Summary
هذه المخطوطة يوضح استنفاد التعبير الجيني في الأمامي للصراصير الألمانية عن طريق الابتلاع عن طريق الفم من الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في الدهنية.
Abstract
تدخل الجيش الملكي النيبالي ([رني]) وقد طبقت على نطاق واسع للكشف عن الوظائف البيولوجية للعديد من الجينات، وتوخيت كالآفات مراقبة أداة تعمل عن طريق تعطيل الجينات الأساسية. ورغم أساليب مختلفة، مثل حقن، التغذية، وامتصاص، للنجاح في إيصال الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل (dsRNA)، الكفاءة [رني] من خلال التسليم الشفوي من دسرنا اختلافاً كبيرا بين مختلف مجموعات الحشرات. الصراصير الألمانية، جرمنيك Blattella، حساس بدرجة كبيرة إلى حقن دسرنا، كما أظهرت العديد من الدراسات التي سبق نشرها. ويصف هذه الدراسة وسيلة للبرهنة على أن دسرنا مغلفة مع الناقلين الحويصلية كافية تؤخر تدهور دسرنا عصير الأمامي. جدير بالذكر أن تغذية مستمرة من دسرنا المغلفة بواسطة الدهنية إلى حد كبير يقلل التعبير tubulin في الأمامي، وأدت إلى وفاة الصراصير. وفي الختام، لصياغة واستخدام ليبوبليكسيس دسرنا، التي تحمي دسرنا ضد نوكليسيس، يمكن أن يكون استخدام عملي من [رني] للسيطرة على الآفات الحشرية في المستقبل.
Introduction
قد ثبت [رني] كطريقة فعالة للتعبير الجيني ضربة قاضية من خلال إليه طريقا إسكات بوستترانسكريبشونال فجرها جزيئات دسرنا في كثير من حقيقيات النوى1. على مدى العقد الماضي للدراسة، وقد أصبح [رني] أداة مفيدة دراسة وظائف الجينات من التنمية إلى سلوك طريق المستنفدة للتعبير عن جينات محددة عن طريق الحقن و/أو تغذية دسرنا في الأنواع المختلفة من الحشرات2،3. نظراً لخصوصية ومتانة أثر مستنفدة، يجري حاليا النظر التطبيق [رني] كاستراتيجية محتملة لمكافحة الآفات مراقبة إدارة4،5. ومع ذلك، الكفاءة [رني] اختلافاً كبيرا بين أنواع الحشرات، اعتماداً على جينات مختلفة يجري استهداف وطرق التسليم. مجموعة متزايدة من الأدلة تشير إلى أن عدم استقرار دسرنا، التي تتحلل ريبونوكليسيس، عامل حاسم في فعالية محدودة [رني]5،6. على سبيل المثال، أوضحت أن دسرنا مختلطة مع hemolymph المتدهورة بسرعة داخل مدار 17الحساسية [رني] منخفضة في سيكستا منداكا . وبالمثل، يرتبط بقوة وجود nucleases القلوية في الأمامي، التي تتحلل كفاءة دسرنا بلعها، مع انخفاض كفاءة [رني] في أوامر الحشرات المختلفة8،،من910.
تقديم شفوي دسرنا مثيرة للاهتمام لا سيما للتطبيق [رني] في استراتيجية لمكافحة الآفات، ولكن أسلوب تؤخر تدهور دسرنا التي نوكليسيس في الأمامي، لم توضع بعد، التي سيكون لديها القدرة على ضمان فعالية [رني] من خلال التغذية. ومع ذلك، أبلغت مشكلة عدم استجابة [رني] للتسليم الشفوي من دسرنا التغذية كمية كبيرة من دسرنا، مثلاً 50 ميكروغرام في بومباي موري، أو تغذية باستمرار لمدة 8 أيام (8 دسرنا ميكروغرام في المجموع) في الأنواع الجراد. الصراصير الألمانية، جيرمينيكا بلاتيلا، حساس بدرجة كبيرة إلى [رني] بحقن دسرنا11،12،،من1314، ولكن لا توجد استجابة إلى دسرنا من خلال التغذية. ومؤخرا، لين et al. (2017) أثبتت أن دسرنا تغليفها بنتائج الناقلين الحويصلية في [رني] ناجحة لضربة قاضية التعبير الجيني α-tubulin في وفيات كبيرة الأمامي والزناد الصراصير الألمانية15. كما تدهور دسرنا في الأمامي هو العامل المقيد للفم [رني]، الناقلين الحويصلية بمثابة وسيلة لحماية دسرنا من التدهور الذي سهولة المطبقة في الحشرات الأخرى مع أنشطة نوكلياسي قوية في الأمعاء. من المذكرة، والسبب في اختيار الكاشف تعداء خاصة (انظر الجدول للمواد) ونحن تستخدم الناقل الحويصلية في البروتوكول الحالي أنه قد تم اختباره للحشرات الخلية خط تعداء مع أقل سمية، استناداً إلى إرشادات الشركة المصنعة. ووفقا للمقارنة بين أنظمة تعداء الحويصلية مختلفة في غارافي et al. (2013) 16، كفاءة ترانسفيكتينج صغيرة تدخل الجيش الملكي النيبالي (siRNA) هو تقريبا نفس بين هذه وغيرها من النظم المتاحة تجارياً التي استخدمت لمنظومات إيصال دسرنا في سائر الحشرات17،18 . وعلاوة على ذلك، لدينا أسلوب التغذية عناية كافية لضمان كمية مناسبة من دسرنا يتم تناولها بكل الصراصير، وأن النتائج قوية ومؤكدة. في ملخص، هذا البروتوكول والنتائج تثبت أن استخدام ليبوبليكسيس دسرنا يحسن الاستقرار دسرنا ويفتح الباب لتصميم استراتيجية تقديم شفوي [رني]، ونهج واعدة لمكافحة الآفات في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-تجميع وإعداد دسرنا
- تحديد المواقع المستهدفة دسرنا في المنطقة 3 ' غير مترجمة من الجينات المستهدفة. دستوب هو استخدامها لاستهداف الجين α-tubulin (الحوض) (رقم الانضمام إلى بنك الجينات: KX228233)، ودسيجفب كما تم تصميم عنصر تحكم دسرنا سلبية من التسلسل المحسن البروتينات الفلورية الخضراء (اجفب؛ بنك الجينات رقم الانضمام: LC311024).
- تنفيذ معيار [بكر] تضخيم توليف قوالب دسرنا مع الإشعال الخاصة بالجينات التي تحتوي على تسلسل المروج T7 (-تاتاكجاكتكاكتاتاجج 5 '-3'). PCR التضخيم الشروط والمعلومات التمهيدي المستخدمة هي تلك المبلغ عنها بلين وآخرون. (2017) 12 (انظر الجدول للمواد).
- المضي قدما في إعداد دسرنا باستخدام نسخ T7 كيت (انظر الجدول للمواد)، اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
ملاحظة: تؤتي دسرنا كمية عالية، مزيج من اثنين من ردود الفعل في أنبوب واحد (بإجمالي 40 ميكروليتر)، واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. - إضافة 2 ميليلتر من الدناز (انظر الجدول للمواد) في عينات دسرنا لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية لهضم الحمض النووي قوالب.
- إضافة 200 ميليلتر استخراج الكاشف (انظر الجدول للمواد) كلوروفورم ميليلتر 40، ثم دوامة.
- الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 13,000 س ز عند 4 درجة مئوية، ثم جمع المادة طافية (150 ميليلتر) في أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة.
- يعجل دسرنا بإضافة 150 ميليلتر الايزوبروبانول وحضانة لمدة 15 دقيقة على الجليد.
- الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 13,000 س ز في 4 درجات مئوية، ثم إزالة المادة طافية.
- إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 70% لغسل الكريات دسرنا. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 13,000 س ز في 4 درجات مئوية.
- إزالة الإيثانول، وكرر الخطوات يغسل الإيثانول.
- إزالة الإيثانول وبيليه دسرنا الجافة بالطرد المركزي مركزات فراغ لمدة 3 دقائق، ثم ريسوسبيند دسرنا مع المياه خالية من رناسي.
- تحديد كمية دسرنا المنقي استخدام جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية مقابل حجم الصغير (انظر الجدول للمواد) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة وضبط للتركيز المطلوب (مثلاً، 0.25 ميكروغرام/ميليلتر لإعداد دسرنا ليبوبليكسيس).
- تخزين العينات دسرنا في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
2-إعداد دسرنا ليبوبليكسيس
- تمييع 4 ميليلتر من الكاشف تعداء (انظر الجدول للمواد) بإضافة 4 ميليلتر من محلول الجلوكوز 5%. تمييع 4 ميليلتر من دسرنا (1 ميكروغرام) بإضافة 4 ميليلتر من محلول الجلوكوز 5%.
- إضافة الحل كاشف الحويصلية المخفف فورا إلى الحل دسرنا المخفف في كل مرة. الدوامة بإيجاز الخلط بينهما، ثم احتضانها لمدة 15 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
ملاحظة: لا تخلط الحلول في ترتيب عكسي. - ليبوبليكسيس دسرنا جاهزة للاستخدام. استخدام حدود 1 ساعة التحضير، وتجاهل بعد ساعة واحدة.
ملاحظة: وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، ينبغي أن تستخدم في ليبوبليكسيس وقت ممكن.
3-مجموعة من إنزيمات خارج الخلية من Hemolymph وعصير الأمامي
-
المخزن المؤقت المالحة الحشرات (10 x الأسهم)
- مزيج 900 مل ماء مقطر مزدوجة مع ز 109.3 كلوريد الصوديوم، ز 15.7 بوكل، ز 6.3 كاكل2، وسين ز 8.3 مجكل2·6H2
- ضبط الأس الهيدروجيني إلى 6.8، وملء يصل إلى 1,000 مل.
-
مجموعة هيموليمف
- تخدير الصراصير على الجليد حتى لا تتحرك لمدة 3 دقائق.
- عقد الصراصير مع اثنين من أصابع (الإبهام والسبابة)، ويصل بدوره على الجانب البطني من الصراصير.
- استخدام مقص تشريح قطع قبالة غيض من كوكسا من إحدى ساقيه الخلفيتين.
ملاحظة: قص تقاطع متصلة بين كوكسا وتروتشانتير. وكان ختان الجزء الآخر من كوكسا أقل كفاءة لجمع هيموليمف. - الضغط على البطن بلطف بالإصبع الأوسط، وجمع hemolymph نزيف من الشق مع ميكروبيبيتي 10 ميليلتر.
- تجمع هيموليمف من الصراصير عدة (5 أفراد) في أنبوب ميكروسينتريفوجي.
ملاحظة: تبقى هذه الأنابيب ميكروسينتريفوجي على الجليد لمنع شكل الميلانين. متوسط حجم هيموليمف التي تم الحصول عليها من الصراصير ذكور هو 2-3 ميليلتر. - تدور إلى أسفل هيموليمف إيجاز مع benchtop جهاز الطرد مركزي لمدة 10 ق.
- نقل المجلد المطلوب من هيموليمف (أي، 10 ميليلتر)، ومزجها مع 50 ميليلتر من 1 x الحشرات المالحة المخزن المؤقت.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 1,000 ز x عند 4 درجة مئوية لزيادة ونقصان لأسفل هيموسيتيس. نقل المادة طافية إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي نظيفة.
- قياس تركيز البروتين الكلي باستخدام جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية مقابل حجم الصغير بقياس A28015.
- ضبط كل عينة أن يكون تركيز البروتين نفسه (6 ملغم/ميليلتر من مجموع البروتين).
-
جمع عصير الأمامي
- تخدير الصراصير على الجليد. إصلاح الصراصير الجانب البطني على لوحة التشريح مع x 1 الباردة المخزن المؤقت المالحة الحشرات باستخدام دبابيس الحشرات.
- تشريح البطن بالملقط غرامة. إزالة القناة الهضمية كاملة (بما في ذلك القناة الهضمية الأمامية، منتصف، وهند) إلى طبق طازجة مع 1 × العازلة المالحة الحشرات.
- إزالة القناة الهضمية الأمامية وهند، ونقل بسرعة الأمامي أنبوب ميكروسينتريفوجي التي تحتوي على 100 ميليلتر الحشرات المالحة المخزن المؤقت.
- تجمع ميدجوتس من الصراصير ستة في الأنبوب نفسه ودوامه لمدة 10 ق.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 1,000 ز x عند 4 درجة مئوية لزيادة ونقصان لأسفل هيموسيتيس وأنسجة القناة الهضمية. نقل المادة طافية إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي نظيفة.
- قياس تركيز البروتين الكلي باستخدام جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية مقابل حجم الصغير بقياس A28015.
- ضبط كل عينة أن يكون تركيز البروتين نفسه (6 ملغم/ميليلتر من مجموع البروتين).
4-دسرنا المقايسة تدهور
- إعداد طازجة 4 ميليلتر دسرنا عارية أو دسرنا ليبوبليكسيس (1 ميكروغرام).
- مزيج عصير دسرنا الإنزيمات الحلول مع 10 ميليلتر من المخزن المؤقت المالحة الحشرات (مراقبة)، المستخرجة من hemolymph، أو الأمامي.
- إضافة 2 ميليلتر عطا (20 مم) أو المياه خالية من رناسي لفصل العينات كعناصر تحكم لتثبيط الأنشطة الانزيمية.
- احتضانها لساعة واحدة أو لفترة أطول (6 أو 12 أو 24 ساعة) عند 25 درجة مئوية.
- إضافة 200 ميليلتر استخراج الكاشف وميليلتر 40 كلوروفورم، ثم دوامة.
- الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 13,000 س ز عند 4 درجة مئوية، ثم جمع المادة طافية (150 ميليلتر) في أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة.
- يعجل دسرنا بإضافة 150 ميليلتر الايزوبروبانول وحضانة لمدة 15 دقيقة على الجليد.
- الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 13,000 س ز في 4 درجات مئوية، ثم إزالة المادة طافية.
- إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 70% لغسل الكريات دسرنا. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 13,000 س ز في 4 درجات مئوية.
- إزالة الإيثانول، وكرر الخطوات يغسل الإيثانول.
- إزالة الإيثانول وبيليه دسرنا الجافة بالطرد المركزي مركزات فراغ للحد الأدنى 3 ريسوسبيند دسرنا مع المياه خالية من رناسي 10 ميليلتر.
- التحقق من سلامة دسرنا المعالجة عن طريق التفريد جل على 1.5% [اغروس] هلام.
5-الفم من دسرنا
- الحفاظ على الصراصير على نظام غذائي libitum الإعلانية للمواد الغذائية الجافة (الكلب تشاو). تحرم إمدادات المياه من الصراصير قبل تجارب ابتلاع دسرنا يوم واحد.
- اضغط الصراصير بالاستيلاء على اجنحتها مع الملقط مرنة (الشكل 1، الخطوة 5).
ملاحظة: عدم انتزاع أجزاء الجسم من الصراصير. - إعداد ليبوبليكسيس دسرنا، فضلا عن دسرنا عارية، للتغذية، كما هو موضح في المقطع 2.
ملاحظة: وينبغي إعداد ليبوبليكسيس دسرنا طازجة قبل التغذية. - آر 4 ميليلتر دسرنا ليبوبليكسيس أو دسرنا عارية (250 نانوغرام) مع ميكروبيبيتي.
- ببطء استيعاب بيبيت الحبرية الحل دسرنا قريبة من فمها للصراصير، واسمحوا الصراصير الحبرية تماما.
- القيام بتجارب ابتلاع مرتين في يوم (ح 1 بعد الأضواء على وح 1 قبل الأنوار) لمدة 8 أيام أو 16 يوما بشكل مستمر.
ملاحظة: اكتسبت الصراصير جميع المياه إلا من خلال التغذية اليدوية مع الكواشف دسرنا الحل أو عنصر تحكم (مثلnuclease الحرة، حل السكر والمياه وكاشف الحويصلية) خلال تجارب الابتلاع. - توفير زجاجات المياه للصراصير بعد 16 يوما ابتلاع دسرنا التجارب.
6-تقييم ضربة قاضية
- وفي الوقت الذي تم اختياره النقاط (2 و 9، و 17 يوما بعد الفحص ابتلاع دسرنا)، جمع الحشرات دسيجفب ودستوب معاملة وتشريح الأنسجة المختارة (مثلاً، الأمامي).
- إجراء PCR الكمي في الوقت الحقيقي (قرت-PCR). قرة--بكر التضخيم الشروط والمعلومات التمهيدي كما أفاد لين وآخرون. (2017) 12.
- تقييم مراقبة ومعاملة دسرنا الحشرات يوميا للتحقق من الوفيات وإزالة الصراصير التي لم تعد تتحرك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مخطط مبسط للبروتوكول لإيصال الفم دسرنا يرد في الشكل 1، حيث أظهرت الخطوات الأساسية لإعداد ليبوبليكسيس دسرنا.
من أجل التحقيق في الحماية الممنوحة الناقلين الحويصلية عند تدهور دسرنا في عصير الأمامي جرمنيك باءومقايسة السابقين فيفو حيث أجرى دستوب ليبوبليكسيس كانت المحتضنة مع عصير الأمامي وسلامة دسرنا وقد تم تحليل في وقت لاحق على 1.5% [اغروس] هلام. ويبين الشكل 2 أن الجيش الملكي النيبالي نوكلاس النشاط القوى كانت موجودة في عصير الأمامي جرمنيك باء (الشكل 2ألف)، بينما كانت قادرة على حماية دسرنا ضد التدهور على الأقل لمدة ساعة واحدة في السابقين فيفو الناقلين الحويصلية الحضانة (الشكل 2أ، ب). نتيجة لذلك تم تطبيق الابتلاع عن طريق الفم من ليبوبليكسيس دسرنا مرتين في يوم لزيادة حساسية الأنسجة الأمامي ل [رني] في التجارب التالية.
التحقق من صحة الاستجابة [رني] من خلال التسليم الشفوي من دسرنا قيمت بقياس تأثير استنزاف الحوض التعبير مرناً في الأمامي عند نقاط زمنية مختلفة بعد الابتلاع المستمر من دسرنا (الشكل 3أ). كان المنضب التعبير الحوض في الأمامي كثير بعد ابتلاع ليبوبليكسيس دستوب المستمر لمدة 8 أيام. بينما تغذية مستمرة من دسرنا استغرقت 16 يوما، التعبير الحوض في الأمامي كان المنضب كثيرا في دستوب عارية وجماعات ليبوبليكسيس دستوب (ما يقرب من 24 و 60 في المائة، على التوالي) على النقيض من عناصر التحكم. الشكل 3 ب يبين زيادة متسقة، كبير من الوفيات بعد الإدارة عن طريق الفم من ليبوبليكسيس دستوب لمدة 16 يوما.
الشكل 1 : نظام مبسط للتسليم عن طريق الفم من ليبوبليكسيس دسرنا للصراصير. وتتمثل الخطوات الأساسية لإعداد ليبوبليكسيس دسرنا للخطوات من 1 إلى 4. أسلوب تغذية (الخطوة 5) يظهر في الصورة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: السابقين فيفو تدهور دسرنا باء-جرمنيك هيموليمف (هيمو) أو عصير الأمامي. (أ) 1 ميكروغرام دستوب عارية أو الحويصلية-كوجوجاتيد كان المحتضنة ح 1 مع المخزن المؤقت المالحة والأنزيمات المستخرجة من hemolymph (حمو) أو عصير الأمامي، على التوالي. كان المتدهورة في دستوب عاريا، ولكن لا مترافق الحويصلية دستوب، تماما عندما المحتضنة مع 1 × عصير الأمامي. تتم الإشارة إلى عوامل مختلفة تمييع عصير الأمامي الأصلي (س 1). وكان تحول دون التدهور بايون الخلبية سبب العلاج عطا كعنصر تحكم. (ب) حماية تعتمد على الوقت لتغليف الحويصلية دستوب (1 ميكروغرام) ضد تدهور السابقين فيفو في عصير هيموليمف أو الأمامي. من المذكرة، تم تخفيضها دستوب مترافق الحويصلية تماما عند المحتضنة مع عصير الأمامي بعد 24 ساعة. واستخدمت عصير hemolymph والامامي في تركيز الأصلي لفترات زمنية مختلفة للحضانة. النتائج مقتبسة من لين وآخرون. (2017) 12- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : آثار استجابة [رني] بابتلاع دسرنا على جرمنيك. (أ) الكمية في الوقت الحقيقي بكر (قرت-PCR) لتحديد التعبير النسبي الحوض في الأمامي للصراصير الألمانية بعد العلاجات التغذية المختلفة. تم تطبيع مستويات التعبير من العلاجات المختلفة لمجموعة الجلوكوز في يوم 2. القيم هي ± يعني سراج الدين من ثلاث تجارب مستقلة (n = 3)، كل منها 3-5 replicates البيولوجية. رسائل مختلفة على الأشرطة تشير إلى اختلافات كبيرة في ف < 0.05 (ANOVA عقب اختبار HSD الوظيفة المخصصة في توكي) بين المجموعات المختلفة في المعاملة. (ب) حالة البقاء على الحياة من الصراصير التي بلعها دستوب عارية أو دستوب ليبوبليكسيس لمدة 8 أيام (8 د) أو 16 يوما (16 د) (كل فوج من الأفراد 12-15؛ n = 3 تجارب مستقلة). القيم ± يعني الحروف ذاتها مختلفة في مجموعة العلاج تشير إلى اختلافات كبيرة في ف < 0.05 (اختبار كروسكال-واليس) لحالة البقاء على الحياة. النتائج مقتبسة من لين وآخرون. (2017) 12- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول يقدم طريقة فعالة [رني] من خلال التسليم الشفوي من دسرنا ليبوبليكسيس، التي تشمل الحماية ضد الهضم ribonuclease في عصير الأمامي للصراصير الألمانية. كما هو مبين في الدراسات الأخرى في مختلف أنواع الحشرات، الأثر [رني] الفقراء من خلال التسليم الشفوي من دسرنا معظمهم ويعزى تدهور دسرنا8،،من910. وينتج هذا البروتوكول الدهنية التي تعمل كمركبات واقية في التسليم الشفوي من دسرنا ضد التدهور في القناة الهضمية. وبالإضافة إلى ذلك، إعداد ليبوبليكسيس دسرنا البساطة وسهولة التطبيق شفوي [رني]، وبخاصة للحشرات مع النشاط ribonuclease قوية في الأمعاء.
بالمقارنة مع غيرها من الدراسات التي تغذي كميات كبيرة نسبيا من دسرنا عارية في الحشرات المختلفة10،،من1819، يستخدم هذا البروتوكول الفم من كمية منخفضة نسبيا من دسرنا (0.5 ميكروغرام في اليوم الواحد)، مما يؤدي كبير استنفاد التعبير الجيني المستهدف في الأمامي من باء-جرمنيك. وتشمل الجوانب الحاسمة للبروتوكول بالتحديد الدقيق لطريقة التغذية وابتلاع كميات صغيرة من دسرنا المتراكمة. أولاً، أسلوب تغذية مناسبة مقايسة ابتلاع مستمر ويقلل من تفاوت كمية دسرنا بلعها كل الحشرات الفردية. ثانيا، تبين أثر استنفاد التعبير الحوض في الأمامي زيادة من 40% في يوم 9 إلى 60% في يوم 17 مع الإدارة عن طريق الفم المستمر من دستوب ليبوبليكسيس (الشكل 3أ). على الرغم من أن سرعة كان المتدهورة دسرنا عارية مع السابقين فيفو الحضانة لعصير الأمامي ضمن ح 1 (الشكل 2ألف)، تغذية مستمرة من دسرنا عارية لمدة 16 يوما أدت أيضا إلى استنفاد التعبير الحوض الكبير في الأمامي (الشكل 3أ). وعلاوة على ذلك، فترة أطول لتغذية مستمرة من ليبوبليكسيس دسرنا لمدة 16 يوما شرطا لتسبب أثرا فتاكة واضح من [رني].
على الرغم من أن استخدام ناقلات الحويصلية (انظر الجدول للمواد) هنا كانت أصلاً في المختبر تعداء من الحمض النووي في خلايا الحشرات، ولم يكن هناك مشكلة تطبيق هذا الكاشف الحويصلية كأداة دسرنا للتسليم الشفوي في نموذجنا الحشرات. العديد من الدراسات أثبتت أيضا بنجاح في تحسين إسكات [رني] في سائر أنواع الحشرات باستخدام الكواشف الحويصلية المختلفة، التي صممت أما من الحمض النووي الريبي أو جزيئات17،،من2021. ومع ذلك، إليه امتصاص دسرنا في القناة الهضمية الحشرات لا بعد تماما ودرست، ونظام التسليم الحويصلية قد يعزز امتصاص دسرنا في الخلايا، ونظرا لما توافق مع الحياة مع هيكل فسفوليبيد22. ولذلك، يمكن تسليم شفوي دسرنا مغلفة في الدهنية استراتيجية مناسبة لتحقيق كفاءة [رني] بسبب التخلف العقلي تدهور رنسيس (الشكل 2).
عيب واحد من هذا البروتوكول قد تكون كمية صغيرة من دسرنا في ناقلات الحويصلية، وهكذا قد تتطلب فترات أطول لتغذية مستمرة. ويرجع تقييد نسبة معينة بين دسرنا إلى الحويصلية (0.25 µg:1 ميليلتر) تصميم الكاشف الحويصلية التجارية، وفقا للاقتراح الخاص بالشركة المصنعة. الصياغات في إعداد الجسيمات النانوية الحويصلية مع قطر أكبر حجماً، ورسوم مختلفة على السطح ليبوبليكسيس، ويقال أن زيادة التغليف siRNA وكفاءة إسكات23،24[رني]. ولذلك، يمكن استخدام الجسيمات النانوية الحويصلية مختلفة أيضا لتحسين إجراءات التغذية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
كان يؤيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من تايوان (وزارة العلوم والتكنولوجيا، وأكثر 100-2923-B-002-002-MY3 و 106-2313-B-002-011-MY3 إلى H.J.L.)، الجمهورية التشيكية (منح جامعة وكالة جنوب بوهيميا، جاجو منح 065/2017/ف Y.H.L)، وإسبانيا ( وزارة الاقتصاد الإسبانية، والقدرة التنافسية، والمنح المقدمة CGL2012 36251 و CGL2015-64727-ف X.B.، و "الحكومة الكاتالونية"، منح 2014 SGR 619 X.B.)؛ أيضا تلقي الدعم المالي من "الصندوق الأوروبي" "التنمية الإقليمية" (FEDER الأموال إلى X.B.) الاقتصادية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent | SignaGen | SL100499 | for lipoplexes preparation |
| Blend Taq plus | TOYOBO | BTQ-201 | for PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | ABI | 4385612 | for qPCR |
| FirstChoice RLM-RACE Kit | Invitrogen | AM1700 | for 3' UTR identification |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AMB13345 | for dsRNA synthesis |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | remove DNA template from dsRNA |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | for dsRNA or total RNA extraction |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | remove DNA template from total RNA |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | for dsRNA or total RNA extraction |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | for dsRNA or total RNA extraction |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 24102 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | for RNase free water preparation |
| glucose solution | Sigma-Aldrich | G3285 | for lipoplexes preparation |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | insect saline buffer formula |
| Potassium chloride, KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | insect saline buffer formula |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | insect saline buffer formula |
| Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | insect saline buffer formula |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | enzyme inhibitor |
| dissecting scissor | F.S.T. | cockroach dissection | |
| fine tweezers | F.S.T. | cockroach dissection | |
| flexible tweezer | F.S.T. | cockroach holding | |
| pipetman | RAININ | P10 | sample preparation |
| microcentrifuge tube | Axygen | MCT175C, PCR02C | sample preparation |
| pipette tip | Axygen | sample preparation | |
| vortexter | Digisystem | vm1000 | sample preparation |
| Minispin centrifuge | The Gruffin Group | GMC 206 | for liquid spin down |
| Centrifuge | ALC | PK121R | sample preparation |
| pH meter | JENCO | 6071 | for pH adjust |
| micro-volume spectrophotometer | Quawell | Q3000 | nucleic acid quantitative |
| PCR Thermal cycler | ABI | 2720 | for template PCR or dsRNA synthesis incubation |
| quantitative real-time PCR | ABI | StepOne plus | gene expression quantitative |
| Centrifugal Vacuum Concentrators | eppendorf | 5301 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Multipette | eppendorf | xstream | for real-time PCR sample loading |
| Agarose I | amresco | 0710 | for nucleic acid electrophoresis |
| tub gene specfifc forward preimer | tri-I biotech | GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA | |
| tub gene specfifc reverse preimer | tri-I biotech | TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA | |
| dsTub template forward primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG | |
| dsTub template reverse primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG | |
| dsEGFP template forward preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG | |
| dsEGFP template reverse preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC | |
| tub qPCR forward primer | tri-I biotech | GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC | |
| tub qPCR reverse preimer | tri-I biotech | CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC | |
| ef1 qPCR forward primer | tri-I biotech | CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A | |
| ef1 qPCRreverse preimer | tri-I biotech | CCT GCA GAG GAA GAC GAA G |
References
- Hammond, S. M. Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).
- Bellés, X. Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).
- Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J. Chapter Five - Biological Mechanisms Determining the Success of RNA Interference in Insects. International Review of Cell and Molecular Biology. Jeon, K. W. 312, Academic Press. 139-167 (2014).
- San Miguel, K., Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest Manag. Sci. 72, 801-809 (2016).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J. Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
- Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: What we know so far. Front. Physiol. 7, (2016).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. J. Insect Physiol. 59, 171-178 (2013).
- Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cDNA encoding extracellular dsRNase and its expression in the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 176-183 (2007).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 1-9 (2016).
- Wynant, N., et al. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect Biochem. Mol. Biol. 46, 1-8 (2014).
- Huang, J. -H., Belles, X., Lee, H. -J. Functional characterization of hypertrehalosemic hormone receptor in relation to hemolymph trehalose and to oxidative stress in the cockroach Blattella germanica. Exp. Endocrinol. 2, 114 (2012).
- Lin, Y. -H., Lee, C. -M., Huang, J. -H., Lee, H. -J. Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica). J. Insect Physiol. 65, 45-50 (2014).
- Lozano, J., Kayukawa, T., Shinoda, T., Belles, X. A role for taiman in insect metamorphosis. PLOS Genet. 10, 1004769 (2014).
- Lozano, J., Montañez, R., Belles, X. MiR-2 family regulates insect metamorphosis by controlling the juvenile hormone signaling pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 3740-3745 (2015).
- Lin, Y. -H., Huang, J. -H., Liu, Y., Belles, X., Lee, H. -J. Oral delivery of dsRNA lipoplexes to German cockroach protects dsRNA from degradation and induces RNAi response. Pest Manag. Sci. 73, 960-966 (2017).
- Gharavi, J., et al. Chiral cationic polyamines for chiral microcapsules and siRNA delivery. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5919-5922 (2013).
- Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 824-832 (2009).
- Luo, Y., et al. Differential responses of migratory locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding. Insect Mol. Biol. 22, 574-583 (2013).
- Liu, J., Smagghe, G., Swevers, L. Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori. J. Insect Physiol. 59, 646-654 (2013).
- Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control. Insects. 8, 4 (2017).
- Taning, C. N. T., et al. Oral RNAi to control Drosophila suzukii: Laboratory testing against larval and adult stages. J. Pest Sci. 89, 803-814 (2016).
- Wu, S. Y., McMillan, N. A. J. Lipidic systems for in vivo siRNA delivery. AAPS J. 11, 639-652 (2009).
- Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5, 498-507 (2013).
- Xia, Y., Tian, J., Chen, X. Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery. Biomaterials. 79, 56-68 (2016).
