Summary
Bu el yazması Almanca hamamböceği lipozomlar içinde kapsüllü çift iplikçikli RNA'ın sözlü sindirim yoluyla gen ifadesinin içinde midgut tükenmesi gösterir.
Abstract
RNA müdahale (RNAi) biyolojik fonksiyonları çok sayıda gen açığa çıkarmak için yaygın olarak uygulanan ve bir haşere kontrol aracı temel gen ekspresyonu bozulma tarafından işletim olarak öngörülen. Besleme ve iliklerine kadar enjeksiyon gibi farklı yöntemler çift iplikçikli RNA (dsRNA) başarılı teslimi için bildirilmiş olan, RNAi verimliliği oral dsRNA teslimini aracılığıyla farklı böcek grupları arasında son derece değişken olsa da. Alman Hamam böceği, Blattella germanica, birçok çalışma daha önce Yayınlanan tarafından gösterildiği gibi dsRNA, enjeksiyon için son derece hassas olur. Bu da çalışmanın lipozom gemileri ile kapsüllü dsRNA dsRNA bozulma midgut suyu tarafından geri zekalı için yeterli olduğunu ispat yöntemi açıklanır. Özellikle önemli ölçüde lipozomlar tarafından kapsüllü dsRNA sürekli besleme midgut tübülin ifadede azaltır ve hamamböceği ölümüne yol açtı. Sonuç olarak, formülasyonu ve dsRNA enzimler karşı korumak, dsRNA lipoplexes kullanımı pratik kullanımı RNAi Böcek ilaçlama için gelecekte olabilir.
Introduction
RNAi döngüsünün birçok Ökaryotlar1dsRNA moleküller tarafından tetiklenen bir çoğu silencing bir mekanizma aracılığıyla devirme gen ekspresyonu için etkili bir yöntem olarak kanıtlanmıştır. Çalışmanın son on yıldır, RNAi enjeksiyon yoluyla belirli genlerin ifade tüketen ve/veya çeşitli takson böcekler2,3dsRNA, besleme için davranış geliştirme genlerin fonksiyonları eğitim için yararlı bir araç haline gelmiştir. Özgüllük ve sağlamlık tüketen etkisi nedeniyle, uygulama, RNAi şu anda haşere kontrol yönetimi4,5için potansiyel bir strateji olarak kabul ediliyor. Ancak, RNAi verimliliğini yaygın hedef farklı genler ve teslim yöntemleri bağlı olarak böcek türler arasında değişir. Kanıt büyüyen bir vücut dsRNA, ribonükleaz tarafından bozulmuş, istikrarsızlık RNAi5,6sınırlı etkinliği kritik bir faktör olduğunu göstermektedir. Örneğin, Manduca sexta düşük RNAi duyarlılık hemolymph ile karışık dsRNA 1 saat7içinde hızlı bir şekilde bozulmuş gerçeği açıkladı. Benzer şekilde, verimli bir şekilde alınan dsRNA düşürebilir, alkalin enzimler içinde midgut varlığı kuvvetle farklı böcek sipariş8,9,10düşük RNAi verimlilik ile ilişkilidir.
DsRNA oral teslimat RNAi uygulamada bir haşere kontrol stratejisi için özellikle ilginç, ancak midgut enzimler tarafından dsRNA bozulma geri zekalı bir yöntem henüz, hangi etkili sağlamak için potansiyel var geliştirilmiştir değil RNAi besleme yoluyla. Ancak, RNAi yanıt alamama durumu dsRNA oral teslimat için dsRNA, örneğin 50 µg Bombiks moriiçinde büyük miktarda besleme veya 8 gün (Toplam 8 µg dsRNA) keçiboynuzu türler için sürekli besleme tarafından bildirilmiştir. Alman Hamam böceği, Blattella germinica, RNAi için son derece hassas dsRNA11,12,13,14enjeksiyonu ile ama besleme yoluyla dsRNA yanıt vermiyor. Son zamanlarda, Lin vd. (2017) dsRNA nakavt için başarılı RNAi lipozom taşıyıcıları sonuçlarında ile α-tübülin gen ekspresyonu midgut ve tetikleyici önemli mortalite Alman Hamam böceği15kapsüllenmiş olduğunu göstermiştir. DsRNA midgut içinde bozulma sözlü RNAi için sınırlayıcı bir faktör olduğu gibi lipozom taşıyıcıları bozulması, kolayca diğer böcekler gut güçlü nükleaz faaliyetleri ile ilgili olan dsRNA korumak için bir araç olarak hizmet vermektedir. Dikkat, belirli transfection reaktif seçtiğiniz için nedeni, lipozom gemisi geçerli protokol bu böcek hücre satırı transfection için daha az toksisite ile test edilmiş olduğu gibi biz kullanılan ( Tablo malzemelerigörmek) göre prosedürü yerine getirin. Gharavi ve ark. farklı lipozom transfection sistemlerinde karşılaştırma göre (2013) 16, transfecting küçük müdahale RNA (siRNA) verimliliğini yaklaşık bu ve diğer böcekler17,18 dsRNA dağıtım sistemleri için kullanılan piyasada bulunan diğer sistemleri arasında aynıdır . Ayrıca, bizim besleme yöntemi dsRNA uygun miktarda her hamamböceği tarafından yutulur ve sonuçları sağlam ve onaylanan emin olmak dikkatli olduğunu. Özet olarak, dsRNA lipoplexes kullanarak dsRNA istikrar geliştirir ve gelecekte haşere kontrolü için umut verici bir yaklaşım olduğu tasarım RNAi, strateji oral teslimat için kapıyı açar mevcut iletişim kuralı ve sonuçları göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sentez ve dsRNA hazırlanması
- DsRNA hedef siteleri 3' Çevrilmeyen bölgesi hedef genlerin tanımlamak. DsTub α-tübülin (küvet) gen hedefleme için kullanılır (GenBank üyelik numarası: KX228233), ve dsEGFP negatif dsRNA Denetim dizisi tasarlandığı gibi gelişmiş yeşil Floresans protein (EGFP; GenBank üyelik numarası: LC311024).
- DsRNA Şablonlar T7 organizatörü sıra içeren gen özgü astar ile sentezlemek için standart PCR güçlendirme gerçekleştirmek (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). PCR güçlendirme koşulları ve kullanılan astar bilgi bildirilen bu Lin ve arktarafından alıyor. (2017) 12 ( Tablo malzemelerigörmek).
- T7 transkripsiyon kullanarak dsRNA hazırlık ile devam edin (bkz. Tablo reçetesi) Kit, üreticinin yönergeleri izleyin.
Not: Yüksek miktar dsRNA verim için iki reaksiyonlar (içinde toplam 40 µL) bir tüp içinde karıştırın ve 37 ° C'de gecede kuluçkaya. - Dnaz 2 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) dsRNA örnekleri Özet DNA şablonları için 37 ° C'de 15 dakika içine.
- 200 µL ayıklama reaktif ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) ve 40 µL kloroform, o zaman girdap.
- 13.000 x g 4 ° c de 10 dakika santrifüj kapasitesi sonra süpernatant (150 µL) yeni microcentrifuge tüp içinde toplamak.
- DsRNA 150 µL isopropanol ekleyip 15 dakika buzda kuluçka çökelti.
- 13.000 x g 4 ° c de 15 dakika santrifüj kapasitesi, sonra süpernatant kaldırın.
- DsRNA granül yıkamak için % 70 etanol 200 µL ekleyin. Santrifüj 13.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için
- Etanol kaldırmak ve etanol yıkama adımları yineleyin.
- Etanol ve kuru dsRNA pelet tarafından 3 dk santrifüj vakum yoğunlaştırıcıları kaldırın ve sonra dsRNA RNase free su ile resuspend.
- Bir mikro-cilt UV-VIS Spektrofotometre kullanarak saf dsRNA sayısını belirle ( Tablo malzemelerigörmek) için üreticinin yönergelerini according ve istenen konsantrasyonu (örneğin, 0,25 µg/µL hazırlanması için ayarlamak dsRNA lipoplexes).
- DsRNA örnekleri-20 ° C'de 3 aya kadar saklayın.
2. dsRNA Lipoplexes hazırlanması
- Transfection reaktif 4 µL seyreltik ( Tablo malzemelerigörmek) %5 glikoz çözüm 4 µL ekleyerek. DsRNA (1 µg) 4 µL %5 glikoz çözüm 4 µL ekleyerek sulandırmak.
- Seyreltilmiş lipozom reaktif çözüm hemen hepsini birden seyreltilmiş dsRNA çözüm içine ekleyin. Kısaca bunları karıştırın, daha sonra 25 ° C'de 15 dakika kuluçkaya girdap
Not: Ters sırada çözümleri birlikte kullanmayın. - DsRNA lipoplexes kullanıma hazır. Hazırlık 1 saat içinde kullanın ve 1 saat sonra atın.
Not: Üreticinin yönergelerine göre lipoplexes en kısa zamanda kullanılmalıdır.
3. Hemolymph ve Midgut suyu ekstrasellüler enzimler topluluğu
-
Böcek tuzlu arabellek (10 x hisse senedi)
- 900 mL 109.3 g NaCl, 15.7 g KCl, 6.3 g CaCl2ve 8.3 g MgCl2·6H2O. ile Çift Kişilik distile su karışımı
- PH 6.8 için ayarlamak ve 1000 mL doldurun.
-
Hemolymph koleksiyonu
- 3 dakikadır hareket değil kadar buz hamamböceği anestezi.
- Hamam böceği (başparmak ve işaret parmağı) iki parmağınızla basılı tutun ve hamamböceği ventral tarafında sesini aç.
- Arka bacak coxa ihbar kesmeye diseksiyon makas kullanın.
Not: Coxa ve trochanter arasında bağlı kavşak kesti. Coxa diğer kısmı eksizyon hemolymph toplamak için daha az verimli. - Karın orta parmağınızla hafifçe sıkmak ve kesi 10 µL micropipette ile gelen kanama hemolymph toplamak.
- Üzerinden birkaç Hamam böcekleri (5 kişi) bir microcentrifuge tüp hemolymph havuz.
Not: Microcentrifuge tüpler melanization önlemek için buz üzerinde tutun. Ortalama erkek Hamam böceği elde edilen hemolymph 2-3 µL birimdir. - Spin hemolymph kısa bir süre için 10 benchtop santrifüj ile s.
- Hemolymph (Yani, 10 µL) istenen hacmi aktarmak ve 1 x böcek tuzlu arabellek 50 µL ile karıştırın.
- Santrifüj 1000 x g hemocytes spin 4 ° c de 10 dakika. Süpernatant temiz microcentrifuge tüp aktarın.
- Bir mikro-cilt UV-VIS Spektrofotometre A28015ölçerek kullanarak toplam protein konsantrasyonu ölçmek.
- Her örnek aynı protein konsantrasyonu (6 mg/µL toplam protein) için ayarlayın.
-
Midgut suyu toplama
- Buzda hamamböceği anestezi. Hamamböceği ventral yan diseksiyon plaka üzerinde böcek iğne kullanarak soğuk 1 x böcek serum fizyolojik ile tampon düzeltmek.
- Karın iyi cımbızla incelemek. (Ön, orta ve arka bağırsak dahil) tüm gut böcek tuzlu arabellek x 1 ile taze bir yemek için kaldırın.
- Ve hızlı bir şekilde transfer midgut 100 µL böcek tuzlu arabellek içeren bir microcentrifuge tüp ön ve arka bağırsak çıkarın.
- Aynı tüp ve 10 için girdap altı hamamböceği üzerinden midguts havuz s.
- Santrifüj 1000 x g aşağı belgili tanımlık hemocytes ve bağırsak dokularında dönmeye 4 ° c de 10 dakika. Süpernatant temiz microcentrifuge tüp aktarın.
- Bir mikro-cilt UV-VIS Spektrofotometre A28015ölçerek kullanarak toplam protein konsantrasyonu ölçmek.
- Her örnek aynı protein konsantrasyonu (6 mg/µL toplam protein) için ayarlayın.
4. dsRNA bozulması tahlil
- Taze çıplak dsRNA veya dsRNA lipoplexes (1 µg) 4 µL hazırlayın.
- DsRNA çıkarılan çözümlerle böcek tuzlu arabelleği (kontrol), 10 µL enzimler hemolymph veya midgut suyunu karıştırın.
- EGTA (20 mM) ya da RNase free su örnekleri enzim aktiviteleri inhibisyonu için denetimler olarak ayırmak için 2 µL ekleyin.
- 1 saat veya daha uzun (6, 12 veya 24 saat) 25 ° C'de için kuluçkaya
- 200 µL ayıklama reaktif ve 40 µL kloroform, sonra girdap ekleyin.
- 13.000 x g 4 ° c de 10 dakika santrifüj kapasitesi sonra süpernatant (150 µL) yeni microcentrifuge tüp içinde toplamak.
- DsRNA 150 µL isopropanol ekleyip 15 dakika buzda kuluçka çökelti.
- 13.000 x g 4 ° c de 15 dakika santrifüj kapasitesi, sonra süpernatant kaldırın.
- DsRNA granül yıkamak için % 70 etanol 200 µL ekleyin. Santrifüj 13.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için
- Etanol kaldırmak ve etanol yıkama adımları yineleyin.
- Etanol ve kuru dsRNA pelet tarafından 3 dk. Resuspend dsRNA RNase free 10 µL suyla için santrifüj vakum yoğunlaştırıcı kaldırmak.
- % 1.5 özel jel üzerinde Jel Elektroforez ile tedavi dsRNA bütünlüğünü denetleyin.
5. sözlü dsRNA İdaresi
- Kuru gıda (köpek yemi) bir ad libitum diyet Hamam böcekleri korumak. Bir gün önce dsRNA yenmesi deneyler hamamböceği su kaynağından mahrum.
- Hamam böceği tarafından kapma kanat esnek forseps (şekil 1, Adım 5) ile tutun.
Not: Hamam böceğinden vücut parçaları kapmak değil. - Çıplak dsRNA yanı sıra dsRNA lipoplexes beslenmesi için 2 bölümünde açıklandığı gibi hazırlayın.
Not: DsRNA lipoplexes taze besleme önce hazırlanmalıdır. - DsRNA lipoplexes ya da çıplak dsRNA 4 µL besleme (250 ng) ile bir micropipette.
- Yavaş yavaş dsRNA çözüm damlacık Hamam böcekleri ağız için kapatın ve hamamböceği izin damlalıklı tamamen damlacığı yutmayın.
- Sindirim denemeleri 8 gün veya 16 gün sürekli olarak günde iki kez (1 h sonra ışıkları ve ışıkları önce 1 h) gerçekleştirir.
Not: Tüm hamamböcekleri manuel dsRNA çözüm veya denetim reaktifleri ile (örneğin, nükleaz boş su, glikoz çözüm ve lipozom reaktif) sindirim deneyler sırasında beslenme yoluyla su satın aldı. - Su şişeleri Hamamböceklerine sindirim dsRNA deneyler 16 gün sonra sağlar.
6. nakavt değerlendirmek
- Seçilen zaman puan (2, 9 ve 17 gün sonra dsRNA yenmesi tahlil), dsEGFP ve dsTub tedavi böcekler toplamak ve seçilen doku (örneğin, midgut) incelemek.
- Nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) gerçekleştirin. Lin ve arktarafından belirlendiği şekilde astar bilgi ve qRT-PCR güçlendirme koşulları. (2017) 12.
- Denetim ve mortalite denetlemek ve artık hareket ediyor hamamböceği kaldırmak için dsRNA tedavi böcekler her gün değerlendirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İletişim kuralı dsRNA oral teslimat için basitleştirilmiş bir düzeni nereye dsRNA lipoplexes hazırlanması için önemli adımlar gösterilir şekil 1' de sunulmuştur.
B. germanica, dsTub lipoplexes midgut suyu ile inkübe nerede yapılmıştır bir ex vivo tahlil ve dsRNA bütünlüğünü midgut suyu dsRNA bozulması üzerine lipozom taşıyıcıları tarafından verilen koruma araştırmak için daha sonra üzerinde % 1.5 özel jel analiz edildi. Şekil 2 lipozom taşıyıcıları dsRNA düşmesine karşı en az 1 saat içinde ex vivo için korumak başardık, ancak güçlü RNA nükleaz etkinlik B. germanica (Şekil 2A), midgut suyu mevcut gösterir kuluçka (Şekil 2A, B). Sonuç olarak, dsRNA lipoplexes oral alımından duyarlılık midgut dokuların RNAi aşağıdaki deneylerde artırmak için günde iki kez uygulandı.
Doğrulama aracılığıyla sözlü dsRNA teslimini RNAi yanıtının küvet mRNA ifadede farklı zaman noktalarda midgut dsRNA (şekil 3A) sürekli sindirim sonra tükenmesi etkisini ölçme tarafından değerlendirildi. Midgut küvet ifadede dsTub lipoplexes sürekli yenmesi için 8 gün sonra önemli ölçüde tükenmiş. DsRNA sürekli besleme 16 gün devam ettiği sürece, midgut küvet ifadesinde önemli ölçüde çıplak dsTub ve dsTub lipoplexes gruplar tükenmiş (yaklaşık 24 ve % 60, tarafından sırasıyla) denetimleri aksine. Şekil 3 B dsTub lipoplexes sözlü yönetimi için 16 gün sonra ölüm tutarlı, önemli bir artış gösterir.
Resim 1 : DsRNA lipoplexes Hamam böcekleri için oral teslimat Basitleştirilmiş düzeni. DsRNA lipoplexes hazırlanması için önemli adımlar için adımlar 1-4 temsil edilir. Beslenme tekniği (5. adım) içinde belgili tanımlık fotoğraf gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Ex vivo dsRNA tarafından bozulması B. germanica hemolymph (Hemo) veya midgut suyu. (A) 1 µg çıplak ya da lipozom-cojugated dsTub inkübe tuzlu tampon ve hemolymph (hemo) veya midgut suyu ayıklanan enzimler ile 1 h için sırasıyla. Çıplak dsTub ama dsTub, lipozom Birleşik bozulmuş tamamen 1 x midgut suyu ile inkübe zaman. Orijinal midgut suyu (1 x) farklı seyreltme kayıpları gösterilir. Bozulması iyon şelasyon EGTA tedavi olarak bir denetim nedeniyle inhibe. (B) lipozom kapsüllü dsTub (1 µg) hemolymph veya midgut suyu ex vivo düşmesine karşı korunması zamana bağımlı. Not, lipozom Birleşik dsTub tamamen ne zaman 24 saat sonra midgut suyu ile inkübe bozulmuş. Hemolymph ve midgut suyu, kuluçka dönemleri için orijinal konsantrasyon kullanılmıştır. Sonuçları Lin ve arkadapte olmuşlardır. (2017) 12. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : DsRNA sindirim Cevabıyla RNAi etkilerini B. germanica. Midgut farklı beslenme tedaviler sonra göreli küvet ifadesinde Almanca hamamböceği, belirlemek için(a)kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR). Farklı tedaviler ifade düzeyde glikoz grup gün 2 için normalleştirilmiş. Üç bağımsız deneyler üzerinden ortalama ± SE değerlerdir (n = 3), her biri 3-5 biyolojik çoğaltır. Farklı harfler çubuklarında p önemli farklılıklar gösterir < 0,05 (ANOVA'ın Tukey HSD Post Hoc testi takip) farklı tedavi grupları arasında. (B) yaşayanlar çıplak dsTub ya da dsTub lipoplexes 8 gün (8 d) veya 16 gün (16 d) Hamam böceğinden (12-15 bireylerin her kohort; n 3 bağımsız deneyler =). Değerler şunlardır: ortalama ± SE. farklı harfler tedavi grubunda p önemli farklılıklar gösteren < 0,05 (Kruskal-Wallis testi) yaşayanlar için. Sonuçları Lin ve arkadapte olmuşlardır. (2017) 12. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı için dsRNA lipoplexes, sözlü teslim yoluyla etkili RNAi Alman Hamam böceği midgut suyu ribonükleaz sindirim karşı koruma içeren bir yöntem sunuyor. Böcek türleri diğer çalışmalarda gösterildiği gibi zavallı RNAi etkisi dsRNA sözlü teslim yoluyla çoğunlukla için dsRNA8,9,10bozulması tarafından muhasebeleştirilir. Bu iletişim kuralı oral teslimat dsRNA gut düşmesine karşı koruyucu araçlar olarak hizmet lipozomlar üretir. Buna ek olarak, dsRNA lipoplexes özellikle güçlü ribonükleaz aktivite bağırsak ile böcekler için basit ve kolayca uygun olarak sözlü RNAi hazırlıktır.
Çıplak dsRNA nispeten büyük miktarda farklı böcekler10,18,19' yem diğer çalışmalar ile karşılaştırıldığında, bu iletişim kuralı neden dsRNA (günde 0,5 µg), nispeten düşük miktarda oral yönetim kullanır bir Hedef gen ifadesinde midgut B. germanicaönemli tükenmesi. İletişim kuralının çok önemli yönleri hassas besleme yöntemi ve dsRNA az miktarda birikmiş sindirim içerir. İlk olarak, beslenme tekniği sürekli sindirim tahlil için uygundur ve her bireysel böcek hafızanın dsRNA miktarını varyasyonu en aza indirir. İkinci olarak, midgut ifadede küvet tükenmesi etkisini sürekli sözlü yönetimi dsTub lipoplexes (şekil 3A) ile 17 gün gün 9-%60 %40 artırmak için gösterildi. Her ne kadar çıplak dsRNA hızla ex vivo kuluçka 1 h (Şekil 2A) içinde midgut suyu ile bozulmuş, çıplak dsRNA sürekli besleme 16 gün için de önemli tükenmesi küvet ifade içinde sonuçlandı midgut (şekil 3A). Ayrıca, sürekli dsRNA lipoplexes 16 gün beslenme daha uzun süre RNAi tarafından dikkat çekici bir öldürücü etkiye neden için bir gereksinimdir.
(Bkz. Tablo reçetesi) lipozom taşıyıcıları kullanılmış olmasına rağmen burada aslında böcek hücreleri içine DNA'ın vitro transfection için dsRNA böcek modelimiz oral teslimat için bir araç olarak bu lipozom reaktif uygulama hiçbir sorun yoktu. Birçok çalışma de başarıyla DNA veya RNA molekülleri17,20,21için tasarlanmış farklı lipozom reaktifler kullanarak diğer böcek türlerinde RNAi damping gelişme göstermiştir. Yine de, böcek gut dsRNA Alım mekanizması değil henüz tamamen çalışılmıştır ve lipozom dağıtım sistemi sayesinde, Biyouyumluluk Fosfolipid yapısı22ile hücre içine dsRNA alımını artırmak. Bu nedenle, lipozomlar içinde kapsüllü dsRNA sözlü teslimini verimli RNAi geriliği RNases (Şekil 2) tarafından bozulması nedeniyle elde etmek için uygun bir strateji olabilir.
Bu protokol bir dezavantaj dsRNA lipozom taşıyıcıları olarak az miktarda olabilir ve böylece sürekli beslenme daha uzun süre gerektirebilir. Arasındaki dsRNA lipozom (0,25 µg:1 µL) için belirli bir oran üreticinin öneri göre ticari lipozom reaktif tasarımı nedeniyle kısıtlamadır. Lipozom nano tanecikleri daha büyük çaplı boyutu ile hazırlanmasında formülasyonları ve lipoplexes yüzeyinde, farklı ücret siRNA ve RNAi susturmak verimliliği23,24encapsulation artırmak için raporlanır. Bu nedenle, farklı lipozom nano tanecikleri besleme yordamlar geliştirmek için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu çalışmada (Bakanlığı bilim ve teknoloji, en 100-2923-B-002-002-MY3 ve H.J.L. 106-2313-B-002-011-MY3), Tayvan gelen hibe tarafından desteklenmiştir Çek Cumhuriyeti (Grant ajansı South Bohemia Üniversitesi, GAJU vermek 065/2017/P Y.H.L için) ve İspanya ( X.B. ve Katalan hükümet İspanyolca Ekonomi Bakanlığı ve rekabet gücünü, CGL2012-36251 ve CGL2015-64727-P verir 2014 SGR 619 X.B. için vermek); Bu aynı zamanda ekonomik ve bölgesel kalkınma (FEDER fon X.B. için) için Avrupa fonundan mali destek aldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent | SignaGen | SL100499 | for lipoplexes preparation |
| Blend Taq plus | TOYOBO | BTQ-201 | for PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | ABI | 4385612 | for qPCR |
| FirstChoice RLM-RACE Kit | Invitrogen | AM1700 | for 3' UTR identification |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AMB13345 | for dsRNA synthesis |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | remove DNA template from dsRNA |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | for dsRNA or total RNA extraction |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | remove DNA template from total RNA |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | for dsRNA or total RNA extraction |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | for dsRNA or total RNA extraction |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 24102 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | for RNase free water preparation |
| glucose solution | Sigma-Aldrich | G3285 | for lipoplexes preparation |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | insect saline buffer formula |
| Potassium chloride, KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | insect saline buffer formula |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | insect saline buffer formula |
| Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | insect saline buffer formula |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | enzyme inhibitor |
| dissecting scissor | F.S.T. | cockroach dissection | |
| fine tweezers | F.S.T. | cockroach dissection | |
| flexible tweezer | F.S.T. | cockroach holding | |
| pipetman | RAININ | P10 | sample preparation |
| microcentrifuge tube | Axygen | MCT175C, PCR02C | sample preparation |
| pipette tip | Axygen | sample preparation | |
| vortexter | Digisystem | vm1000 | sample preparation |
| Minispin centrifuge | The Gruffin Group | GMC 206 | for liquid spin down |
| Centrifuge | ALC | PK121R | sample preparation |
| pH meter | JENCO | 6071 | for pH adjust |
| micro-volume spectrophotometer | Quawell | Q3000 | nucleic acid quantitative |
| PCR Thermal cycler | ABI | 2720 | for template PCR or dsRNA synthesis incubation |
| quantitative real-time PCR | ABI | StepOne plus | gene expression quantitative |
| Centrifugal Vacuum Concentrators | eppendorf | 5301 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Multipette | eppendorf | xstream | for real-time PCR sample loading |
| Agarose I | amresco | 0710 | for nucleic acid electrophoresis |
| tub gene specfifc forward preimer | tri-I biotech | GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA | |
| tub gene specfifc reverse preimer | tri-I biotech | TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA | |
| dsTub template forward primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG | |
| dsTub template reverse primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG | |
| dsEGFP template forward preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG | |
| dsEGFP template reverse preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC | |
| tub qPCR forward primer | tri-I biotech | GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC | |
| tub qPCR reverse preimer | tri-I biotech | CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC | |
| ef1 qPCR forward primer | tri-I biotech | CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A | |
| ef1 qPCRreverse preimer | tri-I biotech | CCT GCA GAG GAA GAC GAA G |
References
- Hammond, S. M. Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).
- Bellés, X. Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).
- Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J. Chapter Five - Biological Mechanisms Determining the Success of RNA Interference in Insects. International Review of Cell and Molecular Biology. Jeon, K. W. 312, Academic Press. 139-167 (2014).
- San Miguel, K., Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest Manag. Sci. 72, 801-809 (2016).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J. Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
- Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: What we know so far. Front. Physiol. 7, (2016).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. J. Insect Physiol. 59, 171-178 (2013).
- Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cDNA encoding extracellular dsRNase and its expression in the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 176-183 (2007).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 1-9 (2016).
- Wynant, N., et al. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect Biochem. Mol. Biol. 46, 1-8 (2014).
- Huang, J. -H., Belles, X., Lee, H. -J. Functional characterization of hypertrehalosemic hormone receptor in relation to hemolymph trehalose and to oxidative stress in the cockroach Blattella germanica. Exp. Endocrinol. 2, 114 (2012).
- Lin, Y. -H., Lee, C. -M., Huang, J. -H., Lee, H. -J. Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica). J. Insect Physiol. 65, 45-50 (2014).
- Lozano, J., Kayukawa, T., Shinoda, T., Belles, X. A role for taiman in insect metamorphosis. PLOS Genet. 10, 1004769 (2014).
- Lozano, J., Montañez, R., Belles, X. MiR-2 family regulates insect metamorphosis by controlling the juvenile hormone signaling pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 3740-3745 (2015).
- Lin, Y. -H., Huang, J. -H., Liu, Y., Belles, X., Lee, H. -J. Oral delivery of dsRNA lipoplexes to German cockroach protects dsRNA from degradation and induces RNAi response. Pest Manag. Sci. 73, 960-966 (2017).
- Gharavi, J., et al. Chiral cationic polyamines for chiral microcapsules and siRNA delivery. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5919-5922 (2013).
- Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 824-832 (2009).
- Luo, Y., et al. Differential responses of migratory locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding. Insect Mol. Biol. 22, 574-583 (2013).
- Liu, J., Smagghe, G., Swevers, L. Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori. J. Insect Physiol. 59, 646-654 (2013).
- Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control. Insects. 8, 4 (2017).
- Taning, C. N. T., et al. Oral RNAi to control Drosophila suzukii: Laboratory testing against larval and adult stages. J. Pest Sci. 89, 803-814 (2016).
- Wu, S. Y., McMillan, N. A. J. Lipidic systems for in vivo siRNA delivery. AAPS J. 11, 639-652 (2009).
- Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5, 498-507 (2013).
- Xia, Y., Tian, J., Chen, X. Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery. Biomaterials. 79, 56-68 (2016).
