Summary
이 원고는의 리에 이중 가닥 RNA의 구강 섭취를 통해 독일 바퀴벌레는 midgut에 유전자 발현의 고갈 보여 줍니다.
Abstract
RNA 간섭 (RNAi) 수많은 유전자의 생물 학적 기능을 잠복 근무에 대 한 광범위 하 게 적용 하 고 필수 유전자 발현의 중단에 의해 해충 제어 도구 운영으로 envisaged 되었습니다. 다른 메서드를 주입, 먹이, 및 몸을 담글, 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 배달에 대 한 보고 되었습니다, 비록 구두 전달의 dsRNA 통해 RNAi의 효율은 매우 다른 곤충 집단 변수. 이전에 게시 하는 많은 연구에 의해 표시 된 독일 바퀴벌레, Blattella germanica, dsRNA 주입에 매우 민감한입니다. 현재 연구는 dsRNA liposome 사업자와 캡슐화 midgut 주스 dsRNA의 저하를 지체 시키는 충분 한지 설명 하는 방법을 설명 합니다. 특히, dsRNA 리 크게 캡슐화의 지속적인 먹이 midgut tubulin 식 감소 하 고 바퀴벌레의 죽음에 지도. 결론적으로, 수립 및 활용 dsRNA nucleases에 대 한 보호, dsRNA lipoplexes 수 곤충 해충에 대 한 RNAi의 실제적인 사용을 미래에 있습니다.
Introduction
RNAi 많은 진핵생물1dsRNA 분자에 의해 트리거되는 post-transcriptional 입을 통로의 메커니즘을 통해 최저의 유전자 발현을 효과적인 방법으로 입증 되었습니다. 연구의 지난 10 년간, RNAi 주사를 통해 특정 유전자의 표현이 없애고 또는 곤충2,3의 다양 한 taxa에 dsRNA의 먹이로 동작을 개발에서 유전자의 기능 연구를 유용한 도구가 되고있다. 특이성 및 고갈 시키는 효과의 견고성, RNAi의 응용 프로그램은 현재 해충 제어 관리4,5에 대 한 잠재적인 전략으로 간주 되고있다. 그러나, RNAi의 효율 대상 다른 유전자 전달 방법에 따라 곤충 종 사이 널리 다릅니다. 증거의 성장 몸은 ribonucleases에 의해 타락은 dsRNA의 불안정 RNAi5,6의 제한 된 효능에 중요 한 요소는 나왔다. 예를 들어, Manduca sexta 에 낮은 RNAi 감도 사실 hemolymph 섞인 dsRNA 신속 하 게 저하 1 시간7에 의해 설명 되어 있다. 유사 하 게, 효율적으로 섭취 dsRNA 저하, midgut에서 알칼리 nucleases의 존재 다른 곤충 순서8,,910낮은 RNAi 효율성과 강하게 상관 된다.
DsRNA의 구두 전달 특히 해충 제어 전략에 RNAi의 응용 프로그램에 대 한 흥미 롭 지만 midgut에 nucleases에 의해 dsRNA의 저하를 지체 하는 방법을 하지 아직 개발 되었습니다, 어떤 효과적인 보장을 했합니다 먹이 통해 RNAi입니다. 그러나, 구두 전달의 dsRNA에 RNAi의 응답 다량 dsRNA, 누에나방에 예를 들어 50 µ g의 먹이 또는 지속적으로 8 일 (총에서 8 µ g dsRNA) 메뚜기 종에서 먹이 보고 되었습니다. 독일 바퀴벌레, Blattella germinica, dsRNA11,12,,1314의 주입에 의해 RNAi에 매우 민감 하지만 먹이 통해 dsRNA에 응답 하지 않습니다. 최근, 린 외. 그는 dsRNA liposome 사업자 결과 최저에 성공적인 RNAi에 α-tubulin 유전자 발현에에서 캡슐화 독일 바퀴벌레15midgut 및 트리거 상당한 사망률 (2017) 증명. DsRNA는 midgut에의 저하는 구두 RNAi에 대 한 제한 요소, liposome 사업자 저하, 쉽게 다른 곤충에 적용 가능한 용기에 강한 nuclease 활동에서 dsRNA를 보호 하기 위해 차량으로 서브. 메모, 특정 transfection 시 약을 선택 하기 위한 이유의 현재 프로토콜에서 liposome 캐리어는 그것 테스트 되었습니다 곤충 세포 선 transfection에 대 한 더 적은 독성으로 사용 ( 재료의 표참조)에 따라에 제조 업체의 지침입니다. Gharavi 외 에 다른 liposome transfection 시스템의 비교에 따르면 (2013) 16, transfecting 작은 간섭 RNA (siRNA)의 효율은 약이 고 다른 곤충17,18 dsRNA 전달 시스템에 사용 된 다른 상용 시스템 사이의 동일 . 또한, 우리의 먹이 방법은 충분히 신중 하 게 각 바퀴벌레에 의해 dsRNA의 적절 한 양을 섭취 하 고 결과 강력 하 고 확인 합니다. 요약 하자면, 현재 프로토콜 및 결과 dsRNA 안정성 향상 dsRNA lipoplexes를 사용 하 여 하는 해충에 대 한 유망한 접근 미래에 RNAi의 전략 구두 납품의 디자인에 문을 열어 보여줍니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 합성 및 dsRNA의 준비
- 대상 유전자의 3' 되지 않은 지역에 dsRNA 대상 사이트를 식별 합니다. Α-tubulin (욕조) 유전자를 대상으로 사용 되는 dsTub (은행 승인 번호: KX228233), 그리고 dsEGFP의 순서에서 부정적인 dsRNA 제어 설계 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP; 은행 승인 번호: LC311024).
- T7 발기인 순서를 포함 하는 유전자 특정 뇌관으로 dsRNA 템플릿 합성 표준 PCR 증폭을 수행 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). 린 외PCR 증폭 조건 및 사용 되는 뇌관 정보 그 보고 있습니다. (2017) 12 ( 재료의 표참조).
- DsRNA 준비 T7 전사를 사용 하 여 계속 키트 ( 재료의 표참조), 제조업체의 지침에 따라.
참고: 높은 수량 dsRNA를, (총 40 µ L)에서 1 개의 관에 2 개의 반응을 혼합 하 고 37 ° C에서 밤새 품 어. - 2 µ L DNase의 추가 ( 재료의 표참조) 다이제스트 DNA 템플릿에 37 ° C에서 15 분 동안 dsRNA 샘플으로.
- 추가 200 µ L 추출 시 약 ( 재료의 표참조) 40 µ L 클로 프롬, 그리고 소용돌이.
- 4 ° C에서 13000 x g에서 10 분 동안 centrifuge 다음 새로운 microcentrifuge 튜브에 상쾌한 (150 µ L)를 수집 합니다.
- 150 µ L 소 프로 파 놀을 추가 하 고 얼음에 15 분 동안 잠복기 여 dsRNA를 침전.
- 4 ° C에서 13000 x g에서 15 분 동안 centrifuge 다음 상쾌한을 제거 합니다.
- DsRNA 펠 릿을 세척을 70% 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 13000 x g에서 10 분 원심 분리기
- 에탄올을 제거 하 고 에탄올 세척 단계를 반복 합니다.
- 에탄올과 3 분 동안 원심 진공 집중 하 여 펠 렛 건조 dsRNA 다음 RNase 무료 물 dsRNA를 resuspend.
- 마이크로 볼륨 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 순화 dsRNA의 수량을 결정 ( 재료의 표참조) 제조업체의 지침에 따라 고 원하는 농도 (예를 들면,의 준비를 위해 µ 0.25 µ g/L dsRNA lipoplexes)입니다.
- 최대 3 개월 동안-20 ° C에서 dsRNA 샘플을 저장 합니다.
2입니다. dsRNA Lipoplexes의 준비
- Transfection 시 약의 4 µ L를 희석 ( 재료의 표참조) 5% 포도 당 솔루션의 4 µ L을 추가 하 여. 5% 포도 당 솔루션의 4 µ L을 추가 하 여 (1 µ g) dsRNA의 4 µ L를 희석.
- 추가 희석된 liposome 시 약 해결책 즉시 희석된 dsRNA 솔루션으로 한 번에. 짧게 그들을 혼합 하 25 ° c.에 15 분 동안 품 어 소용돌이
참고: 역순으로 솔루션을 혼합 하지 마십시오. - DsRNA lipoplexes 사용 하기 위해 준비가 되었습니다. 준비, 1 시간 이내 사용 하 고 1 시간 후 삭제.
참고: 제조업체의 지침에 따라 lipoplexes는 가능한 빨리 사용 되어야 한다.
3. Hemolymph Midgut 주스에서 세포 외 효소의 수집
-
곤충 염 분 버퍼 (10 x 주식)
- 두 배 증류수 109.3 g NaCl, KCl 15.7 g, 6.3 g CaCl2와 8.3 g MgCl2·6H2o. 900 mL를 혼합
- PH 6.8를 조정 하 고 최대 1000 mL를 채우기.
-
Hemolymph 컬렉션
- 그들은 3 분 동안 이동 하지 않습니다 때까지 얼음에 바퀴벌레를 anesthetize.
- 바퀴벌레 (엄지와 검지 손가락), 두 손가락으로 누른 바퀴벌레의 복 부 측을 올려.
- 해가 위를 사용 하 여 뒷 다리의 고관절의 끝을 잘라.
참고: 고관절 및 trochanter 사이의 연결된 교차로 잘라. 고관절의 다른 부분의 절단 hemolymph를 수집 하는 비효율적 이었다. - 부드럽게 가운데 손가락으로 복 부를 짜 내 고 10 µ L micropipette 절 개에서 출혈 하는 hemolymph를 수집 합니다.
- Microcentrifuge 튜브에 여러 바퀴벌레 (5 개인)에서 hemolymph를 풀.
참고: Microcentrifuge 튜브 melanization를 방지 하기 위해 얼음에 계속. 남성 바퀴벌레에서 얻은 hemolymph의 평균 볼륨 2-3 µ L 이다. - 10 대 벤치탑 분리기와 짧게는 hemolymph 아래로 회전 s.
- 원하는 볼륨 (즉, 10 µ L), hemolymph의 전송 및 1 x 곤충 염 분 버퍼의 50 µ L을 혼합.
- Hemocytes 아래로 회전 하 4 ° C에서 1000 x g에서 10 분 원심 분리기. 깨끗 한 microcentrifuge 튜브는 상쾌한 전송.
- A28015를 측정 하 여 마이크로 볼륨 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 총 단백질 농도 계량.
- 동일한 단백질 농도 (6 mg / µ L의 총 단백질)을 각 샘플을 조정 합니다.
-
Midgut 주스 컬렉션
- 얼음에 바퀴벌레 anesthetize 바퀴벌레 복 부 측을 수정 해 부 접시에 찬 1 x 곤충 염 분 버퍼 곤충 핀을 사용 하 여 합니다.
- 고급 핀셋으로 복 부를 해 부. 전체 소화 관 (앞, 중간, 그리고 뒷 창 자 포함) 곤충 염 분 버퍼 x 1 신선한 요리를 제거 합니다.
- 전면 및 뒷 창 자 제거 하 고 신속 하 게 100 µ L 곤충 염 분 버퍼를 포함 하는 microcentrifuge 튜브는 midgut 전송.
- 수영장 6 바퀴벌레 같은 튜브 및 10에 대 한 소용돌이에서 midguts s.
- Hemocytes 및 창 자 조직 회전 하 4 ° C에서 1000 x g에서 10 분 원심 분리기. 깨끗 한 microcentrifuge 튜브는 상쾌한 전송.
- A28015를 측정 하 여 마이크로 볼륨 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 총 단백질 농도 계량.
- 동일한 단백질 농도 (6 mg / µ L의 총 단백질)을 각 샘플을 조정 합니다.
4입니다. dsRNA 저하 분석 결과
- 갓 벗은 dsRNA의 dsRNA lipoplexes (1 µ g) 4 µ L를 준비 합니다.
- 믹스 hemolymph, 또는 midgut dsRNA 솔루션 곤충 염 분 버퍼 (제어)의 10 µ L 추출 효소 주스.
- EGTA (20mm) 또는 RNase 무료 물 효소 활동의 저해에 대 한 컨트롤 샘플을 2 µ L를 추가 합니다.
- 1 시간 또는 더 많은 (6, 12, 또는 24 시간) 25 ° c.에 품 어
- 200 µ L 추출 시 약 및 40 µ L 클로 프롬, 소용돌이 다음을 추가 합니다.
- 4 ° C에서 13000 x g에서 10 분 동안 centrifuge 다음 새로운 microcentrifuge 튜브에 상쾌한 (150 µ L)를 수집 합니다.
- 150 µ L 소 프로 파 놀을 추가 하 고 얼음에 15 분 동안 잠복기 여 dsRNA를 침전.
- 4 ° C에서 13000 x g에서 15 분 동안 centrifuge 다음 상쾌한을 제거 합니다.
- DsRNA 펠 릿을 세척을 70% 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 13000 x g에서 10 분 원심 분리기
- 에탄올을 제거 하 고 에탄올 세척 단계를 반복 합니다.
- 에탄올과 10 µ L RNase 무료 물으로 3 분 Resuspend dsRNA에 대 한 원심 진공 집중 하 여 펠 렛 건조 dsRNA 제거 합니다.
- 1.5 %agarose 젤에 젤 전기 이동 법을 통해 치료 dsRNA의 무결성을 확인 하십시오.
5. 구강 관리 dsRNA의
- 건조 식품 (차 개)의 광고 libitum 다이어트 바퀴벌레를 유지 합니다. 바퀴벌레에서 물 공급을 하루 dsRNA 섭취 실험 전에 박탈.
- 유연한 집게 (그림 1, 5 단계)와 함께 그것의 날개를 잡아 하 여 바퀴벌레를 잡아.
참고: 바퀴벌레의 신체 부위를 잡아 하지 마십시오. - 준비는 dsRNA lipoplexes, 뿐만 아니라 벌 거 벗은 dsRNA, 먹이, 단원 2에서에서 설명한 대로.
참고: DsRNA lipoplexes 먹이 기 전에 갓 준비 되어야 한다. - DsRNA lipoplexes 또는 벌 거 벗은 dsRNA의 4 µ L를 피드 (250 ng)는 micropipette와.
- 천천히 피펫으로 dsRNA 솔루션의 방울, 바퀴벌레의 mouthparts에 가까운 고 바퀴벌레는 물방울을 완전히 섭취.
- 8 일 또는 16 일 지속적으로 섭취 실험을 하루에 두 번 (1 시간 후에 빛 고을 조명 하기 전에 1 시간)을 수행 합니다.
참고: 모든 바퀴벌레는 물만 섭취 실험 동안 dsRNA 해결책 또는 제어 시 약 (예를 들어, nuclease 무료 물, 포도 당 솔루션 및 liposome 시 약)와 수동 먹이 통해 인수. - DsRNA 실험의 섭취의 16 일 후 바퀴벌레에 물병을 제공 합니다.
6. 최저 평가
- 선택한 시간에 포인트 (2, 9, 17 일 dsRNA 섭취 분석 결과 후), dsEGFP 및 dsTub 처리 곤충을 수집 하 고 (예를 들어, midgut) 선택한 조직 해 부.
- 실시간 양이 많은 PCR (qRT-PCR)을 수행 합니다. QRT-PCR 증폭 조건 및 뇌관 정보 린 외에서 보고. (2017) 12.
- 평가 dsRNA 치료 곤충 매일 사망률을 확인 하 고는 더 이상 바퀴벌레를 제거 하 고 제어 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DsRNA의 구두 전달 프로토콜의 단순화 된 구조는 그림 1, dsRNA lipoplexes의 준비에 대 한 주요 단계 표시 됩니다에 표시 됩니다.
B. germanica, 비보 전 분석 결과 dsTub lipoplexes midgut 주스 incubated 했다 실시 됐다는 dsRNA의 무결성의 midgut 주스에서 dsRNA 저하 시 liposome 사업자에 의해 주어진 보호를 조사 하기 위하여 이후에 1.5 %agarose 젤에 분석 했다. 그림 2 는 반면 liposome 사업자 비보 전 에서 1 시간 이상 저하에 대 한 dsRNA를 보호 하기 위해 수 있었다 강한 RNA nuclease 활동 midgut 주스의 B. germanica (그림 2A)에 존재 했다 부 화 (그림 2A, B). 그 결과, dsRNA lipoplexes의 구강 섭취 다음 실험에 RNAi midgut 조직의 민감도 증가 하루에 두 번 적용 했다.
DsRNA의 구두 배달을 통해 RNAi 응답의 유효성 검사는 dsRNA (그림 3A)의 지속적인 섭취 후에 다른 시간 지점에서 midgut 욕조 mRNA 식의 소모 효과 측정 하 여 평가 되었다. Midgut는 욕조 식 했다 8 일 동안 dsTub lipoplexes의 지속적인 섭취 후 크게 고갈 된다. DsRNA의 지속적인 먹이 16 일 지속, 하는 동안은 midgut에 욕조 식 했다 크게 고갈 알몸 dsTub 및 dsTub lipoplexes 그룹 (약 24로 60%, 각각) 컨트롤 달리. 그림 3 B 16 일 dsTub lipoplexes의 구강 관리 후 사망률의 일관성, 상당한 증가 보여줍니다.
그림 1 : 바퀴벌레에 대 한 dsRNA lipoplexes의 구두 전달의 단순화 된 구조. DsRNA lipoplexes의 준비를 위한 중요 한 단계는 1 단계 4에 대 한 표시 됩니다. 먹이 기법 (5 단계)는 사진에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 비보 전 여 dsRNA의 B. germanica hemolymph (Hemo) 또는 midgut 주스. (A) 1 벌 거 벗은 또는 liposome cojugated dsTub의 µ g 1 h 염 분 버퍼 및 hemolymph (hemo) 또는 midgut 주스에서 추출 된 효소에 대 한 각각 incubated 했다. 벌 거 벗은 dsTub, 하지만 하지 liposome 활용 된 dsTub은 저하 완전히 midgut 주스 x 1 알을 품을 때. 원래 midgut 주스 (1 x)의 다른 희석 요인 표시 됩니다. 저하는 이온 킬레이트 컨트롤로 EGTA 처리 때문에 의해 저해 되었다. (B) 시간에 따른 보호 liposome 캡슐화 (1 µ g) dsTub 저하 ex vivo hemolymph 또는 midgut 주스에 대 한의. 노트, liposome 활용 된 dsTub는 저하 완전히 24 시간 후 midgut 주스와 함께 알을 품을 때. Hemolymph midgut 주스 외피의 다른 기간에 대 한 원래 농도에서 사용 되었다. 결과 린 외에서 적응. (2017) 12. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : B. germanica에 RNAi 응답 dsRNA의 섭취에 의해의 효과. (A) 양적 실시간 PCR (qRT-PCR) 상대 욕조 식은 midgut 독일 바퀴벌레의 다른 먹이 치료 후 결정. 다른 트리 트 먼 트 식 레벨 주 2에서 포도 당 그룹에 정상화 했다. 값은 3 개의 독립적인 실험에서 평균 ± SE (n = 3), 각각 3-5 생물 복제. 막대에 다른 편지 p 에 큰 차이가 표시 < 0.05 (ANOVA Tukey의 HSD 게시물 특별 테스트에 따라) 다른 치료 그룹 중. 벌 거 벗은 dsTub 또는 dsTub lipoplexes 또는 16 일 (16 d) 8 일 (8 일) 동안 섭취 하는 바퀴벌레의 (B) Survivorship (12 월 15 일 개인의 각 코 호트; n = 3 독립적인 실험). 값은 평균 ± SE 다른 치료 그룹에 편지 p 에 큰 차이가 표시 < 고 survivorship 0.05 (Kruskal-월리스 테스트). 결과 린 외에서 적응. (2017) 12. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜은 독일 바퀴벌레의 midgut 주스에서 ribonuclease 소화에 대 한 보호를 포함 하는 dsRNA lipoplexes의 구두 배달을 통해 효과적인 RNAi에는 메서드를 제공 합니다. 다양 한 곤충 종에 다른 연구에서와 같이, 구두 전달의 dsRNA 통해 가난한 RNAi 효과 대부분 차지 dsRNA8,,910의 저하에 의해. 이 프로토콜은 구두 전달의 dsRNA에에서 저하에 대 한 보호 차량으로 봉사 하는 리를 생성 합니다. 또한, dsRNA lipoplexes의 준비는 간단 하 고 쉽게 구강 RNAi로 적용 특히 곤충에에서 강한 ribonuclease 활동에 대 한.
다른 곤충10,,1819에 상대적으로 많은 양의 알몸 dsRNA 피드 다른 연구에 비해,이 프로토콜 사용 하면 dsRNA (하루 0.5 µ g), 상대적으로 낮은 금액의 구강 관리는 B. germanica의 midgut에 대상 유전자 발현의 상당한 고갈. 프로토콜의 중요 한 측면에는 정확한 수 유 방법 및 적은 양의 dsRNA의 축적 된 섭취 포함 됩니다. 첫째, 먹이 기술은 지속적인 섭취 분석 결과 적합 하 고 개별 곤충 당 섭취 dsRNA 수량 변화를 최소화 합니다. 둘째, 욕조 는 midgut 식의 고갈 효과 하루 17 dsTub lipoplexes (그림 3A)의 지속적인 구강 관리에 하루 9 ~ 60%에서 40%에서 증가를 표시 했다. 16 일에 대 한 벌 거 벗은 dsRNA의 지속적인 젖 통 식의 중요 한 소모 또한 결과 알몸 dsRNA midgut 주스 1 h그림 2(A) 내에서 부 화 ex vivo와 급속 하 게 타락 했다, 비록 midgut(그림 3)에서. 또한, 16 일에 대 한 dsRNA lipoplexes의 지속적인 먹이의 더 긴 기간 RNAi에 의해 눈에 띄는 치명적인 효과 일으킬 수 있는 요건 이다.
Liposome 사업자 ( 재료의 표참조)을 사용 하지만 여기 원래 생체 외에서 transfection DNA의 곤충 세포에 대 한, 아무 문제가 우리의 곤충 모델에서 구두 전달의 dsRNA 차량으로이 liposome 시 약을 적용 했다. 많은 연구 결과 또한 성공적으로 RNAi는 DNA 또는 RNA 분자17,,2021를 위한 다른 liposome 약을 사용 하 여 다른 곤충 종에서 입을의 개선을 설명 했다. 그럼에도 불구 하 고, 곤충에 dsRNA 통풍 관의 메커니즘은 아직 공부 하지 않은 완전히, 그리고 liposome 배달 시스템 셀, 인지질 구조22의 생체 적합성 때문에 dsRNA의 통풍 관을 강화 수 있습니다. 따라서, dsRNA는 리에의 구두 전달 RNases (그림 2)에 의해 저하의 지체 때문에 효율적인 RNAi를 달성 하기 위해 적절 한 전략을 수 있습니다.
이 프로토콜의 1 개의 불리 liposome 캐리어에서 dsRNA의 작은 금액을 될 수 있으며 따라서 지속적인 먹이의 긴 기간을 요구할 수 있습니다. Liposome (0.25 µg:1 µ L)를 dsRNA 사이 같은 특정 비율의 제한은 제조 업체의 제안에 따라 상업 liposome 시 약의 디자인입니다. 더 큰 직경 크기, 나노 입자 liposome의 준비에서 공식 및 lipoplexes 표면에 다른 충전 siRNA와 RNAi 입을 효율23,24의 캡슐화를 증가 보고 있다. 따라서, 다른 liposome 나노 입자 또한 먹이 절차를 개선 하기 위해 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 대만 (사역의 과학 및 기술, 가장 100-2923-B-002-002-MY3 하 고 H.J.L.를 106-2313-B-002-011-MY3)에서 교부 금에 의해 지원 되었다 체코 공화국 (부여 기관 남쪽 보 헤 미아 대학 GAJU 부여 065/2017/P Y.H.L), 및 스페인 ( 스페인 경제와 경쟁력, CGL2012-36251 및 CGL2015-64727-P X.B., 그리고 카탈루냐어 정부에 부여 부여 2014 SGR 619 X.B.); 그것은 또한 경제 및 지역 개발 (X.B. 페더 자금)에 대 한 유럽 기금에서의 재정 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent | SignaGen | SL100499 | for lipoplexes preparation |
| Blend Taq plus | TOYOBO | BTQ-201 | for PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | ABI | 4385612 | for qPCR |
| FirstChoice RLM-RACE Kit | Invitrogen | AM1700 | for 3' UTR identification |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AMB13345 | for dsRNA synthesis |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | remove DNA template from dsRNA |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | for dsRNA or total RNA extraction |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | remove DNA template from total RNA |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | for dsRNA or total RNA extraction |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | for dsRNA or total RNA extraction |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 24102 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | for RNase free water preparation |
| glucose solution | Sigma-Aldrich | G3285 | for lipoplexes preparation |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | insect saline buffer formula |
| Potassium chloride, KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | insect saline buffer formula |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | insect saline buffer formula |
| Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | insect saline buffer formula |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | enzyme inhibitor |
| dissecting scissor | F.S.T. | cockroach dissection | |
| fine tweezers | F.S.T. | cockroach dissection | |
| flexible tweezer | F.S.T. | cockroach holding | |
| pipetman | RAININ | P10 | sample preparation |
| microcentrifuge tube | Axygen | MCT175C, PCR02C | sample preparation |
| pipette tip | Axygen | sample preparation | |
| vortexter | Digisystem | vm1000 | sample preparation |
| Minispin centrifuge | The Gruffin Group | GMC 206 | for liquid spin down |
| Centrifuge | ALC | PK121R | sample preparation |
| pH meter | JENCO | 6071 | for pH adjust |
| micro-volume spectrophotometer | Quawell | Q3000 | nucleic acid quantitative |
| PCR Thermal cycler | ABI | 2720 | for template PCR or dsRNA synthesis incubation |
| quantitative real-time PCR | ABI | StepOne plus | gene expression quantitative |
| Centrifugal Vacuum Concentrators | eppendorf | 5301 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Multipette | eppendorf | xstream | for real-time PCR sample loading |
| Agarose I | amresco | 0710 | for nucleic acid electrophoresis |
| tub gene specfifc forward preimer | tri-I biotech | GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA | |
| tub gene specfifc reverse preimer | tri-I biotech | TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA | |
| dsTub template forward primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG | |
| dsTub template reverse primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG | |
| dsEGFP template forward preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG | |
| dsEGFP template reverse preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC | |
| tub qPCR forward primer | tri-I biotech | GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC | |
| tub qPCR reverse preimer | tri-I biotech | CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC | |
| ef1 qPCR forward primer | tri-I biotech | CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A | |
| ef1 qPCRreverse preimer | tri-I biotech | CCT GCA GAG GAA GAC GAA G |
References
- Hammond, S. M. Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).
- Bellés, X. Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).
- Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J. Chapter Five - Biological Mechanisms Determining the Success of RNA Interference in Insects. International Review of Cell and Molecular Biology. Jeon, K. W. 312, Academic Press. 139-167 (2014).
- San Miguel, K., Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest Manag. Sci. 72, 801-809 (2016).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J. Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
- Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: What we know so far. Front. Physiol. 7, (2016).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. J. Insect Physiol. 59, 171-178 (2013).
- Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cDNA encoding extracellular dsRNase and its expression in the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 176-183 (2007).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 1-9 (2016).
- Wynant, N., et al. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect Biochem. Mol. Biol. 46, 1-8 (2014).
- Huang, J. -H., Belles, X., Lee, H. -J. Functional characterization of hypertrehalosemic hormone receptor in relation to hemolymph trehalose and to oxidative stress in the cockroach Blattella germanica. Exp. Endocrinol. 2, 114 (2012).
- Lin, Y. -H., Lee, C. -M., Huang, J. -H., Lee, H. -J. Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica). J. Insect Physiol. 65, 45-50 (2014).
- Lozano, J., Kayukawa, T., Shinoda, T., Belles, X. A role for taiman in insect metamorphosis. PLOS Genet. 10, 1004769 (2014).
- Lozano, J., Montañez, R., Belles, X. MiR-2 family regulates insect metamorphosis by controlling the juvenile hormone signaling pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 3740-3745 (2015).
- Lin, Y. -H., Huang, J. -H., Liu, Y., Belles, X., Lee, H. -J. Oral delivery of dsRNA lipoplexes to German cockroach protects dsRNA from degradation and induces RNAi response. Pest Manag. Sci. 73, 960-966 (2017).
- Gharavi, J., et al. Chiral cationic polyamines for chiral microcapsules and siRNA delivery. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5919-5922 (2013).
- Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 824-832 (2009).
- Luo, Y., et al. Differential responses of migratory locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding. Insect Mol. Biol. 22, 574-583 (2013).
- Liu, J., Smagghe, G., Swevers, L. Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori. J. Insect Physiol. 59, 646-654 (2013).
- Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control. Insects. 8, 4 (2017).
- Taning, C. N. T., et al. Oral RNAi to control Drosophila suzukii: Laboratory testing against larval and adult stages. J. Pest Sci. 89, 803-814 (2016).
- Wu, S. Y., McMillan, N. A. J. Lipidic systems for in vivo siRNA delivery. AAPS J. 11, 639-652 (2009).
- Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5, 498-507 (2013).
- Xia, Y., Tian, J., Chen, X. Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery. Biomaterials. 79, 56-68 (2016).
