Summary
この記事では、ひと血清中におけるクロストリジウム ・ ディフィシル抗原を精製の 7 プレックス パネルに対する体液性免疫応答の高プロファイルの単純なタンパク質マイクロ アレイ法について説明します。特定抗体ポリクローナル免疫グロブリン製剤の定量プロトコルを拡張することができます。
Abstract
クロストリジウム ・ ディフィシル抗体ポリクローナルの静脈内の免疫グロブリン (IVIg) の別の準備、ひと血清中で反による高スループット蛋白質マイクロ アレイ分析の詳細な概要をいたします。プロトコルでは、サンプル作製、印刷配列、試金プロシージャ、およびデータ分析の方法論的手順について説明します。さらに、このプロトコルは、プラズマを含む多様な臨床サンプルを取り込んで細胞培養上清にさらに開発できます。蛋白質のマイクロ アレイを使用して、アイソタイプ (IgG、IgA、IgM), サブクラス (IgG1、IgG2, IgG3, IgG4、IgA1、iga2 は) の組み合わせを決定する方法を示す、株特異抗体高純度全体c. ディフィシル毒素 A と B (toxinotype 0、ひずみ VPI10463、ribotype 087) 毒素 B、 c. ディフィシル毒素 B だけ表現するひずみ (CCUG 20309) から、バイナリ毒素、pCDTb、ribotype 全体の表層抗原 B フラグメントの前駆体フォーム (Slp; 001、002、027)、制御タンパク質 (破傷風、トキソイドとカンジダ)。血清c. ディフィシル感染症 (CDI)、健常者 (HC)、下痢症嚢胞性線維症 (CF) を持つ個人に個人個人の事前のポスト IVIg 療法からもプローブ、マイクロ アレイ実験中に、CDI、複合型免疫不全疾患、慢性炎症性脱髄性 polyradiculopathy の治療。我々 は、IVIg と前に血清の商業準備の患者グループと次の IVIg 投与間毒素の中和効果とマルチ アイソタイプ特異抗体レベル差が発生します。また、あるマイクロ アレイと酵素免疫測定法 (ELISA) 相関抗毒素 igg の血清中。そのマイクロ アレイがC.difficileワクチン接種や感染したヒトの抗原抗体反応をプロファイリングするための有望なツールになる可能性が示唆されました。さらに洗練された抗原パネルの生産コストの削減、最適化し、患者固有の方法でc. ディフィシル感染症の最も臨床的に有用な免疫療法を選択マイクロ アレイ技術が役立つことを期待しています。
Introduction
このプロトコルでは、開発、検出のための新規およびカスタマイズされたタンパク質マイクロ アレイ アッセイの検証と菌株のアイソタイプ特異抗体のc. ディフィシル抗原半定量をについて説明します。我々 は正常に私たちのdifficile C.を使用して-患者血清1、2IVIg3の準備で特異抗体コンテンツの組成の生化学分析のための有望な新しいツールとして特定のマイクロ アレイ分析とCDI4の転帰不良と相関する抗体の特異性の id。Difficile C.病原体特異抗体のこのアッセイでの質の高い再現性のあるプロファイリングできるように biobanked 血清と市販の IVIg をマイクロ アレイ スライドに分析する方法を紹介します。
多くの健康な子供および大人検出血清 IgG, IgA 抗体c. ディフィシル毒素 A と B5,6があります。これらは幼児期と成人期のdifficile C.への暴露を次時に一時的な露出の後で発生すると考えられています。このため、ポリクローナル IVIg がずっと再発と劇症 CDI7,8,9を治療するためにオフにラベルを使用します。しかし、その決定的な役割と作用は不明のまま。いくつかの研究は、 C. difficile毒素に体液性免疫反応が病気の発表や結果に役割を果たすことを示しています。具体的には、無症候性の患者は、増加血清抗毒素 A IgG 濃度10症候性疾患を発症した患者と比較して表示します。明白な協会中央抗毒素 A IgG 抗体と 30 日間全ての原因の死亡率11報告されています。いくつかのレポートはまた毒素 A、B、およびいくつかの非毒素抗原 (Cwp66、Cwp84、フリック、ありますと表層タンパク質 (Slp)) 再発・抗体反応に対する保護との関連を明らかにした12,13,14,15. これらの観察が誕生して最初受動免疫療法薬ターゲットc. ディフィシル毒素 B の (bezlotuxumab)、最近、米国食品医薬品局や欧州の医薬品が承認されています。再発の CDI16防災機関。不活化毒素または組換え毒素断片を使用して予防接種戦略もまた中開発17,18,19。これらの新しい治療上のアプローチは間違いなく大きいサンプルの大きさの複数の抗原に対する液性免疫応答を評価するための要件を刺激します。
今日、菌株、アイソタイプ特異抗体のc. ディフィシル抗原を同時に評価することができる市販の高スループット試金の著しい欠乏があります。今後の研究活動や臨床応用を容易にするためにこのようなアッセイを開発するニーズがあります。蛋白質のマイクロ アレイ、接触20または非接触にすることができますロボット システムを用いた顕微鏡スライド ベース表面にスポットの空間的組織化配列として個別に浄化された蛋白質の多数を固定する方法印刷ツール21。スポットのセル lysates、抗体、組織ホモジネート、内因性または組換え蛋白質やペプチド、体液薬22,23など複雑な混合物があります。
蛋白質のマイクロ アレイの技術では、標準的な社内の elisa 法にはなかった利点伝統的反difficile C.の抗体の応答を評価するために使用されている技術を提供しています。マルチ アイソタイプ特異抗体抗原、サンプル、および試薬の量を削減要件標的蛋白質のより広範なパネルの範囲を検出するために増加した能力が含まれますとより大きいを組み込むための強化された機能複数の内部品質管理 (QC) に加えて、技術的な複製の数は、1を測定します。マイクロ アレイは従ってより敏感、正確かつ再現性のある、大きなダイナミック レンジを持っています。これらの要因はマイクロ アレイに知られている蛋白質の大規模検出 Elisa に安く、潜在的に有利な代わりを作る。ただし、マイクロ アレイ技術の不利な点は高度精製抗原のパネルを確立し、技術的なプラットフォームの設定に関連付けられている大規模なアップ フロント コストから主に発生します。
蛋白質のマイクロ アレイは、臨床応用の診断および基本的な研究ツールとして過去 20 年間で広く使用されています。特定のアプリケーションは、タンパク質発現プロファイリング、酵素-基質の関係、バイオ マーカーのスクリーニング、宿主微生物間相互作用の解析に関する研究とプロファイリング抗体特異性23,24, 25,26,,2728。マラリア (原虫)29, HIV 130, インフルエンザ31, 重症急性呼吸器症候群 (SARS)32、ウイルス性出血熱33 を含む多くの新しい病原体の抗原/マイクロ アレイが確立されています。、ヘルペス ウイルスの34、および結核35。
簡単営業C. difficile反応性抗原マイクロ アレイ分析、マルチ アイソタイプとC. 株特異抗体の正確な正確なおよび特定の定量化を可能にするのに係る現在のプロトコルdifficileポリクローナル IVIg および血清中の抗原。ここで、elisa 法と同様、測定精度と再現性プロファイルと比較されたとき許容可能なマイクロ アレイ分析性能に係る代表の結果が含まれています。この試金は他の臨床サンプルをプロファイルにさらに開発できるし、CDI の分子基盤研究のための新しい標準を設定します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. マイクロ プレートの準備
- (患者の血清を実行する前に事前に定義された) を最適な濃度で印刷バッファー [PBS-トゥイーン-トレハロース (50 mM)] c. ディフィシル抗原を希釈: 毒素 (200 μ g/ミリリットル) と毒素 B (100 μ g/mL)、pCDTb (200 μ G/ml) と精製ネイティブ全体の Slp は、ribotypes 001、002、027 (200 μ g/mL) から派生します。
注: 毒素 B 毒素 B 表現するひずみ CCUG 20309 (90 μ g/mL) から得られました。- ポジティブ コントロール、 c. アルビカンスと 100 μ g/mL で印刷バッファーと破傷風トキソイドの lysates を希釈します。最後に、希釈精製ひと免疫グロブリン テスト抗体アイソタイプを逐次マッチング、検量線を作成するための印刷バッファーで 10 希釈液 50 μ G/ml で開始します。
- 384 ウェル プレートに印刷バッファーで希釈液の 10 μ L を転送します。
- カバー プレート シールと 300 × g で 5 分間遠心するプレート。
2. 印刷連絡先ロボットと配列
- 熱各携帯用ガスバーナー 3 × 2 s を使用してシリコン pin 形ときれいな水 3 x 3 s 各でリンス。
- Arrayer のローディングのカートリッジにマイクロ プレートを配置します。
- スライド トレイにアミノシラン スライドを配置します。
注: スライド トレイは 27 のスライドを保持できます: 9 のスライドの 3 行。スライドがから一番下の行の左側にある縦方向に配置され、スペースの残りの部分は、スライド トレイ上のすべての穴をカバーできるように空白のスライドで覆われています。- [Ok]を押し、真空をオンになっているし、すべてのスライドは、セキュリティで保護されたことを確認します。印刷を開始する前に、少なくとも 1 時間の高温多湿の環境でスライドを残します。
注: アミノシラン スライドは、乾燥剤を密封袋で提供されます。開いたら、任意の未使用のスライドが満了する日まで保存用デシケータにすぐに返されます。
- [Ok]を押し、真空をオンになっているし、すべてのスライドは、セキュリティで保護されたことを確認します。印刷を開始する前に、少なくとも 1 時間の高温多湿の環境でスライドを残します。
- クロストリジウム ・ ディフィシル抗原を印刷に適した印刷プログラムを設定します。TAS アプリケーション スイートを起動し、' 私のグリッド化実行 ' をディレクトリから必要な印刷実行パラメーター ファイルを開きます。4 連ですべてのクロストリジウム ・ ディフィシル抗原の印刷にクロストリジウム ・ ディフィシルファイルを選択します。
- メイン ウィンドウにマイクロ アレイのアイコンをダブルクリックする時に 3 つのタブ付きウィンドウと呼ばれる 'MicroArraying パラメーター' が表示されます。 3 つのタブは、「ソース」、「ターゲット」と「オプション」「ソース」タブ詳細にマイクロ プレートで使用されるサンプル数を示します。「ターゲット」タブには、スライド ロード配列のスライドに印刷するか、スライドのレイアウト (16 のサブ配列形式) を編集する方法詳細が表示されます。「オプション」タブには、洗浄、使用などをするツールの詳細が表示されます。すべての完成したサンプル後洗ってください。異なるサンプル間のクロス汚染を避けるためにサンプル間シリコン pin 形をきれい。
- プログラミング オプションがオプションの下にある > TAS アプリケーション スイート ツールバーの環境設定を実行します。このセクションで使用する 9 タブがあり、あなたへと移動クリックして完全な 1 つのタブ。「OK」ボタンをクリックすると「実行の設定」からかかります「実行の設定」の「一般」タブでプログラムを起動するときの楽器の動作に関するこのセクション下で利用可能なチェック ボックス数があります。「総理風呂実行が開始する前」にチェックすべての 3 つの洗い場短いプライミング シーケンス実行の開始前に受けることになります。最初のソースを訪問する前に、チェック ボックスの「実行の開始時に洗う」、ピンのツールが洗浄されます。「実行終了時の洗浄」にチェック、最後にソースを訪問した後、ピンのツールが洗浄されます。ユーザーは、洗浄サイクルの数を設定できます。「実行設定」の「気候変動」タブで加湿を開始します。我々 が使用する設定は、次のとおり: 率 55%、最小湿度 55%、目標湿度 60% 開始率 55%、実行します。目標湿度に達している、そうしないスポットは間違ったサイズになり、ライブラリが急速に蒸発するまで実行は開始されません。
- TAS のメニュー バーで緑の移動ボタンをクリックします。 実行を開始し、定期的に特定のすべてのものに印刷の実行中に arrayer、[ok] を確認します。
注: これにより各スライド上で並列に 15 試料の分析、1 つのサブ配列はネガティブ コントロールとして使用され。サブ配列のデザインは、印刷されたタンパク質 (抗原) の数によって決まり、印刷された生物の数をレプリケートします。
注: 各サンプルを印刷後、頭に向かって移動洗濯風呂蒸留水と 0.002% を含む 2 つの洗浄浴にピンの複数を浸漬を許可する 1.5 のトゥイーン 20 各バースの s に続いて超純水でピンを洗浄・乾燥のピン4 主な洗浄駅 s。
3. 配列のストレージ
- 一晩、デシケータで常温保存印刷スライドを維持します。
注: 印刷のスライドは 1 週間保存できます。
4. アレイ プローブ
- 16 ウェル室形式のスライド ホルダーに印刷スライドを慎重に配置します。
注: 室、約 7.5 mm の深さを持つ混合し、洗浄手順を容易にする容積の比率に寛大な表面を提供します。 - すべての試薬を使用する前に室温に戻を許可します。指定がなければ、室温でのすべての次の手順を実行します。
- フィルター処理された 5% ウシ血清アルブミン トゥイーン (BSAT; 0.2 μ m シリンジ フィルターを使用)、各ブロック スライドをカバーし、1 時間振とうしながらそれらをインキュベートの 100 μ L を追加します。
- Tween 20 と生理食塩水リン酸緩衝の 120 μ L で 5 x 1 分各スライドを洗う (PBST; 0.1% トゥイーン) 揺れもあたり。スライドを乾燥をさせてください。
- 20 分間氷の上の血清サンプルを解凍し、コンポーネントを削減の背景を持つ市販抗体希釈検体を希釈 (材料の表を参照してください)。
- 表 2に示すように、テストの免疫グロブリンによると血清の希釈を最適化します。
- ネガティブ コントロールとして使用される 1 つを除いてすべてのブロックに希釈血清試料 100 μ L を転送します。このブロックのみ抗体希釈の 100 μ L を追加します。1 時間のために穏やかな攪拌とスライドを孵化させなさい。
- PBST の 120 μ L で各 5 x 3 分スライドを洗う (0.1% トゥイーン) 揺れもあたり。
- ビオチン標識ヤギ抗ひと抗体抗体の希釈剤で希釈の 100 μ L を追加します。
- 表 2で説明したテストの免疫グロブリンによると二次抗体の希釈を最適化します。スライドをカバーし、1 時間を穏やかな揺れでそれらを孵化させなさい。
- 揺れでよくあたり PBST の 120 μ L でスライド各 5 x 3 分を洗浄します。
- ストレプトアビジン Cy5 の 100 μ L を 5 %bsa の配分で希釈した各ブロックに追加します。穏やかな攪拌に 15 分間揺れながら光からそれらを保護するために箔のスライドをカバーします。
- 続いて PBS で 1 分の 2 洗浄揺れだけで揺れ、よくあたりスライド 5 x 1 分各 120 μ L の pbst; を洗ってください。
- それらを乾燥する 300 × g で 5 分間スライドをスピンします。
- 常温輸送および保管用暗箱にスライドをしてください。
- 調査した後信号整合性を確実にすぐに配列をスキャンに進みます。
注: ただし、プローブ スライド暗闇の中で保存できスキャン調査から 1 週間以内。
5. 配列のスキャン
- レーザー スキャナーに切り替える (テーブルの材料を参照) ウォーム アップ レーザー スキャンする前に 30 分。スキャナー用のソフトウェアをアップロードし、スキャナーをコンピューターに接続します。
- 再生光が緑色に変わったら、スキャナーに印刷面を上にスライドを配置します。
- 設定ボタンを押すし、次のようにスライドをスキャンする場合、次の設定を調整: スキャン モード, 中央値;買収、635 だけです。アクイジション ・ モード、マニュアル;ゲイン、20;電源、低;スライド型、ラベルのないスライド;フォーカス、オート フォーカス。自動スクロールをオフし、バーコードの読み取りをピクセル サイズ 10 と 35 のスキャンに設定します。
- 16 ビットのグレースケールとして複数画像の TIFF 形式の画像を保存します。インポート グリッドボタンを押すし、適切な配列リストを選択します。
注: 配列リストは、サイズとサブ配列の位置、および各機能インジケーターに関連付けられている印刷物名をについて説明します。- スライド上のスポットをグリッドに合わせます。
- 各スポットの蛍光信号強度を測定し、GenePix 結果 (GPR) と呼ばれるテキスト形式で結果を保存するプロセスを定量化」ボタンを押すことによって、画像を分析します。
注: GPR ファイルに含まれる抗原ターゲット アレイ上の局在と識別変数とも平均蛍光強度と抗体の結合を表すローカル背景信号を各スポットの値。
6. データの分析
- 逆相蛋白質配列 (セルシグナル) アナライザー、クラン36統計解析言語 R 内のモジュールと呼ばれる無料のマイクロ アレイ解析ソフトウェアを用いた背景差分の後各抗原のレプリケートの中央値を計算します。
- 標準曲線をプロットし、商業科学グラフと統計ソフトウェア (材料の表を参照) を使用して抗体のレベルを計算する免疫グロブリンの標準曲線を基準にして各抗原の信号を補間します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
記述されていたプロトコルの主な手順を示すフローチャートを図 1に示します。図 2は、スピアマンの相関関係テスト テスト患者血清中の抗毒素 A と B レベル IgG および IgA のマイクロ アレイと ELISA との重要な契約を示しています。図 3は、下痢なし CF 患者、下痢、CDI 患者と HC 毒素は、毒素 B、およびバイナリ毒素 (pCDTb) 特定抗体の差動 IgG, IgA 抗体クラスを示します。図 4は、患者血清中の抗体を中和difficile C.抗毒素を示しています。( C. difficile毒素および Slp) に対する免疫反応性と IVIg の ( c. ディフィシル毒素) に対する中和効果を図 5に示します。図 6は、( C. difficile毒素および Slp) に対する免疫反応性と患者血清プレとポスト IVIg 投与 ( c. ディフィシル毒素) に対する中和効果を示します。表 1は、許容できる測定内および測定間の係数被検血清を用いたマイクロ アレイの変動を示します。免疫グロブリンは、二次抗体および血清の浄化された蛋白質として最適化された希釈濃度が関連するこの研究で使用されるの一覧を表 2に示します。
図 1: マイクロ アレイのプロトコルに関連する主要な手順の概要です。最初のステップは、抗原とコントロールの準備です。以降のサンプルの希釈は、アミノシラン スライド上に quadruplicates で印刷するための準備で 384 プレートに転送されます。乾燥とスライドのブロック、患者血清を配列に孵化します。さらに洗浄後は、指定したアイソタイプのビオチン標識抗ひと免疫グロブリン (Ig) が追加されます。後に最終的な洗浄、乾燥の手順スライドがスキャンされ、結果の画像はマイクロ アレイ画像の解析ソフトウェアで処理します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: マイクロ アレイと ELISA の結果の相関します。スピアマンの相関係数は、2 つのプラットフォーム間の合意のレベルを評価するために使用されました。ときに、社内の酵素抗体法 (ELISA)、 Aとマイクロ アレイのパフォーマンスを比較します。毒素 A の良い相関が認められた (r = 0.7051;P < 0.0001)、 B。毒素 B の適度によい相関 (r = 0.5809;P < 0.0001)。完全な ELISA プロトコルがされている37の詳細に関する説明です。この図は、Negmらから転載されています1権限を持つ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:アイソタイプ特異抗体クロストリジウム ・ ディフィシル毒素。この画像は豚血清抗毒素 IgG および IgA 応答 (toxinotype 0、ひずみ VPI ribotype 087 10463; 200 μ g/ml、100 μ g/mL で毒素 B 毒素 A) 毒素 B (c. ディフィシル毒素 B 生産ひずみ CCUG 20309; 90 μ g/mL で毒素 B) と B の前駆体フォームバイナリ毒素、pCDTb (200 μ G/ml) 患者c. ディフィシル感染症 (CDI) の下痢で、下痢症嚢胞性線維症 (CF) 患者と健常者 (HC) のフラグメント。IgG および IgA の血清希釈、1: 500、1: 100、それぞれです。グループ間の違いは、複数回答のダンの事後テストに続いて、クラスカル-ウォリス検定を使用して評価されました。HC と比較して (n = 17) 症候性 CDI と患者 (n = 16)、大人の CF の患者 (n = 16) 血清 IgA 抗毒素 A の有意レベルと B レベルを展示P 0.05。抗毒素 A IgG レベルに差がなかったことを除いて、同じパターンは igg 抗体は、勝った。ボックスと、ウィスカのプロットは、中央値、範囲、四分位数を表します。P ≤0.0001;P ≤0.01;P 0.05。標準化された信号は、免疫グロブリンの標準曲線に正規化されます。この図は、モナハンらから転載されています2権限を持つ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:に中和抗体効能 difficile C. 患者の血清中の毒素 A と B.この図は、保護の中和抗体 (NAb) c. ディフィシル毒素 A と B [toxinotype 0、ひずみ VPI 10463 ribotype 087、50% 致死線量 (LD50) で使用] レスポンス血清 (1: 100 希釈; 毒素 A 2.5 ng/mL、毒素 B 0.5 ng/mL) HC から、下痢、なし CF 患者と CDI と下痢症。CF の患者の血清は、HC (毒素 A と B) と CDI (毒素) 患者からの血清と比較して大幅に強く保護抗毒素 NAb 応答を出展しました。グループ間の違いは、複数回答のダンの事後テストに続いて、クラスカル-ウォリス検定を使用して評価されました。ボックスと、ウィスカのプロットは、中央値、範囲、四分位数を表します。P ≤0.01;P 0.05。この図は、モナハンらから転載されています2権限を持つ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 免疫反応性とC.difficile抗原に対する IVIg の効果を中和します。A.この画像は商業の静脈内の免疫グロブリン (IVIg) 準備でc. ディフィシル抗原特異抗体マルチ アイソタイプの反応性を示します。ヒート マップ 7 c. ディフィシル抗原 [毒素 (200 μ に対する 3 つの市販製剤 (材料の表を参照してください) のアイソタイプ特異的抗体 (IgG, IgG1、IgG2、IgG3, IgG4、伊賀、IgA1、iga2 は、, IgM) のレベルを示しています。/mL)、毒素 B (100 μ g/mL)、pCDTb (200 μ G/ml) 毒素 B (CCUG 20309; 90 μ g/mL)、表面層蛋白質 (Slp) 001、002、027 (すべて 200 μ g/mL) と] 蛋白質のマイクロ アレイの技術を使用して。ヒート マップの色コードのとおりです: 赤 (高) 信号の強さに対するグリーン (低)。ヒート マップのカラー スケールで表される信号の値が任意の蛍光ユニット (AFU) から log2 変換します。くださいメモ AFU は、標準化された記述子より最近置き換わりました信号2です。総 IgG, IgG1, IgG2, アイソタイプを与えた毒素毒素 B、バイナリ毒素 (pCDTb)、A に対して最高のバインディングの反応性と毒素 B (CCUG 20309)。B. これらのプロット表示ネイティブc. ディフィシルに対する IVIg の中和効果全体毒素 A と B彼らはc. ディフィシル毒素 A と B に対して IVIg 商品の保護の中和効果の割合を与える各プロットは、1: 100 希釈で帳票の実験の中央値を表します。IVIg の準備 1 展示毒素 A. に対して特に IVIg 製剤 2 および 3 と比較して最も低い保護効果 * * * P ≤0.0001;P 0.05 (一方向の分散分析)。この図は、Negmらから変更されています。3権限を持つ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 免疫反応性とc. ディフィシル抗原に対する患者の血清の作用を中和します。A.この図は、IVIg 投与の前後に患者血清のdifficile C.タンパク質に対する抗体の反応性の比較を示します。ヒート マップは 7 c. ディフィシル抗原に対する IVIg 投与の前後に 7 人の患者の血清中のアイソタイプ (IgG, IgG1、IgG2、IgG3, IgG4、伊賀、IgA1、iga2 は、, IgM) の発現レベルを示しています [毒素、(200 μ G/ml)、毒素 B (100 μ g/mL)、pCDTb (200 μ G/ml) 毒素 B (CCUG 20309; 90 μ g/mL)、および Slp 001、002、027 (すべて 200 μ g/mL)] 蛋白質のマイクロ アレイの技術を使用して。ヒート マップの色コードのとおりです: 赤 (高) 信号の強さに対するグリーン (低)。ヒート マップのカラー スケールで表される信号値は、AFU から log2 変換です。AFU は、標準化された信号2最近置き換わりましたに注意してください。毒素は、毒素 B、pCDTb 総 IgG, IgG1, IgG2, IgG3 の反応性と後注入強化があった。B。 IgG レスポンス ポスト IVIg 投与とバイナリ毒素 (pCDTb)、前毒素 B 毒素 A を表しています。すべての毒素に対して総 IgG レベルを表示 (ウィルコクソンの符号順位検定を使用して) IVIg 投与が大幅に増加。各プロットは 1:10 で帳票実験の中央値を表す希釈。C. これらのプロットは、ネイティブc. ディフィシルに対する中和効果を示す毒素 A と B の IVIg の投与します。前およびポスト注入の中和抗体活動の比較、ネイティブに対して IVIg 注入後保護効果の増強を示していますc. ディフィシル毒素 A と B各プロットは 1:10 で帳票実験の中央値を表す希釈。(ウィルコクソンの符号順位検定を使用) 患者血清テスト ポスト IVIg 投与で毒素 A と B に対する保護効果の大幅な増加を認めた。この図は、Negmらから転載されています。3権限を持つ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 再現性 | 毒素 A | 毒素 B | SLP001 | SLP002 | SLP027 | 毒素 B CCUG 20309 | pCDTb |
| 内アッセイ | 7.70% | 6.40% | 7.40% | 5.10% | 7.60% | 7% | 3.70% |
| 測定間 | 9.10% | 9.10% | 7.40% | 11.20% | 12.8 | 9.70% | 12.50% |
表 1: マイクロ アレイの測定内および測定間の精密1。 マイクロ アレイ測定内および測定間変動は、7 患者の血清を用いて算出しました。同一のサンプルは、2 つの独立した時点で 2 つのスライドの各測定しました。すべての抗原 (n = 7 のテストと n = 2 コントロール) 各配列に 5 つのレプリケートで発見されました。
| 浄化された蛋白質の集中 | 血清希釈 | 二次抗体の希釈 | |
| IgG | 50 μ g/ml | 1/500 | 1/20000 |
| IgG1 | 200 μ g/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgG2 | 200 μ g/ml | 1/100 | 1/10000 |
| IgG3 | 200 μ g/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgG4 | 200 μ g/ml | 1/100 | 1/5000 |
| 伊賀 | 50 μ g/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgA1 | 200 μ g/ml | 1/100 | 1/10000 |
| Iga2 は | 200 μ g/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgM | 50 μ g/ml | 1/500 | 1/20000 |
表 2:免疫グロブリンはこの研究で使用されるの一覧。Igs は、関連する浄化された蛋白質の濃度 (μ g/mL) および血清および二次抗体の希薄で表示されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルでは、マイクロ アレイは (図 3および6) 患者血清および IVIg (図 5) の商業準備のdifficile C.タンパク質抗原に対する液性免疫応答を定義するための適切なプラットフォームを示しました。マイクロ アレイ技術が従来の elisa 法 (図 2) と比較した場合にも実行して測定内および測定間変動 (精度の許容範囲内で落ちると優れた再現性を示していますがまたできた表 1)。
重要なステップ:
あらゆる成功した抗原マイクロ アレイ プラットフォームを構築するときいくつかの重要な手順に従わなければなりません。最初は、QC の実験を実行する非常に重要です。QC の実験で異なるパラメーター評価されるべき、適切な界面化学、印刷バッファー、ブロック バッファー、血清サンプルおよび二次抗体の希釈液の選択など。これらの実験は、よく検証で信頼性の高い手法38,39を提供することを目的と行われなければなりません。
適切なタンパク質固定化プロセスの選択は、この研究に見られるようにテスト アミノシラン スライドの質の高いパフォーマンスを確保するためのマイクロ アレイ解析で最も重要な手順の 1 つです。正規と円形スポット形態, 高と特定の信号強度、および明確な背景を観察することが重要です。マイクロ アレイのパフォーマンスに影響を与えるもう一つの要因は、スライドに制服と正規の斑点を生成する目的の表面化を達成するために均等に重要である印刷バッファーです。
これは、最適なサイズと印刷するスポットの形状、印刷の正しい設定を選択することが重要です。たとえば、湿度レベル維持しなければなりません約 55% 印刷時に湿度なしマイクロ アレイ チャンバー内の蒸発速度が増加し、少ないスポットが印刷されますので。
非固有の蛋白結合率は背景とスポット信号に影響を与えるその他の要因したがって、ブロック バッファーの適切な選択は、感度の向上と配列データ39の精度につながる任意の非特異的結合を減らすことができます。
変更とトラブルシューティング:
抗原と血清必要があります避けようと冷凍庫に小さい蓄積管でストアドを避けることを使用するまで配列の信号強度が劣化することができます複数の凍結融解サイクルを繰り返します。実験が成功のチャンスを高めるためには、すべての試薬は新鮮な準備する必要があります、フィルターします。印刷と必要な設定をチェックする前に、arrayer をクリーニングします。また、スライド ホルダーは、バック グラウンド ノイズを最小限に抑えるためにきれい保たれなければなりません。
制限事項:
蛋白質のマイクロ アレイのアプリケーションは現在蛋白質マイクロ アレイ作製における界面化学に対する厳しい要求により妨げられます。ここでタンパク質分子の化学的および物理的特性に大きな変化は、タンパク質と抗体の分子のための40の異なるクラスのカスタム設計ユニークな界面化学を必要とします。このような技術の広範な実装に直面しているその他の技術的な課題は、高価な特殊な装置とソフトウェア保守料金、複雑なデータ分析、相対の考察と同様、割り当てられたベンチの必要性プロテインの定量と批判的に精製抗原へのアクセス。
メソッドによって既存の/代替法の意義:
マイクロ アレイの技術 Luminex イムノアッセイやメソ スケールの発見、elisa 法の原理に近いがカスタマイズ可能です、統計的な検出力を達成するためにスケール アップすることができます、唯一 1 マイクロリットル貴重なサンプル量に依存しているし、画面血清する能力を持って複数のタンパク質の反応。つまり、特に大規模な歴史的な血清銀行とバイオ マーカーの探索とスクリーニングに適して。
将来のアプリケーションまたはメソッドの方向:
今後の取り組みは、二重盲検の方法で大規模なコホートを使用して潜在的なバイオ マーカーの外部検証患者成層のアッセイ予後ツールとして使用 (細胞培養上清)、その他のサンプルの分析を最適化することに向けられるだろうし、予測し、(モノクローナル抗体、ワクチン) は免疫療法への応答を最適化します。将来的にマイクロ アレイの技術は有効な診断ツールとしてまたは時間の期間にわたって薬物治療計画を監視するための病院の設定で使えます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
なし。
Acknowledgments
この研究は、エルメス交わりオラ Negm とターニャ モナハンとノッティンガム消化器病センターと NIHR ノッティンガム消化器疾患医療研究センターから個別の資金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobotics MicroGrid II arrayer | Digilab, Malborough, MA, USA | N/A | Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides. |
| Scanner InnoScan 710. | Innopsys | N/A | A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction. |
| MAPIX software version 7.2.0 | Innopsys | N/A | Measure signal intensities of the spots. |
| Silicon contact pin | Parallel Synthesis Technologies | SMT-P75 | Print the samples onto the slides. |
| Thermo Scientific Nalgene Desiccator | Thermo Scientific | 41102426 | To store the new and printed slides. |
| 384-well plate | Genetix | X7022UN | To prepare the antigens. |
| Plate cover | Sigma Aldrich, UK | CLS6570-100EA | To reduce evaporation of the samples. |
| Aminosilane slides | Schott, Germany | 1064875 | The slide of choice for printing the antigens. |
| Slide holders | GraceBio Labs, USA | 204862 | Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells . |
| Candida albicans lysate | NIBSC | PR-BA117-S | Positive control |
| Tetanus Toxoid | Athens Research and Technology | 04/150 | Positive control |
| Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707 | Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-1 | Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-2 | Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-3 | Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-4 | Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma. |
| Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701 | Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-1M | Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-2M | Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma. |
| Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090713 | Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma. |
| Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific | Vector Labs | BA-3080 | Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9052-08 | Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT | Southern Biotec | 9060-08 | Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9210-08 | Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT | Southern Biotec | 9190-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - Biotinylated | Vector Labs | BA-3030 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA1-BIOT | Southern Biotec | 9130-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA2-BIOT | Southern Biotec | 9140-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgM-BIOT | Southern Biotec | 9020-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| 0.2 mm syringe filter | Thermo scientific | 723-2520 | Filter the 5% BSA. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, UK | A7284 | Use 5% BSA for blocking the slides. |
| Antibody diluent | Dako, UK | S3022 | To dilute the serum and the secondary antibody. |
| Streptavidin Cy5 | eBioscience | SA1011 | Detection of the immune reaction. |
| Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb | University of Bath | NA | Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70) |
| Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins | Dublin City University | NA | |
| Vigam (IVIg preparation 1) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Privigen (IVIg preparation 2) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Intratect (IVIg preparation 3) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A |
References
- Negm, O. H., et al. Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).
- Monaghan, T. M., et al. High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection. Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).
- Negm, O. H., et al. Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration. Clinical & Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).
- Monaghan, T., et al. OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection. Gut. 66, Suppl. 2 31 (2017).
- Bacon, A. E. Immunoglobulin G directed against toxins A and B of Clostridium difficile in the general population and patients with antibiotic-associated diarrhea. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 18 (4), 205-209 (1994).
- Viscidi, R., et al. Serum antibody response to toxins A and B of Clostridium difficile. The Journal of Infectious Diseases. 148 (1), 93-100 (1983).
- Salcedo, J., et al. Intravenous immunoglobulin therapy for severe Clostridium difficile colitis. Gut. 41 (3), 366-370 (1997).
- Abougergi, M. S., Kwon, J. H. Intravenous immunoglobulin for the treatment of Clostridium difficile infection: a review. Digestive Diseases and Sciences. 56 (1), 19-26 (2011).
- Shah, N., Shaaban, H., Spira, R., Slim, J., Boghossian, J. Intravenous immunoglobulin in the treatment of severe Clostridium difficile colitis. Journal of Global Infectious Diseases. 6 (2), 82-85 (2014).
- Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A. The New England Journal of Medicine. 342 (6), 390-397 (2000).
- Solomon, K., et al. Mortality in patients with Clostridium difficile infection correlates with host pro-inflammatory and humoral immune responses. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 9 1453-1460 (2013).
- Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea. Lancet. 357 (9251), 189-193 (2001).
- Leav, B. A., et al. Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium difficile infection (CDI). Vaccine. 28 (4), 965-969 (2010).
- Drudy, D., et al. Human antibody response to surface layer proteins in Clostridium difficile infection. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 41 (3), 237-242 (2004).
- Bauer, M. P., Nibbering, P. H., Poxton, I. R., Kuijper, E. J., van Dissel, J. T. Humoral immune response as predictor of recurrence in Clostridium difficile infection. Clinical Microbiology and Infection. 20 (12), 1323-1328 (2014).
- Wilcox, M. H., et al. Bezlotoxumab for prevention of recurrent Clostridium difficile infection. The New England Journal of Medicine. 376 (4), 305-317 (2017).
- Leuzzi, R., Adamo, R., Scarselli, M. Vaccines against Clostridium difficile. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 10 (6), 1466-1477 (2014).
- Ghose, C., Kelly, C. P. The prospect for vaccines to prevent Clostridium difficile infection. Infectious Disease Clinics of North America. 29 (1), 145-162 (2015).
- Henderson, M., Bragg, A., Fahim, G., Shah, M., Hermes-DeSantis, E. R. A review of the safety and efficacy of vaccines as prophylaxis for Clostridium difficile infections. Vaccines. 5 (3), Basel. (2017).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Delehanty, J. B., Ligler, F. S. Method for printing functional protein microarrays. BioTechniques. 34 (2), 380-385 (2003).
- Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 27 (Unit 27) 21 (2013).
- Huang, Y., Zhu, H. Protein array-based approaches for biomarker discovery in cancer. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 15 (2), 73-81 (2017).
- Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
- Bacarese-Hamilton, T., Mezzasoma, L., Ardizzoni, A., Bistoni, F., Crisanti, A. Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays. Journal of Applied Microbiology. 96 (1), 10-17 (2004).
- Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).
- Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection. Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).
- Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 30, 21-27 (2016).
- Crompton, P. D., et al. A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6958-6963 (2010).
- Khodakov, D. A., et al. An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV. BioTechniques. 44 (2), 241-246 (2008).
- Ryabinin, V. A., et al. Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus. PLoS One. 6 (4), 17529 (2011).
- Zhu, H., et al. Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).
- Cleton, N. B., et al. Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers. PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580 (2015).
- Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies. PLoS One. 8 (9), 73842 (2013).
- Zhou, F., et al. Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection. Scientific Reports. 5, 15349 (2015).
- Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data. Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).
- Monaghan, T. M., et al. Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis. PLoS One. 8 (9), 74452 (2013).
- Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. Current microarray surface chemistries. Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).
- Wellhausen, R., Seitz, H. Facing current quantification challenges in protein microarrays. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, article ID 831347 (2012).
- Guo, A., Zhu, X. -Y. The critical role of surface chemistry in protein microarrays. Functional Protein Microarrays in Drug Discovery. , CRC Press. Boca Raton. (2007).
