Summary
מחקר זה בוחן את השימוש הרומן מבוססי אנזים microelectrode טכנולוגיית מערך (מאה) כדי לעקוב אחר ויוו עצבי פעילות מטילי יסודי. ההשערה הייתה ש-dysregulation גלוטמט הזה תורם המנגנון של הרדמה neurotoxicity. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להסתגל MEA הטכנולוגיה כדי לחקור את המנגנון של הרדמה-induced neurotoxicity.
Abstract
בכל שנה, מיליוני ילדים עוברים הרדמה עבור מספר רב של הליכים. עם זאת, מחקרים בבעלי חיים ובבני יש בסימן שאלה את הבטיחות של הרדמה אצל ילדים, שמערבות הרדמה כמו רעיל למוח בשלבי פיתוח. נכון להיום, אין מחקרים בהצלחה מבואר את mechanism(s) על ידי הרדמה אשר עשוי להיות העצבים. מחקרים שנעשו בבעלי חיים לאפשר חקירה של מנגנונים אלה, ומייצגות חזירונים neonatal מודל מצויין ללמוד אפקטים אלה בשל דמיון התפתחותית מרשימה שלהם למוח האנושי.
פרוטוקול זה מסתגל השימוש של טכנולוגיית מערך (מאה) מבוססי אנזים microelectrode דרך מקורית כדי ללמוד את mechanism(s) של הרדמה-induced neurotoxicity (לימור). אותי לאפשר ניטור בזמן אמת של ויוו עצבי פעילות ומציעים טמפורלית יוצאת דופן ופתרון מרחבית. זה זה שיערו כי neurotoxicity הרדמה נגרמת באופן חלקי על ידי גלוטמט dysregulation ולהציע לי שיטה למדידת גלוטמט. מימוש טכנולוגיה MEA במודל של חזרזיר הרומן מציג הזדמנות ייחודית המחקר של לימור.
Introduction
בכל שנה, מיליוני ילדים עוברים הרדמה עבור שגרות פולשני ו פולשני ארה ב1. במשך שנים, ספקי הרדמה יש הרגיע את ההורים של הבטיחות של חומרי הרדמה, אפילו אצל ילדים קטנים neonates. עם זאת, בשנת 1999 התברר ארעי זה חסימה של המשנה N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) של רצפטורים גלוטמט במהלך התקופה המוקדמת בחיים עלול לגרום אפופטוזיס עצביים נרחבת חולדות2. לאחרונה, ה-FDA שוחרר תקשורת בטיחות התרופה שיחייבו את התוויות של הרדמה כדי לכלול אזהרה על הרדמה כללית, שלהם פוטנציאל השפעה שלילית על המוח המתפתח של ילדים מתחת לגיל 3 שנים (המזון, והתרופות האמריקני, 2017). עם זאת, יש עדיין צורך להבהיר מנגנונים אפשריים ואמצעים neuroprotective פוטנציאליים.
מפעילות רגילה של נוירוטרנסמיטרים גלוטמט ו חומצה גאמא אמינו בוטירית (GABA) הם קריטיים עבור neurodevelopment הרגיל להתרחש. רוב המסלולים המעורבים AIN אמנם עדיין חמקמקה, מוליך עצבי מערכות סביר מאוד להיות מעורבת מאז הרדמה ידועים כדי לווסת את המסלולים הללו לייצר חוסר הכרה. בפרט, עצבי סינאפסות גלוטמט גורם excitotoxicity כאשר פעילותה הוא dysregulated. בדרך כלל מעורב הזה עצבי נוירוג'נסיס, פלסטיות עצבית, בצמיחה סינפטית והעצבים, מספר פונקציות אחרות במוח חשובה ביותר. עם זאת, הפעלה ממושכת של רצפטורים גלוטמט יכול לגרום excitotoxicity אפופטוזיס עצביים, במיוחד בתנאים סטרס כגון ניתוח, מחסור בחמצן, זמינות אנרגיה מופחתת3. עקדת גלוטמט ל NMDA קולטן הוכח לגרום Na+ ו Cl− זרם. דפולריזציה הבאים נחשב להוביל Ca2 + פתיחת ערוץ ומאחסן שחרורו של Ca תאיים2 + 4. זה תפקוד סביר מוביל מפל של derangements מטבולית אשר בסופו של דבר להקטין את תפוצת עצביים להגדיל דלקת, להוביל למוות עצביים. למרות השערות אלה, mechanism(s) האמיתית של לימור נשאר לא ברור5. בשל אפופטוזיס, גלוטמט dysregulation מייצג שביל הרומן שעשויים לתרום המנגנון של אפופטוזיס עצביים תועדו בעבר, תכונה של לימור.
אחד מכשולים על חקר תהליכים עצביים הוא והמורכבות שלהם גבוהה, במיוחד בסביבה של ההתפתחות העצבית. בחודשים הראשונים של החיים הם התקופה של פגיעות מקסימלי לפגיעה, במהלך אשר רוב הצעדים החשובים להתפתחות העצבית כגון הפיזיולוגיות אפופטוזיס (גיזום עצביים), synaptogenesis, gliogenesis ו- myelination לקחת מקום6 . לאור האופי המורכב של תקשורת עצביים ואת הקושי של הלומדים תהליכים אלה מבלי לשבש את פעולת תפקוד תקין של מערכת העצבים המרכזית, טכנולוגיות חדשות פותחו אשר לכוון ויוו זיהוי, כימות של הרכיבים החשובים תקשורת עצביים.
מקושרים-אנזים טכנולוגיה MEA שימש במחקר זה דרך מקורית כדי לחקור את המנגנונים של לימור במודל של חזרזיר הרלוונטית קלינית. טכנולוגיה זו ניתן ללמוד מורכבים ויוו אלקטרוכימי תהליכים מוחיים, כולל dysregulation גלוטמט. האתרים incorporated 4 ערוצים הקלטה פלטינה של אותי (2 אתרי גלוטמט רגיש ואתרי סנטינל 2) מאפשרים הכוללות הפניה עצמית, אשר תורמת דיוק הזיהוי. בנוסף, רובד הדרה מוחל על כל אלקטרודה, ומעניקה סלקטיביות על ידי מניעת מולקולות אחרות מפריעות להיות מזוהה7. יתר על כן, מאפשר עיצוב פרופיל נמוך של כר הדשא טראומת רקמות מינימלי לעומת טכנולוגיות קודמות. תכונה זו זהה מקנה מרעה רזולוציה מרחבית גבוהה יותר, המאפשרת לימוד מיקרוסקופיים אזורים במוח. לדוגמה, אזורים נפרדים של ההיפוקמפוס (משוננת הפיתול, CA1, CA2) יכול להיות במיוחד למד8. פרטים ספציפיים על הפונקציונליות של לי כבר שתואר לעיל9.
בהשוואה MEA אלקטרוכימיה, microdialysis משלבת קרום בין הפתרון עניין ומשנה פתרון קומפוזיציה דומה, המאפשר זיהוי של נוזל חוץ-תאי10. למרות microdialysis הוא עמוד התווך של נוירוכימיה ארוך שימש איתור של נוירוטרנסמיטרים, יש לו את החיסרון של נמוך זמן ברזולוציה, גילוי מושהה של שינוי גלוטמט ו- טראומה לרקמות משמעותי11.
אותי יכול לזהות בעקיפין נוירוטרנסמיטורים כגון גלוטמט, אצטילכולין, כולין, באמצעות אנזימים אוקסידאז המתאים לייצר מולקולות כתב electroactive כגון H2O2 או O212,13 .
טכנולוגיית MEA כבר בשימוש נרחב לחקר neurotoxicity בהקשר של תהליכים הקשורים pathophysiological למעט AIN7,14חולדות, קופים. בקרב חלק תהליכים הקשורים pathophysiological אלה, MEA טכנולוגיה שימש לחקר מחלת אלצהיימר, אפילפסיה, פגיעה מוחית טראומטית, ועל ההשפעה של תרכובות תרופתי סינפטית תקשורת8,15 , 16 , 17. למרות שימשו אותי ללמוד פתולוגיות אלה חולדות, קופים, הדמיון התפתחותית גבוהה בין בני אדם החזירון המוח הופך העיבוד של הטכנולוגיה MEA מטילי יסודי טכניקה מתאימה במיוחד לצורך המחקר לימור mechanism(s)18.
Protocol
חזירונים (Sus scrofa) נקלטים דרך חווה המקומי מראש שאושר על ידי אוניברסיטת מדינת אוהיו (אוסו) טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה (IACUC). לאחר האישור של הפרוטוקול, experimentations בעלי חיים נעשים בהתאם למדיניות IACUC.
1. חזירונים וטיפול חזרזיר
- לנצל את החזרזירונים זכר ונקבה באופן אקראי ושיטתית לחסל את כל confounders פוטנציאליים מבוסס-סקס על פי הנחיות יגיעו19.
הערה: מאז תקופת הצמיחה המוח מקסימלי תוך 3-5 ימים הלידה חזרזיר, ניסויים נעשית אך ורק עם חזירונת בן 3-5 ימים. - ודא חזירונים מגיעות ביבר לפחות 24 h לפני ניסויים כדי לאפשר להתאקלמות לסביבה.
הערה: צוות וטרינרי מיומן מספק טיפול בבעלי חיים שגרתיים. החזרזירים מוחזקים בכלובים מנוטרים באופן רציף, לשמור על טמפרטורה בנפרד ולקבל תחליף חלב השלמה תזונתית ad libitum למניעת היפוגליקמיה. החזרזירים נשמרים גם ללא תחליף חלב (אפס לכל מערכת הפעלה), במשך לפחות 3 שעות לפני ההרדמה, מסופקות עם שמיכות וצעצועים כדי להבטיח רמות נורמליות של גירוי. במידת האפשר, שמור חזירונים מרובים באותו הכלוב כדי לאפשר תהליכי חיברות.
2. פיתוח והתאמה של אותי ללימודי AIN במודל של חזרזיר
הערה: טכנולוגיה זו משתמשת מבוססי אנזים אותי כי הם מצופים מראש אנזים electroplated עם m-phenylenediamine dihydrochloride (mPD). האלקטרודות היו מותאמים אישית מעוצבת עם מוט קשיח 40 מ מ, מיוצרים לשימוש חזירונים (איור 1).
- כדי להימנע יתירות, אנא ראה שתיאור מפורט של הכנה MEA וכיול כאמור תיאר15 (איור 2).
3. הרדמה ושימוש של המנגנון Stereotaxic מותאם אישית עבור לופז
- עזים ומתנגד חיות באמצעות תחנת העבודה של הרדמה ההנשמה המתאים וניטור מכשירים ונטר הפיזיולוגיות פרמטרים כגון אוקסימטר, לחץ דם לא פולשנית, אלקטרוקרדיוגרם וטמפרטורה ברחבי כאמור, מכלול של הניסוי תיאר19. לצנרר, לאוורר את החזרזירונים ולפקח sevoflurane הרדמה בבית 1 ריכוז מכתשי מינימלי (MAC) (כ 2.5-3%) עבור ה 3.5 ודא לבורנטים מיומנים חברי הם מתנה ניסויים אלה. פרווה המכסים שהאזור הכירורגי מוסר באמצעות קוצץ חשמלי לפני הכנה של העור.
הערה: ריכוז והמשך של הרדמה המשמש מאפשר את הניסוי לדמות את אורך הזמן החשיפה בפועל הרדמה במהלך הליך כירורגי. בנוסף, sevoflurane הוא הכי מנוצל בדרך כלל בהרדמה כללית באוכלוסיית ילדים ביצוע החקירה המקיפה שלה בטיחות בעל חשיבות עליונה. - לפני השמה למסגרת stereotaxic, מתחילים rocuronium טעינה במינון של 2.5 מ"ג/ק"ג, אינפוזיה של 1.5 mg/kg/שעה כדי למנוע תנועת בעלי חיים בזמן מאובטח במסגרת.
- המקום חזרזיר חזרזיר ספציפיות במסגרת stereotaxic, ברגע עומק נאותה של הרדמה אושר על ידי הבוהן-קורט.
- מספקים ריפוד נאותה בתוך מסגרת stereotaxic על-ידי הצבת את חזרזיר על משטח התחממות כדור הארץ בכוח-אייר עם ריפוד נוסף (למשל, fluidized positioner) כדי למנוע לחץ כיבים.
- מיקום השיניים של הלסת התחתונה העליון מעל השן בר (איור 3).
הערה: הבר השן צריך להיות ברמה מספיקה כדי להחזיק את הגולגולת מאוד בחוזקה במקום. - לתקן והדק את הסורגים האוזן חודר בתוך האוזניים, מטפל על מנת להבטיח כי לופז במצב קו האמצע. מיקום קצות המחודד לרוחב מחזיק בתוך תעלת האוזן, הוספה האוזן ברים בחוזקה מספיק כדי לשמוע את הצליל "פופ" הקשורים עם חדירת התוף. לצרף את הסורגים האוזן הגולגולת וביציבות להוסיף עומק שווה מכל צד כדי למנוע תנועה של הגולגולת במהלך הניסוי (איור 4פאנל A).
הערה: זה חשוב מאין כמותו לחמם את חזרזיר (~ 37.8-38.6 מעלות צלזיוס), לפקח באופן רציף את הטמפרטורה במהלך ההליך כולו לצורך תחזוקה של normothermia. זה יכול להיות מוכשר ויה שמיכה ו/או מנורת חימום. הקפד למקם את החיה האכזרית המרחק המתאים כדי למנוע שריפת העור של החיה.
- ליצור חתך קו האמצע 4-6 ס מ לאורך הגולגולת באמצעות התראה כדי להימנע הבקיע את הגולגולת עם האזמל. לאחר החיתוך, השתמש הכחשה עדין עמום כדי לרומם את הקרקפת מהגולגולת. לשפשף בעדינות את הגולגולת עם כרית גזה להסיר את כל רקמת ולחשוף את קווי תפר (איור 4לוח ב').
הערה: אין צורך לשמור על עקרות במהלך הניסויים ההישרדות. עם זאת, עקרות חייבת להישמר במהלך הניסויים הישרדות. - בהמשך משקפים את הקרקפת, במידת הצורך לחשוף את תחום העניין ולקבוע את המיקום המיועד הניתוח (איור 5פאנל A). השתמש תרגיל ניתוח ליצירת חלון גולגולת של 0.25 ס מ2 (עשוי להיות גדול יותר או קטן יותר בהתאם מטרות הניסוי) המכסים את המבנה של עניין, שימוש זהירות לא לפגוע השכבה הקשה של המוח או המוח המשמשים כבסיס (איור 5 , פאנל B). השתמש בסדר מספריים כירורגיים לסלק את דורא המכסים על רקמת המוח (איור 5לוח ג).
- הצב האלקטרודה שפרושות אנכית ככל האפשר bregma על-ידי אבטחת בזרוע המתכת של headstage micromanipulator של stereotax חזרזיר. להוריד את האלקטרודה ככל האפשר מבלי לגעת במשטח של הגולגולת. להקליט את הקואורדינטות של bregma (איור 6פאנל A).
- לקבוע את הקדמי-את ישבנה ואת הצד המדיאלי מרכזת כמו גם העומק של המבנה עניין בזיקה bregma. לקבוע את נקודות הציון stereotaxic באמצעות מינים אטלס stereotaxic בגיל המתאים. במקרה זה, שימוש על האטלס stereotaxic פותח במיוחד עבור חזירונים20.
- מיקום מחדש של האלקטרודה כך יש את הקדמי-את ישבנה ואת הצד המדיאלי מיקומו הנכון, להבטיח כי גם את microelectrode וגם את המנגנון הם בניצב למשטח. המקום האלקטרודה הפניה מדומה תחת הקרקפת, הבטחת קשר עם החיה (איור 6לוח ב').
- לאט ובעדינות, להוריד את האלקטרודה לעומק המתאים למוח באמצעות הזרוע stereotaxic. סופי 2 מ מ, לשימוש microdrive הידראולי לכונן נוספת האלקטרודה את המיקום המדויק (איור 6לוח ג).
הערה: המיקום אלקטרודה צריך החמים החלון גולגולת. העומק אלקטרודה ישתנו בהתאם למבנה המוח של ריבית. אין צורך לסגור את החתך עם השלמת איסוף הנתונים בניסויים ההישרדות.
4. מדידה של גלוטמט חוץ-תאית תחת הרדמה Sevoflurane
- ודא חזרזיר תחת ניטור הפיזיולוגיות רציף לאורך כל מכלול של הליך זה. החזרזירים הם מרדימים inhalationally (דרך הפנים חרוט) לקראת ההליך.
- לאחר ההשתלה של כר הדשא, המתן 30 דקות כדי לאפשר האלקטרודה להגיע בסיסית כדי להבטיח כי מדידה נכונה ניתן להשיג עבור 3 h (איור 7).
- 0.25% נמשך (1 מ"ל/ק"ג) ניתנת subcutaneously באתר של הניתוח לניהול כאב לאחר הניתוח. בנוסף, שחרור-מתמשכת הבופרנורפין ניתנת subcutaneously q72h לפי הצורך.
5. זלוף והקרבה
- ביצוע ההליכים אוסף רקמה זלוף והמוח כפי שתואר לעיל21. עבור ניתוחים ההישרדות, בעלי החיים מורדמים מיד לאחר ניסויים בזמן עדיין תחת הרדמה כללית.
- קח ברוטו חתכי רוחב של המוח חזרזיר קבוע ולהשתמש מיקרוסקופ אור לדמיין המסלול של האלקטרודה כפי שתואר לעיל22 כדי לאפשר אימות של מיקום MEA, להבטיח השמה נכונה באזור עניין.
Representative Results
מחקר זה הוכחה הרעיון עם אנזים קרמיקה MEA טכנולוגיה מבוססת במודל של חזרזיר יכול לספק הצצה נדירה הדינמיקות גלוטמט המשמש כבסיס לימור. מחקר זה בהמשך מדגים כי ניתן להתאים בהצלחה טכנולוגיה מבוססת אנזים MEA במודל חזרזיר למדוד שינויים הפיזיולוגיות, הרדמה-הקשורים בפעילות עצבי עם רגישות גבוהה, וגבוה יכולות רזולוציה. הומאוסטזיס הפיזיולוגיות נשמר לאורך כל הניסויים שלנו באמצעות שיטות הרלוונטית קלינית ותקנים, חזרזיר לא הציג סימני לפליטת הפיזיולוגיות.
הנתונים שהתקבלו מציין את היכולת של לי לפתור בדיוק והמרגשים מידות עצבי מוח קליפתי ולא תת קורטיקליים. השימוש מנגנון stereotaxic מאפשר זיהוי ברור של מבנה השטח הפניה (bregma) על מנת לאתר באופן עקבי את האזור של עניין, ללא קשר להבדלים בודדים אנטומיה ובגודל של חזרזיר. ברור ויזואליזציה של התפרים מקלה על עקבי ההשמה האזורי של כר הדשא עם דיוק בטווח מיקרומטר (איור 4). קבלת גישה אל פני השטח בקליפת המוח של המוח מהווה טראומה מינימלית עם דימום זניח, ולהבטיח כי כל הדינמיקה גלוטמט ויוו אינם עקב עלבון מקומית או מערכתית לא מכוונת (איור 5). מותאם אישית, נוקשה כר הדשא ואז מיושר בניצב למישור הקדמית של לופז (איור 6). כשל כדי ליישר כהלכה את כר הדשא לפני הכניסה עשוי למנוע הקלטה המרחבי מדויק של האזור יישוב, במיוחד עבור אזורים subcortical.
צולמו בזמן אמת אין ויוו גלוטמט מדידות את hippocampi של חזירונים בת 3-4 ימים (n = 4) תחת הרדמה sevoflurane 2.5-3% (כ 1 MAC). מדידות Amperometry הוקלט ב- 4 הרץ, המרה הריכוז באמצעות רגרסיה ליניארית בהתבסס על פרמטרים כיול (איור 8פאנל A). עבור כל נקודת זמן, האותות של שני האתרים הרגישים גלוטמט היו בממוצע לפני החסרת האות סנטינל בממוצע להניב אות גלוטמט המתוקן. מדידות רציפה אלה היו החליק על-ידי החלת ממוצע נע משופרת של המגמה הכללית לאורך זמן (איור 8לוח ב'). ריכוז גלוטמט הבזליים מרושע היה מחושב כדי להיות 4.61 ± 0.02 µM, נשאר יציב יחסית במהלך החשיפה הרדמה. פעילות glutamatergic ארעי זוהה חיה אחת על-ידי ניתוח פסגות בתוך האות לא היו בקורלציה עם האות בלוטת הזקיף (R2 < 0.5) וחרג יחס אות לרעש של 3 (איור 9פאנל A). סך של פסגות ארעי 116 אותרו על פני תקופה של 3.5 h (איור 10פאנל A). משרעת של הפסגות ארעי וכתוצאה מכך נצפתה בדרך כלל להיות בטווח 1 מיקרומטר (איור 10לוח ב'). על מנת לכמת את משך כל ארעי, משך הזמן (t80) הנדרש עבור כל ערך מרבי שיא להירקב 80% הושג (איור 9לוח ב'). T כלומר80 של כל תופעות מעבר גלוטמט בתקופת הקלטת 3.5 h היה 4.68 ± 0.82 s (איור 10לוח ג). נתונים אלה להדגים שאפשר למדוד באופן מדויק בשני פעילות ממושכת וחולף עצבי באזור subcortical של המוח חזרזיר מרדימים.
איור 1: השוואה חזותית של ס ג-2 סוגי מערכים microelectrode. ס ג-2 מערכים מכילים שני אתרים גלוטמט רגיש סנטינל גלוטמט-רגישות שני אתרים (150 מיקרומטר מיקרומטר x 20 לכל אתר). (A) מערך גמיש פיר microelectrode מוצג בצד השמאל. המערך נוקשה פיר microelectrode היה ואקסקלוסיביות המותאמות לשימוש בהשרשה עמוק החזרזירים ואת ההיתרים בבעלי חיים גדולים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: סקירה של תהליך ההכנה וכיול של מערך microelectrode. כיול והכנה MEA הכולל מעמד כשבוע. ציפוי אנזים אי-הכללה של השכבה, כיול analytes הספציפיים נוירוטרנסמיטר עניין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: המיקום של חזרזיר במנגנון stereotaxic. הפה חזרזיר מושם על הפה בר האחורי ישירות לשיניים הכלבים. פסי האוזן חודר מוכנסים לתוך תעלות האוזן כדי לאבטח את הקצה האחורי של הגולגולת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: המיקום של חזרזיר במנגנון stereotaxic עבור גולגולת. (א) חזרזיר של הראש בחוזקה מאובטח בתוך מסגרת stereotaxic מותאם אישית, להבטיח השמה עקבית של כר הדשא. מיקום קו מקביל של ברים האוזן חודר מוצגת. (B) קו האמצע החתך הקדמי-אחוריים לאורך הקרקפת. הניקוד של הגולגולת היה נמנע כדי להמחיש את התפרים הילתית ואת הווריד ולמטב ויזואליזציה של bregma. סרגל קנה מידה מוצג כדי לציין את הגודל היחסי של החתך ואת המיקום של חלון גולגולת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: גולגולת עבור גישה אל ההיפוקמפוס. (א) הקרקפת נוסף בא לידי ביטוי לחשוף את המיקום המשוער של ההוספה MEA על פי קואורדינטות stereotaxic. חגו באזור מסומן (נקודה שחורה) להנחות את הניתוח. דש (ב') החלון גולגולת (0.25 ס מ2) עם הגולגולת הוסר כדי לחשוף את הדורה המשמש כבסיס. (C) קרומי המוח להסיר בזהירות כדי לחשוף את קליפת שטחיים ללא טראומה לרקמות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: MEA מיצוב והוספה בהיפוקמפוס אל. (א) השמה של MEA-bregma כדי לקבוע את מיקום stereotaxic היחסית של ההיפוקמפוס. (B) Stereotaxic השמה של כר הדשא על פני המוח כדי לקבוע את עומק ההכנסה ההיפוקמפוס. אלקטרודת כסף מדומה הפניה בצורה מאובטחת שמונח מתחת הקרקפת (מסומן על-ידי החץ). (ג) כר הדשא נוסף בעומק המתאים ביותר לקבל בזמן אמת, אין ויוו גלוטמט חוץ-תאית מדידות ההיפוקמפוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: MEA התנהגות במהלך תקופת 30-מין baselining. העלייה המהירה הראשונית מקביל הירידה של כר הדשא בהיפוקמפוס באמצעות micromanipulator. תקופת בסיסית מתחילה ברגע כר הדשא הגיעה העומק המתאימה (קו מנוקד). מידות חוץ-תאית גלוטמט יקטן על פני תקופה של 30 דקות, אין לפרש כמו קריאות הפיזיולוגיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8: מידות גלוטמט חוץ-תאית בזמן אמת ההיפוקמפוס של חזיר neonatal בהרדמה sevoflurane. (א) העברה ממוצע של הריכוז גלוטמט בהיפוקמפוס של חזיר neonatal אחד תחת הרדמה sevoflurane (באמצעות 10 נקודות נתונים). מדידות נלקחו ב- 4 הרץ 3 שעות לאחר תקופה קצרה 30 דקות baselining. (B) Smoothing של גלוטמט מדידות באמצעות ממוצע נע של 100 נקודות בכל 15 דקות משופרת של המגמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 9: זיהוי של גלוטמט ארעי פעילות ההיפוקמפוס של חזיר neonatal בהרדמה sevoflurane. (א) פסגות גלוטמט ארעי (באדום) מצוינים העקיבה גלוטמט בזמן אמת. פסגות נחשבו משמעותי כאשר האות לרעש יחס חריגה 3 האות שלהם לא היה בקורלציה עם האות בלוטת הזקיף (R2 < 0.5). (B) A שיא ארעי נציג מזוהה איור 9פאנל A. קווים מנוקדים לציין את משך הזמן הנדרש הפסגה להירקב 80%. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 10: אפיון של גלוטמט שנחשולי בהיפוקמפוס של חזיר neonatal בהרדמה sevoflurane. (א) A מספר פסגות גלוטמט ארעי בסלי 15 דקות. פסגות נחשבו משמעותי כאשר האות לרעש יחס חריגה 3 האות שלהם לא היה בקורלציה עם האות בלוטת הזקיף (R2 < 0.5). פסגות (ב') משרעת של גלוטמט ארעית. קווי שגיאה מציינים את שגיאת התקן של הממוצע. (ג) T מתכוון80 הפסגות גלוטמט ארעית. קווי שגיאה מציינים את שגיאת התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
מן ההתחלה של הניסוי, הומאוסטזיס פיזיולוגיים של חזרזיר חייב להישמר כפי שמתואר פרסום מראש של המעבדה הזה21 פיקוח מינימלי צריך לכלול אוקסימטר אלקטרוקרדיוגרם, capnography, לא פולשנית לחץ דם, טמפרטורה. חוקרים מאומנים נדרשים כך לפליטת הפיזיולוגיות (למשל, היפו/היפרתרמיה, היפוקסיה, תת לחץ דם, הפרעה בקצב הלב) ניתן לתקן בהתאם.
לפני הגיוס, במבחנה MEA ולידציות מבוצעות להקים סלקטיביות של כר הדשא בתנאים ידועים ופונקציונליות. כיול של ציפוי של לי חיוני לשימוש יעיל של הטכנולוגיה. ישנן שגיאות פוטנציאליות רבות שעשויות להתרחש במהלך הכיול. כיול ניתן לזהות בעיות אלה, כמו גם הפסולה ציפוי, מה שמוביל לתגובה interferent שגוי. חשבון טבלה מפורטת יותר של שגיאות שעלולות להתרחש בתגובה MEA נאסף, לאורך עם הגורמים הבולטים ואת הפתרונות המוצעים, אשר צריך להוכיח כלי שימושי עבור פתרון סביר (טבלה 1). חשוב לציין כי לפני הכיול וגם ציפוי, האלקטרודה הפניה זכוכית יש לבדוק נוכחות של בועות אוויר או שינוי צבע לבן, כמו גם להשפיע לרעה על דיוק MEA פונקציה והקלטה.
| תסמין | הסיבה | פעולה מתקנת |
| . אין אות | אלקטרודה לא מחובר | כמו שצריך להתחבר אלקטרודה headstage ו- headstage למערכת amperometry מהר. |
| אין כוח למערכת amperometry מהר | הפעל את מתג ההפעלה על האחורי של מערכת מהירה | |
| אות רעש | אלקטרודה שזוהמו על ידי דם | ללא הרף להשקיית השטח המוח במהלך הכניסה אלקטרודה |
| לשטוף את האלקטרודה מיד dH2O | ||
| ציפוי האנזים משוחרר | Recoat האלקטרודה ונקי | |
| אלקטרודה הפניה לא היה שנוספו או מצופה | מעיל ומניחים האלקטרודה הפניה רחוק יותר תחת הקרקפת | |
| אלקטרודה מזהה תנועה של פני השטח של המוח | מתרחשת בדרך כלל במבנים שטחית. הכנס האלקטרודה עמוק (1 מ מ בכל פעם) אם אפשר | |
| תנועת בעלי חיים | חיה מאובטחת כראוי | להעביר את החיה לכיוון אחורי מאובטח יותר טוב earbars על הגולגולת. במידת הצורך, לרומם את הגוף כדי לאפשר איזון גוף טוב יותר. |
| חיה. הוא מורדם כראוי | לוודא את תקינות הציוד הרדמה. Titrate ההרדמה כדי המינון היעיל ולפקח מנה rocuronium תוך שרירית (5 מ"ג/ק"ג) | |
| מיקום האלקטרודות לא מדויק | אלקטרודה לא מיושר כראוי | להסתגל האלקטרודה תוך שמירה על חיבור תקין headstage. |
| קואורדינטות stereotaxic אינם מדויקים | ודא כי הרי האטלס חזרזיר הפניה אינו משתמש עוד נקודת התייחסות או מטוס של היישור. | |
| יש להיזהר לא לטשטש את סימני תפירה כשקלע את הגולגולת. |
טבלה 1: הוראות לפתרון בעיות MEA השתמש מטילי יסודי. סיבות אפשריות, פעולות מתקנות כדי לסייע עם אופטימיזציה ופתרון בעיות.
אטלס stereotaxic עבור חזרזיר משמש כדי לקבוע את נקודות הציון stereotaxic של האזור של הריבית ביחס לנקודת ידועים כגון bregma18. ברים האוזן יש לאבטח כראוי כדי להבטיח כי הגולגולת היא רמת קיבוע באופן מלא. כדאי לשים לב במהלך החיתוך קו האמצע של הקרקפת כדי להימנע הבקיע את הגולגולת כמו זה עלול להשפיע על ויזואליזציה של קווי תפר. החלון גולגולת צריך להיות גדול מספיק כדי להכיל את כר הדשא.
פרוטוקול זה מציג מספר אתגרים טכניים הדורשים הפעלה סוויטה מצויד היטב ו חוקר/צוות מיומן בהיבטים ניתוח, הרדמה של הפרוטוקול. המודל מציג בנוסף למגבלות פיננסיים כי המודל חזרזיר יקר יותר מאשר הדגם מכרסמים; עם זאת, משמעותית פחות יקר מאשר השימוש של קופים, אשר יכולה לעלות עשרות אלפי דולרים. השימוש בטכנולוגיה MEA מציג אתגרים משלו, כמו בהליך של ציפוי, ציפוי האלקטרודות ידנית דורש חוקר מיומן או עוזר להבטיח סלקטיביות מספיק ותפקוד אמין. Microelectrodes עצמם הם שבירים, כפי שהם קרמיים, ובכך פגום בקלות אם זהירות נאותה לא נצפית. Microelectrodes כפופים הפרעה ממכשירים חשמליים אחרים, אשר ניתן ליצור רעש בהקלטות, ובדם באתר פעיל, אשר ניתן occlude את האתרים הקלטה. הצורך של ציוד מיוחד מציג נטל נוסף כמו מסגרת כירורגי stereotaxic חייב להיות מותאם אישית נבנה כדי לשתק את הגולגולת חזרזיר במהלך ההשתלה. המסגרת stereotaxic אוקסידאז גלוטמט, האלקטרודות עצמם הם הכל יקר. בנוסף, העדר חזרזיר stereotaxic והחזיר בתוך העשור האחרון מציב מגבלות טכניות הדורשים מומחיות מיוחדת כדי לקבוע את המיקום הספציפי של מבנים עמוק במוח חזרזיר. התפתחות אטלס stereotaxic חדש, אולי באמצעות תהודה מגנטית, מאוד לשפר את היכולת להשתמש בטכנולוגיה הזו מטילי יסודי.
לופז הוא מודל הרלוונטית קלינית לצורך המחקר של לימור בעיקר בשל ההקבלה הקיימים בין מין זה את neonate האנושית, כפי שניהם בעלי מבנה המוח דומה ופיתוח. שלא כמו דגמים יותר נפוצים כגון עכברים או חולדות, לחזיר יש דמיון גדול יותר CNS לבני אדם, אשר משאיל translatability של התוצאות של הדגם. המודל חזרזיר בנוסף זול יותר, כולל טיפול פחות מסובך מאשר מודל אנושיות הפרימטים. המודל חזרזיר נועד לבחון את התהליך על ידי איזו הרדמה עלול לגרום neurotoxicity התפתחותית למדוד את תרומתה נזק נוירולוגי, לחימה סוגיית הנזק שנגרם על ידי משתנה מתערב משתנים. למשל, היפוקסיה עלולה להתפרש שלא כהלכה עבור הנזק שנגרם על ידי הרדמה כפי שיש לזה השפעות גלובלית על המוח לופז מנוצל עם התנאים באותו ניתוח, הרדמה שנעשה בהן שימוש ברפואה האנושית כדי להבטיח נאמנות של תוצאות.
השימוש בטכנולוגיה מבוססת-קרמיקה MEA מבטל החסרונות הקשורים עם הטכניקה עכשווי של microdialysis. Microdialysis הגביל זמני ופתרון המרחבי בהשוואה amperometric שיטות כמו כר הדשא, אשר יכול להקליט ללא הרף גלוטמט אירועים מרובים, אזורים מיקרוסקופיים Hz עד 1023. קצב הדגימה מהירה זו מבטלת את הגורם מבלבלים של פיזור עצבי מקומי הטמון בשיטות דגימה איטי כמו microdialysis24. בנוסף, כר הדשא הוא שיטה פחות פולשנית מאשר בדיקה microdialysis, אשר יכול לגרום gliosis משמעותית במהלך הכניסה, עשוי לשנות עצבי פעילות האתר ההכנסה22.
מחקרים קודמים ניצול מגוון של מודלים בתרבית של טכניקות מדידה, אזורים במוח, הדגימו גלוטמט הבזליים רמות דומות לאלה שנמצאו בעזרת טכניקה זו. הדבר מצביע על כי MEA טכנולוגיה, כאשר המותאמים לדגם חזרזיר, מספק הקלטות חוקי ריכוז ויוו גלוטמט (טבלה 2).
| מחבר (שנה) | טכניקת הקלטה | במודל חיה | גיל | Region(s) המוח | כלומר ריכוז גלוטמט הבזליים (מיקרומטר) |
| Hascup et al. (2008)23 | MEA (מבוסס על אנזים) | מכרסם | 20 - 24 שבועות | קליפת המוח הקדם חזיתית, סטריאטום | 3.3 ± 1.0; 5.0 ± 1.2 |
| Hascup et al. (2010)25 | MEA (מבוסס על אנזים) | מכרסם | 3 - 6 חודשים | היפוקמפוס | 4.7-10.4 |
| רתרפורד et al. (2007)9 | MEA (מבוסס על אנזים) | מכרסם | 3 - 6 חודשים | קליפת המוח הקדם חזיתית, סטריאטום | 44.9 ± 4.7; 7.3 ± 0.9 |
| Miele et al. (1996)26 | Microdialysis (מבוסס על אנזים) | מכרסם | - | סטריאטום | 3.6 ± 0.5 |
| יום et al. (2006)27 | MEA (מבוסס על אנזים) | מכרסם | 3 - 6 חודשים | סטריאטום החזיתית | 1.6 ± ± 0.3; 1.4 0.2 |
| קואנטרו et al. (2007)28 | MEA (מבוסס על אנזים) | הלא - האדם הפרימטים | 5.3-5.5 שנים | קליפת premotor, Motor Cortex | ± 3.8 1.7; 3.7 ± 0.9 |
| סטיבנס ואח '. (2010) 29 | מאה [ספנסר-גרהארט-2 (SG-2)] | הלא - האדם הפרימטים | 11 - 21 שנים | Putamen | 8.53 |
| קודאמה et al. (2002)30 | Microdialysis (מבוסס על אנזים) | הלא - האדם הפרימטים | - | קליפת המוח הקדם חזיתית | 1.29-2.21 |
| Galvan et al. (2003)31 | Microdialysis (מבוסס על אנזים) | הלא - האדם הפרימטים | ילדותי | סטריאטום | 28.74 ± 2.73 |
| במהלך ספנסר (1993)32 | Microdialysis (מבוסס על אנזים) | אנושי | 18 - 35 שנים | היפוקמפוס | 20.3 ± 6.6 |
| Reinstrup et al. (2000)33 | Microdialysis (מבוסס על אנזים) | אנושי | - | החזיתית | 16 ± 16 |
| Cavus et al. (2005)34 | Microdialysis (מבוסס על אנזים) | אנושי | 15 - 52 שנים | וקליפת | 2.6 ± 0.3 |
בטבלה 2. השוואה של גלוטמט חוץ-תאי הבסיס levelsacross מודלים בבעלי חיים שונים. שנבחר סקירה של מחקרים הקמת גלוטמט חוץ-תאית נורמלי רמות בבעלי חיים בריא ער "". מורדם באמצעות microdialysis או microelectrodes.
השימוש בטכנולוגיה MEA לפקח ויוו גלוטמט ריכוזים במודל חזרזיר ניתן להתיר על הערכה עתידית של חזרזיר תוצאות נוירולוגיות לאחר הרדמה. הישרדות ניסויים כי תכנן, אשר יהיה לקדם הבנה של ההשפעה לטווח ארוך של הרדמה על נוירוקוגניטיבי לרווחתם של האדם neonates. הישרדות ניסויים תאפשר בדיקה וניטור התנהגותית של גלוטמט משתנה זמן לאחר חשיפה הרדמה. זה נפוץ גם לילדים לעבור הרדמה בתנאים שבו הם עשויים לחוות מתח פיזיולוגיים בצורה של התערבות כירורגית. מחקרים עתידיים מיעון השפעת ניתוח מבחינת פגיעה נוירולוגית, עלייה ב neurotoxicity תאפשר מדויקת יותר מידול של הגדרה קלינית נפוצה עבור ילדים. השימוש במודלים חלופית היא גם אפשרית, כפי היא המחקר של מודלים שונים אלה באמצעות השתלה כרונית, אשר מאפשר לנו לעקוב אחר שינויים התנהגותיים הקשורים neurotoxicity. טכנולוגיה MEA עצמו הוא תכליתי, אז המחקר העתידי לא צריך להיות מוגבל לניתוח של רמות גלוטמט (למשל, גאבא, כולין, ליזין, וכו ' יכול להיות מנותח).
Disclosures
גרהארט גרג הוא הבעלים העיקרי של Quanteon LLC. חורחה קואנטרו, ג'ייסון Burmeister שמשו כיועצים כדי Quanteon LLC.
Acknowledgments
המחברים רוצה להודות התרומות של המרכז אוניברסיטת קנטאקי לטכנולוגיה Microelectrode (CenMeT), את אוהיו סטייט אוניברסיטת מעבדה חיה משאב מרכז (מעו).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advance Liqui-Wean Pig Milk Replacer | PBS Animal Health | 292-13 | |
| Piglet Anesthesia Face-Cone Mask | VetEquip | 921428 | |
| Integra SL Anesthesia Workstation | DRE Veterinary | 2350 | This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention. |
| Sevoflurane | Ultane | 0074-4456-04 | |
| Rocuronium Bromide Injection | Hospira | 0409-9558-05 | |
| Medfusion 4000 IV Infusion | Smiths Medical | ||
| Model 1530 Heavy-Duty Research Model Stereotax | Kopf | custom made | |
| Model 1541 Piglet Adaptor | Kopf | custom made | |
| Infrared Spot Lamp | Amazon | B000HHQ94C | |
| Bair Hugger Torso Blanket | 3M | 540 | |
| Bair Hugger | 3M | 750 | |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Fisherbrand | 22-363-750 | |
| Carbon Steel Rib-Back Surgical Blade | Bard-Parker | #10 | |
| Scalpel Handel | Havel's | HAN-G4 | |
| Surgical Scissors | World Precision Instruments | 504615 | |
| Mosquito Forceps | Sklar Surgical Instruments | 17-1225 | |
| Gauze Pads | Fisherbrand | 22-246-069 | |
| Adson Tissue Forceps | Teleflex | 181223 | |
| Dremel 111 Engraving Cutter | Amazon | Dremel 111 | |
| Microelectrode Array | Center for Microelectrdoe Technology, University of Kentucky | S2 4Ch MEA; custom made | |
| Headstage | Quanteon | 2pA/mV | |
| Wire, silver, PFA, .008" Bare, .0110" coated | A-M Systems | 786500 | |
| Fine Micromanipulator | Narishige Scientific Instrument Lab | MO-8 |
References
- Hall, M. J., DeFrances, C. J., Williams, S. N., Golosinskiy, A., Schwartzman, A. National hospital discharge Survey: 2007 summary. Natl Health Stat Report. (29), 1-24 (2010).
- Ikonomidou, C., et al. Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science. 283 (5398), 70-74 (1999).
- Mattson, M. P. Glutamate and neurotrophic factors in neuronal plasticity and disease. Ann N Y Acad Sci. 1144 (1), 97-112 (2008).
- Atlante, A., et al. Glutamate neurotoxicity, oxidative stress and mitochondria. FEBS Lett. 497 (1), 1-5 (2001).
- Kavitha, J., Durga, P., Ramachandran, G. Inhalational agents in anesthesia induced developmental neurotoxicity - Recent advances. Trends in Anaesthesia and Critical Care. 11 (1), 14-18 (2016).
- Zanghi, C. N., Jevtovic-Todorovic, V. A holistic approach to anesthesia-induced neurotoxicity and its implications for future mechanistic studies. Neurotoxicol Teratol. 60 (2), 24-32 (2017).
- Fan, X., et al. In situ real-time monitoring of glutamate and electrophysiology from cortex to hippocampus in mice based on a microelectrode array. Sensors (Basel). 17 (1), 1-8 (2016).
- Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
- Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Strömberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
- Benveniste, H.
- Kohno, T., et al. An improved method for the detection of changes in brain extracellular glutamate levels. J Neurosci Methods. 81 (1-2), 199-205 (1998).
- Hascup, K. N., Hascup, E. R. Electrochemical techniques for subsecond neurotransmitter detection in live rodents. Comp Med. 64 (4), 249-255 (2014).
- Rooij, N. F., Koudelka-Hep, M., Frey, O. Biosensor microprobe array for in vivo monitoring of neurotransmitters. EPFL. , Lausanne. (2010).
- Fan, X. T., et al. Cortical glutamate levels decrease in a non-human primate model of dopamine deficiency. Brain Res. 1552, 34-40 (2014).
- Hunsberger, H. C., et al. Using enzyme-based biosensors to measure tonic and phasic glutamate in Alzheimer's mouse models. J Vis Exp. (123), (2017).
- Hill, A. J., Jones, N. A., Williams, C. M., Stephens, G. J., Whalley, B. J. Development of multi-electrode array screening for anticonvulsants in acute rat brain slices. J Neurosci Methods. 185 (2), 246-256 (2010).
- Defranchi, E., et al. Feasibility assessment of micro-electrode chip assay as a method of detecting neurotoxicity in vitro. Front Neuroeng. 4 (6), (2011).
- Whitaker, E. E., et al. Use of a piglet model for the study of anesthetic-induced developmental neurotoxicity (AIDN): A translational neuroscience approach. J Vis Exp. (124), (2017).
- Kilkenny, C., et al. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Salinas-Zeballos, M., Ceballos, G., Gootman, P. A stereotaxic atlas of the developing swine (Sus scrofa) forebrain. , 887-906 (1986).
- Whitaker, E. E., et al. A novel, clinically relevant use of a piglet model to study the effects of anesthetics on the developing brain. Clin Transl Med. 5 (1), (2016).
- Hascup, E. R., et al. Histological studies of the effects of chronic implantation of ceramic-based microelectrode arrays and microdialysis probes in rat prefrontal cortex. Brain Res. , 12-20 (2009).
- Hascup, K. N., Hascup, E. R., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Second-by-second measures of L-Glutamate and other neurotransmitters using enzyme-based microelectrode arrays. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 324 (2), 725-731 (2008).
- Rice, M. E., Cragg, S. J. Dopamine spillover after quantal release: rethinking dopamine transmission in the nigrostriatal pathway. Brain Res Rev. 58 (2), 303-313 (2008).
- Hascup, E. R., et al. Rapid microelectrode measurements and the origin and regulation of extracellular glutamate in rat prefrontal cortex. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1608-1620 (2010).
- Miele, M., Boutelle, M. G., Fillenz, M. The source of physiologically stimulated glutamate efflux from the striatum of conscious rats. J Physiol. 497 (Pt 3), 745-751 (1996).
- Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), 1626-1635 (2006).
- Quintero, J. E., et al. Amperometric measures of age-related changes in glutamate regulation in the cortex of rhesus monkeys. Exp Neurol. 208 (2), 238-246 (2007).
- Stephens, M. L., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A., Zhang, Z. Real-time glutamate measurements in the putamen of awake rhesus monkeys using an enzyme-based human microelectrode array prototype. J Neurosci Methods. 185 (2), 264-272 (2010).
- Kodama, T., Hikosaka, K., Watanabe, M. Differential changes in glutamate concentration in the primate prefrontal cortex during spatial delayed alternation and sensory-guided tasks. Exp Brain Res. 145 (2), 133-141 (2002).
- Galvan, A., Smith, Y., Wichmann, T. Continuous monitoring of intracerebral glutamate levels in awake monkeys using microdialysis and enzyme fluorometric detection. J Neurosci Methods. 126 (2), 175-185 (2003).
- During, M. J., Spencer, D. D. Extracellular hippocampal glutamate and spontaneous seizure in the conscious human brain. Lancet. 341 (8861), 1607-1610 (1993).
- Reinstrup, P., et al. Intracerebral microdialysis in clinical practice: baseline values for chemical markers during wakefulness, anesthesia, and neurosurgery. Neurosurgery. 47 (3), 701-710 (2000).
- Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
