Denne studien utforsker romanen bruk av enzym-baserte microelectrode matrise (MEA) teknologi for å overvåke i vivo nevrotransmitter aktivitet i grisunger. Hypotesen var at glutamat feilregulering bidrar til mekanisme bedøvende nevrotoksisitet. Her presenterer vi en protokoll for å tilpasse MEA teknologi for å studere mekanismen for anestesi-indusert nevrotoksisitet.
Hvert år gjennomgår millioner av barn anestesi for en rekke prosedyrer. Men har både dyr og mennesker kalt inn spørsmålet sikkerheten til anestesi i barn, implicating bedøvelse som potensielt giftig for hjernen i utvikling. Hittil har ingen studier ble belyst mechanism(s) som anestesi kan være nevrotoksiske. Dyrestudier at etterforskningen av slike mekanismer, og neonatal grisunger representerer en utmerket modell å studere disse effektene på grunn av sin slående utviklingsmessige likheter med den menneskelige hjernen.
Denne protokollen tilpasser bruken av enzym-baserte microelectrode matrise (MEA) teknologi som en ny måte å studere mechanism(s) av anestesi-indusert nevrotoksisitet (AIN). Tiltak aktiverer sanntids overvåking i vivo nevrotransmitter aktivitet, og tilbyr eksepsjonell timelige og romlig oppløsning. Det er en teori om at bedøvende nevrotoksisitet skyldes delvis glutamat feilregulering og tiltak tilbyr en metode for å måle glutamat. Romanen gjennomføringen av MEA teknologi i piglet modell presenterer en unik mulighet for studiet av AIN.
Hvert år gjennomgår millioner av barn anestesi for både invasive og ikke-invasive prosedyrer i USA1. For år, har anestesi leverandører beroliget foreldre for anestesi, selv i små barn og nyfødte. Men i 1999 ble det funnet at midlertidig blokkering av N-methyl-D-aspartate (NMDA) undertypen av glutamat reseptorer i løpet av tidlig liv føre utbredt neuronal apoptose rotter2. Nylig FDA ut en narkotika sikkerhet kommunikasjon som krever etikettene bedøvende narkotika inkluderer en advarsel om generell anestesi og deres potensielle negativ effekt på utvikling hjernen barn yngre enn 3 år (USAs mat og Drug Administration, 2017). Men er det fortsatt behov for å belyse mulig mekanismer og potensielle neuroprotective tiltak.
Normal aktivitet av nevrotransmittere som glutamat og gamma-amino butyric acid (GABA) er avgjørende for normal neurodevelopment oppstår. Selv om de fleste veier i AIN er fortsatt flyktig, er nevrotransmitter systemer svært sannsynlig å være involvert siden anestesi er kjent for å modulere disse stier å produsere bevisstløshet. Spesielt forårsaker eksitatoriske signalstoffet glutamat excitotoxicity når det er dysregulated. Denne nevrotransmitter er normalt involvert i neurogenesis, neural plastisitet, synaptic og nevrale vekst og en rekke andre kritisk viktig hjernefunksjoner. Men kan langvarig aktivering av glutamat reseptorer forårsake excitotoxicity og neuronal apoptose, spesielt under stress forhold som kirurgi, oksygenmangel og redusert energi tilgjengelighet3. Binding av glutamat til NMDA har reseptor vist å forårsake Na+ og Cl− tilstrømningen. Den påfølgende depolarization antas å føre til Ca2 + kanal åpning og utgivelsen av intracellulær Ca2 + lagrer4. Dette dysfunksjon sannsynlig fører til en kaskade av metabolske derangements som til slutt redusere neuronal spredning, forhøye inflammation og føre til nevronale døden. Til tross for disse hypoteser fortsatt de sanne mechanism(s) av AIN uklart5. På grunn av sin rolle i apoptose representerer glutamat feilregulering en ny sti som bidrar til at mekanismen av tidligere dokumenterte neuronal apoptose, en funksjon i AIN.
En av hindringer på studier av neuronal prosesser er høy kompleksitet, spesielt i innstillingen for neuronal utvikling. De første månedene av livet er perioden av maksimal sikkerhetsproblemet for skade, under som de fleste av de viktige trinnene neuronal utvikling som fysiologiske apoptose (neuronal beskjæring), synaptogenesis, gliogenesis og myelination ta sted6 . Gitt den komplekse naturen neuronal kommunikasjon og vanskelighetene med å studere disse prosessene uten å forstyrre normal CNS-funksjon, har ny teknologi blitt utviklet som mål i vivo gjenkjenning og kvantifisering av viktige elementer neuronal kommunikasjon.
Enzym knyttet MEA teknologien ble brukt i denne studien som en ny måte å studere mekanismer for AIN i en klinisk relevante piglet modell. Denne teknologien kan brukes til å studere kompleks i vivo elektrokjemiske hjernen prosesser, inkludert glutamat feilregulering. Webområdene innarbeidet 4-kanals platina opptak av tiltak (2 glutamat-sensitive områder og 2 sentinel nettsteder) tillate selvrefererende, som bidrar til gjenkjenning nøyaktighet. I tillegg en utelukkelse lag gjelder hver elektrode, overdragelse selektivitet ved å hindre at andre forstyrrende molekyler blir oppdaget7. Videre gir Lavprofils utforming av MEA minimal vev traumer sammenlignet med tidligere teknologier. Denne samme funksjonen gir til tiltak høyere romlig oppløsning, som muliggjør studiet av mikroskopiske regioner i hjernen. Diskrete områder av hippocampus (dentate gyrus, CA1, ca 2) kan for eksempel være spesielt studerte8. Detaljerte opplysninger om funksjonaliteten til tiltak har vært beskrevet tidligere9.
I forhold til MEA elektrokjemi, microdialysis inneholder en membran mellom løsningen rundt og en løsning av lignende komposisjon, slik at påvisning av ekstracellulære væske endres10. Selv om microdialysis er en bærebjelke i neurochemistry og har lenge vært brukt for påvisning av nevrotransmittere, har det ulempen med lav tid oppløsning, forsinket påvisning av glutamat endring og betydelig vev traumer11.
Tiltak kan indirekte oppdage signalstoffer som glutamat, acetylcholine og kolin, ved hjelp av riktig oksidase enzymer som produserer electroactive reporter molekyler som H2O2 eller O212,13 .
MEA teknologi har vært mye brukt i rotter og ikke-menneskelige primater for studier av nevrotoksisitet i sammenheng med patofysiologiske prosesser enn AIN7,14. Blant noen av prosessene patofysiologiske, har MEA teknologien vært brukt for studier av Alzheimers, epilepsi, traumatisk hjerneskade og effekten av farmakologiske forbindelser på synaptic kommunikasjon8,15 , 16 , 17. selv om tiltak har blitt brukt til å studere disse patologi i rotter og ikke-menneskelige primater, høy utviklingsmessige likheten mellom mennesker og piglet hjernen gjør tilpasning av MEA teknologien i grisunger en velegnet teknikk for å studere AIN mechanism(s)18.
Fra starten av eksperimentet, må piglet’s fysiologiske homeostase vedlikeholdes som beskrevet i dette laboratoriet forhånd publikasjon21. Minimal overvåking bør inkludere puls oximetry, electrocardiography, capnography, ikke-invasiv blodtrykk og temperatur. Utdannet etterforskere er nødvendig for at fysiologiske forstyrrelser (f.eks, hypo/hypertermi, hypoksi, hypotensjon, arytmi) kan bli riktig korrigert.
Før induksjon utføres i vitro MEA kalibreringer for å etablere funksjonalitet og selektivitet av MEA under kjent forhold. Kalibreringen og plating av tiltak er avgjørende for effektiv bruk av teknologi. Det er mange mulige feil som kan oppstå under kalibrering. Kalibreringen kan identifisere disse problemer samt uriktig plating, som fører til feil interferent svar. En mer detaljert tabell beretning om feil som kan oppstå MEA svar er utarbeidet, sammen med kjente årsaker og foreslåtte løsninger, som bør være et nyttig verktøy for sannsynlig feilsøking (tabell 1). Det er viktig å merke seg at før både kalibrering og plating, skal glass referanse elektrode kontrolleres for luftbobler eller hvit misfarging, som enten vil negativt påvirke MEA funksjon og opptak nøyaktighet.
Symptom | Årsak | Korrigerende tiltak |
Ingen Signal | Elektroden ikke tilkoblet | Koble riktig elektroden til headstage og headstage rask amperometry systemet. |
Ingen strøm til rask amperometry systemet | Slå på strømbryteren på baksiden av rask system | |
Signal bråk | Elektroden forurenset av blod | Kontinuerlig vanne hjernen overflaten under elektrode innsetting |
Stoffet elektroden i dH2O | ||
Enzym belegg er løs | Rengjør og recoat elektroden | |
Referanse elektrode ikke er satt inn eller belagt | Pels og plasserer referanse elektrode lenger under skalpen | |
Elektroden registrerer bevegelse av hjernen overflate | Vanligvis oppstår i overfladisk strukturer. Sett inn elektroden dypere (1 mm samtidig) hvis mulig | |
Dyr bevegelse | Dyr er mangelfullt sikret | Flytte dyret i bakre retning til bedre sikre earbars på skallen. Eventuelt heve torso å tillate bedre kroppen justering. |
Dyr er ikke tilstrekkelig anesthetized | Kontroller integriteten til anestesi utstyret. Sjarmere anesthetic til en effektiv dose og administrere en intramuscular rocuronium dose (5 mg/kg) | |
Unøyaktig elektrodeplassering | Elektroden ikke er riktig justert | Justere elektroden mens riktig kobling til headstage. |
Stereotaxic koordinatene er unøyaktig | Kontroller at piglet atlas refereres ikke bruker et annet referansepunkt eller fly av justering. | |
Pass på at du ikke skjule Sutur merkene scoret skallen. |
Tabell 1: instruksjoner for feilsøking MEA bruke grisunger. Mulige årsaker og korrigerende tiltak for å hjelpe med søkemotoroptimalisering og feilsøking.
En stereotaxic atlas for piglet brukes til å bestemme stereotaxic koordinatene til området av interesse med hensyn til et kjent punkt som bregma18. Øret barer skal være ordentlig sikret for å sikre at skallen nivå og fullt immobilisert. Forsiktighet bør utvises under midtlinjen innsnitt av hodebunnen å unngå scoret skallen som dette kan påvirke visualisering av Sutur linjene. Vinduet craniotomy bør være store nok til å huse MEA.
Denne protokollen presenterer en rekke tekniske utfordringer som krever en velfylt drift suite og en etterforsker/team dyktige i kirurgiske og anesthetic aspekter av protokollen. Modellen presenterer i tillegg økonomiske begrensninger i at piglet modellen er dyrere enn den gnagere modellen; Det er imidlertid betydelig mindre kostnadskrevende enn bruk av ikke-menneskelige primater, som kan koste tusenvis av dollar. Bruk av MEA teknologi presenterer sine egne utfordringer, som av belegg og plating elektrodene manuelt krever dyktige etterforsker eller assistent å sikre tilstrekkelig selektivitet og pålitelig funksjon. Microelectrodes selv er skjøre, som de er laget av keramikk, og dermed lett skadet hvis riktig forsiktighet ikke er observert. Microelectrodes er utsatt for interferens fra andre elektriske enheter, som kan lage støy i innspillinger, og blod på operative området, som kan occlude webområdene opptak. Behovet for spesialisert utstyr presenterer en ekstra byrde som en stereotaxic kirurgisk ramme må være tilpasset bygget for å nakkens piglet skallen under implantasjon. Stereotaxic rammen og glutamat oksidase elektrodene seg er alle kostbare. I tillegg utgjør mangel på en piglet stereotaxic atlas fra innenfor det siste tiåret tekniske begrensninger som krever spesialkompetanse å bestemme spesifikke plasseringen av dype strukturer i hjernen piglet. Utviklingen av en ny stereotaxic atlas, muligens bruker magnetisk resonans imaging, ville øke muligheten for å bruke denne teknologien i grisunger.
Piglet er en klinisk relevante modell for studiet av AIN hovedsakelig på grunn av parallellene som eksisterer mellom denne arten og menneskelige neonate, som begge har lignende hjernens struktur og utvikling. I motsetning til vanlige modeller som mus eller rotter har piglet en større CNS likhet til mennesker, som låner til translatability modellen resultater. Piglet modellen er i tillegg billigere og innebærer mindre komplisert behandling enn en ikke-menneskelige primas modell. Piglet modellen skal undersøke prosessen av hvilke anestesi kan indusere utviklingsmessige nevrotoksisitet måle dens bidrag til nevrologiske skader og bekjempe spørsmålet om skader forårsaket av confounding variabler. For eksempel, kan hypoksi bli feiltolket for skader forårsaket av bedøvelse som har global effekter på hjernen. Piglet benyttes med samme kirurgiske og anesthetic vilkår som brukes i human medisin slik gjengivelse av resultater.
Bruk av keramisk-basert MEA teknologi eliminerer flere ulemper med moderne teknikk for microdialysis. Microdialysis har begrenset timelige og romlig oppløsning i forhold til amperometric metoder som MEA, som kan registrere kontinuerlig glutamat arrangementer i flere, mikroskopiske regioner opptil 10 Hz23. Denne rask samplingsfrekvens eliminerer forvirrende faktor på lokaliserte nevrotransmitter diffusjon som er iboende til langsom Prøvetaking metoder som microdialysis24. Dessuten er MEA en mindre invasiv metode enn en microdialysis sonde, som kan forårsake betydelig gliosis under innsetting og kan endre nevrotransmitter aktivitet på innsetting området22.
Tidligere studier utnytte en rekke pattedyr modeller, måling teknikker og områder av hjernen, har vist basale glutamat nivåer sammenlignes med de funnet ved hjelp av denne teknikken. Dette tyder på at MEA teknologi, når tilpasset piglet modellen, gir gyldig opptak i vivo glutamat konsentrasjon (tabell 2).
Forfatter (år) | Opptak teknikk | Dyremodell | Alder | Hjernen områdene | Mener basale glutamat konsentrasjon (µM) |
Hascup et al. (2008)23 | MEA (enzym-basert) | Gnagere | 20 – 24 uker | Prefrontal Cortex, Striatum | 3.3 ± 1.0; 5.0 ± 1.2 |
Hascup et al. (2010)25 | MEA (enzym-basert) | Gnagere | 3 – 6 måneder | Hippocampus | 4.7-10.4 |
Rutherford et al. (2007)9 | MEA (enzym-basert) | Gnagere | 3 – 6 måneder | Prefrontal Cortex, Striatum | 44,9 ± 4.7; 7.3 ± 0,9 |
Miele et al. (1996)26 | Microdialysis (enzym-basert) | Gnagere | – | Striatum | 3.6 ± 0,5 |
Dag et al. (2006)27 | MEA (enzym-basert) | Gnagere | 3 – 6 måneder | Frontal Cortex, Striatum | 1.6 ± 0,3; 1,4 ± 0,2 |
O Quinteiro et al. (2007)28 | MEA (enzym-basert) | Ikke – menneskelige primas | 5.3-5.5 år | Premotor Cortex, motorisk Cortex | 3.8 ± 1.7; 3.7 ± 0,9 |
Stephens et al. (2010) 29 | MEA [Spencer-Gerhardt-2 (SG-2)] | Ikke – menneskelige primas | 11 – 21 år | Putamen | 8,53 |
Kodama et al. (2002)30 | Microdialysis (enzym-basert) | Ikke – menneskelige primas | – | Prefrontal Cortex | 1,29-2.21 |
Galvan et al. (2003)31 | Microdialysis (enzym-basert) | Ikke – menneskelige primas | Juvenile | Striatum | 28.74 ± 2,73 |
Under og Spencer (1993)32 | Microdialysis (enzym-basert) | Menneskelige | 18 – 35 år | Hippocampus | 20,3 ± 6.6 |
Reinstrup et al. (2000)33 | Microdialysis (enzym-basert) | Menneskelige | – | Frontal Cortex | 16 ± 16 |
Cavus et al. (2005)34 | Microdialysis (enzym-basert) | Menneskelige | 15 – 52 år | Neocortex | 2.6 ± 0,3 |
Tabell 2. Sammenligning av basale ekstracellulære glutamat levelsacross ulike dyr modeller. En valgte gjennomgang av studier å etablere normale ekstracellulære glutamat nivåer i friske våken og bedøvet dyr med microdialysis eller microelectrodes.
Bruk av MEA teknologi for å overvåke i vivo glutamat konsentrasjoner i piglet modellen kan tillate fremtidige evalueringen av piglet nevrologiske resultater etter anestesi. Overlevelse eksperimenter er planlagt, som vil ytterligere en forståelse av den langsiktige virkningen av bedøvelsen på nevrokognitive velvære menneskelige nyfødte. Overlevelse eksperimenter vil tillate atferdsmessige testing og overvåking av glutamat endrer lenge etter anestesi eksponering. Det er også vanlig for barn å gjennomgå anestesi i forhold der de kan oppleve fysiologiske stress i form av kirurgiske inngrep. Fremtidige studier påvirkning av kirurgi nevrologiske skader og økning i nevrotoksisitet ville tillate for mer nøyaktig modellering av en vanlig klinisk setting for barn. Bruk av alternative dyr modeller er også mulig, som er studiet av disse ulike modeller gjennom kronisk implantasjon, slik at vi kan spore opptreden endre forbundet med nevrotoksisitet. MEA teknologien i seg selv er allsidig, slik at fremtidige studie ikke trenger være begrenset til analyse av glutamat nivåer (f.eksGABA, kolin lysin, osv. kunne analyseres).
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å erkjenne bidrag av University of Kentucky senter for Microelectrode teknologi (CenMeT) og Ohio State University laboratorium dyr Resource Center (Sirkelformet).
Advance Liqui-Wean Pig Milk Replacer | PBS Animal Health | 292-13 | |
Piglet Anesthesia Face-Cone Mask | VetEquip | 921428 | |
Integra SL Anesthesia Workstation | DRE Veterinary | 2350 | This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention. |
Sevoflurane | Ultane | 0074-4456-04 | |
Rocuronium Bromide Injection | Hospira | 0409-9558-05 | |
Medfusion 4000 IV Infusion | Smiths Medical | ||
Model 1530 Heavy-Duty Research Model Stereotax | Kopf | custom made | |
Model 1541 Piglet Adaptor | Kopf | custom made | |
Infrared Spot Lamp | Amazon | B000HHQ94C | |
Bair Hugger Torso Blanket | 3M | 540 | |
Bair Hugger | 3M | 750 | |
Sterile Alcohol Prep Pad | Fisherbrand | 22-363-750 | |
Carbon Steel Rib-Back Surgical Blade | Bard-Parker | #10 | |
Scalpel Handel | Havel's | HAN-G4 | |
Surgical Scissors | World Precision Instruments | 504615 | |
Mosquito Forceps | Sklar Surgical Instruments | 17-1225 | |
Gauze Pads | Fisherbrand | 22-246-069 | |
Adson Tissue Forceps | Teleflex | 181223 | |
Dremel 111 Engraving Cutter | Amazon | Dremel 111 | |
Microelectrode Array | Center for Microelectrdoe Technology, University of Kentucky | S2 4Ch MEA; custom made | |
Headstage | Quanteon | 2pA/mV | |
Wire, silver, PFA, .008" Bare, .0110" coated | A-M Systems | 786500 | |
Fine Micromanipulator | Narishige Scientific Instrument Lab | MO-8 |