Summary
Это исследование исследует роман использование технологии на основе ферментов микроэлектродные массив (МПС) для мониторинга в vivo активности нейротрансмиттера чушки. Гипотеза была что глутамата dysregulation способствует к механизму обезболивающий нейротоксичности. Здесь мы представляем протокол адаптировать технологии МПС для изучения механизма анестезии индуцированной нейротоксичности.
Abstract
Каждый год миллионы детей подвергаются анестезии для множества процедур. Однако исследования на животных и человека поставили под сомнение безопасность анестезии в детей, подразумевающие анестетиков потенциально токсичным для мозга в процессе развития. На сегодняшний день никаких исследований успешно освещены механизм(ы) какой наркоз может быть нейротоксическое. Исследования на животных позволяют расследования таких механизмов, и новорожденных поросят представляют отличную модель для изучения этих эффектов из-за их поразительное сходство развития человеческого мозга.
Этот протокол адаптирует использование технологий на основе ферментов микроэлектродные массив (MEA) как новый способ для изучения механизм(ы) анестезии индуцированной нейротоксичности (AIN). МЭС включить мониторинг в реальном времени в vivo активности нейротрансмиттера и предлагают исключительные временнóго и пространственного разрешения. Он предположил, что цистит нейротоксичности частично вызвано глутамата регуляции и МПС предложить метод измерения глутамата. Роман осуществления МЭС технологии в Пятачок модели представляет собой уникальную возможность для изучения АЙН.
Introduction
Каждый год миллионы детей подвергаются анестезии для инвазивных и неинвазивных процедур в Соединенных Штатах1. Лет поставщики анестезии заверили родителей безопасности анестетиков, даже у новорожденных и маленьких детей. Однако, в 1999 году было обнаружено, что переходные закупорки N-метил D-аспартат (NMDA) подтипа рецепторов глутамата во время ранней жизни может привести к широко апоптоза нейронов крысы2. Недавно, FDA выпустила наркотиков безопасности связи, которые будут требовать этикетки анестетики включить предупреждение об общих анестетиков и их возможное негативное воздействие на развивающиеся мозги детей моложе 3 лет (еда США и Лекарствами, 2017). Однако есть еще необходимость выяснения возможных механизмов и потенциальных нейропротекторной мер.
Нормальной активность нейромедиаторов например глютамат и гамма амино-масляная кислота (ГАМК) являются критическими для нормального нейроразвития происходят. Хотя большинство участвующих в АЙН пути по-прежнему недостижимой, нейромедиатор системы являются весьма вероятно принять участие, поскольку анестетиков, как известно, модулировать этих путей производить бессознательного. В частности возбуждающих нейромедиатора глутамата вызывает Эксайтотоксичность, когда его деятельность является dysregulated. Обычно это нейромедиатор участвует в нейрогенез, нейронные пластичности, синаптических и нейронных роста и целый ряд других критически важных мозговых функций. Однако длительной активации рецепторов глутамат может вызвать Эксайтотоксичность и апоптоза нейронов, особенно в условиях стресса как хирургия, лишение кислорода и снижение доступности3. Привязка глутамата к NMDA рецептор было показано, что причиной+ Na и Cl− приток. Считается, что последующие деполяризации привести к Ca2 + канал открытия и освобождение внутриклеточных Ca2 + хранит4. Это дисфункция вероятно приводит к каскад метаболических нарушений, которые в конечном итоге снижение нейронов распространения, увеличения воспаление и привести к гибели нейронов. Несмотря на эти гипотезы истинный механизм(ы) АЙН остаются неясными5. Из-за его роль в апоптозе глютамат dysregulation представляет новый путь, который может способствовать к механизму ранее документально апоптоза нейронов, особенность АЙН.
Одним из препятствий на исследование нейронов процессов является их высокая сложность, особенно в условиях развития нервной системы. В первые несколько месяцев жизни являются период максимальной подверженности травмы, во время которого большинство из важных шагов нейронов развития таких физиологических апоптоз (нейрональных Обрезка), synaptogenesis, глиогенез и миелинизации занять место6 . Учитывая сложный характер нейронные связи и сложность изучения этих процессов без нарушения нормальной функции ЦНС, новые технологии были разработаны которые направлены в в естественных условиях обнаружения и количественного определения важных элементов нейронные связи.
Энзим соединенный МПС технология была использована в данном исследовании как новый способ для изучения механизмов АЙН в клинически значимых Пятачок модели. Эта технология может использоваться для изучения комплекса в естественных условиях электрохимической мозга процессы, включая глутамата регуляции. Встроенный 4-канальный платины записи сайты МЭС (2 глутамат чувствительных мест и 2 контрольных участках) позволяют ссылающиеся сами на себя, что способствует точность обнаружения. Кроме того слой изоляции применяется для каждого электрода, присвоении избирательности, предотвращая других молекул, мешая будучи обнаружены7. Кроме того Низкопрофильная конструкция МПС позволяет минимальное тканей травм по сравнению с более ранними технологиями. Эта же функция предоставляет МЭС более высоким пространственным разрешением, который облегчает изучение микроскопических регионов в головном мозге. К примеру дискретных областей гиппокампа (зубчатой извилине, СА1, CA2) может быть специально изучал8. Конкретные сведения о функциональности МЭС были ранее описанных9.
По сравнению с МПС электрохимии микродиализом включает в себя мембрану между решение интерес и решение аналогичного состава, позволяя обнаружения внеклеточной жидкости изменяется10. Хотя микродиализом является основой нейрохимии и уже давно используется для обнаружения нейротрансмиттеров, она имеет недостаток низкой время резолюции, задержка обнаружения изменения глутамата, и значительные ткани травмы11.
МЭС косвенно можно обнаружить медиаторы глутамата, ацетилхолина и холин, используя соответствующие оксидазы ферменты, которые производят Электроактивные репортер молекул, таких как H2O2 или O212,13 .
МПС технология широко используется в крыс и нечеловеческих приматов для изучения нейротоксичности в контексте патофизиологических процессов помимо АЙН7,14. Среди некоторых из этих патофизиологических процессов МПС технология была использована для исследования болезни Альцгеймера, эпилепсия, черепно-мозговой травмы, и эффект фармакологических соединений на синаптической связи8,15 , 16 , 17. Хотя МЭС были использованы для изучения этих патологий крыс и нечеловеческих приматов, высокого развития сходство между людьми и Пятачок мозги делает адаптации технологии МПС в поросят метод хорошо подходит для изучения Аин механизм(ы)18.
Protocol
Через местные фермы, предварительно одобренных университета государство Огайо (OSU) институциональные животное уход и использование Комитет (IACUC) получил поросят (Sus scrofa). После утверждения протокола в соответствии с политикой IACUC сделали животных экспериментов.
1. поросят и Пятачок обработка
- Использование мужского и женского пола поросят на основе систематического и рандомизированных для устранения любых потенциальных вмешивающиеся факторы пола в соответствии с руководящими принципами прибытие19.
Примечание: Поскольку период роста максимальной мозга в течение 3-5 дней рождения Пятачок, эксперименты делается исключительно с поросят 3-5 дней. - Убедитесь, что Поросята поступают в виварий по крайней мере 24 часа до экспериментов, чтобы позволить адаптационного для окружающей среды.
Примечание: Ветеринарных специалистов обеспечивает обычного ухода за животными. Поросят хранятся в отдельности поддержание температуры, постоянно Мониторим клетки и получить питательно полная молочных заменитель ad libitum для предотвращения гипогликемии. Поросят также хранятся без замены молока (ноль в ОС), по крайней мере за 3 часа до анестезии и поставляются с одеяла и игрушки для обеспечения нормальных уровней стимуляции. Если это возможно Держите несколько поросят в той же клетке, чтобы позволить социализации.
2. Разработка и адаптация МЭС для AIN исследований в модели Пятачок
Примечание: Эта технология использует на основе ферментов МЭС, которые предварительно покрытых фермента и гальваническим с m фенилендиамином дигидрохлорид (ПДС). Электроды были пользовательских разработана с 40-мм жесткий вал и изготовлен для использования в поросят (рис. 1).
- Чтобы избежать избыточности, смотрите подробное описание MEA подготовка и калибровки как описано15 (рис. 2).
3. анестезия и использование пользовательских стереотаксического аппарата для поросят
- Анестезировать животных с использованием анестезии станции с соответствующим вентилятора и устройства контроля и мониторинга физиологических параметров, таких как пульсоксиметрии, неинвазивная кровяное давление, электрокардиография и температуру на протяжении всего совокупность эксперимента как описано19. Интубации и проветрить поросят и управлять севофлюран анестезии на 1 минимальная альвеолярная концентрация (MAC) (примерно 2,5-3%) для 3,5 ч. обеспечить подготовку лаборантов, которые члены представляют для этих экспериментов. Мех, обволакивающие хирургические области удаляется с помощью Электрические ножницы до подготовки кожи.
Примечание: Концентрация и Продолжительность анестезии используется позволяет эксперимент для имитации продолжительность воздействия фактической анестезии во время хирургической операции. Кроме того севофлюран является наиболее часто используется общая анестезия в педиатрической популяции делая расследования, окружающих его безопасности первостепенное значение. - Перед размещением в стереотаксической рамы, начать rocuronium, загрузкой в дозе 2,5 мг/кг и настой 1,5 мг/кг/ч для предотвращения перемещения животных в то время как обеспечено в кадре.
- Место Поросёнок Пятачок конкретных Стереотаксическая рама раз адекватной глубины анестезии подтверждается мыс пинча.
- Обеспечить достаточное заполнение в стереотаксической рамы, поместив Пятачок на приточно-потепление площадку с дополнительные поля (например, кипящий позиционера) чтобы предотвратить пролежни.
- Место зубы верхней челюсти зубов бар (рис. 3).
Примечание: В баре зуба должна быть на достаточном уровне провести череп очень твердо на месте. - Исправить и затяните проникающее уха баров в уши, заботясь, чтобы убедиться, что Пятачок в срединной позиции. Позиция, заостренными кончиками боковых держит в канал уха и вставить уха баров достаточно прочно, чтобы звук «поп», связанные с проникновением барабанной перепонки. Твердо приложите ухо баров с черепом и вставьте равные глубине на каждой стороне для того, чтобы предотвратить движение черепа во время эксперимента (Рисунок 4Группа A).
Примечание: Это жизненно важно, чтобы согреться Пятачок (~ 37,8-38,6 ° C) и постоянно контролировать температуру в течение всей процедуры для поддержания normothermia. Это может быть достигнуто через в одеяло и/или тепла лампы. Не забудьте поставить светильник жары на соответствующем расстоянии чтобы избежать горения кожи животного.
- Создание 4-6 см срединной линии разреза вдоль черепа с помощью осторожность во избежание скоринга черепа с скальпель. После того, как делается надрез, используйте нежный ретракции и тупым рассечение поднять головы от черепа. Аккуратно скраб черепа с марлевый тампон удалить любой соединительной ткани и разоблачить линии швов (Рисунок 4Группа B).
Примечание: Нет необходимости поддерживать стерильность во время экспериментов-выживание. Однако во время экспериментов выживания должна поддерживаться стерильности. - Далее, отражают волосистой части головы, при необходимости, предоставлять области интересов и определить предполагаемое место для Краниотомия (рис. 5Группа A). Для создания окна краниотомии примерно 0,25 см2 (может быть больше или меньше в зависимости от экспериментальных целей) использовать Дрель хирургическая вышележащих структуры интереса, используя осторожно чтобы не повредить Дура или базовой мозга (Рисунок 5 , Группа B). Используйте тонкой Ножницы хирургические для акцизных Дура, вышележащих тканей мозга (рис. 5Группа C).
- Положение электрода максимально вертикально над bregma, обеспечивая металлические руки headstage к микроманипулятор Пятачок stereotax. Ниже электрод как можно больше, не касаясь поверхности черепа. Запишите координаты bregma (рис. 6Группа A).
- Определить передней задней и боковых медиальной координирует и глубины структуры интереса, как они относятся к bregma. Определите стереотаксического координаты с помощью видов и возрастных стереотаксического Атлас. В этом случае используйте стереотаксического Атлас разработан специально для20поросят.
- Изменить положение электрода, так, что он имеет правильное место передней задней и боковых медиальной, обеспечения того, чтобы микроэлектродные и аппарат перпендикулярно к поверхности. Место электрода псевдо-ссылка под кожу головы, обеспечивая контакт с животным (рис. 6Группа B).
- Медленно и осторожно опустите электрода на соответствующую глубину в мозг, с использованием стереотаксического руку. Для окончательного 2 мм используйте гидравлические microdrive для дальнейшего привод электрода в точное место (рис. 6Группа C).
Примечание: Положение электрода должен покрывают краниотомии окна. Электрод глубина будет варьироваться в зависимости от структуры мозга интерес. Это не нужно закрыть разрез после завершения сбора данных в экспериментах-выживание.
4. Измерение внеклеточного глутамата анестезию севофлюран
- Убедитесь, что Пятачок под непрерывный мониторинг физиологического на протяжении всей этой процедуры. Поросята находятся под наркозом inhalationally (через конус лицом) в рамках подготовки к процедуре.
- После имплантации МПС ждать 30 мин, чтобы позволить электрода для достижения базовой линии для обеспечения точных измерений, которые будут получены для 3 h (рис. 7).
- 0,25% бупивакаин (1 мл/кг) подкожно в месте операции для управления послеоперационной боли. Кроме того устойчивый релиз бупренорфин дается подкожно q72h при необходимости.
5. перфузии и жертвоприношения
- Выполните перфузии и процедуры сбора ткани мозга как описано21. Для операции-выживание животные являются умерщвлены сразу же после экспериментов в то время как все еще под общим наркозом.
- Возьмите брутто сечения фиксированной Пятачок мозга и использовать световой микроскопии для визуализации трек электрода как описано22 разрешить проверки размещения МПС, обеспечение надлежащего размещения в области интереса.
Representative Results
Это доказательство концепции исследование технологией на основе ферментов керамические МПС в модели Пятачок может обеспечить уникальное понимание динамики глутамата лежащие в основе АЙН. Это исследование далее демонстрирует, что фермент MEA-технологии может быть успешно адаптирована в Пятачок модели для измерения физиологических и анестезии связанные изменения активности нейротрансмиттера с высокой чувствительностью и высоким пространственных и временных резолюции. Физиологического гомеостаза сохранялся на протяжении наши эксперименты, используя клинически значимых методов и стандартов, и не Пятачок выставлены знаки физиологического возмущений.
Полученные данные указывает МЭС возможность нейромедиатора измерения в структурах корковых и югу коры мозга решить точно и пространственно. Использование стереотаксического аппарата позволяет четкое определение структуры поверхности ссылку (bregma) для того, чтобы последовательно найти области интереса, независимо от индивидуальных различий в размерах Пятачок и анатомии. Четкой визуализации швов облегчает последовательного регионального размещения МПС с точностью в диапазоне микрометров (рис. 4). Получение доступа к поверхности коры головного мозга является минимально травмирующих с незначительным кровотечением, обеспечения того, чтобы любые динамики в vivo глютамат не из-за непреднамеренного системного или местных оскорбление (рис. 5). Обычай, жесткой МПС затем выравнивается перпендикулярно фронтальной плоскости поросенка (рис. 6). Неспособность правильно согласовать МПС до вставки может предотвратить точных пространственных записи целевого региона, особенно для подкорковых областей.
В реальном времени в vivo глутамата измерения были проведены в гиппокампах 3-4-дневный старые поросят (n = 4) до 2,5-3% севофлюран анестезии (примерно 1 MAC). Amperometry измерения были записаны на 4 Гц и преобразованы в концентрации с использованием линейной регрессии на основе калибровочных параметров (Рисунок 8Группа A). Для каждой точки времени сигналы от двух глутамат чувствительных участках были среднем до вычитания усредненной дозорных сигнал давать сигнал исправленные глутамата. Эти непрерывные измерения были сглажены путем применения скользящего среднего лучше визуализировать общую тенденцию с течением времени (рис. 8Группа B). Среднее базальной глутамата концентрации рассчитывается как 4.61 ± 0,02 мкм и оставались относительно стабильными в течение анестезии воздействия. Переходных глутаматергические деятельность была определена в одно животное, анализируя пики сигнала, которые не связаны с дозорных сигнала (R2 < 0,5) и превысили отношение сигнал шум 3 (рис. 9Группа A). В общей сложности 116 переходных пики были обнаружены в течение 3,5 ч (рис. 10Группа A). Амплитуда результате переходных пиков обычно наблюдалось в пределах 1 мкм (рис. 10Группа B). Для того чтобы измерить продолжительность каждого преходящее, время (80т), необходимое для каждого значения максимальный пик спада 80% был получен (рис. 9Группа B). Средняя t80 всех глутамата транзиентов в период 3,5 часа записи был 4.68 ± 0,82 s (Рисунок 10Группа C). Эти данные показывают, что это можно точно измерить как длительное и переходных нейромедиатора активности в подкорковых регионе наркотизированных Пятачок мозга.
Рисунок 1: визуальное сравнение типов массивов микроэлектродные СГ-2. SG-2 массивы содержат два глутамат чувствительных и две зависящие от глутамата дозорных сайты (150 мкм x 20 мкм на сайте). (A) массив гибкий вал микроэлектродные показано на левой стороне. Грузовик вал микроэлектродные массив был специально разработан для использования в поросят и позволяет глубже имплантации в крупных животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: обзор процесса подготовки и калибровки массива микроэлектродные. Общая подготовка МПС и калибровки последний приблизительно одну неделю. Покрытие фермента, слой изоляции и калибровки аналитов являются специфическими для нейромедиатора интерес. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: размещение Пятачок стереотаксического аппарата. Пятачок рот помещается на рот бар непосредственно кзади клыки. Проникающее баров уха вставляются в каналов уха задний конец черепа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: размещение Пятачок стереотаксического аппарата для краниотомии. (A) Пятачок в голову плотно закреплены в рамках пользовательской стереотаксического, обеспечивая последовательное размещение МПС. Равноотстоящих размещение проникающего уха баров является видимым. (B) разрез передней задней срединной линии вдоль головы. Озвучивание черепа удалось избежать визуализации фронтальная и сагиттальная плоскости швов и оптимизировать визуализацию bregma. Чтобы указать относительный размер разреза и местоположение окна краниотомии показано линейки шкалы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: краниотомии для доступа к гиппокампа. (A) волосистой части головы дальнейшее отражение подвергать приблизительное местоположение вставки МПС по стереотаксического координатам. Кружил область отмечена (черная точка) для руководства краниотомии. (B) окна Краниотомия (0,25 см2) с черепом лоскут удалены для предоставления базовой твердой мозговой оболочки. (C) мозговых оболочек тщательно удалены подвергать поверхностные головного мозга без ткани травмы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: MEA позиционирования и вставки в гиппокампе. (A) размещение в МЭС на bregma чтобы определить относительное расположение стереотаксического гиппокампа. (B) стереотаксического размещение МЭС на поверхности мозга для определения глубины вставки гиппокампа. Электрод псевдо-сравнения Серебряный надежно помещены под головы (указано стрелкой). (C) МПС вставлен на соответствующей глубине для получения в реальном времени, в естественных условиях внеклеточного глутамата измерений в гиппокампе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: MEA поведение в период создания базиса 30-мин. Начальный быстрый рост соответствует происхождения МПС в гиппокампе, используя микроманипулятор. Базовый период начинается после МПС достиг соответствующей глубины (пунктирная линия). Внеклеточные глутамата измерения будет уменьшаться в течение 30 мин и не должно толковаться как физиологический чтений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: измерения в реальном времени внеклеточного глутамата в гиппокампе новорожденных свинья под наркозом севофлюран. (A) скользящего среднего глутамата концентрации в гиппокампе одной неонатальной свинья под наркозом севофлюран (с использованием 10 точек данных). Измерения проводились на 4 Гц за 3 ч после периода создания базиса краткий 30 мин. (B) сглаживание глутамата измерений с помощью скользящего среднего 100 очков каждые 15 мин лучше визуализировать эту тенденцию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9: идентификация деятельности переходных глутамата в гиппокампе новорожденных свинья под наркозом севофлюран. (A) переходных глутамата вершины (в красном) указаны на реальном времени глутамата трассировки. Пики были рассмотрены значительные, когда соотношение сигнал-шум превысил 3 и их сигнал не коррелируется с дозорных сигнала (R2 < 0.5). (B) представительных переходных пик, выявленных в рисунке 9Группа A. Пунктирные линии показывают общей продолжительности, необходимой для пик спада 80%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 10: характеристика глутамата транзиентов в гиппокампе новорожденных свинья под наркозом севофлюран. (A) A количество переходных глутамата пиков в закромах 15 мин. Пики были рассмотрены значительные, когда соотношение сигнал-шум превысил 3 и их сигнал не коррелируется с дозорных сигнала (R2 < 0.5). (B) амплитуды переходных глутамата пиков. Планки погрешностей указывают Среднеквадратичная ошибка среднего значения. (C) означает T80 пиков переходных глутамата. Планки погрешностей указывают Среднеквадратичная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
С самого начала эксперимента Пятачок физиологического гомеостаза должна поддерживаться как описано в этой лаборатории до публикации21. Минимальный мониторинг должен включать пульсоксиметрии, электрокардиография, capnography, неинвазивная кровяное давление и температуру. Подготовленные следователи необходимы, так что физиологического возмущения (например, гипо/гипертермия, гипоксия, гипотония, аритмия) может быть соответствующим образом исправлена.
До зачисления в пробирке МПС калибровок выполняются создать функциональность и избирательности МЭС при известных условиях. Калибровка и обшивка МЭС имеет решающее значение для эффективного использования технологии. Существует много потенциальных ошибок, которые могут возникнуть во время калибровки. Калибровка может идентифицировать эти вопросы, а также ненадлежащего покрытие, что приводит к неправильной interferent ответ. Более подробный отчет табличных ошибок, которые могут произойти в МЭС ответ был составлен, вместе с известные причины и предложены решения, который окажется полезным инструментом вероятность неполадок (Таблица 1). Важно отметить, что до калибровки и обшивка, Стеклянный электрод сравнения должны быть проверены на наличие пузырьков воздуха или белого цвета, как либо негативно повлияет на МПС функции и точность записи.
| Симптом | Причина | Меры по исправлению положения |
| Нет сигнала | Электрод не подключен | Правильно подключите электрод headstage и headstage быстро amperometry систему. |
| Нет питания в системе быстрого amperometry | Включите выключатель питания на задней части быстрые системы | |
| Сигнал-шум | Электрод, загрязненные кровью | Непрерывно орошают поверхности мозга во время вставки электрода |
| Немедленно промойте электрод в dH2O | ||
| Фермент покрытие сыпучих | Чистота и перекрытия электрод | |
| Электрод сравнения не был вставлен или с покрытием | Пальто и место электрод сравнения дальше под кожей головы | |
| Электрод обнаружение движения поверхности мозга | Обычно происходит в поверхностных структур. Если возможно вставить электрода глубже (1 мм за один раз) | |
| Движение животных | Животное неадекватно обеспеченных | Переместите животного в заднем направлении более безопасных earbars на черепе. При необходимости, поднимите туловище для лучшего выравнивания тела. |
| Животное неадекватно под наркозом | Проверьте целостность обезболивающий оборудования. Титруйте анестетика для эффективной дозы и администрировать дозы рокурония внутримышечно (5 мг/кг) | |
| Размещение неточной электрода | Электрод не выровнено | Скорректировать электрода при сохранении надлежащего подключения к headstage. |
| Стереотаксическая координаты являются неточными | Убедитесь, что Пятачок Атлас снабжанными не использовать другой контрольной точки или плоскости выравнивания. | |
| Будьте осторожны, чтобы не скрывать следы швов, забив черепа. |
Таблица 1: использовать инструкции по устранению неполадок МПС в поросят. Возможные причины и меры по исправлению положения для оказания помощи в оптимизации и устранения неполадок.
Стереотаксическая Атлас для поросят используется для определения стереотаксического координаты области интересов в отношении известной точки, такие как bregma18. Ухо баров следует надлежащим образом защищена для обеспечения уровня и полностью обездвиженных черепа. Следует позаботиться при срединной линии разреза кожи головы во избежание забил череп, как это может повлиять на визуализацию линии швов. Краниотомия окно должно быть достаточно большим, чтобы вместить МПС.
Этот протокол представляет собой ряд технических проблем, которые требуют хорошо укомплектованный набор операционных и следователь/команда квалифицированных в хирургической и обезболивающий аспекты протокола. Дополнительно модели представляет финансовые ограничения в том, что Пятачок модель является более дорогим, чем грызунов модель; Однако это значительно менее дорогостоящими, чем использование нечеловеческих приматов, которые могут стоить тысячи долларов. Использование технологии МПС представляет свои собственные проблемы, как процедура покрытия и покрытия электродов вручную требуется квалифицированный следователь или помощник для обеспечения достаточной селективностью и надежные функции. Микроэлектродов, сами являются хрупкими, как они изготовлены из керамики и таким образом легко повреждены, если надлежащей осторожности не наблюдается. А также помехи от других электрических устройств, которые может создать шум в записи и кровь в постановляющей части сайта, которая может загородить записи сайтов микроэлектродов. Потребность в специализированное оборудование представляет дополнительное бремя как стереотаксического хирургические кадр должен быть пользовательские построен для иммобилизации Пятачок череп во время имплантации. Стереотаксическая рама, глютамат оксидазы и электродов, сами все дорого. Кроме того отсутствие Пятачок стереотаксического Атлас из в течение последнего десятилетия создает технические ограничения, которые требуют определенного опыта для определения местоположения глубинных структур мозга Пятачок. Разработка нового стереотаксического Атлас, возможно с помощью магнитно-резонансной томографии, значительно укрепило бы способность использовать эту технологию в поросят.
Пятачок является клинически значимых модель для изучения АЙН во многом благодаря parallels, которые существуют между этой породы и человека новорожденных, как оба имеют аналогичные структуры мозга и развития. В отличие от более широко используемых моделей мышей или крыс Пятачок имеет большее сходство ЦНС с человеком, который одалживает к переводимости результатов модели. Пятачок модель дополнительно дешевле и включает менее сложной обработки чем модель нечеловеческих приматов. Пятачок модель предназначена для изучения процесса, какой наркоз может побудить развитием нейротоксичности, измерить его вклад неврологические повреждения и борьбы с проблемой повреждения, вызванные спутывающих переменных. К примеру гипоксия может быть неправильно за ущерб, причиненный анестетиков, как это имеет глобальное воздействие на мозг. Пятачок используется на тех же условиях хирургического и цистит как те, которые используются в человеческой медицине для обеспечения точности результатов.
Использование технологии МЭС на керамической основе устраняет ряд недостатков, связанных с современной техникой микродиализом. Микродиализом имеет ограниченную временнóго и пространственного разрешения по сравнению с Амперометрическое методы, такие как МПС, который непрерывно может записывать события глутамата в нескольких, микроскопические регионов до 10 Гц-23. Этот быстрый дискретизации устраняет смешанным фактором локализованных нейромедиатора диффузии, которая присуща методы медленно выборки как микродиализом24. Кроме того МПС является менее инвазивным методом, чем микродиализом зонд, который может вызвать значительные глиоза во время вставки и может изменять активность нейромедиатора вставки сайт22.
Предыдущие исследования, используя широкий спектр млекопитающих моделей, методов измерения и областей мозга, продемонстрировали базальной глутамата уровня, сопоставимого с найденными, используя эту технику. Это свидетельствует о том, что МПС технологии, когда адаптированы к модели Пятачок, обеспечивает допустимых записей в vivo глутамата концентрации (Таблица 2).
| Автор (год) | Техника записи | Модели на животных | Возраст | Мозг регион(ы) | Средняя концентрация базальной глутамата (мкм) |
| Hascup et al. (2008)23 | МПС (на основе ферментов) | Грызун | 20 - 24 недели | Префронтальной коры, Полосатое тело | 3.3 ± 1.0; 5,0 ± 1,2 |
| Hascup et al. (2010)25 | МПС (на основе ферментов) | Грызун | 3 - 6 месяцев | Гиппокамп | 4.7-10.4 |
| Резерфорд et al. (2007)9 | МПС (на основе ферментов) | Грызун | 3 - 6 месяцев | Префронтальной коры, Полосатое тело | 44.9 ± 4,7; 7,3 ± 0,9 |
| Miele et al. (1996)26 | Микродиализом (на основе ферментов) | Грызун | - | Полосатое тело | 3.6 ± 0,5 |
| 27 день et al. (2006) | МПС (на основе ферментов) | Грызун | 3 - 6 месяцев | Лобной коры, Полосатое тело | 1.6 ± ± 0,2 0,3; 1,4 |
| Кинтеро – et al. (2007)28 | МПС (на основе ферментов) | Не - человека приматов | 5.3-5.5 лет | Премоторной коры, моторной коры | 3,8 ± 1,7; 3.7 ± 0,9 |
| Стивенс и др. (2010) 29 | МПС [Спенсер Gerhardt-2 (SG-2)] | Не - человека приматов | 11 - 21 лет | Путамен | 8.53 |
| Кодама et al. (2002)30 | Микродиализом (на основе ферментов) | Не - человека приматов | - | Префронтальной коры | 1.29-2.21 |
| GALVAN et al. (2003)31 | Микродиализом (на основе ферментов) | Не - человека приматов | Несовершеннолетних | Полосатое тело | 28.74 ± 2,73 |
| Во время и Спенсер (1993)32 | Микродиализом (на основе ферментов) | Человека | 18 - 35 лет | Гиппокамп | 20.3 ± 6,6 |
| Reinstrup et al. (2000)33 | Микродиализом (на основе ферментов) | Человека | - | Лобной коры | 16 ± 16 |
| Cavus et al. (2005)34 | Микродиализом (на основе ферментов) | Человека | 15 - 52 лет | Новая кора | 2.6 ± 0,3 |
В таблице 2. Сравнение базальной внеклеточного глутамата levelsacross различные животные модели. Выбранного обзор исследований, установления нормальных внеклеточного глутамата уровней в здоровых бодрствовать и осознающие животных, с использованием микродиализом или микроэлектродов.
Использование технологии МПС для мониторинга в vivo глутамата концентрации в Пятачок модели может позволить для будущей оценки Пятачок неврологических осложнений после анестезии. Выживание эксперименты были запланированы, которая будет дальнейшее понимание долгосрочных последствий анестезии на нейрокогнитивный благосостояние человека новорожденных. Выживание эксперименты позволит для поведенческого тестирования и мониторинга глутамата изменяется после анестезии экспозиции. Это также часто для детей наркоз в условиях, где они могут испытывать физиологический стресс в виде хирургического вмешательства. Будущие исследования, касающиеся влияния хирургии с точки зрения неврологические травмы и увеличения в нейротоксичности позволит более точное моделирование общих клинических условиях для детей. Возможна также использование альтернативных животных моделей, как изучение этих различных моделей через хронический имплантации, что позволяет нам отслеживать поведенческие изменения, связанные с нейротоксичности. Сама технология МПС является универсальным, так что будущего исследования не должны ограничиваться анализ уровня глутамата (например, ГАМК, холин, лизина и т.п. могли бы быть проанализированы).
Disclosures
Грег Gerhardt является основным владельцем Quanteon LLC. Хорхе Кинтеро и Джейсон Бурмайстер служили консультанты ООО «Quanteon».
Acknowledgments
Авторы хотели бы признать вклад Университета Кентукки центр технологии микроэлектродные (CenMeT) и Огайо государственного университета лабораторных животных ресурсов центр (УЛАР).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advance Liqui-Wean Pig Milk Replacer | PBS Animal Health | 292-13 | |
| Piglet Anesthesia Face-Cone Mask | VetEquip | 921428 | |
| Integra SL Anesthesia Workstation | DRE Veterinary | 2350 | This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention. |
| Sevoflurane | Ultane | 0074-4456-04 | |
| Rocuronium Bromide Injection | Hospira | 0409-9558-05 | |
| Medfusion 4000 IV Infusion | Smiths Medical | ||
| Model 1530 Heavy-Duty Research Model Stereotax | Kopf | custom made | |
| Model 1541 Piglet Adaptor | Kopf | custom made | |
| Infrared Spot Lamp | Amazon | B000HHQ94C | |
| Bair Hugger Torso Blanket | 3M | 540 | |
| Bair Hugger | 3M | 750 | |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Fisherbrand | 22-363-750 | |
| Carbon Steel Rib-Back Surgical Blade | Bard-Parker | #10 | |
| Scalpel Handel | Havel's | HAN-G4 | |
| Surgical Scissors | World Precision Instruments | 504615 | |
| Mosquito Forceps | Sklar Surgical Instruments | 17-1225 | |
| Gauze Pads | Fisherbrand | 22-246-069 | |
| Adson Tissue Forceps | Teleflex | 181223 | |
| Dremel 111 Engraving Cutter | Amazon | Dremel 111 | |
| Microelectrode Array | Center for Microelectrdoe Technology, University of Kentucky | S2 4Ch MEA; custom made | |
| Headstage | Quanteon | 2pA/mV | |
| Wire, silver, PFA, .008" Bare, .0110" coated | A-M Systems | 786500 | |
| Fine Micromanipulator | Narishige Scientific Instrument Lab | MO-8 |
References
- Hall, M. J., DeFrances, C. J., Williams, S. N., Golosinskiy, A., Schwartzman, A. National hospital discharge Survey: 2007 summary. Natl Health Stat Report. (29), 1-24 (2010).
- Ikonomidou, C., et al. Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science. 283 (5398), 70-74 (1999).
- Mattson, M. P. Glutamate and neurotrophic factors in neuronal plasticity and disease. Ann N Y Acad Sci. 1144 (1), 97-112 (2008).
- Atlante, A., et al. Glutamate neurotoxicity, oxidative stress and mitochondria. FEBS Lett. 497 (1), 1-5 (2001).
- Kavitha, J., Durga, P., Ramachandran, G. Inhalational agents in anesthesia induced developmental neurotoxicity - Recent advances. Trends in Anaesthesia and Critical Care. 11 (1), 14-18 (2016).
- Zanghi, C. N., Jevtovic-Todorovic, V. A holistic approach to anesthesia-induced neurotoxicity and its implications for future mechanistic studies. Neurotoxicol Teratol. 60 (2), 24-32 (2017).
- Fan, X., et al. In situ real-time monitoring of glutamate and electrophysiology from cortex to hippocampus in mice based on a microelectrode array. Sensors (Basel). 17 (1), 1-8 (2016).
- Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
- Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Strömberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
- Benveniste, H.
- Kohno, T., et al. An improved method for the detection of changes in brain extracellular glutamate levels. J Neurosci Methods. 81 (1-2), 199-205 (1998).
- Hascup, K. N., Hascup, E. R. Electrochemical techniques for subsecond neurotransmitter detection in live rodents. Comp Med. 64 (4), 249-255 (2014).
- Rooij, N. F., Koudelka-Hep, M., Frey, O. Biosensor microprobe array for in vivo monitoring of neurotransmitters. EPFL. , Lausanne. (2010).
- Fan, X. T., et al. Cortical glutamate levels decrease in a non-human primate model of dopamine deficiency. Brain Res. 1552, 34-40 (2014).
- Hunsberger, H. C., et al. Using enzyme-based biosensors to measure tonic and phasic glutamate in Alzheimer's mouse models. J Vis Exp. (123), (2017).
- Hill, A. J., Jones, N. A., Williams, C. M., Stephens, G. J., Whalley, B. J. Development of multi-electrode array screening for anticonvulsants in acute rat brain slices. J Neurosci Methods. 185 (2), 246-256 (2010).
- Defranchi, E., et al. Feasibility assessment of micro-electrode chip assay as a method of detecting neurotoxicity in vitro. Front Neuroeng. 4 (6), (2011).
- Whitaker, E. E., et al. Use of a piglet model for the study of anesthetic-induced developmental neurotoxicity (AIDN): A translational neuroscience approach. J Vis Exp. (124), (2017).
- Kilkenny, C., et al. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Salinas-Zeballos, M., Ceballos, G., Gootman, P. A stereotaxic atlas of the developing swine (Sus scrofa) forebrain. , 887-906 (1986).
- Whitaker, E. E., et al. A novel, clinically relevant use of a piglet model to study the effects of anesthetics on the developing brain. Clin Transl Med. 5 (1), (2016).
- Hascup, E. R., et al. Histological studies of the effects of chronic implantation of ceramic-based microelectrode arrays and microdialysis probes in rat prefrontal cortex. Brain Res. , 12-20 (2009).
- Hascup, K. N., Hascup, E. R., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Second-by-second measures of L-Glutamate and other neurotransmitters using enzyme-based microelectrode arrays. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 324 (2), 725-731 (2008).
- Rice, M. E., Cragg, S. J. Dopamine spillover after quantal release: rethinking dopamine transmission in the nigrostriatal pathway. Brain Res Rev. 58 (2), 303-313 (2008).
- Hascup, E. R., et al. Rapid microelectrode measurements and the origin and regulation of extracellular glutamate in rat prefrontal cortex. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1608-1620 (2010).
- Miele, M., Boutelle, M. G., Fillenz, M. The source of physiologically stimulated glutamate efflux from the striatum of conscious rats. J Physiol. 497 (Pt 3), 745-751 (1996).
- Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), 1626-1635 (2006).
- Quintero, J. E., et al. Amperometric measures of age-related changes in glutamate regulation in the cortex of rhesus monkeys. Exp Neurol. 208 (2), 238-246 (2007).
- Stephens, M. L., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A., Zhang, Z. Real-time glutamate measurements in the putamen of awake rhesus monkeys using an enzyme-based human microelectrode array prototype. J Neurosci Methods. 185 (2), 264-272 (2010).
- Kodama, T., Hikosaka, K., Watanabe, M. Differential changes in glutamate concentration in the primate prefrontal cortex during spatial delayed alternation and sensory-guided tasks. Exp Brain Res. 145 (2), 133-141 (2002).
- Galvan, A., Smith, Y., Wichmann, T. Continuous monitoring of intracerebral glutamate levels in awake monkeys using microdialysis and enzyme fluorometric detection. J Neurosci Methods. 126 (2), 175-185 (2003).
- During, M. J., Spencer, D. D. Extracellular hippocampal glutamate and spontaneous seizure in the conscious human brain. Lancet. 341 (8861), 1607-1610 (1993).
- Reinstrup, P., et al. Intracerebral microdialysis in clinical practice: baseline values for chemical markers during wakefulness, anesthesia, and neurosurgery. Neurosurgery. 47 (3), 701-710 (2000).
- Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
