Dette manuskriptet viser uttømming av byggkorn under midttarmen og blir av den tysk kakerlakk gjennom muntlig svelging av double-strandet innkapslet i liposomer.
RNA-interferens (RNAi) har vært mye brukt for avdekke biologiske funksjonene til mange gener, og har vært forutsett som en pest kontroll verktøyet drift ved avbrudd av viktige genuttrykk. Selv om ulike metoder, for eksempel injeksjon, fôring og soaking, er rapportert for vellykket levering av double-strandet RNA (dsRNA), er effektiviteten av RNAi gjennom muntlig levering av dsRNA svært variabel blant annet insekt-grupper. Den tyske affinitet Blattella germanicaer svært følsom for injeksjon av dsRNA, som vist av mange studier publisert tidligere. Studien beskriver en metode for å demonstrere at dsRNA innkapslet med liposome bærere er tilstrekkelig for å retard nedbrytning av dsRNA av midttarmen juice. Spesielt kontinuerlig fôring av dsRNA innkapslet av liposomer betydelig reduserer det tubulin uttrykket i midttarmen og blir, og førte til døden av cockroaches. Avslutningsvis kan formulering og utnyttelse av dsRNA lipoplexes, som beskytter dsRNA mot nucleases, være en praktisk bruk av RNAi til insekt skadedyrbekjempelse i fremtiden.
RNAi har vist som en effektiv metode for å pusse genuttrykk gjennom en mekanisme av en post-transcriptional stanse sti utløst av dsRNA molekyler i mange eukaryoter1. Det siste tiåret av studien, har RNAi blitt et nyttig verktøy å studere funksjonene av gener fra utvikling til oppførsel av tappe uttrykk for bestemte gener via injeksjon og/eller fôring av dsRNA i ulike arter av insekter2,3. Spesifisitet og robusthet tappe effekt vurderes anvendelse av RNAi nå som potensielle strategi for pest kontroll management4,5. Men varierer effektiviteten av RNAi mellom insekt arter, avhengig av de ulike genene målrettet og leveringsmetodene. En voksende mengde bevis antyder at ustabilitet i dsRNA, som er nedverdiget ved ribonucleases, er en kritisk faktor i begrenset effekten av RNAi5,6. For eksempel har den lave RNAi følsomheten i Manduca sexta blitt forklart av det faktum at dsRNA blandet med hemolymph var raskt dårligere innen 1 time7. Tilsvarende er tilstedeværelsen av alkalisk nucleases i midttarmen og blir, som effektivt redusere inntatt dsRNA, sterkt korrelert med lav RNAi effektivitet i forskjellige insekt bestillinger8,9,10.
Muntlig levering av dsRNA er spesielt interessant anvendelse av RNAi i en pest kontroll strategi, men en metode for å retard nedbrytning av dsRNA av nucleases i midttarmen og blir ikke ennå har utviklet, som ville ha potensial til å sikre effektiv RNAi gjennom fôring. Imidlertid har fungere bedre av RNAi muntlig levering av dsRNA blitt rapportert av fôring store mengder dsRNA, f.eks 50 µg i Bombyx mori, eller kontinuerlig mating 8 dager (8 µg dsRNA totalt) locust arter. Den tyske affinitet Blattella germinica, er svært følsom for RNAi av injeksjon av dsRNA11,12,13,14, men svarer ikke til dsRNA gjennom fôring. Lin et al. nylig (2017) har vist at dsRNA innkapslet med liposome bærere gir vellykket RNAi til knockdown genuttrykk α-tubulin i midttarmen og utløse betydelig dødeligheten av tysk kakerlakk15. Som nedbrytning av dsRNA i midttarmen og blir den begrensende faktoren for muntlig RNAi, tjene liposome bærere som et redskap for å beskytte dsRNA fra fornedrelse, som er lett tilgjengelig i andre insekter med sterk nuclease aktiviteter i tarmen. Av notatet, grunnen til å velge bestemt hva reagensen (se Tabell for materiale) vi brukte liposome transportør i gjeldende protokollen er at det er testet for insekt cellen linje transfection med mindre toksisitet, ifølge den produsentens instruksjoner. I henhold til sammenligning av ulike liposome transfection systemer i Gharavi et al. (2013) 16, effektiviteten av transfecting lite forstyrrende RNA (siRNA) er omtrent det samme mellom denne og andre tilgjengelige systemer som har vært brukt i dsRNA leveringssystemer i andre insekter17,18 . Videre er våre fôring metoden forsiktig nok til å sikre riktig mengde dsRNA blir svelget av hver kakerlakk, og at resultatene er robust og bekreftet. Oppsummert viser stede protokollen og resultatene at bruker dsRNA lipoplexes forbedrer dsRNA stabilitet og åpner døren til design av strategi muntlig levering av RNAi, som er en lovende tilnærming til skadedyrbekjempelse i fremtiden.
This protocol presents a method for effective RNAi through oral delivery of dsRNA lipoplexes, involving protection against ribonuclease digestion in the midgut juice of the German cockroach. Som vist i andre studier i ulike insekt arter, er dårlig RNAi effekten gjennom muntlig levering av dsRNA hovedsakelig regnskapsføres etter nedbrytning av dsRNA8,9,10. Denne protokollen gir liposomer tjene som beskyttende biler i muntlig le…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av tilskudd fra Taiwan (departementet for vitenskap og teknologi, mest 100-2923-B-002-002-MY3 og 106-2313-B-002-011-MY3 til H.J.L.), den tsjekkiske republikk (gi byrå av Sør-Böhmen University, GAJU gi 065 2017 inngående Y.H.L), og Spania ( Spanske departementet for økonomi og konkurranseevne, gir CGL2012-36251 og CGL2015-64727-P til X.B., og den katalanske regjeringen, gi 2014 SGR 619 til X.B.); Det har også mottatt økonomisk støtte fra europeiske fondet for økonomiske og regionaldepartementet (ble tildelt und midler til X.B.).
GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent | SignaGen | SL100499 | for lipoplexes preparation |
Blend Taq plus | TOYOBO | BTQ-201 | for PCR |
Fast SYBR Green Master Mix | ABI | 4385612 | for qPCR |
FirstChoice RLM-RACE Kit | Invitrogen | AM1700 | for 3' UTR identification |
MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AMB13345 | for dsRNA synthesis |
TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | remove DNA template from dsRNA |
TRIzol | Invitrogen | 15596018 | for dsRNA or total RNA extraction |
RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | remove DNA template from total RNA |
chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | for dsRNA or total RNA extraction |
2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | for dsRNA or total RNA extraction |
ethanol | Sigma-Aldrich | 24102 | for dsRNA or total RNA extraction |
Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | for RNase free water preparation |
glucose solution | Sigma-Aldrich | G3285 | for lipoplexes preparation |
Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | insect saline buffer formula |
Potassium chloride, KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | insect saline buffer formula |
Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | insect saline buffer formula |
Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | insect saline buffer formula |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | enzyme inhibitor |
dissecting scissor | F.S.T. | cockroach dissection | |
fine tweezers | F.S.T. | cockroach dissection | |
flexible tweezer | F.S.T. | cockroach holding | |
pipetman | RAININ | P10 | sample preparation |
microcentrifuge tube | Axygen | MCT175C, PCR02C | sample preparation |
pipette tip | Axygen | sample preparation | |
vortexter | Digisystem | vm1000 | sample preparation |
Minispin centrifuge | The Gruffin Group | GMC 206 | for liquid spin down |
Centrifuge | ALC | PK121R | sample preparation |
pH meter | JENCO | 6071 | for pH adjust |
micro-volume spectrophotometer | Quawell | Q3000 | nucleic acid quantitative |
PCR Thermal cycler | ABI | 2720 | for template PCR or dsRNA synthesis incubation |
quantitative real-time PCR | ABI | StepOne plus | gene expression quantitative |
Centrifugal Vacuum Concentrators | eppendorf | 5301 | for dsRNA or total RNA extraction |
Multipette | eppendorf | xstream | for real-time PCR sample loading |
Agarose I | amresco | 0710 | for nucleic acid electrophoresis |
tub gene specfifc forward preimer | tri-I biotech | GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA | |
tub gene specfifc reverse preimer | tri-I biotech | TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA | |
dsTub template forward primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG | |
dsTub template reverse primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG | |
dsEGFP template forward preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG | |
dsEGFP template reverse preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC | |
tub qPCR forward primer | tri-I biotech | GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC | |
tub qPCR reverse preimer | tri-I biotech | CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC | |
ef1 qPCR forward primer | tri-I biotech | CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A | |
ef1 qPCRreverse preimer | tri-I biotech | CCT GCA GAG GAA GAC GAA G |