Deze studie verkent het nieuwe gebruik van enzym gebaseerde micro-elektrode matrix (MEA) technologie om te controleren in vivo neurotransmitter activiteit bij biggen. De hypothese was dat glutamaat disregulatie draagt bij aan het mechanisme van verdoving neurotoxiciteit. Hier presenteren we een protocol aan te passen van MEA technologie om te bestuderen van het mechanisme van anesthesie-geïnduceerde neurotoxiciteit.
Elk jaar, ondergaan miljoenen kinderen anesthesie voor een veelheid van procedures. Echter, studies in zowel dieren als mensen hebben op losse schroeven de veiligheid van de narcose bij kinderen, we verdoving als potentieel toxische naar de hersenen in ontwikkeling. Tot op heden geen studies hebben met succes de mechanism(s) toegelicht door die verdoving mogelijk neurotoxische. Dierproeven toestaan onderzoek van dergelijke mechanismen en neonatale biggen vertegenwoordigen een uitstekend model deze effecten als gevolg van hun opvallende developmental gelijkenissen met het menselijk brein te bestuderen.
Dit protocol past het gebruik van micro-elektrode enzym gebaseerde matrix (MEA) technologie als een nieuwe manier om te studeren het mechanism(s) van anesthesie-geïnduceerde neurotoxiciteit (AIN). MEA’s in staat stellen real-time bewaking van in vivo neurotransmitter activiteit en bieden uitzonderlijke temporele en ruimtelijke resolutie. Het is veronderstelde dat verdoving neurotoxiciteit gedeeltelijk door de glutamaat disregulatie veroorzaakt wordt en MEA’s een methode bieden voor het meten van glutamaat. De nieuwe implementatie van MEA technologie in een Knorretje model presenteert een unieke kans voor de studie van AIN.
Elk jaar, ondergaan miljoenen kinderen anesthesie voor zowel invasief en niet-invasieve procedures in de Verenigde Staten1. Jarenlang, hebben de aanbieders van de verdoving ouders van de veiligheid van de verdoving, zelfs bij kleine kinderen en pasgeborenen gerustgesteld. Echter in 1999 werd geconstateerd dat voorbijgaande verstopping van de N-methyl-D-aspartaat (NMDA)-subtype van glutamaat receptoren tijdens de vroege leven kan veroorzaken wijdverspreide neuronale apoptosis in ratten2. De FDA onlangs een drug veiligheid mededeling waarvoor de etiketten van verdoving drugs op te nemen van een waarschuwing over algemene verdoving en hun mogelijke negatieve effecten de ontwikkelende hersenen van kinderen jonger dan 3 jaar oud (Amerikaanse Food en Drug Administration, 2017). Er is echter nog steeds een noodzaak om te verhelderen mogelijke mechanismen en potentiële neuroprotectieve maatregelen.
Normale activiteit van neurotransmitters zoals glutamaat en gamma-amino boterzuur (GABA) zijn essentieel voor de normale neurologische optreden. Hoewel de meeste van de routes betrokken in AIN nog steeds ongrijpbaar zijn, zijn neurotransmitter systemen zeer waarschijnlijk te worden betrokken aangezien anesthetica zijn gekend om te moduleren van deze trajecten voor de productie van bewusteloosheid. In het bijzonder veroorzaakt de excitatory neurotransmitter glutamaat excitotoxicity wanneer zijn activiteit dysregulated is. Deze neurotransmitter is normaal betrokken bij neurogenese, Neurale plasticiteit, synaptic en neurale groei en een aantal andere kritisch belangrijke hersenfuncties. Langdurige activering van glutamaat receptoren kan echter leiden tot excitotoxicity en neuronale apoptosis, met name onder stress omstandigheden zoals chirurgie, zuurstof ontbering en verminderde energie beschikbaarheid3. Binden van glutamaat naar de NMDA heeft receptor aangetoond dat nb+ en Cl− toestroom veroorzaken. De daaropvolgende depolarisatie wordt verondersteld te leiden tot Ca2 + kanaal openen en vrijlating van intracellulaire Ca2 + slaat4. Deze dysfunctie waarschijnlijk leidt tot een cascade van metabole verstoringen die uiteindelijk afnemen van neuronale proliferatie, ontsteking verhogen en leiden tot de neuronale dood. Ondanks deze hypothesen blijven de echte mechanism(s) van AIN onduidelijk5. Door haar rol in apoptosis vertegenwoordigt glutamaat disregulatie een nieuwe weg die aan het mechanisme van eerder gedocumenteerd neuronale apoptosis, een functie van AIN bijdragen kan.
Eén van de belemmeringen op de studie van neuronale processen is hun hoge complexiteit, vooral in de omgeving van neuronale ontwikkeling. De eerste paar maanden van het leven zijn de periode van maximale kwetsbaarheid voor letsel, tijdens welke de meeste van de belangrijke stappen van neuronale ontwikkeling zoals fysiologische apoptosis (neuronale snoeien), synaptogenese, gliogenesis en myelinisering nemen plaats6 . Gezien het complexe karakter van de neuronale communicatie en de moeilijkheid om deze processen te bestuderen zonder te onderbreken van de normale functie van de CNS, nieuwe technologieën ontwikkeld die gericht zijn op de in vivo detectie en kwantificering van belangrijke elementen voor neuronale communicatie.
Enzyme-linked MEA technologie werd gebruikt in deze studie als een nieuwe manier om te bestuderen van de mechanismen van AIN in een klinisch relevante Knorretje-model. Deze technologie kan worden gebruikt om complexe in-vivo elektrochemische hersenen processen, met inbegrip van glutamaat disregulatie te bestuderen. De ingebouwde 4-kanaals platina opname sites van de multilaterale milieu-akkoorden (2 glutamaat-gevoelige sites en 2 studiesites) toestaan zichzelf verwijzende, die bijdraagt tot de detectie nauwkeurigheid. Bovendien, een laag van de uitsluiting wordt toegepast op elke elektrode, houdende toekenning selectiviteit door te verhinderen dat andere storende moleculen wordt gedetecteerd7. Bovendien, het ontwerp van de laag-profiel van de MEA zorgt voor minimale weefseltrauma ten opzichte van eerdere technologieën. Deze dezelfde functie verleent aan MEAs een hogere ruimtelijke resolutie, dat de studie van microscopische regio’s in de hersenen vergemakkelijkt. Bijvoorbeeld, kunnen afzonderlijke regio’s van de hippocampus (getand gyrus, CA1, CA2) specifiek bestudeerde8. Specifieke details over de functionaliteit van multilaterale milieuovereenkomsten geweest eerder beschreven9.
In vergelijking met de MEA elektrochemie, microdialysis omvat een membraan geplaatst tussen de oplossing van belang en een oplossing van soortgelijke samenstelling, waardoor detectie van extracellulaire vloeistof verandert10. Hoewel microdialysis een steunpilaar van neurochemie is en al lange tijd voor de detectie van neurotransmitters gebruikt heeft, heeft het als nadeel van lage tijd resolutie, vertraagde detectie van glutamaat veranderingen en belangrijke weefsel trauma11.
MEA’s kunnen niet indirect het detecteren van neurotransmitters zoals glutamaat, acetylcholine en choline, met behulp van passende oxidase enzymen die electroactive verslaggever moleculen zoals H2O2 of O212,13 produceren .
MEA technologie wijd gebruikt in ratten en niet-menselijke primaten voor de studie van neurotoxiciteit in het kader van de pathofysiologische processen dan AIN7,14. Onder sommige van deze pathofysiologische processen, is MEA technologie gebruikt voor de studie van de ziekte van Alzheimer, epilepsie, traumatisch hersenletsel en het effect van farmacologische stoffen op de mededeling van de synaptische8,15 , 16 , 17. Hoewel MEA’s zijn gebruikt voor het bestuderen van deze pathologieën in ratten en niet-menselijke primaten, de hoge ontwikkelings gelijkenis tussen mensen en Knorretje hersenen maakt de aanpassing van de MEA technologie bij biggen van een zeer geschikte techniek voor de studie AIN mechanism(s)18.
Vanaf het begin van het experiment, moet de fysiologische homeostase van de biggen worden gehouden zoals beschreven in dit lab voorafgaande bekendmaking21. Minimale controle moet met name pulse oxymetrie, electrocardiografie, capnography, niet-invasieve bloeddruk en temperatuur. Opgeleide onderzoekers zijn vereist zodat fysiologische verstoringen (b.v.hypo/hyperthermie, hypoxie, hypotensie, aritmie) op de juiste wijze kunnen worden gecorrigeerd.
Voorafgaand aan de inductie, worden in vitro MEA kalibraties uitgevoerd om de functionaliteit en de selectiviteit van de MEA bekende omstandigheden. De kalibratie en de beplating van multilaterale milieu-akkoorden is van cruciaal belang voor het doeltreffend gebruik van de technologie. Er zijn vele mogelijke fouten die zich tijdens de kalibratie voordoen kunnen. Kalibratie herkent deze kwesties evenals onjuiste beplating, die tot onjuiste interferent reactie leidt. Een meer gedetailleerde tabelvorm account van fouten die in MEA reactie optreden kunnen is samengesteld, langs met bekende oorzaken en de voorgestelde oplossingen, die moet blijken te zijn een nuttig instrument voor het waarschijnlijk oplossen (tabel 1). Het is belangrijk op te merken dat het glas referentie-elektrode voorafgaand aan zowel kalibratie en beplating, moet worden gecontroleerd op de aanwezigheid van luchtbellen of witte verkleuring, zoals een negatieve invloed hebben op MEA functie en nauwkeurigheid opnemen.
Symptoom | Oorzaak | Corrigerende maatregelen |
Geen signaal | Elektrode niet verbonden | Goed verbinden elektrode headstage en de headstage snel amperometry systeem. |
Geen macht aan de snelle amperometry-systeem | Schakelaar op achterzijde snel systeem inschakelen | |
Signal Noise | Elektrode besmet door bloed | Voortdurend de bevloeiing van de hersenen oppervlak tijdens het inbrengen van de elektrode |
Spoel de elektrode direct in dH2O | ||
Enzym coating is los | Schoon en terrasgedeelte van de elektrode | |
Referentie-elektrode was niet ingevoegd noch bekleed | Jas en plaats van de referentie-elektrode verder onder de hoofdhuid | |
Elektrode is het opsporen van verkeer van hersenen oppervlak | Treedt meestal op in de oppervlakkige structuren. Invoegen van de elektrode dieper (1 mm tegelijk) indien mogelijk | |
Dierlijke verkeer | Dier is onvoldoende beveiligd | Het dier in de achterste richting verplaatsen naar beter beveiligde earbars op de schedel. Indien nodig, verheffen de romp te voorzien in betere uitlijning van het lichaam. |
Dier is onvoldoende verdoofd | Controleer de integriteit van de verdoving apparatuur. Titreer de verdoving om een effectieve dosis en beheren van een intramusculaire rocuronium dosis (5 mg/kg) | |
Onjuiste elektrode plaatsing | Elektrode is niet correct uitgelijnd | Passen de elektrode met behoud van de goede verbinding met de headstage. |
Stereotaxic coördinaten zijn onjuist | Verzekeren dat de biggen atlas wordt verwezen maakt geen gebruik van een andere referentiepunt of een ander vliegtuig van uitlijning. | |
Wees voorzichtig niet te verdoezelen van de hechtdraad merken door te scoren op de schedel. |
Tabel 1: instructies voor het oplossen van MEA gebruiken bij biggen. Mogelijke oorzaken en corrigerende maatregelen om te helpen met optimalisatie en probleemoplossing.
Een stereotaxic atlas voor de biggen is gebruikt om te bepalen van de stereotaxic coördinaten van het gebied van belang met betrekking tot een bekend punt zoals bregma18. Oor balken moeten goed worden beveiligd om ervoor te zorgen dat de schedel vlak en volledig geïmmobiliseerdet is. Zorg moet worden genomen tijdens de insnijding van de middellijn van de hoofdhuid om te voorkomen dat het scoren van de schedel, zoals dit van invloed zou kan zijn op de visualisatie van de lijnen van de hechtdraad. Het craniotomy-venster moet groot genoeg zijn om de MEA tegemoet te komen.
Dit protocol bevat een aantal technische uitdagingen waarvoor een goedgevulde operationele suite en een onderzoeker/team ervaren in de chirurgische en verdoving aspecten van het protocol. Het model presenteert bovendien financiële beperkingen in dat de biggen model duurder dan het knaagdier model is; het is echter beduidend minder kostbaar dan het gebruik van niet-menselijke primaten, die duizenden dollars kosten kan. Het gebruik van MEA technologie presenteert zijn eigen uitdagingen, als de procedure van coating en de elektroden handmatig plating vereisen een ervaren onderzoeker of assistent om voldoende selectiviteit en betrouwbare functie. De microelectrodes zelf zijn kwetsbaar, omdat ze zijn gemaakt van keramiek, en dus gemakkelijk beschadigd als juiste waarschuwing niet wordt nageleefd. Microelectrodes zijn onderworpen aan de inmenging van andere elektrische apparaten, die ruis in de opnames kunnen maken, en uit bloed op de operatieve site, die de opname-sites kunt occlude. De behoefte aan gespecialiseerde apparatuur presenteert een extra last, zoals een stereotaxic chirurgische frame moet aangepaste gebouwd om te immobiliseren van de biggen schedel tijdens implantatie. Het stereotaxic frame, glutamaat oxidase, en de elektroden zelf zijn allemaal duur. Bovendien vormt het ontbreken van een stereotaxic atlas van de biggen uit in het laatste decennium technische beperkingen waarvoor specifieke expertise om te bepalen van de specifieke locatie van diepe structuren in de hersenen van de biggen. Ontwikkeling van een nieuwe stereotaxic atlas, misschien met behulp van magnetische resonantie beeldvorming, zou de mogelijkheid tot gebruik van deze technologie in biggen sterk verbeteren.
De biggen is een klinisch relevante model voor de studie van AIN grotendeels te wijten aan de parallellen tussen deze soorten en de menselijke neonate, zoals beide soortgelijke hersenstructuur en ontwikkeling bezitten. In tegenstelling tot de meer gebruikte modellen zoals muizen of ratten heeft de biggen een grotere CNS gelijkenis met mensen, die aan de vertaalbaarheid van de resultaten van het model leent. De biggen model is bovendien goedkoper en minder ingewikkeld behandeling dan een niet-menselijke primaten model omvat. Het model van de biggen is bedoeld om te onderzoeken het proces door die verdoving kan induceren developmental neurotoxiciteit, meten van haar bijdrage aan neurologische schade en bestrijding van de kwestie van schade veroorzaakt door de verstorende variabelen. Hypoxie kan bijvoorbeeld verkeerd worden geïnterpreteerd voor schade veroorzaakt door de verdoving zoals het globale effecten op de hersenen heeft. De biggen wordt gebruikt met dezelfde chirurgische en verdoving voorwaarden als die welke worden gebruikt in de menselijke geneeskunde om ervoor te zorgen betrouwbaarheid van resultaten.
Het gebruik van keramische gebaseerde MEA technologie elimineert verscheidene van de nadelen die de hedendaagse techniek van microdialysis is gekoppeld. Microdialysis heeft een beperkte temporele en ruimtelijke resolutie in vergelijking met amperometrische methoden zoals de MEA, die continu van glutamaat gebeurtenissen in veelvoud registreren kan, microscopische regio’s op maximaal 10 Hz-23. Deze snelle samplefrequentie elimineert de storende factor voor de verspreiding van de gelokaliseerde neurotransmitter die inherent is aan langzaam-bemonsteringsmethoden als microdialysis24. Bovendien, is de MEA een minder invasieve methode dan een microdialysis-sonde, die kan leiden tot aanzienlijke gliosis tijdens het inbrengen en neurotransmitter activiteit op de invoeging site22kan wijzigen.
Eerdere studies met behulp van een aantal zoogdieren modellen, meettechnieken en regio’s van de hersenen, hebben aangetoond dat basale glutamaat niveaus vergelijkbaar zijn met die gevonden met behulp van deze techniek. Dit suggereert dat MEA technologie, wanneer aangepast aan het model van biggen, geldig opnames van in vivo glutamaat concentratie (tabel 2 biedt).
Auteur (jaar) | Opname-techniek | Diermodel | Leeftijd | Hersenen regio(‘s) | : Basale glutamaat concentratie (µM) |
Hascup et al. (2008)23 | MEA (enzym-gebaseerd) | Knaagdier | 20 – 24 weken | Prefrontale Cortex, Striatum | 3.3 ± 1,0; 5.0 ± 1,2 |
Hascup et al. (2010)25 | MEA (enzym-gebaseerd) | Knaagdier | 3 – 6 maanden | Hippocampus | 4.7-10.4 |
Rutherford et al. (2007)9 | MEA (enzym-gebaseerd) | Knaagdier | 3 – 6 maanden | Prefrontale Cortex, Striatum | 44.9 ± 4,7; 7.3 ± 0,9 |
Miele et al. (1996)26 | Microdialysis (enzym-gebaseerd) | Knaagdier | – | Striatum | 3.6 ± 0,5 |
Dag et al. (2006)27 | MEA (enzym-gebaseerd) | Knaagdier | 3 – 6 maanden | Frontale Cortex, Striatum | 1.6 ± 0,3; 1.4 ± 0,2 |
Quintero et al. (2007)28 | MEA (enzym-gebaseerd) | Niet – menselijke primaten | 5.3-5.5 jaar | Premotor Cortex, motorische Cortex | 3.8 ± 1,7; 3.7 ± 0,9 |
Stephens et al.. (2010) 29 | MEA [Spencer-Gerhardt-2 (SG-2)] | Niet – menselijke primaten | 11 – 21 jaar | Putamen | 8.53 |
Kodama et al. (2002)30 | Microdialysis (enzym-gebaseerd) | Niet – menselijke primaten | – | Prefrontale Cortex | 1.29-2.21 |
Galvan et al. (2003)31 | Microdialysis (enzym-gebaseerd) | Niet – menselijke primaten | Jonge | Striatum | 28.74 ± 2.73 |
Tijdens en Spencer (1993)32 | Microdialysis (enzym-gebaseerd) | Menselijke | 18 – 35 jaar | Hippocampus | 20.3 ± 6.6 |
Reinstrup et al. (2000)33 | Microdialysis (enzym-gebaseerd) | Menselijke | – | Frontale Cortex | 16 ± 16 |
Cavus et al. (2005)34 | Microdialysis (enzym-gebaseerd) | Menselijke | 15 – 52 jaar | Neocortex | 2.6 ± 0,3 |
Tabel 2. Vergelijking van basale extracellulaire glutamaat levelsacross verschillende diermodellen. Een geselecteerd overzicht van studies tot vaststelling van de normale extracellulaire glutamaat niveaus in gezonde wakker en narcose dieren met microdialysis of microelectrodes.
Het gebruik van MEA technologie om te controleren in vivo glutamaat concentraties in het model van de biggen kan zorgen voor de toekomstige evaluatie van Knorretje neurologische resultaten na narcose. Overleving experimenten zijn gepland, die verder inzicht in het langetermijneffect van de verdoving op de neurocognitieve welzijn van menselijke pasgeborenen. Overleving experimenten toestaat voor gedrags testen en monitoring van glutamaat verandert lang na blootstelling van de verdoving. Het is ook gebruikelijk voor kinderen tot en met het ondergaan van narcose in omstandigheden waar ze misschien ervaren fysiologische stress in de vorm van chirurgische interventie. Toekomstige studies adressering van de invloed van chirurgie in termen van neurologische schade en toename in neurotoxiciteit zou mogelijk maken meer nauwkeurige modellering van een gemeenschappelijk klinische setting voor kinderen. Het gebruik van alternatieve diermodellen is ook haalbaar is, zoals de studie van deze verschillende modellen door chronische implantatie, waardoor wij voor het bijhouden van gedragsveranderingen neurotoxiciteit is gekoppeld. MEA technologie zelf is veelzijdig, zodat toekomstige studie niet te beperkt tot de analyse van glutamaat niveaus worden hoeft (bijvoorbeeldGABA, choline, lysine, enz. kon worden geanalyseerd).
The authors have nothing to disclose.
De auteurs wil erkennen van de bijdragen van het centrum van de Universiteit van Kentucky voor micro-elektrode technologie (CenMeT), en de Ohio State University Laboratory dier Resource Center (ULAR).
Advance Liqui-Wean Pig Milk Replacer | PBS Animal Health | 292-13 | |
Piglet Anesthesia Face-Cone Mask | VetEquip | 921428 | |
Integra SL Anesthesia Workstation | DRE Veterinary | 2350 | This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention. |
Sevoflurane | Ultane | 0074-4456-04 | |
Rocuronium Bromide Injection | Hospira | 0409-9558-05 | |
Medfusion 4000 IV Infusion | Smiths Medical | ||
Model 1530 Heavy-Duty Research Model Stereotax | Kopf | custom made | |
Model 1541 Piglet Adaptor | Kopf | custom made | |
Infrared Spot Lamp | Amazon | B000HHQ94C | |
Bair Hugger Torso Blanket | 3M | 540 | |
Bair Hugger | 3M | 750 | |
Sterile Alcohol Prep Pad | Fisherbrand | 22-363-750 | |
Carbon Steel Rib-Back Surgical Blade | Bard-Parker | #10 | |
Scalpel Handel | Havel's | HAN-G4 | |
Surgical Scissors | World Precision Instruments | 504615 | |
Mosquito Forceps | Sklar Surgical Instruments | 17-1225 | |
Gauze Pads | Fisherbrand | 22-246-069 | |
Adson Tissue Forceps | Teleflex | 181223 | |
Dremel 111 Engraving Cutter | Amazon | Dremel 111 | |
Microelectrode Array | Center for Microelectrdoe Technology, University of Kentucky | S2 4Ch MEA; custom made | |
Headstage | Quanteon | 2pA/mV | |
Wire, silver, PFA, .008" Bare, .0110" coated | A-M Systems | 786500 | |
Fine Micromanipulator | Narishige Scientific Instrument Lab | MO-8 |