommages excessive des tissus à la suite de la chirurgie. Ce protocole a utilisé des titres viraux jusqu'à une concentration de 1 x 1013 GC/mL sans toxicité apparente, mais des titres plus élevés résultant de virus peut-être devenir toxiques à un certain moment de temps. En outre, toxicité très probablement aussi dépendra de la protéine codée par l’AAV injectée.
Modifications :
Plusieurs paramètres dans le protocole peuvent être adaptés à la population neuronale et la question de recherche à étudier. Injection de 300 nL virus solution à une profondeur de 300 µm mène à transduction des neurones dans l’ensemble et surtout dans la corne dorsale. Si l’objectif est de neurones cibles plus ventrales, la profondeur est réglable. L’injection de plus gros volumes du virus (nous avons utilisé jusqu'à 500 nL par injection) conduira à une plus grande propagation dans dorsoventral et Rostro directions. Cela peut être utile de réaliser le ciblage des cellules supplémentaires dans la mesure du Rostro, mais peut augmenter l’effet d’entraînement sur le côté controlatéral, qui risquent d’entraver l’utilisation du côté controlatéral comme témoin interne. En outre, la mesure dorsoventral de cellules transduits augmentera, qui peut être l’effet désiré ou doit être évitée. Injection de 300 nL à une profondeur de 300 µm à éviter côté effets sur la motricité chez les souris GlyT2::Cre, tandis que l’injection de 500 nL ou injection à une plus grande profondeur parfois produit des phénotypes moteurs, telles que l’extension spastique des membres postérieurs (données non présentées). Injection de petites quantités peut être utilisée pour restreindre le ciblage pour encore plus de zones confinées5. Le titre viral est un autre paramètre qui peut être modifié et doit en effet être déterminé pour chaque virus. Pour les toxines bactériennes, telles que le DTA très efficace, les niveaux d’expression faible peuvent être suffisantes pour induire l’effet recherché, tandis que les reporters fluorescents et DREADDs, des titres plus élevés peuvent être nécessaires pour expression détectable ou efficace.
Importance de la méthode en ce qui concerne les méthodes existantes/Alternative :
A ce jour, principalement deux techniques ont été utilisées pour interroger fonctionnellement les circuits neuronaux requis pour la transmission de signaux sensoriels. Beaucoup de chercheurs ont utilisé des injections intramédullaires du rAAV codant pour reporter et effectrices protéines chez des souris exprimant une recombinase afin d’étiqueter et de manipuler des sous-populations de neurones spinale. Intrarachidienne comme technique pour manipuler des cellules de la colonne vertébrale a été précédemment décrit15,16. Le protocole décrit ici a été spécialement conçu pour transmettre des neurones génétiquement marqués dans trois segments consécutifs de la moelle épinière lombaire tout en minimisant la manipulation chirurgicale. Ceci est réalisé en plaçant deux des trois injections dans l’espace intervertébral rostral et caudale de la T13 vertèbres et la deuxième, en forant un trou dans le T13 pour la troisième injection au lieu de supprimer les vertèbres. Les segments de L3-L5 ciblées sont le domaine principal de résiliation des neurones sensitifs innervant le membre postérieur. Nous avons démontré que ce type de transduction est suffisant pour produire des changements de comportement robustes après la manipulation des neurones glycinergic et suggèrent qu’il est approprié pour l’analyse d’une variété de différents neurones spinaux génétiquement marquées.
La deuxième technique qui a été utilisée afin de manipuler la fonction des sous-ensembles de neurone spinal repose sur le passage des animaux transgéniques. Ici, des souris exprimant une recombinase dans un sous-ensemble spécifique des neurones spinaux ont à franchir aux souris journaliste afin d’obtenir l’expression du marqueur désirée ou protéines effectrices dans le sous-ensemble neuronale respectifs17,18, 19. pour illustrer certaines des différences qui peuvent se produire lorsque comparant les résultats obtenus en utilisant la souris de journaliste ou des injections de virus intraspinale nous traversé RORβCre knock-in animaux à une souris de journaliste de Cre-dépendante ou injecté RORβ CRE souris avec une Cre-dépendante journaliste rAAV. Nous avons comparé les expression du gène rapporteur obtenue à partir du rAAV expression du gène rapporteur a obtenu en RORβCre; R26Tom souris. Expression du gène rapporteur obtenue de l’administration intrarachidienne d’un rAAV Cre-dépendante a été restreint aux neurones de la moelle épinière, tandis que journaliste R26Tom évoquée par la souris tdTomato expression se retrouve dans les astrocytes. Ceci suggère que la RORβ est transitoirement exprimé dans les astrocytes. De même, Gutierrez-Mecinas et coll. ont découvert une expression plus restreinte de la journaliste (spatialement et spécifiques du type cellulaire) après injection virale par rapport à l’expression du Rapporteur évoquée par souris dans Tac1Cre souris20. En utilisant des injections intramédullaires du rAAV reporter dans la moelle épinière de souris adultes, journaliste et/ou effecteur l’expression des gènes peut efficacement être restreinte à la population de cellules qui expriment le gène chez l’adulte et ainsi éviter la recombinaison/expression dans ces populations avec activité génétique transitoire antérieure.
Un deuxième avantage principal d’injections intramédullaires rAAV est la possibilité de restreindre l’expression des gènes codés rAAV au site d’injection. Chez des souris transgéniques, Cre induite par le pilote expression souvent seulement se trouve pas dans la sous-population neuronale d’intérêt, mais aussi dans d’autres populations dans le système nerveux. Dymecki et ses collègues, ainsi que les groupes de Ma et Goulding, ont développé des façons élégants d’utiliser des approches axées sur les souris d’une journaliste intersectionnelle qui évitent la recombinaison dans certaines parties du système nerveux qui restera inchangée17, 18,19,21,22,23. À l’aide de souris knock-in pour obtenir l’expression de protéines effectrices de marqueur peut aussi supposer être moins variable, car il n’y a qu’une seule copie de génomique de la cassette d’expression respectifs par cellule et la cassette d’expression est présente dans toutes les cellules dans la région d’intérêt . En revanche, la présence d’une cassette d’expression respectifs ainsi que le nombre de copie de la cassette d’expression après la transduction virale dépend de l’efficacité de la transduction, qui peut varier de cellule en cellule, d’une injection à l’injection et dépend de la beaucoup de virus. Enfin, le principal inconvénient de l’expression génique induite par le virus sur les méthodes traditionnelles de génétiques est la nécessité de la chirurgie. Blessures/inflammation induite par la chirurgie peuvent affecter directement les neurones et les circuits. Inclusion des souris témoins qui ont subi la même chirurgie est donc obligatoire.
Applications futures :
Intrarachidienne peut servir à analyser et manipuler toute sous-population spinale génétiquement identifiée par le biais de la surexpression de protéines marqueur et effectrices. Il est donc probable à l’avenir que beaucoup adoptent cette technique pour étudier les populations de neurones dans leur concentration. Par ailleurs, outre l’utilisation intrarachidienne de rAAVs pour atteindre la surexpression de protéines effectrices exogène, cette technique permet également aux protéines endogènes silence ou overexpress et donc d’étudier la fonction d’un gène donné avec haute spatiale et la résolution temporelle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Hanns Ulrich Zeilhofer pour soutenir généreusement ce travail. Hendrik Wildner a été soutenu par la Fondation Olga Mayenfisch. Nous remercions l’anticorps Lmx1b Carmen Birchmeier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller | Zeitz | NA | |
| anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator | Weinmann | NA | |
| anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer | Midmark | NA | |
| Heat mat: Mio Star Thermocare 100 | Migros | 717614700000 | |
| Electric shaver | Philips | BT9290 | |
| surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | NA | |
| Small animal stereotaxic apparatus | Kopf | NA | |
| Neurostar StereoDrive (optional) | Neurostar | NA | |
| Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| PHD Ultra syringe pump with nanomite | Harvard Apparatus | 70-3601 | |
| Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40 | Osada | OS-40 | |
| spherical cutter, 0.5mm | Busch | 12001005B | |
| electronic von Frey anesthesiometer | IITC | 23905 | |
| flexible von Frey hairs | IITC | #7 | |
| LSM710 Pascal confocal microscope | Zeiss | NA | |
| 0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective | Zeiss | NA | |
| 1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective | Zeiss | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | |||
| Scalpel Handle #4, 13cm | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Dumont #2 laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Fine forceps #5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables and Chemicals | |||
| Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter | World Precision Instruments | TW 100-3 | |
| Syringes (1, 5 and 20 ml) | B. Braun | (9166917V, 4606051V, 4606205V) | |
| 26G beveled needle | B. Braun | 4665457 | |
| Sterile scalpel blades | B. Braun | BB523 | |
| Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable | B. Braun | C1046220 | |
| Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable | B. Braun | C0932191 | |
| Sterile PBS or saline (0.9%) | NA | ||
| Ethanol, 70% (disinfectant) | NA | ||
| Iodine solution (e.g. Braunol) | B. Braun | 18380 | |
| Anaesthetics (e.g. Attane isoflurane) | Provet | 2222 | |
| Aldasorber | Provet | 333526 | |
| analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic) | Indivior | GTIN: 7680419310018 | |
| Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos) | Pharma medica | GTIN: 4031626710635 | |
| Cotton swabs (e.g. from) | IVF Hartmann | 1628100 | |
| Facial tissues (e.g. from) | Uehlinger AG | 2015.10018 | |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoScientific | J1800AMNZ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| C57BL/6J mice (wildtype) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:000664 | |
| Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:023526 | |
| Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom) | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:007914 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viral vectors | |||
| AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-PV1963 | |
| AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-ALL854 | |
| AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE .bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato) |
Penn Vector Core | AV-1-ALL864 | |
| AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA) | Penn Vector Core | Custom production | |
| AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi)) | Penn Vector Core | Custom production | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | |
| pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP | Addgene | 20298 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteria | |||
| MDS42 | ScarabGenomics | ||
| Stbl3 | ThermoScientific | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Quiagen | 12362 | |
| NucleoBond PC 500 | Machery & Nagel | 740574 | |
| clozapine-N-oxide (CNO) | Enzo Life Sciences | BBL-NS105-0025 | |
| chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| histamine | Sigma | H7125 | |
| Dapi | Invitrogen | D3571 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (dilution) | |||
| Rabbit anti-GFP (1:1000) | Molecular Probes | RRID:AB_221570 | |
| Rabbit anti-NeuN (1:3000) | Abcam | RRID:AB_10711153 | |
| Goat anti-Pax2 (1 : 200) | R & D Systems | RRID:AB_10889828 | |
| Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000) | Dr Carmen Birchmeier | Muller et al. 2002 | |
| Rabbit anti-GFAP (1 : 1000) | DakoCytomation | RRID:AB_10013382 | |
| Secondary antibodies raised in donkey (1:800) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | NA |
References
- Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. Inhibition downunder: an update from the spinal cord. Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).
- Sandkuhler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).
- Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control. Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).
- Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
- Cui, L., et al. Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain. Neuron. 91 (6), 1413 (2016).
- Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
- Francois, A., et al. A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins. Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).
- Peirs, C., et al. Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain. Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).
- Petitjean, H., et al. Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury. Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).
- Zhang, Y., et al. Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons. J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).
- Haenraets, K., et al. Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters. J Neurochem. , (2017).
- Abraira, V. E., et al. The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn. Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).
- Wildner, H., et al. Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity. J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), e50313 (2013).
- Kohro, Y., et al. A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn. Sci Rep. 5, 14306 (2015).
- Bourane, S., et al. Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons. Science. 350 (6260), 550-554 (2015).
- Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
- Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
- Gutierrez-Mecinas, M., et al. Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli. Pain. 158 (3), 440-456 (2017).
- Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation. Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).
- Kim, J. C., et al. Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele. Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).
- Kim, J. C., Dymecki, S. M. Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus. Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).
