Summary
Межпозвонковые инъекции рекомбиназа зависимых рекомбинантных аденоассоциированный вирус (rAAV) может использоваться для манипулирования любой тип генетически маркированных клеток спинного мозга. Здесь мы опишем, как передавать нейронов в спинной рога поясничного отдела спинного мозга. Эта техника позволяет функциональной допроса манипулировать нейрон подтипа.
Abstract
Селективный манипулирования позвоночника подгруппы нейронов был достигнут главным образом двумя различными способами: 1) совокупной генетики, whereby двойной или тройной трансгенных мышей создаются для того, чтобы достичь избирательным выражение репортер или эффекторных ген (например, от Rosa26 Локус) в желаемой позвоночника населения. 2) межпозвонковым инъекции Cre зависимых рекомбинантных аденоассоциированный вирус (rAAV); Здесь векторы AAV Cre зависимых кодирования для репортера или эффекторных гена выбора вводят в спинной мозг мышей, выражая рекомбиназа КРР в желаемой нейрональных субпопуляция. Этот протокол описывает способы создания Cre зависимых векторов rAAV и как передавать нейронов в спинной рога поясничного отдела спинного сегментах L3-L5 с rAAVs. Поясничного отдела позвоночника сегменты, L3-L5 иннервируются этих периферийных сенсорных нейронов, которые передают сенсорную информацию от гомотерия спонтанного поведения и ответы на сенсорные испытания применительно к задних конечностей, ипсилатеральные стороне инъекции могут быть проанализированы для того, чтобы допросить функцию манипулировать нейронов в сенсорной обработки. Мы предлагаем примеры как эта техника может использоваться для анализа генетически определена подгруппы нейронов спинного мозга. Основными преимуществами вирус опосредованной трансген выражения в Cre трансгенных мышей, по сравнению с классической репортер мыши индуцированной трансген выражения являются следующие: 1) различных Cre зависимой rAAVs кодирования различных репортер или эффекторных белков может быть вводят в одной Cre трансгенные линии, преодолев тем самым необходимость создания нескольких несколько трансгенные мыши линии. 2) межпозвонковым инъекции ограничивает манипуляции Cre выражая клеток в месте инъекции и на время после инъекции. Основными недостатками являются: 1) выражение гена репортера из rAAVs является более переменной. 2) хирургии требуется передавать позвоночника нейронов интерес. Какой из этих двух методов является более подходящим зависит от нейрона населения и исследований вопрос.
Introduction
Спинной мозг дорсальной имеет важное значение для обмена информацией между периферии тела и мозга. Сенсорные стимулы, такие как тепло, холод, сенсорных или вредных раздражителей распознаются специализированных периферийных нейронов, которые передают эту информацию нейронов спинного мозга Спинной рога. Здесь модулирует сложной сети тормозящее и возбуждающих интернейронов и в конечном итоге реле сенсорную информацию через нейроны спинного мозга проекции supraspinal сайты1,2. Вычисления, проведенного спинного Интер- и проекции нейронов строба сенсорной информации, таким образом определить какая информация подавлены или ретранслируется на какой интенсивности. Изменения в интеграции сензорных стимулах, например изменения баланса между торможения и возбуждения, может вызвать сенсорные дисфункции Гиперчувствительность или аллодиния (болевые ощущения после обычно болезненный стимуляции). Эти изменения являются считается основной причиной хронической боли в различных государств3,4. Таким образом, позвоночника цепи имеют первоочередное значение в сенсорной обработки и, следовательно, в восприятии окружающей среды организма и сам. С недавнего появления и сочетание молекулярных и генетических и хирургические методы, которые позволяют точного манипулирования генетически выявленных спинного мозга нейрон субпопуляций ученые сейчас начинают понимать основные позвоночника цепей ответственный за обработку различных сенсорных механизмов.
Межпозвонковым инъекции rAAV в мышах одичал тип или трансгенных внесла манипуляции, анализа и понимания функции конкретных подмножеств нейронов спинного мозга5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. Этот метод позволяет доставки маркера белков (например GFP / GFP синтез белков), репортер белков (например, GCaMP), или эффекторных белков (например, бактериальные токсины, channelrhodopsin или фармакогенетических рецепторов) в пространственно ограниченным образом нейронов спинного мозга. Местные инъекции Cre зависимой rAAVs в трансгенных мышей, выражая рекомбиназа КРР в определенное подмножество нейронов спинного мозга позволяет конкретный анализ соответствующих нейронов населения. Мы использовали этот метод для обозначения, удалять, подавляют или активировать спинного glycinergic нейронов, демонстрируя, что они являются неотъемлемой частью позвоночника ворота контроля боли и зуд передачи7. В этих экспериментах межпозвонковые инъекции Cre зависимой rAAV в GlyT2::Cre мышей позволили селективного манипуляции glycinergic нейронов в поясничного отдела спинного мозга. Таким образом можно избежать одновременной манипуляции supraspinal цепей, которые содержат glycinergic нейронов, решающее значение для выживания животного.
Хотя межпозвонковым инъекции rAAVs ограничивает инфекции на сайт инъекции, вирусный трансдукции может возникнуть не только в местных нейронов, но и в нейроны, которые подключаются к инъекции через аксональное прогнозы. Последние часто используется для трассировки ЦНС областях нейронов предоставления определенного ядра в головном мозге. Инфекция аксональное прогнозы однако, также может быть смешанным фактором при определенных населения нейронов должно учился в определенном сайте. Для решения этих вопросов, мы недавно провели всесторонний анализ AAV серотипов и выражение кассет для выявления серотипов и промоутеров, которые могут использоваться для сведения к минимуму или максимизировать Ретроградная трансдукции. В контексте конкретных исследований в позвоночнике цепей мы проанализировали способность различных серотипов и промоутеров передавать retrogradely нейронов в спинной корень ганглиев (DRG), Ростральные вентромедиального продолговатого мозга (RVM) и соматосенсорной коры 12. техника, изложенные в настоящем Протоколе, поэтому может использоваться для анализа позвоночника нейронов в месте инъекции или для анализа проекции нейронов, которые обеспечивают вклад вводят сайт спинного мозга. В протоколе, описанные здесь три инъекции rAAV в левой части поясничного отдела спинного выполняются для включения трансдукции нейронов в трех поясничных сегментов (L3-L5). L3-L5 сегментов получают большинство сенсорного ввода от задних конечностей ипсилатеральные в месте инъекции. Мы продемонстрировать, что функциональные манипуляции генетически помечены нейронов в L3-L5 достаточно, чтобы вызвать надежные поведенческие изменения, таким образом обеспечивая функциональные доказательств для цепи функции подтипом генетически помечены нейрона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были утверждены управлением Швейцарии кантональных ветеринарные (Цюрих) и находятся в соответствии и соблюдение всех соответствующих нормативных и институциональных руководящих принципов.
Примечание: Все материалы вместе с соответствующими производителями или поставщиками, перечислены в Таблице материалов.
1. поколение векторы AAV Cre зависимых
Примечание: Можно приобрести разнообразные Cre зависимых векторов с различными промоутеров (см. Таблицу материалов) или, если нужное выражение конструкция не доступен, он может быть создана путем изменения существующих конструкций AAV. Обратите внимание, что промоутер и серотип может иметь влияние на распространение вирусных трансдукции (см. 12). В первой части настоящего Протокола кратко описывает поколения двух различных векторы AAV Cre зависимых, подходит для выгоды и потери функции экспериментов, соответственно.
-
Фармакогенетических активации (усиление функции)
- Заказать pAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq)-mCherry (см. Таблицу материалы) для дизайнера рецепторов, исключительно активированную дизайнерские наркотики (DREADD)-опосредованной активации.
- После получения бактериальной удар культуры, полоса бактерий на ФУНТ пластин (агар бактериологического класса растворяют в жидкой среде Лурия Бертани) дополнены соответствующим антибиотиком. Инкубируйте на ночь при 37 ° C и выбрать единую колонию на следующий день.
Примечание: Плазмиды, содержащие AAV геномов вектор может быть нестабильным и рекомбинации вирусного генома, особенно в рамках вирусный Перевернутый терминал повторяет (ИТР), может произойти во время усиления в E. coli. Мы предлагаем с помощью recA недостаточным/подавлены штаммов таких как MDS42 или Stbl3, чтобы избежать рекомбинации в плазмиды, содержащие AAV генома. - Усилить бактерий следуя указаниям производителя выбранного ДНК-макси-Kit и готовить высококачественные плазмида ДНК с коммерчески доступных ДНК-макси-Kit (например, смотрите Таблицу материалы). Выполните контроль качества подготовки ДНК плазмиды путем проверки целостности и личность плазмидной ДНК через ограничение дайджест Алиготе плазмидной ДНК.
Примечание: Есть признание сайты для эндонуклеазы ограничения ссии в РМЭ. Включите дайджест ссии контроля качества для проверки целостности РМЭ. - Отправьте объекте ядро вирусный вектор для того чтобы произвести высокое качество rAAV ДНК.
Примечание: Высокий титр, вирусный парфюмерные высокого качества имеют решающее значение для избегая смешанным фенотипов, вызванные загрязнений в Вирусный prep. Поэтому рекомендуется rAAV выбор производится в установленных вектор основного объекта, если производство AAV хорошо установленной в лаборатории.
-
Аблация (потеря функции)
Примечание: Бактериальные токсины или токсинного рецепторов может использоваться посредником клеток абляции или нейронов глушителей. Мы породили pAAV.EF1α.flex.DTA Экспресс дифтерии токсин фрагмент (DTA) в зависимости от КРР.- Чтобы создать вирусный вектор Cre зависимых, выберите Cre зависимых вектор с подходящей промоутер (например, pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP). Усилить кодирующая последовательность выбора (например, DTA) полимеразной цепной реакции с праймерами, которые включают AscI и NheI или совместимый эндонуклеазы признания в их свесы (см. Фостер и др. 7)
- С помощью стандартных молекулярные методы биологии, выполнять дайджесты ограничения дна вектора (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) и ПЦР усиливается insert (NheI-ДТА-AscI) с эндонуклеазами ограничения AscI и NheI. Перевязать очищенный фрагментов.
- Трансформировать реакции перешнуровки в подходящих бактерий, согласно протоколу, предоставленных поставщиком компетентным бактерий выбора и пластины бактерий на ФУНТ пластин. Используйте recA недостаточным/подавлены штаммов, например MDS42 или Stbl3, для клонирования и последующего усиления плазмидной ДНК.
- На следующий день после преобразования выберите клонов и прививать им в среде LB дополнена соответствующим антибиотиком ночевкой в 37 ° C. На следующий день экстракт плазмида ДНК из искусственного бактерий. Проверка успешного клонирования путем ограничения дайджесты и секвенирования извлеченные плазмидной ДНК.
- Усилить высокого качества, бактериальных плазмида ДНК (см. шаг 1.1.3). Отправьте амплифицированного ДНК на вирусный вектор основной объект для производства вирус.
2. трансдукции клеток спинного мозга
- Приготовление раствора вирус
Предупреждение: Вирусы являются инфекционные реагентов и должен осуществляться согласно соответствующим руководящим принципам. В большинстве случаев rAAVs может быть обработано на уровне биобезопасности 1 (BSL1).- В день, инъекции размораживание запасов Алиготе желаемого очищенный вирус на льду и держать его на льду пока непосредственно перед инъекцией. Избегайте повторяющихся замораживания оттаивания циклов, как это позволит снизить эффективную титр вируса.
Примечание: В случае необходимости, размороженные аликвота вирус может храниться при температуре 4 ° C до 3 дней. - Разбавить частицы вируса в стерильного 0,9% NaCl или фосфата буфер солевой раствор (PBS).
Примечание: Соответствующие титр зависит экспериментальных целей и должны быть определены экспериментально. Хорошее общее вирусная нагрузка начать с – 3 х 109 генома экземпляров (3.33x1012 GC/мл, 3 x 300, которые вводят nL). Принимая избыточное и некоторые потери при загрузке капилляров в счет, около 2,5 мкл раствора вирус будет необходимо для каждой мыши.
- В день, инъекции размораживание запасов Алиготе желаемого очищенный вирус на льду и держать его на льду пока непосредственно перед инъекцией. Избегайте повторяющихся замораживания оттаивания циклов, как это позволит снизить эффективную титр вируса.
- Подготовка Micropipettes к межпозвонковым инъекции
- «Тянуть» тонкостенных стеклянные капилляры (наружный диаметр 1 мм) на микропипеткой съемник для создания ~5.5 мм в длину, неглубокие хвостовик. Используйте накаливания нагреватель 3,0 мм и параметры программы 00 с P(A), адаптирована как показано в таблице 1.
Примечание: Потянув можно сделать заранее. Вытащил капилляров должны храниться в закрытом контейнере на пластилин, чтобы избежать пыли, которая позже может засорить микропипеткой. Автоклавирование micropipettes нет необходимости. - Клип хвостовик вытащил капилляра с щипцами Ламинэктомия длиной около 4,5-5 мм для создания кончик открытия с внутренним диаметром 25-35 мкм. С помощью микроскопа с микрометра масштабе, Измерьте внутренний диаметр несколько micropipettes, чтобы получить чувство для как большие открытия должна быть, или измерения для каждого микропипеткой.
Примечание: Меньше подсказка может привести к засорению; большие чаевые может вызвать повреждение тканей и трудности проникнуть спинного мозга.
- «Тянуть» тонкостенных стеклянные капилляры (наружный диаметр 1 мм) на микропипеткой съемник для создания ~5.5 мм в длину, неглубокие хвостовик. Используйте накаливания нагреватель 3,0 мм и параметры программы 00 с P(A), адаптирована как показано в таблице 1.
- Подготовка хирургической установки и инструменты
- Убедитесь, что оборудование является чистым и готов к использованию. Лечить области работы, вытирая с 70% этанола и стерилизовать инструменты автоклавирования или их обеззараживания. Не допускайте любой дезинфектант микролитр шприц, который бы вред вирусный вектор для использования.
- Анестезия и подготовка животного для хирургии
Примечание: Общая продолжительность операции составляет 60-90 мин.- Выберите 6 - до 10 - неделю старых мышей для облегчения хирургической процедуры.
Примечание: Если это требуется экспериментальный дизайн, инъекции молодых или старых животных возможен. Любое напряжение и обоих полов могут быть использованы в принципе, но использовать же фон деформации (например, C57BL/6J) для сравнения между различными трансгенные мыши линии поведения. Если половые различия, как ожидается, или должны расследоваться, анализировать мужчин и женщин в отдельных группах. - Вызвать обезболивание с помощью ~ 5% изофлюрановая. Животное в Стереотаксическая рама на мат тепла и поддержания анестезии в изофлюрановая 1-2,5% (воздушный поток скорость 900 мл/мин). Монитор частоты дыхания на протяжении операции.
- Применение смазки глазную мазь для предотвращения высыхания роговицы во время операции.
- Брить спины животного и удалить волосы тщательно с мокрой ткани. Продезинфицируйте бритой кожи раствором йода и позволяют коже высохнуть.
- Дать обезболивающее лечение (например, 0,1-0,2 мг/кг бупренорфин подкожно).
- Выберите 6 - до 10 - неделю старых мышей для облегчения хирургической процедуры.
- Экспозиции позвоночного столба на уровне поясничного отдела спинного мозга
Примечание: Из-за дифференциального развития спинного мозга и позвоночного столба, соответствующие уровни не совпадают, но поясничного отдела спинного сегменте L4 находится на том же уровне, как грудной позвонок T13.- Найдите наиболее хвостового пара ребер, пальпируя вдоль позвоночного столба. С помощью скальпеля, делают продольный разрез 1,5-2,5 см в кожу, начиная от просто ростральной наиболее хвостового паре ребер.
- Снять кожу с щипцами и отсоединить его от основных мышц с ножницами. На протяжении операции, держать облученных тканей влажным с стерильным 0,9% NaCl.
- С помощью тонкой щипцы и маленькие ножницы, надрезать в следующий, тонкий слой мембранное рядом срединной и отрезать его от остистого отростка. Это отдельно от основной paraspinous мышц, но придает остистого отростка.
- Идентификация позвонков на уровне поясничного отдела спинного мозга
Примечание: После того, как подвергается позвоночного столба, межпоперечный связки и спинной остистого отростка должно быть видимым. Некоторые анатомические ориентиры могут помочь в определении правильного позвонка до цели (рис. 1B).- Потяните кожу обратно к хвосту подвергать подвздошной кости. На том же уровне наиболее хвостового пара видимых межпоперечный связок соединяет остистого отростка L6. Граф назад в хвостовой ростральной направлении для идентификации позвонка интерес.
- Ощупывайте вдоль позвоночного столба. Наиболее хвостового пара ребер расположен просто ростральной T13 позвонка и тазовые кости на уровне бедер на уровне позвонка L6.
- Найдите место, где сухожилия вдоль стороны позвоночного столба белее и наиболее медиальной. T13 позвонка расположен просто Ростральных. Поясничного отдела спинного сегменте L4 расположен в пределах этого позвонка.
- Фиксация позвоночника и воздействия поясничного отдела спинного мозга
- Поместите животное на подушке засучив тканей, чтобы поднять его позвоночника зажимы стереотаксической рамы.
- Исправьте целевой позвонка во избежание движений позвоночника из-за дыханием. Для этой цели Совместите зажимы, прилегающих к целевой позвонка, исправить один зажим в положении и удерживая второй зажим фиксации позвоночника, пинцетом Adson.
Примечание: Столбец должен быть перпендикулярен плоскости инъекций и твердо закреплены так, чтобы он не двигаться на давление сверху. При необходимости, вторая пара зажимов может быть установлена для позвоночника. В этом случае полезно исправить две пары зажимов для двух позвонков, прилегающих к целевой позвонка. - Удалите paraspinous мышцы выше позвонков интерес. С помощью скальпеля, сделать параллельный разрез просто медиальнее сухожилий, которые параллельно позвоночному столбу, а также перпендикулярных разрезов, Ростральные и хвостового до целевой позвонка. Будьте осторожны, чтобы не отрезать слишком глубоко. Слеза/вырезать прочь мышцы с помощью rongeurs. При необходимости воспользуйтесь щипцы для удаления тканей, оставшиеся на позвонка или выше Дура в межпозвонкового пространства.
- В межпозвонкового пространства спинной кровеносный сосуд должен быть виден маркировки midline спинного мозга. Для односторонних инъекции выполните частичное ламинэктомии, сверлить отверстие в середине целевой стороны позвонка. Использование тонкой стоматологии, бурение аппарат с 0,5 мм сферические резец и сверлить особенно тщательно при приближении к спинного мозга. Удалите любые оставшиеся фрагменты костей с 26G среза иглы подвергать спинного мозга.
- С помощью 26G среза иглы, перфорации Дура в просверленное отверстие и в межпозвонкового пространства ростральной и каудально к целевой позвонка, все примерно 200 мкм сбоку спинной кровеносного сосуда. Спинномозговой жидкости должны спасаясь от отверстия и спинной мозг должен быть слегка выпуклый.
- Подготовки шприц инъекций
Примечание: Шприц инъекции должны быть готовы непосредственно перед началом инъекций снижения риска засорения микропипеткой частиц пыли.- Смонтируйте стеклянные капиллярные на микролитр шприц с помощью съемной иглой резьбовое комплект. Затяните гайку плотно, чтобы обеспечить плотный и безопасную посадку.
- Заполните шприц микролитр стерильной дистиллированной водой и начать нажав его вне с поршнем.
Примечание: Если есть слишком много сопротивление таким образом, чтобы вода не легко прийти из кончика, микропипеткой вероятно блокируется и должны быть обменены. - Смонтируйте шприца микроманипулятор, подключенных к электронным управлением microinjector. Будьте осторожны, чтобы не прикасаться с микропипеткой.
- С помощью microinjector, составить около 1 мкл воздуха для создания пузырь между водой и вирус.
- Тщательно место капельку 2,5 мкл раствора вирус на кусок парафина фильма, переместите кончик микропипеткой в капли, с помощью стереотаксической рамы и нарисовать его. Затем тщательно пресс обойтись до тех пор, пока немного раствора вирус выходит на вершине.
- Убрать шприц и с помощью пера, Марк микропипеткой со шкалой и отмечаем уровень вирус решения; Это будет способствовать мониторингу ли вливание идет как запланировано.
- Межпозвонковые инъекции
- Переместите кончик микропипеткой выше одно из отверстий в Дура, а затем вниз до тех пор, пока небольшая вмятина отмечается в Дура. Для инъекций спинного мозга Спинной рога, переместите вниз 500 мкм 100 мкм последовательными шагами (скорость 1 мм/сек) и затем 200 мкм до для механической стабилизации ткани.
Примечание: Окончательный глубины наконечника в данном случае это 300 мкм, но могут быть адаптированы в зависимости от целевой области.- Если ткань устойчива к проникновению, микропипеткой может ловить на Дура. В этом случае убрать и слегка пошевелить покрывают отверстие, или снова использовать иглы для перфорации Дура должным образом, прежде чем повторять попытку проникновения.
- Программа насос для целевой объем впрыска 300 nL скоростью инъекций 50 нл/мин и нажмите кнопку Пуск для начала инфузии.
- После завершения инъекций, проверьте масштаб снизился ли уровень вирус и оставить микропипеткой в место для дополнительных 3 мин разрешить давление, чтобы сбалансировать перед медленно втягивать шприца.
- Повторите шаг 2.9.1.-2.9.3. для других сайтов двух инъекций.
- Переместите кончик микропипеткой выше одно из отверстий в Дура, а затем вниз до тех пор, пока небольшая вмятина отмечается в Дура. Для инъекций спинного мозга Спинной рога, переместите вниз 500 мкм 100 мкм последовательными шагами (скорость 1 мм/сек) и затем 200 мкм до для механической стабилизации ткани.
- Ушивание и восстановление
- Удаление спинного мозга зажимы и подушки ниже мыши.
- Закройте рану в слои с прерванного швами, ушивание слои поверхностной ткани с рассасывающиеся швы и кожи с не рассасывающиеся швы. Примените дезинфицирующим йода на рана зашивается.
- Прекратить анестезии и оставить животное на мат тепла до тех пор, пока он восстанавливается до возвращения в свои дома клетке.
- Послеоперационный уход
- Мониторинг состояния здоровья животного на в день операции, на следующий день, а затем каждые 2-3 дня. Убедитесь, что животное имеет нормальной походкой, здоровый внешний вид (вес, глаза, меха и поведение), и что заживление.
- Продолжать болеутоляющее лечение (например, 0,1-0,2 мг/кг бупренорфин подкожно) в случае необходимости, три раза в день.
3. поведенческие и морфологического анализа
-
Поведенческого анализа
Примечание: Позволяют животных для размещения в соответствующие установки по крайней мере 30 минут до начала измерения, чтобы позволить им приспособиться к новой экспериментальной среде.-
фон Frey тест
- Поместите животных индивидуально в отдельных отсеков около 10 см x 10 см на полу металлическую сетку.
- Стимулировать подошвенной поверхности ипсилатеральные hindpaw к месту инъекции с динамический фон Frey накаливания. Обратите внимание на силу, в которой животное не покинет лапой стимул.
- Повторите пять раз и вычислить среднее вывода порога от шести измерениям для каждого животного.
-
PIN-код укола тест
- Место животных на отдельных отсеков около 10 см x 10 см на полу металлическую сетку.
- Стимулировать подошвенной поверхности ипсилатеральные hindpaw для укола иглой притупляются 26-G без проникновения кожи. Оценка поведения как ноль (не реагирует) или один (реакция).
- Повторите 9 раз с интервалом в 3 минуты между стимуляцию и рассчитать процент отклика от 10 измерений для каждого животного.
-
Инъекции DREADD-лиганд клозапин N-оксид (CNO)
- Растворяют CNO в диметилсульфоксида (ДМСО) для создания Стоковый раствор 0,2 мг/мкл, который может храниться при комнатной температуре.
- В день эксперимента, разбавить раствор стерильного 0,9% NaCl в 0.2 мкг/мкл и залить 10 мкл/г веса тела внутрибрюшинно. Придать контрольных животных с транспортного средства (0,2% ДМСО в 0,9% NaCl).
Примечание: Согласно опыту, пик воздействие на поведение может быть ожидаемым 1-3 ч после инъекции, и эффекты должны полностью спадать после 24 ч. В случае активации нейронов glycinergic наблюдается поведения включают снижение реакции на боль и зуд. Поведения, вызванные DREADD-опосредованной активации нейронов будет зависеть от целевых подмножество нейронов спинного мозга.
-
Инъекции Pruritogens вызвать зуд
- Растворяют pruritogens в 0,9% NaCl решения 8 мг/мл (хлорохин) или 10 мг/мл (гистамин). 2 ч после приема CNO, inject 10 мкл раствора pruritogen или транспортного средства, подкожно в подошвенной поверхности ипсилатеральные hindpaw для позвоночника укола. Кроме того придать pruritogen intradermally теленка, которая сбрил один день прежде чем уменьшить отрицательной поведения, вызванные бритья, сам.
-
Видеозаписи для анализа спонтанной Nocifensive или Pruritogen индуцированной зуд поведения
- Поместите животных индивидуально в прозрачной отсеков (около 10 см в диаметре) с немного постельных принадлежностей от их соответствующих дома клетке на полу.
- Видеокассету для записи pruritogen индуцированного поведения животных за 5 мин до записи Спонтанная и 30 мин. Анализ видео off-line в закромах 5 мин.
-
Боль и зуд поведения
- Наблюдать и отмечаем дрогнув, лизать и кусаться поведения.
Примечание: Уклоняясь и лизать пострадавших сайта считается ответы на боль, тогда как кусаться ассоциируется с зуд. - Анализировать видео на нормальной скорости, измерить время что мыши лизать или кусаться пострадавших сайта или измерения в замедленном движении для более четкое различие между лизать и кусаться рефлексов. Кроме того количество лизать/кусаться/дрогнув приступы.
- Наблюдать и отмечаем дрогнув, лизать и кусаться поведения.
-
фон Frey тест
-
Морфологический анализ
- Морфологический анализ от одной до трех недель после инъекции вируса или в конце поведенческих эксперимента.
Примечание: Мы обнаружил eGFP выражение как только 48 ч после инъекции, но также обнаружили, что выражение значительно возрастает в течение ближайших дней и даже недель. Для ячеек с сильным репортер выражение одну неделю инкубации (от межпозвонковым инъекции до перфузии) может быть достаточно. Для ячеек с выражением слабых трансген, вирусы с слабой промоутеров или слабее флуорофоров, выражение больше времени может потребоваться обеспечить поддающихся обнаружению уровней. -
Фиксация ткани
- Perfuse каждый transcardially мыши, сначала с 20 мл раствора ледяной искусственных спинномозговой жидкости (ФАГО) (NaCl 125 мм, NaHCO3 NaH2PO4 1,25 мм, D-глюкозы 20 мм, KCl 2,5 мм и CaCl2 2 MgSO4 1 мм, 25 мм), затем с 100 мл из ледяной параформальдегида 4% (в 0,1 М натрия фосфат буфера, рН 7,4).
Предупреждение: Параформальдегида токсичных и должны быть обработаны с осторожностью. - Сразу же вскрыть поясничного отдела спинного мозга и пост исправить ткани на 2 ч с параформальдегида 4% на льду. Кратко мыть после фиксированных тканей с буфером фосфат натрия 0,1 М (рН 7,4) и затем инкубировать в 25%-ая сахароза растворе (0,1 М натрия фосфат буфера, рН 7,4) на ночь при 4 ° C.
- Вырезать ткань cryoprotected на 30 мкм на криостат и смонтировать разделы на скольжениях микроскопа.
- Perfuse каждый transcardially мыши, сначала с 20 мл раствора ледяной искусственных спинномозговой жидкости (ФАГО) (NaCl 125 мм, NaHCO3 NaH2PO4 1,25 мм, D-глюкозы 20 мм, KCl 2,5 мм и CaCl2 2 MgSO4 1 мм, 25 мм), затем с 100 мл из ледяной параформальдегида 4% (в 0,1 М натрия фосфат буфера, рН 7,4).
-
Иммунофлюоресценции пятнать
- После краткого моет в PBS, применять 300 мкл блокирования решения (10% нормальной осла сыворотки в 0,3% Тритон-PBS) на участках за 1 ч при комнатной температуре.
- Инкубируйте слайды с 300 мкл соответствующих сочетаний первичных антител в блокировании решение (см. Таблицу материалы) за ночь при 4 ° C. Вымойте секции 3 раза за 5 мин в PBS.
- Инкубируйте слайды с соответствующей комбинации вторичных антител в блокирующие решение за 1 час при комнатной температуре. Вымойте секции 3 раза за 5 мин в PBS.
- Кратко промойте слайды в ddH2O, а затем смонтировать с помощью флуоресцентных монтажа среднего coverslips.
- Приобрести флуоресцентного изображения с помощью Конфокальный микроскоп с 20 x 40 x цели.
- Морфологический анализ от одной до трех недель после инъекции вируса или в конце поведенческих эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для того чтобы проиллюстрировать уровни выражения, которые могут быть получены путем межпозвонковым инъекций rAAV, шифруя протеин маркер, мы сначала вводят AAV1. CAG.eGFP в поясничного отдела спинного мозга мышей дикого типа. На расстоянии примерно 1 мм друг от друга три инъекции производятся почти непрерывной инфекции поясничного отдела позвоночника сегментов L3, до L5 (рис. 1A-C). Инъекции вируса на глубине 300 мкм от поверхности позвоночника приводит к преобладающей инфекции клеток в спинной Рог спинного мозга. Однако инфицированных клеток можно также найти в вентральной Хорн (рис. 1 d). Далее цель заключается в том, чтобы проиллюстрировать разницу в rAAV опосредованной выражение при внутривенном введении Cre зависимой rAAV в Cre трансгенные мыши. Мы поэтому вводят Cre зависимой AAV1. CAG.flex.eGFP вектор в спинной GlyT2::Cre трансгенных мышей. Как раньше, eGFP выражение было отмечено в дорсальной и вентральной рога. Однако как и ожидалось, выражение eGFP стало более ограниченным, отражая распределение GlyT2 + нейронов, то есть сравнительно разреженные в поверхностных спинной рога и плотной выражений в глубокая дорсальная рога (Рисунок 1E).
Далее чтобы продемонстрировать возможности адресации цепи функции спинного мозга нейрональных субпопуляций, два разных Cre зависимой AAVs кодирования для различных эффекторных белков (ДТА и hM3Dq) вводили в GlyT2::Cre трансгенных мышей. Аналогично вирусный выражение наблюдается после 3 инъекции AAV1. CAG.eGFP в мышах одичал типа, существует надежный абляции ингибирующих нейронов (Pax2 +) в поясничных сегментах L3-L5 после инъекции AAV1. EF1a.Flex.dta в Glyt2::Cre мышей (рисунок 2AC). Потеря glycinergic ингибирующих нейронов в этих сегментах вызвала заметное механические Гиперчувствительность (Рисунок 2D) и спонтанное отрицательной поведение направлена на ипсилатеральной задних конечностей (Рисунок 2E). Отрицательной поведение привело к себе самому поражений, которые можно было наблюдать на лапах, до голени и бедра (данных, см. Фостер и др. 7) напротив эффекты наблюдались при активации нейронов glycinergic через инъекции AAV1.hSyn.flex.hM3Dq и последующих внутрибрюшинной инъекции CNO (рис. 2B). Мышей стали десенсибилизированные вредных механических раздражений (Рисунок 2F) и других вредных раздражителей (см. Фостер и др. 7) Кроме того, при обработке в pruritogens гистамина или хлорохин, hM3Dq-опосредованной активации нейронов glycinergic эффективно подавляется prurifensive реакции (рис. 2 g). Эти результаты показывают, что три инъекции rAAV в поясничного отдела спинного мозга способны передавать области поясничного отдела спинного мозга достаточно соблюдать надежные поведенческие изменения, вызываемые стимуляции соответствующего задних конечностей.
В окончательный набор экспериментов мы хотели продемонстрировать потенциальные различия в использовании Cre репортер мышей, по сравнению с КРР репортер вирусов. Таким образом водитель ген Cre был выбран, который ранее был описан как отображение ограничения выражения в спинной мозг мыши. Ген RORβ было предложено быть выражено преимущественно ингибирующее интернейронов глубокая дорсальная Рог13,14. В этом исследовании используется RORβCre забивные мышей и перешли их Rosa26жидкий кислород стоп lox-tdTomato (TomR26) Cre репортер мышей, которые приводят к выражению tdTomato во всех клетках, отображение Cre выражение в любой момент времени до анализа ( Рис. 3A). Характеристика tdTomato + клеток в RORβКРР; R26Tom мышей показало выражение в нейроны и астроциты спинной рога (рисунок 3BC). В самом деле количественная оценка tdTomato + клеток предложил, что большинство клеток происходят Cre опосредованной рекомбинации (58%) были не нейронов. Мы затем вводят Cre зависимой tdTomato репортер rAAV (AAV1. CAG.flex.tdTomato) в спинной мозг мышей P40 RORβCre (рис. 3D). В отличие от R26Tom-опосредованной репортер выражения, мы нашли все tdTomato + клетки обозначены репортер вирус быть нейронов (Рисунок 3EF). Наконец личность нейронов tdTomato + было проанализировано в обоих наборах мышей (CreRORβ; R26тома и RORβCre вводили с AAV1. CAG.flex.tdTomato). В обоих случаях, большинство из нейронов были тормозной (> 85%), а меньшинство возбуждающих нейронов (< 20%) (Рис. 3 G-я), который согласуется с предыдущей оценки личности RORβ + нейронов13,14.
Рисунок 1: Межпозвонковым инъекций AAV1-eGFP/AAV1-flex-eGFP
(A) схематическая иллюстрация межпозвонкового инъекции AAV1. CAG.eGFP (AAV1-eGFP) в поясничного отдела спинного мозга, которые иннервируются от задних конечностей. (B) анатомическое расположение сегментов поясничного отдела спинного L3-L4 можно увидеть в сверху вниз по задней части мыши. Кожа была открыта подвергать позвоночного столба. Позвоночника, отростков позвонков T13-L6 окрашены как анатомические ссылки и стрелка указывает подвздошной кости. (C) представитель изображение всей горе поясничного отдела спинного мозга. Зеленая Флуоресценция указывает вирус преобразованы области спинного мозга. (D) представитель изображение сечения через AAV1-eGFP преобразованы поясничного отдела спинного мозга от дикого типа мышь. (E) представитель изображение сечением AAV1. CAG.flex.eGFP преобразованы спинного GlyT2::Cre мыши. Пунктирные линии представляют собой изложение серого вещества и поверхностные спинной Рог спинного мозга. Масштаб баров C = 1 мм, D = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Функциональные манипуляции спинного мозга выразив Cre Glycinergic нейронов
(A + B) Схематическая иллюстрация межпозвонкового инъекции AAV1. EF1a.Flex.dta (A) или AAV1. EF1a.Flex.hM3Dq (B) в поясничного отдела спинного мозга. CRE зависимой выражения дифтерии токсин фрагмента (DTA) приведет к абляции нейронов (GlyT2 +) glycinergic (A), в то время как Cre зависимой выражения фармакогенетических дизайнер рецептора hM3Dq сделает GlyT2 нейронов активируемых Клозапин N-оксид (CNO) (B). (C) 3 инъекции AAV1. EF1a.Flex.dta в сегментах L3-L5 GlyT2::Cre мышей привело к заметному потере ингибирующих нейронов в соответствующих сегментах ипсилатеральные, но не контралатеральную сторону. (D) потеря GlyT2 нейронов вызвала длительный Гиперчувствительность к механическим раздражением фон Фрей в ипсилатеральные задние лапы GlyT2::Cre мышей, вводится с AAV1. EF1a.Flex.dta, но никаких изменений не было отмечено, если Cre отрицательных мышей были введены. (E) потеря GlyT2 нейронов вызвало спонтанные отрицательной поведение напоминает хронический зуд. (F) hM3Dq-опосредованной активации нейронов GlyT2 облегчить вредных механических боли, вызванные уколоться стимуляции. (G) hM3Dq-опосредованной активации нейронов GlyT2 уменьшить pruritogen (хлорохин или гистамин)-вызвала отрицательной поведение. Данные представлены как среднее ± SEM. *** p < 0,001; p < 0.01. Масштаб бар C = 1 мм. g = грамм. Изображения используется повторно и изменение от приемных и др. 7 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: генетические и вирус опосредованной маркировки RORβ-выражая клеток. (A) диаграмма, показывающая стратегии для зависящих от Cre выражение флуоресцентный tdTomato репортер в RORβКРР; Rosa26жидкий кислород стоп lox-tdTomato (TomR26) мышах. (B) иммуноокрашивания на спинной секции RORβКРР; R26Tom мышей показало, что нейроны NeuN + RORβ-том можно найти в пластинки-IV. (C) Cre зависимой выражения tdTomato было также отмечено в СВМС + клеток RORβКРР; R26Tom мышей, предполагая, что RORβ выражается в астроциты во время разработки. Стрелки указывают двойной меченых астроциты в пластинки III. (D) диаграмма, показывающая межпозвонковым инъекции вируса AAV-flex том (rAAV1.CAG.flex.tdTomato) в RORβCre мышей, чтобы диск местных Cre зависимой выражения tdTomato. (E) иммуноокрашивания на спинной секции RORβCre мышей, вводят с вирусом AAV-flex том. RORβ-том нейроны были локализованы поверхностные пластинки спинного мозга Спинной рога и выражение tdTomato отсутствовал из астроцитов. (F) процент RORβ-том клетки, выражая нейрональных маркер NeuN в спинной секции RORβКРР; R26Tom мышей и RORβCre мышей, вводят с вирусом AAV-flex том. (G-H) Иммуноокрашивания на спинной секции (G) RORβКРР; R26Tom мыши и мыши (H) RORβCre , вводят с вирусом AAV-flex том, показаны colocalization между RORβ-том нейронов и тормозящий маркер Pax2 или возбуждающих маркер Lmx1b. (I) процент RORβ-том нейроны, выражая Lmx1b и Pax2 в RORβКРР; R26Tom мышей и RORβCre мышей, вводят с вирусом AAV-том. Данные представлены как среднее ± SEM. данные взяты из 2-3 мышей и разделы 1-3 на мышь. Масштаб бары представляют 100 мкм (B, E) и 20 мкм (C, E на высокое увеличение изображения, G и H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Переменная | Установить значение | Единица |
| жара (H) | 450 | -(значение пропорционально мощности излучаемого тепла) |
| силу предварительные тянуть (F(TH)) | 20 | -(значение, пропорциональное тому напряжения сил катушки) |
| пороговое расстояние (s(TH)) | 25 | 0.12 мм |
| задержка heatstop (t(H)) | 30 | 0,5 мс |
| Расстояние heatstop (s(H)) | 0 | 0.12 мм |
| Вытяните задержки 1 (t(F1)) | 200 | 0,5 мс |
| сила тяги 1 (F1) | 300 | -(значение, пропорциональное тому напряжения сил катушки) |
| Потяните расстояние 2 (s(F2)) | 30 | 0.12 мм |
| сила тяги 2 (F2) | 600 | -(значение, пропорциональное тому напряжения сил катушки) |
| Отрегулируйте (AD) | 0 | - |
Таблица 1: Параметры Puller
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Межпозвонковые инъекции AAVs может стать мощной техникой в научно-исследовательской лаборатории, что позволяет анализ спинномозговой клеток с высоким временные и пространственные решения. Этот протокол позволяет трансдукции трех основных сегментов спинного мозга иннервируются сенсорных нейронов, расширяя их периферийных аксоны задних конечностей. Преобразователя трех сегментов производит надежных и воспроизводимых поведенческих данных. Он также позволяет тестирование сенсорные большую площадь, чем возможно после однократной инъекции межпозвонковым. Например, один и тот же режим инъекции позволяет для тестирования на лапу (фон Frey, Харгривз, и т.д.) и бедра (подкожные инъекции, стимуляции механо рецепторов), расширяя тем самым сенсорных механизмов, которые могут быть решены.
Важнейшие шаги:
Есть несколько шагов, решающее значение для получения надежных данных о морфологических и поведенческих и избежать артефактов. Дизайн вирусный вектор и выбор промоутер и серотип может иметь сильное влияние на эффективность трансдукция и степени transduced района и поэтому на поведенческих результатов (для подробной информации о вирусного распространения и электромеханической эффективности, см 12). вирусные препараты высокого качества необходимы для сведения к минимуму побочные эффекты инъекций вирус, который может произойти, если загрязнители или клетка мусора присутствуют в решении вирус. Хирургии, который необходим для придания спинного должно проводиться с большой осторожностью во избежание морфологических и поведенческих артефактов введены операции. Особое внимание требуется при обработке спинного мозга, особенно во время Ламинэктомия и перфорация дура с иглой. Повреждение спинного мозга может ухудшить соматические ощущения и координация движений мыши, таким образом, ставя под угрозу любые запланированные поведенческих эксперименты. Кроме того важно тщательно собрать шприц. Неправильная сборка или засорение микропипеткой может препятствовать эксперимент. Спинного тканей в месте инъекции должен быть рассмотрен в конце эксперимента с целью проверки успешной инъекций и трансдукция области вводится и исключить чрезмерное ткани ущерб в результате операции. Этот протокол использовал вирусный титры до концентрации 1 x 1013 GC/мл без очевидной токсичности, но более высокие титры вируса могут стать токсичными в определенный момент времени. Кроме того токсичность скорее зависит также белков, кодируемых вводят AAV.
Модификации:
Несколько параметров в протоколе могут быть адаптированы к нейрональных населения и исследований вопрос необходимо изучить. Инъекция раствора 300 nL вирус на глубине 300 мкм приводит к трансдукции нейронов во всем и преимущественно в спинной рога. Если целью является целевой нейронов далее брюшной, глубина может корректироваться. Введения большего количества вируса (мы использовали до 500 nL на инъекцию) приведет к большего распространения в dorsoventral и rostrocaudal направлениях. Это может быть полезным для достижения ориентации дополнительных клеток в rostrocaudal степени, но может увеличить распространения на контралатеральную сторону, которая может затруднить использование контралатеральную сторону в качестве внутреннего контроля. Кроме того dorsoventral степень transduced клеток будет увеличиваться, что может быть желаемого эффекта или следует избегать. Инъекций 300 nL на глубине 300 мкм избежать побочных эффектов на управления двигателем GlyT2::Cre мышей, во время инъекции 500 nL или инъекции на большей глубине иногда производятся мотор фенотипы, такие как спастический расширение задних конечностей (данные не показаны). Инъекции меньших объемов может использоваться для ограничения ориентации на более ограниченном пространстве5. Титр вирусных является еще один параметр, который может быть изменен и на самом деле должны определяться для каждого вируса. Для бактериальные токсины, такие как высокоэффективных ДТА уровни низкие выражения может быть достаточно, чтобы побудить желаемого эффекта, тогда как для флуоресцентных репортеров и DREADDs, более высокие титры могут быть необходимы для обнаружению или эффективного выражения.
Значение метода в отношении существующих/альтернативные методы:
На сегодняшний день, главным образом два методы были использованы функционально допросить нейронных цепей, необходимых для передачи сенсорных сигналов. Многие исследователи использовали межпозвонковым инъекции rAAV кодирования для репортера и эффекторные белки в рекомбиназа выражая мышей для того чтобы маркировать и манипулировать позвоночника подгруппы нейронов. Межпозвонковые инъекции как способ манипулировать позвоночника клетки ранее описанных15,16. Протокол, изложенные здесь была специально разработана для передают генетически помечены нейронов в трех последовательных сегментов поясничного отдела спинного мозга при сведении к минимуму хирургические манипуляции. Это достигается путем размещения двух из трех инъекций в межпозвонкового пространства ростральной и каудального позвонков T13 и во-вторых, путем сверлить отверстие в T13 для третьего инъекций вместо удаления позвонков. Целевые сегменты L3-L5 являются основным прекращение области сенсорных нейронов, иннервирующих задних конечностей. Мы демонстрируем, что этот тип трансдукции достаточно производить надежные поведенческие изменения после манипуляции glycinergic нейронов и предположить, что она подходит для анализа целого ряда различных генетически помечены нейронов спинного мозга.
Второй метод, который был использован для того чтобы манипулировать функции спинного мозга нейрон подмножеств основана на пересечении трансгенных животных. Здесь выражая рекомбиназа в определенное подмножество нейронов спинного мозга мышей должны быть пересеченным репортер мышей для достижения выражение нужный маркер или эффекторных белков в соответствующих нейронов подмножество17,18, 19. чтобы проиллюстрировать некоторые из различий, которые могут возникнуть при сравнении результаты получены с помощью репортер мышей или межпозвонковым вирусом инъекции мы пересекли RORβCre стук в животных для мыши репортер Cre зависимых или вводят RORβ CRE мышей с rAAV репортер Cre зависимых. Мы сравнили экспрессии гена репортера, полученные от rAAV экспрессии гена репортера, полученной вCreRORβ; R26Tom мышей. Репортер экспрессии генов, полученные из межпозвонковым инъекции Cre зависимой rAAV была ограничена нейронов спинного мозга, а R26Tom репортер мыши вызвала tdTomato выражение встречается также в астроциты. Это свидетельствует о том, что RORβ временно выражается в астроциты. Аналогичным образом, Гутьеррес-Mecinas et al. нашли выражение более ограниченным репортер (пространственно и конкретного типа клеток) после вирусных инъекции, по сравнению с мыши вызвала репортер выражение в Tac1Cre мышей20. С помощью межпозвонковым инъекции rAAV репортер в спинной мозг взрослых мышей, репортер и/или эффекторных экспрессии генов эффективно может быть ограничена популяция клеток, которые выражают гена в взрослых и таким образом избежать рекомбинации/выражение в населения с ранее переходных гена активностью.
Вторым основным преимуществом межпозвонковые rAAV инъекции является способность ограничивать экспрессии генов, rAAV кодировке в месте инъекции. В трансгенных мышей КРР драйвер опосредованной выражение часто не встречается в нейрональных субпопуляция интерес, но и в других группах населения в нервной системе. Dymecki и коллеги, а также групп мА и Гулдинг, разработали элегантные способы использования подходов, основанных на мыши совокупной репортер которые избежать рекомбинации в части нервной системы, которая должна оставаться неизменной17, 18,-19,-21,-22,-23. Использование стук в мышей, чтобы получить выражение маркер или эффекторных белков можно также предположить, что меньше переменной, поскольку существует только одна копия геномной соответствующих выражений кассеты на ячейку и кассеты выражение присутствует во всех клетках в регионе интереса . Напротив, наличие соответствующих выражений кассету, а также копировать количество кассеты выражение после вирусных трансдукции зависит электромеханической эффективности, который может варьироваться от ячейки к ячейке, от инъекций для инъекций и зависит от много вирусов. Наконец главный недостаток экспрессии генов вируса опосредованной над традиционными генетических методов является необходимость операции. Хирургия опосредованной травмы/воспаление может непосредственно влиять нейронов и цепей. Включение управления мышей, которые подверглись операции же поэтому является обязательным.
Будущих приложений:
Межпозвонковые инъекции может использоваться для анализа и обработки любых генетически выявленных позвоночника субпопуляция через гиперэкспрессия маркер и эффекторных белков. Поэтому вполне вероятно в будущем что многие примет эту технику, чтобы изучить нейрональных популяций в их конкретной направленности. Кроме того, помимо использования межпозвонковым инъекций rAAVs для достижения гиперэкспрессия экзогенных эффекторных белков, этот метод может также использоваться для молчания или overexpress эндогенных белков и таким образом изучить функции любого данного гена с высокой пространственной и временным разрешением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Hanns Ulrich Zeilhofer за щедрую поддержку этой работы. Хендрик Wildner был поддержан Фондом Ольга Mayenfisch. Мы благодарим Кармен Бирхмайер за Lmx1b антител.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller | Zeitz | NA | |
| anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator | Weinmann | NA | |
| anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer | Midmark | NA | |
| Heat mat: Mio Star Thermocare 100 | Migros | 717614700000 | |
| Electric shaver | Philips | BT9290 | |
| surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | NA | |
| Small animal stereotaxic apparatus | Kopf | NA | |
| Neurostar StereoDrive (optional) | Neurostar | NA | |
| Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| PHD Ultra syringe pump with nanomite | Harvard Apparatus | 70-3601 | |
| Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40 | Osada | OS-40 | |
| spherical cutter, 0.5mm | Busch | 12001005B | |
| electronic von Frey anesthesiometer | IITC | 23905 | |
| flexible von Frey hairs | IITC | #7 | |
| LSM710 Pascal confocal microscope | Zeiss | NA | |
| 0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective | Zeiss | NA | |
| 1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective | Zeiss | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | |||
| Scalpel Handle #4, 13cm | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Dumont #2 laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Fine forceps #5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables and Chemicals | |||
| Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter | World Precision Instruments | TW 100-3 | |
| Syringes (1, 5 and 20 ml) | B. Braun | (9166917V, 4606051V, 4606205V) | |
| 26G beveled needle | B. Braun | 4665457 | |
| Sterile scalpel blades | B. Braun | BB523 | |
| Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable | B. Braun | C1046220 | |
| Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable | B. Braun | C0932191 | |
| Sterile PBS or saline (0.9%) | NA | ||
| Ethanol, 70% (disinfectant) | NA | ||
| Iodine solution (e.g. Braunol) | B. Braun | 18380 | |
| Anaesthetics (e.g. Attane isoflurane) | Provet | 2222 | |
| Aldasorber | Provet | 333526 | |
| analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic) | Indivior | GTIN: 7680419310018 | |
| Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos) | Pharma medica | GTIN: 4031626710635 | |
| Cotton swabs (e.g. from) | IVF Hartmann | 1628100 | |
| Facial tissues (e.g. from) | Uehlinger AG | 2015.10018 | |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoScientific | J1800AMNZ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| C57BL/6J mice (wildtype) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:000664 | |
| Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:023526 | |
| Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom) | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:007914 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viral vectors | |||
| AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-PV1963 | |
| AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-ALL854 | |
| AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE .bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato) |
Penn Vector Core | AV-1-ALL864 | |
| AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA) | Penn Vector Core | Custom production | |
| AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi)) | Penn Vector Core | Custom production | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | |
| pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP | Addgene | 20298 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteria | |||
| MDS42 | ScarabGenomics | ||
| Stbl3 | ThermoScientific | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Quiagen | 12362 | |
| NucleoBond PC 500 | Machery & Nagel | 740574 | |
| clozapine-N-oxide (CNO) | Enzo Life Sciences | BBL-NS105-0025 | |
| chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| histamine | Sigma | H7125 | |
| Dapi | Invitrogen | D3571 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (dilution) | |||
| Rabbit anti-GFP (1:1000) | Molecular Probes | RRID:AB_221570 | |
| Rabbit anti-NeuN (1:3000) | Abcam | RRID:AB_10711153 | |
| Goat anti-Pax2 (1 : 200) | R & D Systems | RRID:AB_10889828 | |
| Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000) | Dr Carmen Birchmeier | Muller et al. 2002 | |
| Rabbit anti-GFAP (1 : 1000) | DakoCytomation | RRID:AB_10013382 | |
| Secondary antibodies raised in donkey (1:800) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | NA |
References
- Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. Inhibition downunder: an update from the spinal cord. Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).
- Sandkuhler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).
- Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control. Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).
- Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
- Cui, L., et al. Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain. Neuron. 91 (6), 1413 (2016).
- Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
- Francois, A., et al. A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins. Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).
- Peirs, C., et al. Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain. Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).
- Petitjean, H., et al. Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury. Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).
- Zhang, Y., et al. Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons. J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).
- Haenraets, K., et al. Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters. J Neurochem. , (2017).
- Abraira, V. E., et al. The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn. Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).
- Wildner, H., et al. Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity. J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), e50313 (2013).
- Kohro, Y., et al. A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn. Sci Rep. 5, 14306 (2015).
- Bourane, S., et al. Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons. Science. 350 (6260), 550-554 (2015).
- Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
- Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
- Gutierrez-Mecinas, M., et al. Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli. Pain. 158 (3), 440-456 (2017).
- Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation. Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).
- Kim, J. C., et al. Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele. Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).
- Kim, J. C., Dymecki, S. M. Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus. Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).
