לטווח ארוך לחיות תאים הדמיה כדי להעריך את גורל בתגובה פקליטקסל
Summary
הדמיה לחיות תאים מספק שפע של מידע על תאים בודדים או באוכלוסיות שלמות כי הוא בלתי ניתן להשגה על-ידי תא קבוע הדמיה לבד. כאן, מתוארים פרוטוקולי הדמיה לחיות תאים כדי להעריך את החלטות גורל התא לאחר הטיפול עם פקליטקסל סמים אנטי mitotic.
Abstract
הדמיה לחיות תאים היא טכניקה רב עוצמה שיכול לשמש ישירות להמחיש תופעות ביולוגיות בתאים יחיד במשך פרקי זמן ארוכים. בעשור האחרון, טכנולוגיות חדשני יש שיפור משמעותי את המעשיות של הדמיה לחיות תאים. התאים עכשיו ניתן לשמור בפוקוס, באופן רציף עם תמונה על פני כמה ימים תוך מתוחזקים תחת 37 °C ו- 5% CO2 תנאים התרבות תאים. יתר על כן, המבט של שדות מרובים, המייצג תנאים ניסויים שונים ניתן לרכוש בו זמנית, ובכך לספק נתוני הניסוי תפוקה גבוהה. הדמיה לחיות תאים מספק יתרון משמעותי על פני תאים קבוע הדמיה על-ידי מתן עבור פריט חזותי ישיר וכימות הטמפורלי של אירועים הסלולר דינמי. הדמיה לחיות תאים יכולים לזהות גם וריאציה בהתנהגות של תאים בודדים שאת אחרת הוחמצו באמצעות מבחני מבוסס-אוכלוסייה. כאן נתאר פרוטוקולים הדמיה לחיות תאים כדי להעריך את החלטות גורל התא לאחר הטיפול עם פקליטקסל סמים אנטי mitotic… נדגים שיטות לדמיין אם mitotically נעצר למות תאים ישירות מתוך מיטוזה או להחליק בחזרה לאטמוספרה. גם נתאר כיצד מערכת מחזור התא מבוסס ubiquitination פלורסנט מחוון (FUCCI) ניתן להשתמש כדי להעריך את השבר של תאים לאטמוספרה נולד מן החלקה mitotic מסוגלים להזין מחדש את מחזור התא. לבסוף, אנו מתארים שיטה הדמיה לחיות תאים לזיהוי אירועים קרע מעטפת הגרעין.
Introduction
תרופות אנטי-mitotic זמן רב השתמשו ב- משטרי כימותרפיות של סוגים שונים של גידולים מוצקים, לעתים קרובות להציג את היעילות הגדולה1,2,3. Mechanistically, תרופות אלו לשבש את התקדמות mitotic נורמלית ולקדם mitotic למעצר מתרבים במהירות תאים סרטניים. עם זאת, גורל, בתגובה למעצר mitotic זה משתנה מאוד: בעוד שבריר של תאי עובר מוות של תאים ישירות מתוך מיטוזה, יציאה של מיטוזה ואחרים לחזור לאטמוספרה כתאים tetraploid (תהליך הנקרא גלישה mitotic)4, 5,–6,–7,–8. תאים אלה לאטמוספרה יכול לבצע אפופטוזיס, עוברים קבוע מחזור התא מעצר או אפילו להזין מחדש את מחזור התא4,5,6,7,8,9 10, ,11. תאים להתחמק מוות תאי mitotic על ידי מחליקה לתוך לאטמוספרה, רק להזין מחדש את מחזור התא בעקבות הסרת סמים, עשויים לתרום לכן הופעתה של אוכלוסיות תאים סרטן. יתר על כן, תאים כי לחמוק מן מיטוזה הן tetraploid, tetraploidy ידוע לקדם יציבות כרומוזום שמניע הגידול נסיגה12,13,14,15. הגדרת הגורמים השולטים גורל בתגובה טיפולים תרופות אנטי mitotic לכן קריטי כדי למטב את הרפוי הנוכחי.
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות ישירות להתבונן וללמוד את גורלו של תאים עוברים מעצר ממושך mitotic בתגובה פקליטקסל אנטי-mitotic סמים. פקליטקסל היא הוותיקה טיפולית במרפאה הוכיח תכופה בסוגי גידולים רבים, כולל אלה של השד, השחלות והריאות16,17,18,19, 20-פקליטקסל, אשר אלקלואיד צמח נגזר מקליפת עץ הטקסוס, מייצבת microtubules, וכך מונע שלהם21,dynamicity22. בעוד לשבור של דינמיקה microtubule מאת פקליטקסל אינה משפיעה על מחזור התא התקדמות של גרם1 G2, התרופה להוביל ההפעלה מתמשכת של המחסום מכלול ציר במהלך מיטוזה על ידי הפרעה קינטוכור-microtubule מצורף (נבדקה לעומק כאן23,24)25. כתוצאה מכך, “אנאפאזה” תחילת נמנעת ב תאים שטופלו פקליטקסל ותוצאות mitotic מעצר ממושך.
פרוטוקול זה יתאר תחילה גישות לזהות תאים mitotic בניסויים הדמיה לחיות תאים. מיטוזה, ניתן לאבחן בתאים תרביות רקמה חסיד בשל שני שינויים ביולוגיים תא מורגש. ראשית, כרומוזומים להיות מרוכז מאוד מייד לפני התמוטטות מעטפת הגרעין. אמנם, לעיתים קרובות ניתן לגילוי על ידי מיקרוסקופ שלב-ניגודיות סטנדרטי כרומוזום עיבוי יכול באופן ברור יותר יזוהו באמצעות פלורסנט מתייג את תווית כרומוזומים (למשל היסטון שכותרתו fluorescently חלבונים). השני, mitotic תאים גם יכול להיות מזוהה על ידי השינויים הדרמטיים מורפולוגי הנובעים תא עיגול.
פרוטוקול זה ואז תדגים כיצד להשתמש גישות הדמיה לחיות תאים כדי לאתר את גורלם של התאים חווים מעצר mitotic ממושך. תאים נעצרה מיטוזה עוברים אחד הגורל ברורים. ראשית, תאים יכול לעבור מות תאים במהלך מיטוזה. תופעה זו הוא מדמיין בקלות על ידי מיקרוסקופ אור, כמו תאים הגוסס שנצפו הפסיכיאטר, bleb, ו/או קרע. שנית, תאים יכולים לצאת מן מיטוזה, לחזור בחזרה לאטמוספרה ללא הפרדה בין כרומוזום או ציטוקינזה, תהליך הנקרא mitotic החלקה. את decondensation של כרומוזומים ו/או את שיטוח של התא mitotic ברצון מזהה תהליך זה. התאים לגלוש בין מיטוזה גם לעתים קרובות להציג גרעינים לא סדיר, מרובי אונות, לעתים קרובות הנמל micronuclei מספר5. שלישית, התאים נעצרה מיטוזה יכול ליזום את “אנאפאזה”, להמשיך דרך מיטוזה לאחר עיכוב ארוך. בעוד נדיר בריכוזים גבוהים של סמים, התנהגות זו עולה כי התאים נעצר ייתכן ששיחת במחסום מכלול ציר, או כי המחסום מכלול ציר הוא נחלש חלקית או לקויה. תחילת “אנאפאזה”, ניתן לאבחן על ידי כרומוזום סגרגציה ציטוקינזה עוקבות באמצעות הדמיה לחיות תאים.
שיטות הדמיה לחיות תאים כדי לעקוב אחר גורלם של תאים להתחמק מוות תאי mitotic מאת שעברו החלקה mitotic גם יתוארו. התאים עוברים החלקה mitotic למות. לאטמוספרה עוקבות, להפעיל מעצר עמיד של מחזור התא1 G או הזן מחדש את מחזור התא ליזום סבב חדש של חלוקת התא4. גישה באמצעות המערכת (מחזור התא מבוסס ubiquitination פלורסנט מחוון) FUCCI כדי לקבוע את השבר של תאים הזן מחדש את מחזור התא בעקבות גלישה mitotic יתוארו. FUCCI מאפשר פריט חזותי ישיר של המעבר /S1G, ניתן להשתמש בשילוב עם לטווח ארוך לחיות תאים הדמיה26,גם במבחנה וגם ויוו27. מערכת FUCCI לוקח את היתרונות של שני חלבונים fluorescently שכותרתו, קטום צורות של hCdt1 (כרומטין הרישוי של שכפול ה-DNA גורם 1) ו- hGeminin, רמות אשר נעים בהתבסס על מיקום מחזור התא. hCdt1 (דבוקה חלבון פלואורסצנטי אדום) נוכח ברמה גבוהה במהלך שלב1 G איפה שהוא פועל רשיון ה-DNA לצורך שכפול, אבל הוא ubiquitinated על ידי ליגאז אוביקוויטין E3 SCFSkp2 והשפילו במהלך שלבי /M2S/G כדי למנוע שכפול מחדש של ה-DNA26. לעומת זאת, הוא מעכב של hCdt1 אשר רמות שיא במהלך S/G2/M hGeminin (דבוקה של חלבון פלואורסצנטי ירוק), אבל היא ubiquitinated על-ידי E3 ליגאז אוביקוויטין APCCdh1 והשפילו בקצה של מיטוזה ולאורך ג’י1 26. כתוצאה מכך, FUCCI מספק פלורסצנטיות פשוטה מפרט. של החלקים שלב מחזור התא, כמוצג תאים פלואורסצנטי אדום במהלך פלורסצנטיות1, ו- green G במהלך S/G2/M. מערכת FUCCI היא התקדמות משמעותית על גישות אחרות (כגון צביעת bromodeoxyuridine) כדי לזהות תאים המקדימות, כי היא לא דורשת קיבוע תא, מאפשר הדמיה תא בודד ללא הצורך נוספים תרופתי טיפולים כדי לסנכרן את אוכלוסיות תאים. אך לא נדון במסגרת פרוטוקול זה, חיישנים לחיות תאים נוספים גם פותחו כדי להמחיש התקדמות מחזור התא, כולל חיישן הליקאז B G128, DNA ליגאז-RFP29 , PCDNA-GFP30 חיישנים S-פאזי, החיישן FUCCI-4 האחרונות, אשר מזהה בכל שלבי מחזור התא31.
לבסוף, שיטת הדמיה לחיות תאים כדי לזהות קרע מעטפת הגרעין יתוארו. מחקרים שנעשו לאחרונה חשפו כי המעטפות גרעיני של תאים סרטניים הם לא יציבה ונוטה להתפרץ, ובכך לאפשר את התוכן של נוקלאופלזמה, הציטופלסמה להתערבב. תופעה זו, כינה קרע גרעינית, יכול לקדם נזק לדנ א וגירוי של תגובה חיסונית מולדת32,33,34,35,36,37, 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. בעוד הגורמים הבסיסיים של קרע גרעיני להישאר שהיישום מאופיין, ידוע כי דפורמציות במבנה הגרעין לתאם עם שכיחות מוגברת של קרע גרעיני42. אפקט ידוע אחד של טיפול פקליטקסל הוא הדור של מבנים גרעיני חריג בצורה בולטת בעקבות מיטוזה; ככזה, שיטה באמצעות הדמיה לחיות תאים לכמת קרע גרעיני יתוארו, בעת סיור גם אם פקליטקסל לטיפול מגדיל את תדירות האירועים קרע גרעינית. קרע גרעיני יכול יזוהו על-ידי דליפת חלבון פלואורסצנטי גרעיני במיקוד שנצפה לתוך הציטופלסמה (למשל דיימר טנדם חוזר של RFP דבוקה אות לוקליזציה גרעינית, TDRFP-NLS). דליפה זו מוצגת בפירוש לפי העין, אשר מאפשרת כימות פשוטה אירועי קרע.
פרוטוקול זה דורש מיקרוסקופ epifluorescence widefield, אשר מצויד עם הבמה מקודד, תוכנה autofocusing שותק. השלב מקודד מאפשר תנועה אוטומטי מדויק קואורדינטות X-Y מוגדר, בזמן פוקוס אוטומטי התוכנה שומרת על תאים בפוקוס למשך כל תקופת הדמיה. בנוסף, פרוטוקול זה דורש ציוד כדי לשמור על תאים ב 37 ° C עם humidified 5% CO2 אווירה. זו יכולה להיות מושגת על-ידי תחימת המיקרוסקופ כולו בתוך חום, אווירה מבוקרת מארז, או באמצעות מכשירים הבמה-העליון כך מקומית שומר על הטמפרטורה והסביבה. המטרה בשלב ניגודיות בשימוש פרוטוקול זה היא עבור תוכנית חיל הים 10 x עם הפתח המספרי של 0.30. עם זאת, המטרות X 20 מספיקים גם לזהות שני תאים מעוגלים לאטמוספרה mitotic, שעברו שיטוח מוקד מטוס בודד. אם ביצוע שלב-ניגודיות הדמיה (כמתואר בשיטה זו), המכסה יכול להיות או זכוכית או פלסטיק. אם נעשה שימוש במיקרוסקופ ניגוד (DIC) התערבות דיפרנציאלית, זה הכרחי כדי להשתמש לכסות זכוכית כדי למנוע דפולריזציה של אור.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההיבט הקריטי ביותר של הדמיה לחיות תאים לטווח ארוך זה להבטיח את בריאותו של התאים להיות עם תמונה. זה חיוני כי תאים להיחשף מינימלי לחצים סביבתיים חיצוניים, כגון תנאים ירודים לגבי טמפרטורה, לחות, ו/או CO2 רמות. חשוב גם להגביל את נזקי מ תאורה פלורסנט עירור, הדמיה מתח הידוע להשפיע על התנהגות ת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AFB, MAV, NJG רוצה להודות ריאן קווינטון להערות על כתב היד, אדריאן Salic עבור TDRFP-NLS הבונה. AFB ו MAV ממומנות על ידי 5T32GM008541 NIGMS למערכות ביולוגיות פרמקולוגיה הכשרה גרנט. NJG הוא חבר של בימוי ותסריט, מעבדות מחקר של סרטן השד Dahod אשרף, נתמכת על ידי NIH מענקים GM117150, CA-154531, קרן Grunebaum קארין, התוכנית פרסים משפחת סמית, התוכנית מלומדים סרל ומחקר של מלנומה ברית.
Materials
| phenol red-free, DMEM:F12 media | Hyclone | SH3027202 | |
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| 100 IU/ml penicillin, and 100 mg/ml streptomycin. | Gibco | 15070063 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gemini | 50-753-3104 | |
| 12-well glass bottomed imaging dish | Cellvis | P12-1.5H-N | |
| Paclitaxel | TSZ Chem | RS036 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | NC0215085 | |
| Environmental Chamber | In Vivo Scientific | ||
| 5% CO2 | Airgas | Z03NI7432000201 | |
| 15 mL Conical Tubes | Fisherbrand | 05-539-12 | |
| 10 cm polystyrene tissue culture plates | Falcon | 08772E | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Fisherbrand | 4488 | |
| 5804R 15 amp Centrifuge | Eppendorf | 97007-370 | |
| 1000 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| 20 microliters Pipette | Gilson | Pipetman Classic | |
| p1000 Pipette Tips | Sharp | p1126 | |
| p20 Pipette Tips | Sharp | P1121 | |
| RPE-1 Cells | ATCC | CRL-4000 | |
| Incubator Galaxy 170S | Eppendorf | CO17011005 | |
| Pipette Boy | Integra | 156401 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Nikon Ti-E-PFS Inverted Microscope for Live Cell Imaging | Micro Video Instruments, Inc. | MEA53100 | |
| Prior X-Y Stage System and White Light LED Illuminator | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H117P1N4 | |
| Prior Proscan 3 Controller XYZ with Encoders | Micro Video Instruments, Inc. | 500-H31XYZE | |
| Andor Digital Camera | Micro Video Instruments, Inc. | D10NLC | |
| Nikon NIS Elements AR Software | Micro Video Instruments, Inc. | MQS31000 | |
| SOLA LED Illuminator for Fluorescence | Micro Video Instruments, Inc. | SOLA-E | |
| InVivo Environmental Chamber with CO2 Flow Control | Micro Video Instruments, Inc. | Ti-IVS-100 | |
| Ti-ND6-PFS Perfect Focus Motorized Nosepiece | Micro Video Instruments, Inc. | MEP59391 | |
| Ti-C System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL51000 | |
| Ti-C LWD LWD Lens Unit for System Condenser Turret | Micro Video Instruments, Inc. | MEL56200 | |
| Te-C LWD Ph1 Module | Micro Video Instruments, Inc. | MEH41100 | |
| CFI Plan Fluor DLL 10X Objectivena 0.3 wd 16mm | Micro Video Instruments, Inc. | MRH10101 | |
| CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objective | Micro Video Instruments, Inc. | MRH48230 |
References
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1101-1112 (2015).
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death Dis. 3, e411 (2012).
- Jackson, J. R., Patrick, D. R., Dar, M. M., Huang, P. S. Targeted anti-mitotic therapies: can we improve on tubulin agents?. Nat Rev Cancer. 7 (2), 107-117 (2007).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
- Rieder, C. L., Maiato, H. Stuck in division or passing through: what happens when cells cannot satisfy the spindle assembly checkpoint. Dev Cell. 7 (5), 637-651 (2004).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14 (2), 111-122 (2008).
- Huang, H. C., Mitchison, T. J., Shi, J. Stochastic competition between mechanistically independent slippage and death pathways determines cell fate during mitotic arrest. PLoS One. 5 (12), e15724 (2010).
- Shi, J., Orth, J. D., Mitchison, T. Cell type variation in responses to antimitotic drugs that target microtubules and kinesin-5. Cancer Res. 68 (9), 3269-3276 (2008).
- Ganem, N. J., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131 (3), 437-440 (2007).
- Ganem, N. J., Storchova, Z., Pellman, D. Tetraploidy, aneuploidy and cancer. Curr Opin Genet Dev. 17 (2), 157-162 (2007).
- Ganem, N. J., Pellman, D. Linking abnormal mitosis to the acquisition of DNA damage. J Cell Biol. 199 (6), 871-881 (2012).
- Sotillo, R., Schvartzman, J. M., Socci, N. D., Benezra, R. Mad2-induced chromosome instability leads to lung tumour relapse after oncogene withdrawal. Nature. 464 (7287), 436-440 (2010).
- Sotillo, R., et al. Mad2 overexpression promotes aneuploidy and tumorigenesis in mice. Cancer Cell. 11 (1), 9-23 (2007).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4 (8), e6564 (2009).
- McGuire, W. P., et al. Cyclophosphamide and Cisplatin Compared with Paclitaxel and Cisplatin in Patients with Stage III and Stage IV Ovarian Cancer. New England Journal of Medicine. 334 (1), 1-6 (1996).
- McGuire, W. P., et al. Taxol: a unique antineoplastic agent with significant activity in advanced ovarian epithelial neoplasms. Ann Intern Med. 111 (4), 273-279 (1989).
- Ettinger, D. S. Taxol in the treatment of lung cancer. J Natl Cancer Inst Monogr. (15), 177-179 (1993).
- Weaver, B. A. How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol Biol Cell. 25 (18), 2677-2681 (2014).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat Rev Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Wall, M. E., Wani, M. C. Camptothecin and Taxol: Discovery to Clinic-Thirteenth Bruce F. Cain Memorial Award Lecture. Cancer Research. 55 (4), 753-760 (1995).
- Schiff, P. B., Horwitz, S. B. Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (3), 1561-1565 (1980).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22 (22), R966-R980 (2012).
- Musacchio, A. The Molecular Biology of Spindle Assembly Checkpoint Signaling Dynamics. Curr Biol. 25 (20), R1002-R1018 (2015).
- Uetake, Y., et al. Cell cycle progression and de novo centriole assembly after centrosomal removal in untransformed human cells. J Cell Biol. 176 (2), 173-182 (2007).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
- Gu, J., et al. Cell cycle-dependent regulation of a human DNA helicase that localizes in DNA damage foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).
- Easwaran, H. P., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Cell cycle markers for live cell analyses. Cell Cycle. 4 (3), 453-455 (2005).
- Hahn, A. T., Jones, J. T., Meyer, T. Quantitative analysis of cell cycle phase durations and PC12 differentiation using fluorescent biosensors. Cell Cycle. 8 (7), 1044-1052 (2009).
- Bajar, B. T., et al. Fluorescent indicators for simultaneous reporting of all four cell cycle phases. Nat Methods. 13 (12), 993-996 (2016).
- Gekara, N. O. DNA damage-induced immune response: Micronuclei provide key platform. J Cell Biol. 216 (10), 2999-3001 (2017).
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Crasta, K., et al. DNA breaks and chromosome pulverization from errors in mitosis. Nature. 482 (7383), 53-58 (2012).
- Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J., Hetzer, M. W. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154 (1), 47-60 (2013).
- Maciejowski, J., Li, Y., Bosco, N., Campbell, P. J., de Lange, T. Chromothripsis and Kataegis Induced by Telomere Crisis. Cell. 163 (7), 1641-1654 (2015).
- Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).
- Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
- Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
- Bernhard, W., Granboulan, N. THE FINE STRUCTURE OF THE CANCER CELL NUCLEUS. Exp Cell Res. 24 (Suppl 9), 19-53 (1963).
- de Noronha, C. M., et al. Dynamic disruptions in nuclear envelope architecture and integrity induced by HIV-1 Vpr. Science. 294 (5544), 1105-1108 (2001).
- Vargas, J. D., Hatch, E. M., Anderson, D. J., Hetzer, M. W. Transient nuclear envelope rupturing during interphase in human cancer cells. Nucleus. 3 (1), 88-100 (2012).
- Sieprath, T., Darwiche, R., De Vos, W. H. Lamins as mediators of oxidative stress. Biochem Biophys Res Commun. 421 (4), 635-639 (2012).
- Mitchison, T. J., Pineda, J., Shi, J., Florian, S. Is inflammatory micronucleation the key to a successful anti-mitotic cancer drug?. Open Biol. 7 (11), (2017).
- Shenk, E. M., Ganem, N. J. Generation and Purification of Tetraploid Cells. Methods Mol Biol. 1413, 393-401 (2016).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J Vis Exp. (115), (2016).
- Salmon, E. D., Canman, J. C. Proper alignment and adjustment of the light microscope. Curr Protoc Cell Biol. , (2001).
- Cole, R. Live-cell imaging. Cell Adh Migr. 8 (5), 452-459 (2014).
- Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J Vis Exp. (111), (2016).
- Douthwright, S., Sluder, G. Live Cell Imaging: Assessing the Phototoxicity of 488 and 546 nm Light and Methods to Alleviate it. J Cell Physiol. 232 (9), 2461-2468 (2017).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
- Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).
- Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
- Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nat Cell Biol. 5 (3), 255-260 (2003).
- Bekker-Jensen, S., Lukas, C., Melander, F., Bartek, J., Lukas, J. Dynamic assembly and sustained retention of 53BP1 at the sites of DNA damage are controlled by Mdc1/NFBD1. J Cell Biol. 170 (2), 201-211 (2005).
- Loewer, A., Batchelor, E., Gaglia, G., Lahav, G. Basal dynamics of p53 reveal transcriptionally attenuated pulses in cycling cells. Cell. 142 (1), 89-100 (2010).
- Lekshmi, A., et al. A quantitative real-time approach for discriminating apoptosis and necrosis. Cell Death Discovery. 3, 16101 (2017).
- Jullien, D., Vagnarelli, P., Earnshaw, W. C., Adachi, Y. Kinetochore localisation of the DNA damage response component 53BP1 during mitosis. J Cell Sci. 115 (Pt 1), 71-79 (2002).
