Denna studie undersöker roman användningen av enzym-baserade mikroelektrod array (MEA) teknik för att övervaka i vivo signalsubstans aktivitet hos smågrisar. Hypotesen var att glutamat dysreglering bidrar till mekanismen av bedövningsmedel neurotoxicitet. Här presenterar vi ett protokoll för att anpassa MEA teknik för att studera mekanismen för anestesi-inducerad neurotoxicitet.
Varje år genomgå miljontals barn anestesi för en mångfald av förfaranden. Dock har studier på både djur och människor ifrågasatt säkerheten av anestesi hos barn, ifrågasätta bedövningsmedel som potentiellt giftiga för hjärnans utveckling. Hittills har inga studier framgångsrikt klarlagd mekanismerna som anestesi kan vara neurotoxiska. Djurstudier möjliggöra undersökning av sådana mekanismer och neonatal smågrisar representerar en utmärkt modell för att studera dessa effekter på grund av sin slående utvecklingsmässiga likheter med den mänskliga hjärnan.
Detta protokoll anpassar användningen av enzym-baserade mikroelektrod array (MEA) teknik som ett nytt sätt att studera mekanismerna för anestesi-inducerad neurotoxicitet (AIN). MEAs aktivera övervakning i realtid av i vivo signalsubstans aktivitet och erbjuder enastående temporal och spatial upplösning. Det är en hypotes om att narkos neurotoxicitet orsakas delvis av glutamat dysreglering och MEAs erbjuder en metod att mäta glutamat. Romanen genomförandet av MEA teknik i en Nasse modell presenterar en unik möjlighet för studier av AIN.
Varje år genomgå miljontals barn anestesi för både invasiva och icke-invasiva procedurer i USA1. I åratal har anestesi leverantörer lugnade föräldrar av anestetika, även hos små barn och nyfödda. Dock i 1999 konstaterades att övergående blockering av N-metyl-D-aspartat (NMDA) subtyp av glutamatreceptorer under uppväxt kunde orsaka utbredda neuronala apoptos i råttor2. FDA släppte nyligen, en drog säkerhet kommunikation som kommer att kräva etiketterna anestetiska läkemedel att inkludera en varning om allmänna bedövningsmedel och deras potentiella negativa inverkan på barn yngre än 3 år gammal utveckla hjärnor (US Food och Drug Administration, 2017). Dock finns det fortfarande ett behov av att klarlägga möjliga mekanismer och potentiella nervskyddande åtgärder.
Normal aktivitet av neurotransmittorer som glutamat och gamma-amino smörsyra (GABA) är kritiska för normalt neuroutvecklingssjukdomar inträffa. Även om de flesta av vägarna som är inblandade i AIN är fortfarande gäckande, är neurotransmittorsystemet mycket sannolikt att vara inblandade eftersom bedövningsmedel är kända för att modulera dessa vägar för att producera medvetslöshet. I synnerhet orsakar excitatoriska signalsubstansen glutamat excitotoxicitet när dess aktivitet är dysreglerad. Denna neurotransmittor är normalt inbegripna i neurogenes, neural plasticitet, synaptic och neurala tillväxt och ett antal andra kritiskt viktiga hjärnfunktioner. Långvarig aktivering av glutamatreceptorer kan dock orsaka excitotoxicitet och neuronala apoptos, särskilt under stress förhållanden såsom kirurgi, syrebrist och minskad energi tillgänglighet3. Bindning av glutamat till NMDA har receptorn visat sig orsaka Na+ och Cl− tillströmning. Den efterföljande depolarisation tros leda till Ca2 + kanal öppning och frisläppandet av intracellulära Ca2 + lagrar4. Denna dysfunktion som sannolikt leder till en kaskad av metabola derangemang introducerades som så småningom minskar neuronal spridning, öka inflammation och leda till neuronala dödsfall. Trots dessa hypoteser förblir de sanna mekanismerna Ain oklart5. På grund av dess roll i apoptos representerar glutamat dysreglering en ny väg som kan bidra till mekanismen av tidigare dokumenterat neuronala apoptos, en funktion i AIN.
Ett av hindren på studiet av neuronala processer är deras hög komplexitet, särskilt i fastställandet av neuronal utveckling. De första månaderna av livet är perioden av maximal sårbarhet för skada, under vilket de flesta av de viktiga stegen i neuronal utveckling såsom fysiologiska apoptos (neuronala beskärning), synaptogenes och gliogenesis myelinisering ta plats6 . Med tanke på den komplicerade karaktären av neuronal kommunikation och svårigheten att studera dessa processer utan att störa normala CNS-funktion, har ny teknik utvecklats som syftar till i vivo detektering och kvantifiering av viktiga element neuronal kommunikation.
Enzymkopplad MEA teknik användes i denna studie som ett nytt sätt att studera mekanismerna i AIN i en kliniskt relevant Nasse modell. Denna teknik kan användas för att studera komplexa i vivo elektrokemiska processer i hjärnan, inklusive glutamat dysreglering. Inbyggda 4-kanals platina inspelning webbplatser av de multilaterala miljöavtal (2 glutamat-känsliga platser och 2 sentinel platser) kan självrefererande, vilket bidrar till identifiering noggrannhet. Dessutom ett utanförskap skikt appliceras på varje elektrod, ger selektivitet genom att förhindra andra störande molekyler ifrån upptäckt7. Den låg profil designen av MEA tillåter dessutom minimal vävnad trauma jämfört med tidigare teknik. Denna samma funktion ger till MEAs högre spatial upplösning, vilket underlättar studier av mikroskopiska regioner i hjärnan. Diskreta regioner i hippocampus (dentate gyrus, CA1, CA2) kan till exempel vara specifikt studerade8. Specifika detaljer om funktionerna i MEAs har varit tidigare beskrivna9.
I jämförelse med MEA elektrokemi, mikrodialys innehåller ett membran som placeras mellan lösningen av intresse och en lösning med liknande sammansättning, möjliggör detektering av extracellulär vätska ändrar10. Mikrodialys är en stöttepelare i neurokemi och har länge använts för detektion av neurotransmittorer, har men nackdelen med låg tidsupplösning, försenad upptäckt av glutamat förändring, och betydande vävnad trauma11.
MEAs kan indirekt identifiera neurotransmittorer som glutamat, acetylkolin och kolin, med hjälp av lämpliga oxidas enzymer som producerar elektroaktiva reporter molekyler såsom H2O2 eller O212,13 .
MEA-tekniken har använts i råttor och icke-mänskliga primater för studien av neurotoxicitet i samband med patofysiologiska processer än AIN7,14. Bland några av dessa patofysiologiska processer, har MEA teknologi använts för studier av Alzheimers sjukdom, epilepsi, traumatisk hjärnskada och effekten av farmakologisk föreningar på synaptisk kommunikation8,15 , 16 , 17. även om MEAs har använts för att studera dessa patologier i råttor och icke-mänskliga primater, hög utvecklingsmässiga likheten mellan människor och Nasse hjärnor gör anpassning av MEA tekniken hos smågrisar en mycket lämplig teknik för att studera AIN mekanismerna18.
Från början av experimentet upprätthållas de Nasses fysiologiska homeostas som beskrivs i denna lab’s offentliggörande21. Minimal övervakning bör omfatta pulsoximetri, EKG, capnography, icke-invasivt blodtryck och temperatur. Utbildad utredare krävs så att fysiologiska störningar (t.ex., hypo/hypertermi, hypoxi, hypotoni, arytmi) kan korrigeras på rätt sätt.
Före induktion utförs in vitro- MEA kalibreringar för att fastställa funktionalitet och selektivitet av MEA kända villkor. Den kalibrering och plätering av åtgärder är avgörande för effektiv användning av tekniken. Det finns många potentiella fel som kan uppstå under kalibreringen. Kalibrering kan identifiera dessa frågor samt felaktig plätering, vilket leder till felaktiga interferens svar. En mer detaljerad tabell hänsyn till fel som kan uppstå i MEA svar har sammanställts, längs med anmärkningsvärda orsaker och föreslagna lösningar, som bör bevisa ett användbart instrument för sannolikt felsökning (tabell 1). Det är viktigt att notera att glas referenselektroden före kalibrering och plätering, bör kontrolleras för förekomst av luftbubblor eller vit missfärgning, som antingen kommer att negativt påverka MEA funktion och inspelning noggrannhet.
Symptom | Orsak | Korrigerande åtgärder |
Ingen Signal | Elektroden inte ansluten | Korrekt ansluta elektroden till headstage och headstage till snabb amperometry system. |
Ingen ström till snabb amperometry systemet | Slå på strömbrytaren på baksidan av FAST system | |
Signal brus | Elektrod som förorenats av blod | Kontinuerligt vattna hjärnan ytan under elektroden införande |
Skölj elektroden omedelbart i dH2O | ||
Enzymet beläggning är lös | Rengör och övermålningsbar elektroden | |
Referenselektroden var inte införas eller belagda | Päls och placera referenselektroden längre under hårbotten | |
Elektroden är att upptäcka rörelse av hjärnans yta | Uppstår oftast i ytliga strukturer. Infoga elektroden djupare (1 mm åt gången) om möjligt | |
Djurförflyttningar | Djur är otillräckligt säkrade | Flytta djuret i posterior riktning till bättre säkert earbars på skallen. Om nödvändigt, höja bålen för bättre kropp anpassning. |
Djur är otillräckligt sövd | Kontrollera integriteten för utrustningen som bedövningsmedel. Titrera bedövningsmedlet till en effektiv dos och administrera en intramuskulär rokuronium dosen (5 mg/kg) | |
Felaktig elektrodplacering | Elektroden är inte korrekt justerad | Justera elektroden bibehållen korrekt anslutning till headstage. |
Stereotaxic koordinater är felaktiga | Säkerställa att Nasse atlas refererade inte använder en annan referenspunkt eller ett annat plan för anpassningen. | |
Var noga med att inte dölja markeringarna sutur genom poängsättning skallen. |
Tabell 1: instruktioner för felsökning av MEA Använd i smågrisar. Möjliga orsaker och korrigerande åtgärder för att hjälpa till med optimering och felsökning.
En stereotaxic atlas för Griseknoen används för att bestämma de stereotaxic koordinaterna för området av intresse med avseende på en känd punkt såsom bregma18. Öra barer bör säkras ordentligt för att säkerställa att skallen är nivå och helt orörlig. Försiktighet iakttas under mittlinjen snitt i hårbotten att undvika scoring skallen eftersom detta kan påverka visualisering av suturen raderna. Kraniotomi fönstret bör vara tillräckligt stor för att rymma MEA.
Detta protokoll presenterar ett antal tekniska utmaningar som kräver en välfylld operativa svit och en utredare/team skickliga kirurgiska och bedövningsmedel aspekter av protokollet. Modellen presenterar dessutom ekonomiska begränsningar i att Nasse modellen är dyrare än gnagare modellen; Det är dock betydligt mindre kostsamt än användning av icke-mänskliga primater, som kan kosta tusentals dollar. Användning av MEA teknik presenterar sina egna utmaningar, som förfarandet för beläggning och plätering elektroderna manuellt kräver en skicklig prövaren eller assistent att säkerställa tillräcklig selektivitet och pålitlig funktion. Mikroelektroder själva är ömtåliga, eftersom de är gjorda av keramik, och således lätt skadas om lämplig försiktighet inte beaktas. Mikroelektroder är föremål för störningar från andra elektriska apparater, som kan skapa brus i inspelningar, och blod vid operationsstället, som kan absorbera inspelning webbplatser. Behovet av specialutrustning presenterar en ytterligare börda som en stereotaxic kirurgiska ram måste vara anpassade byggd för att immobilisera Nasse skallen under implantation. Den stereotaxic ramen, glutamat oxidas och elektroderna själva är alla kostsamma. Dessutom utgör bristen på en Nasse stereotaxic atlas från inom det senaste decenniet tekniska begränsningar som kräver särskild sakkunskap att avgöra specifika platsen för djupa strukturer i hjärnan Nasse. Utveckling av en ny stereotaxic atlas, kanske med magnetkamera, skulle kraftigt öka möjligheten att använda denna teknik på smågrisar.
Griseknoen är en kliniskt relevant modell för studier av AIN till stor del på grund av de paralleller som finns mellan denna art och mänskliga nyfödda, som båda besitter liknande hjärnans struktur och utveckling. Till skillnad från vanliga modeller såsom möss eller råttor har Griseknoen en större CNS likheten till människor, som lånar till översättbarhet av modellens resultat. Nasse modellen är dessutom billigare och innebär mindre komplicerad hantering än en icke-mänskliga primater modell. Nasse modell är avsedd att granska processen av som anestesi kan inducera utvecklingsmässiga neurotoxicitet, mäta dess bidrag till neurologiska skador och bekämpa frågan om skador orsakade av confounding variabler. Hypoxi kan exempelvis misstolkas för skador orsakade av anestetika har globala effekter på hjärnan. Griseknoen utnyttjas med samma kirurgiska och bedövningsmedel villkor som de som används inom humanmedicinen för att säkerställa trohet av resultat.
Användningen av keramik-baserad MEA teknik eliminerar flera av de nackdelar som är associerad med den moderna tekniken med mikrodialys. Mikrodialys har begränsad tidsmässig och rumslig upplösning jämfört med amperometrisk metoder såsom MEA, som glutamat händelser kan kontinuerligt registreras i flera, mikroskopiska områden på upp till 10 Hz23. Denna snabba samplingsfrekvens eliminerar störande faktorn för lokaliserade signalsubstansen diffusion som är inneboende till långsam-provtagningsmetoder som mikrodialys24. MEA är dessutom en mindre invasiv metod än en mikrodialys probe som kan orsaka betydande gliosis under införande och kan förändra neurotransmittor aktivitet på insättningspunktens plats22.
Tidigare studier utnyttjar en rad däggdjur modeller, mätteknik och regioner av hjärnan, har visat basala glutamat nivåer jämförbara med de som finns med denna teknik. Detta tyder på att MEA-tekniken, när anpassas till Nasse modellen, ger giltig inspelningar i vivo glutamat koncentration (tabell 2).
Författare (år) | Inspelningsteknik | Djurmodell | Ålder | Hjärnan-regioner | Menar basala glutamat koncentration (µM) |
Hascup et al. (2008)23 | MEA (enzym-baserade) | Gnagare | 20 – 24 veckor | Prefrontala Cortex, Striatum | 3.3 ± 1,0; 5,0 ± 1,2 |
Hascup et al. (2010)25 | MEA (enzym-baserade) | Gnagare | 3 – 6 månader | Hippocampus | 4.7-10,4 |
Rutherford et al. (2007)9 | MEA (enzym-baserade) | Gnagare | 3 – 6 månader | Prefrontala Cortex, Striatum | 44,9 ± 4,7; 7,3 ± 0,9 |
Miele et al. (1996)26 | Mikrodialys (enzym-baserade) | Gnagare | – | Striatum | 3.6 ± 0,5 |
Dag et al. (2006)27 | MEA (enzym-baserade) | Gnagare | 3 – 6 månader | Frontala Cortex, Striatum | 1,6 ± 0,3; 1,4 ± 0,2 |
Quintero et al. (2007)28 | MEA (enzym-baserade) | Icke – mänskliga primater | 5,3-5,5 år | Premotor Cortex, motoriska Cortex | 3,8 ± 1,7; 3,7 ± 0,9 |
Stephens et al. (2010) 29 | MEA [Spencer-Gerhardt-2 (SG-2)] | Icke – mänskliga primater | 11 – 21 år | Putamen | 8,53 |
Kodama et al. (2002)30 | Mikrodialys (enzym-baserade) | Icke – mänskliga primater | – | Prefrontala Cortex | 1.29-2,21 |
Galvan et al. (2003)31 | Mikrodialys (enzym-baserade) | Icke – mänskliga primater | Juvenil | Striatum | 28.74 ± 2,73 |
Under och Spencer (1993)32 | Mikrodialys (enzym-baserade) | Mänskliga | 18 – 35 år | Hippocampus | 20,3 ± 6,6 |
Reinstrup et al. (2000)33 | Mikrodialys (enzym-baserade) | Mänskliga | – | Frontala Cortex | 16 ± 16 |
Cavus et al. (2005)34 | Mikrodialys (enzym-baserade) | Mänskliga | 15 – 52 år | Neocortex | 2,6 ± 0,3 |
Tabell 2. Jämförelse av basala extracellulära glutamat levelsacross olika djurmodeller. En valda genomgång av studier om normal extracellulär glutamat nivåer i friska vaken och sövda djur med mikrodialys eller mikroelektroder.
Användning av MEA-teknik för att övervaka i vivo glutamat koncentrationer i Nasse modellen kan tillåta för framtida utvärdering av Nasse neurologiska utfall efter anestesi. Överlevnad experiment har planerats, vilket kommer att ytterligare förståelse för den långsiktiga inverkan av anestesi på neurokognitiva välbefinnande mänskliga nyfödda. Överlevnad experiment kommer att möjliggöra beteendemässiga testning och övervakning av glutamat förändringar långt efter anestesi exponering. Det är också vanligt att barn genomgå anestesi under förhållanden där de kan uppleva fysiologisk stress i form av kirurgiska ingrepp. Framtida studier att hantera påverkan av kirurgi i form av neurologiska skador och ökning i neurotoxicitet skulle möjliggöra mer korrekt modellering av en gemensam klinisk miljö för barn. Användning av alternativa djurmodeller är också möjligt, som är studiet av dessa olika modeller genom kronisk implantation, tillåter oss att spåra beteendeförändringar som är associerad med neurotoxicitet. MEA tekniken själv är mångsidig, så framtida studie inte behöver begränsas till analys av glutamat nivåer (t.ex., GABA, kolin, lysin, etc. kan analyseras).
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna bidrag från University of Kentucky Center for mikroelektrod teknik (CenMeT), och den Ohio State University laboratorium djur Resource Center (ULAR).
Advance Liqui-Wean Pig Milk Replacer | PBS Animal Health | 292-13 | |
Piglet Anesthesia Face-Cone Mask | VetEquip | 921428 | |
Integra SL Anesthesia Workstation | DRE Veterinary | 2350 | This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention. |
Sevoflurane | Ultane | 0074-4456-04 | |
Rocuronium Bromide Injection | Hospira | 0409-9558-05 | |
Medfusion 4000 IV Infusion | Smiths Medical | ||
Model 1530 Heavy-Duty Research Model Stereotax | Kopf | custom made | |
Model 1541 Piglet Adaptor | Kopf | custom made | |
Infrared Spot Lamp | Amazon | B000HHQ94C | |
Bair Hugger Torso Blanket | 3M | 540 | |
Bair Hugger | 3M | 750 | |
Sterile Alcohol Prep Pad | Fisherbrand | 22-363-750 | |
Carbon Steel Rib-Back Surgical Blade | Bard-Parker | #10 | |
Scalpel Handel | Havel's | HAN-G4 | |
Surgical Scissors | World Precision Instruments | 504615 | |
Mosquito Forceps | Sklar Surgical Instruments | 17-1225 | |
Gauze Pads | Fisherbrand | 22-246-069 | |
Adson Tissue Forceps | Teleflex | 181223 | |
Dremel 111 Engraving Cutter | Amazon | Dremel 111 | |
Microelectrode Array | Center for Microelectrdoe Technology, University of Kentucky | S2 4Ch MEA; custom made | |
Headstage | Quanteon | 2pA/mV | |
Wire, silver, PFA, .008" Bare, .0110" coated | A-M Systems | 786500 | |
Fine Micromanipulator | Narishige Scientific Instrument Lab | MO-8 |