Summary
本文介绍了一种简单的蛋白质芯片方法, 用于分析人体血清中高纯度梭菌抗原7丛细胞的体液免疫反应。该协议可推广用于测定多克隆静脉注射免疫球蛋白制剂中特异抗体的反应。
Abstract
我们提供了一种新的高通量蛋白微阵列检测方法, 用于测定人血清中的抗梭菌抗体水平, 以及单独制备多克隆静脉注射免疫球蛋白 (球蛋白)。该议定书描述了样品制备、阵列印刷、化验程序和数据分析所涉及的方法步骤。此外, 本议定书还可进一步发展, 以纳入多种临床样本, 包括血浆和细胞培养上清液。我们展示了如何使用蛋白微阵列来确定同种的组合 (IgG, IgA, IgM), 子类 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), 和应变特异抗体的高度纯化全C. 梭菌毒素 a 和 B (toxinotype 0, 应变新品10463, ribotype 087), 毒素 b 从一个C. 芽孢杆菌毒素 b 只表达应变 (CCUG 20309), 一种前体形式的 b 片段的二元毒素, pCDTb, ribotype 特定的整个表面层蛋白 (SLPs; 001, 002, 027) 和控制蛋白 (破伤风毒素和白色念珠菌)。在实验中, 微阵列是用C................................治疗 CDI, 联合免疫机能丧失障碍, 慢性炎症性脱髓鞘 polyradiculopathy。我们在免疫球蛋白治疗前和之后的毒素中和疗效和多同种特异抗体水平上均有显著差异。此外, 基因芯片与酶联免疫吸附试验 (ELISA) 在血清样品中抗毒素 IgG 水平有显著的相关性。这些结果表明, 微阵列可能成为一个很有希望的工具来分析抗体反应的C.随着抗原板的进一步细化和生产成本的降低, 我们预计微阵列技术可以帮助优化和选择临床上最有用的免疫疗法, 以病人特有的方式感染.
Introduction
该协议描述了一种新的和自定义的蛋白质微阵列检测和半定量的细菌应变和同种特异抗体反应的C.我们成功地使用了我们的C. 梭菌特异微阵列检测作为一个有希望的新工具的成分生物分析中的具体抗体含量的患者血清1,2, 免疫球蛋白3的准备, 并识别与 CDI4中不良结局相关的抗体特异性。我们展示了如何 biobanked 血清样品和免疫球蛋白的商业制剂可以分析在微阵列, 允许高质量的重现性分析的C.
许多健康的儿童和成人有检测到的血清 IgG 和 IgA 抗体的C. 梭菌毒素 a 和 B5,6。这些被认为是发生在婴儿期短暂暴露后, 在成年后接触到C.由于这个原因, 多克隆免疫球蛋白已被使用离标签治疗复发和暴发的 CDI7,8,9。然而, 它的明确作用和行动方式仍然不清楚。几项研究表明, 体液免疫反应的C. 梭菌毒素在疾病的呈现和结果中发挥作用。具体而言, 无症状患者显示, 血清抗毒素抗体浓度增加, 与发育症状性疾病10的患者相比。据报, 有一个明显的关联, 其中中位抗毒素抗体滴度和30天全死因死亡率11。一些报告还揭示了一个协会的预防复发和抗体反应的毒素 a, B, 和一些非毒素抗原 (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD 和表层蛋白 (SLPs))12,13,14,15. 这些观察刺激了第一个被动免疫治疗药物靶向C. 刺杆菌毒素 B (bezlotuxumab), 最近被美国食品和药物管理局和欧洲药品批准防止经常性 CDI16的机构。使用灭活毒素或重组毒素片段的免疫接种战略目前也在开发17、18、19。这些新的治疗方法无疑将刺激对大样本大小的多抗原的体液免疫应答的评估要求。
今天, 有明显的缺乏商业可用的高通量检测, 能够同时评估细菌的应变和同种特异抗体反应的C. 梭菌抗原。目前尚无未满足的需要开发这种化验, 以促进今后的研究工作和临床应用。蛋白质微阵列是一种将大量单独纯化的蛋白质作为空间组织的斑点排列在微观滑动表面上的一种方法, 使用机器人系统, 可以是接触20或非接触印刷工具21。斑点可能代表复杂的混合物, 如细胞裂解物, 抗体, 组织组织匀浆, 内源性或重组蛋白或肽, 体液或药物22,23。
蛋白质微阵列技术比标准的内部 ELISA 技术具有明显的优势, 传统的检测方法用于评估抗C.其中包括提高检测一系列多同种特异抗体的能力, 针对更广泛的蛋白质靶点, 减少抗原、样品和试剂的体积要求, 以及增强吸收更大技术复制的数量, 除了多个内部质量控制 (QC) 措施1。因此, 微阵列更灵敏、准确、重现性强, 具有更大的动态范围。这些因素使微阵列成为一种更便宜和潜在的有利替代 ELISAs 的大规模检测已知蛋白质。然而, 微阵列技术的缺点主要是由于建立了高度纯化抗原的面板, 建立了技术平台, 导致了巨大的前置成本。
蛋白质微阵列作为临床应用的诊断和基础研究工具, 在过去的两年中得到了广泛的应用。具体应用包括蛋白质表达谱、酶基质关系的研究、生物标志物筛选、寄主-微生物相互作用分析、以及分析抗体特异性23、24、 25,26,27,28。许多新的病原体蛋白/抗原微阵列已经建立, 包括疟疾 (疟原虫)29, HIV-130, 流感31, 严重急性呼吸道综合征 (SARS)32, 病毒性出血热33, 疱疹病毒34, 结核病35。
本议定书涉及建立一个易于操作的c. 梭菌反应抗原微阵列检测, 这使得对 C 的多同种和应变特异抗体反应的准确、精确和具体量化。血清中的梭菌抗原和多克隆免疫球蛋白。在这方面, 我们包括了与 ELISA 相比可接受的微阵列检测性能的具有代表性的结果, 以及测定的精确度和重现性。该方法可进一步开发, 以分析其他临床样本, 并制定一个新的标准, 研究的分子基础的 CDI。
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Protocol
1. 制备微阵列板
- 用印刷缓冲器稀释C. 梭菌抗原 [PBS-海藻糖 (50 毫米)] 在最佳的浓度 (在运行患者血清之前预定义): 毒素 a (200 µg/毫升) 和毒素 B (100 µg/毫升), pCDTb (200 µg/毫升), 纯化本机整个 SLPs 来自核糖体 001, 002 和 027 (200 µg/毫升)。
注: 毒素 b 从毒素 b 表达菌株 CCUG 20309 (90 µg/毫升) 获得。- 稀释阳性对照, 裂解物白念珠菌, 破伤风毒素与印刷缓冲器在100µg/毫升。最后, 稀释纯化的人类免疫球蛋白与测试过的抗体同种序列, 开始在50µg/mL 横跨10稀释在打印缓冲区, 以创建一个校准曲线。
- 将打印缓冲区中的稀释的10µL 转移到384井板中。
- 用板封和离心机盖板, 300 x 克, 5 分钟。
2. 用接触机器人打印阵列
- 使用手持式燃气燃烧器加热硅销, 每 3x 2 秒, 并在清水中冲洗 3x 3 秒。
- 将微阵列板放入机器人的加载盒中。
- 将 aminosilane 幻灯片放在幻灯片托盘上。
注意: 幻灯片托盘可以容纳27张幻灯片: 三行九张幻灯片。幻灯片以纵向方向排列, 从底部行的左边开始, 其余的空格用空白幻灯片覆盖, 以确保幻灯片托盘上的所有孔都被覆盖。- 按"确定"并检查是否已打开真空, 所有幻灯片都是安全的。在开始打印之前, 将幻灯片放在潮湿的环境中至少1小时。
注: aminosilane 幻灯片是在密封袋中提供干燥剂。打开后, 任何未使用的幻灯片都应立即返回到干燥, 以便存储到到期日期为止。
- 按"确定"并检查是否已打开真空, 所有幻灯片都是安全的。在开始打印之前, 将幻灯片放在潮湿的环境中至少1小时。
- 建立合适的印刷方案, 打印出梭菌抗原。启动助教应用程序套件, 并从 "我的网格运行" 目录中打开所需的打印运行参数文件。选择四份梭菌文件, 打印出所有的梭菌抗原。
- 当双击主窗口上的微阵列图标时, 三个选项卡式窗口将显示为 "MicroArraying 参数"。 三选项卡是 "源"、"目标" 和 "选项"。"源" 选项卡显示了微阵列中使用的样本数量的详细信息。"目标" 选项卡显示了如何加载幻灯片的详细信息, 其中应在幻灯片上打印数组并编辑幻灯片版式 (16 个子数组格式)。"选项" 选项卡显示了要使用的洗涤协议和工具的详细信息。每次完成样品后清洗。清洁样品之间的硅针, 以避免不同样品之间的交叉污染。
- 编程选项位于助教应用程序套件工具栏上的 "选项" > "运行首选项" 下。在本节中, 有9个选项卡可供使用, 当您完成一个 tab 键移动到下一个选项卡时, 单击它。单击 "确定" 按钮将带您走出 "运行首选项"。在 "运行首选项" 的 "常规" 选项卡中, 在本节中有许多可用的复选框, 其中涉及在程序启动时仪器的行为方式。检查 "开始运行前的主要浴缸" 框, 所有三个洗涤站将经历一个短的启动序列之前的运行开始。检查 "在运行开始时清洗" 框, pin 工具将在第一次源访问之前清洗。检查 "在运行结束时清洗" 框, pin 工具将在最后一次源访问后清洗。用户可以设置洗涤周期的数量。在 "运行首选项" 的 "气候" 选项卡中, 开始加湿。我们使用的设置如下: 启动速率 55%, 运行速率 55%, 最小湿度 55%, 目标湿度60%。在达到目标湿度之前, 不要开始运行, 否则斑点将是错误的大小, 库将迅速蒸发。
- 在助教的菜单栏中, 单击 "绿色转到" 按钮。 开始运行, 并定期观察机器人在打印运行期间, 确定一切正常。
注意: 这可以在每张幻灯片上并行分析15个样本, 因为一个子数组用作负控制。子阵的设计是由印刷蛋白 (抗原) 的数量和印刷的生物复制的数量决定的。
注: 打印完每个样品后, 头部向洗涤浴池移动, 允许将针多次浸入两个沐浴液中, 每个浴缸中含有蒸馏水和0.002% 吐温 20, 然后用超纯水冲洗别针, 然后将针脚烘干。4 s 的主要洗涤站。
3. 阵列的存储
- 将打印的幻灯片存放在干燥的室温下过夜。
注意: 打印的幻灯片最多可存储一周。
4. 阵列探测
- 小心地将打印的幻灯片放在16多井室格式的幻灯片夹中。
注: 分庭, 深度约7.5 毫米, 提供了一个慷慨的表面体积比, 以方便混合和洗涤步骤。 - 使用前, 请允许所有试剂对室温进行预热。除非另行指定, 否则在室温下执行以下步骤。
- 添加100µL 过滤5% 牛血清白蛋白 (BSAT; 使用0.2 µm 注射器过滤器) 到每个块, 覆盖的幻灯片, 并孵化他们与颤抖1小时。
- 在120µL 的磷酸盐缓冲盐水中, 每1分钟洗一次, 每袋 20 (PBST; 0.1% 补间) 用颤抖。不要让幻灯片干燥。
- 将血清样品在冰上解冻20分钟, 用具有背景还原成分的商用抗体稀释剂稀释每个样品 (见材料表)。
- 根据检测到的免疫球蛋白, 优化血清样品的稀释, 如表 2所示。
- 将稀释后的血清样品的100µL 转移到除一条以外的所有区块, 用作阴性对照;对这个区块, 只添加100µL 的抗体稀释剂。用柔和的搅拌1小时孵化幻灯片。
- 在120µL PBST (0.1% 补间) 中每张幻灯片 5x 3 分钟, 每井都用震动冲洗。
- 添加100µL 的生物素化山羊抗人抗体稀释与抗体稀释剂。
- 按照表 2所述, 根据所测试的免疫球蛋白优化二次抗体的稀释。盖上幻灯片, 用柔和的震动孵化1小时。
- 在120µL 中, 每 PBST 3 分钟的每井都要用震动来清洗。
- 添加100µL 的链亲和素 Cy5 每块稀释 1:2000 5% BSA。用箔盖在幻灯片上, 以保护他们免受光线的震动, 同时用柔和的搅动15分钟。
- 在120µL 的 PBST 中, 每井1分钟冲洗一张幻灯片, 然后在 PBS 中进行2洗1分钟, 仅与震动。
- 旋转幻灯片5分钟, 在 300 x g, 以烘干它们。
- 将幻灯片放在一个深色的盒子里, 以便在室温下进行运输和储存。
- 继续扫描阵列, 以确保探测后信号的一致性。
注意: 但是, 探测到的幻灯片可以存储在黑暗中, 并在一个星期内扫描探测。
5. 扫描阵列
- 打开激光扫描仪 (见材料表), 扫描前30分钟预热激光。上载扫描仪软件并将计算机连接到扫描仪。
- 将带有打印面的幻灯片放到扫描仪中, 直到播放指示灯变为实心绿色。
- 在扫描幻灯片时按下 "设置" 按钮并调整以下设置: 扫描模式, 中值;承购, 仅 635;采购模式, 手册;增益, 20;功率低;幻灯片类型, 未标记幻灯片;焦点, 自动对焦。打开自动滚动, 并将条形码读数设置为像素大小10和扫描35。
- 将结果图像保存为16位灰度多图像 TIFF 格式。按 "导入网格" 按钮, 然后选择相应的阵列列表。
注意: 数组列表描述了子阵的大小和位置以及与每个特征指示器关联的打印物质的名称。- 将网格与幻灯片上的点对齐。
- 通过按量化过程按钮对图像进行分析, 测量每个点的荧光信号强度, 并将结果保存为称为 GenePix 结果 ("探地") 的文本格式。
注: 探地雷达文件包含了阵列抗原靶的定位和识别变量, 同时也包括了中值荧光强度和局部背景, 代表了各点的抗体结合信号值。
6. 数据分析
- 用一个叫做反向相蛋白阵列 (RPPA) 分析仪的自由基因芯片分析软件 (莓36中的 R 统计语言中的一个模块) 计算背景减法后各抗原复制的中位数。
- 利用商业科学绘图和统计软件 (见材料表), 绘制标准曲线, 并用相关的免疫球蛋白标准曲线来插入每个抗原的信号, 以计算抗体水平。
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Representative Results
图 1展示了描述协议中主要步骤的流程图。图 2显示了与检测血清中的 IgG 和 IgA 抗毒素 A 和 B 水平的基因芯片和 ELISA 之间的显著一致的长矛相关性试验。图 3显示了不同的 IgG 和 IgA 抗体类特异抗体反应的毒素 A, 毒素 B, 二进制毒素 (pCDTb) 的患者没有腹泻, CDI 患者腹泻, 和 HC。图 4显示了在患者血清中的C. 梭菌抗毒素中和抗体应答。图 5显示了免疫反应 (对c..... ...... ...。图 6显示了免疫反应性 (对c....... .......... ....表 1显示了使用测试血清的微阵列变异性的可接受的内和间测定系数。表 2说明了本研究中使用的免疫球蛋白列表, 其中含有相关的纯化蛋白浓度以及对血清和次级抗体的优化稀释。
图 1: 对微阵列协议所涉及的主要步骤的一般概述.第一步是制备抗原和控制。随后的示例稀释将被转移到384版, 准备在 quadruplicates 上打印到 aminosilane 幻灯片上。随着幻灯片的干燥和堵塞, 这些阵列会与患者血清一起孵化。进一步洗涤后, 添加指定同种的生物素化抗人免疫球蛋白 (Ig)。最后的洗涤和干燥步骤后, 扫描的幻灯片和结果图像处理的芯片图像分析软件。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 微阵列与 ELISA 结果的相关性.用长矛相关系数来评估两个平台之间的协议水平。将微阵列性能与内部酶联免疫吸附试验 (ELISA) 进行比较时, A。对毒素 a (r = 0.7051) 进行了良好的相关系数观察;P < 0.0001), B。毒素 B (r = 0.5809) 的适度良好相关性;P < 0.0001)。《全 ELISA 议定书》已在别处详细说明了37。这一数字已从 Negm等转载。1以允许。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 同种梭菌毒素的特异抗体反应。该图像母猪血清抗毒素 IgG 和 IgA 反应 (toxinotype 0, 应变 10463, ribotype 087; 毒素 A 在200µg/毫升, 毒素 b 在100µg/毫升), 毒素 b (C. 芽孢杆菌毒素 b 产生菌株 CCUG 20309; 毒素 b 在90µg/毫升) 和 a b 的前体形式二元毒素的片段, pCDTb (200 µg/毫升), 在囊性纤维化 (CF) 患者无腹泻, 患者与C. 梭菌感染 (CDI) 腹泻, 并在健康的控制 (HC)。血清 IgG 和 IgA 的稀释率分别为1:500 和1:100。各组之间的差异是用克鲁斯卡尔-沃利斯测试, 其次是邓恩的后检查多项反应。与 HC (n = 17) 和症状性 CDI (n = 16) 患者相比, 成人 CF 患者 (n = 16) 显著提高血清 IgA 抗毒素 A 和 B 水平;P ≤0.05。同样的模式盛行的 igg, 除了没有区别的抗毒素的 igg 水平之间的组。盒和晶须地块代表中值、范围和分位数。P ≤0.0001;** P ≤0.01;* P ≤0.05。规范化的信号被规范化到免疫球蛋白标准曲线。这一数字已从莫纳汉等转载。2以允许。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 在患者血清中中和抗体对 甲、乙杆菌毒素 a 和 B 的疗效.该图显示了保护性中和抗体 (抓获) 对C 的反应. 芽孢杆菌毒素 a 和 B [toxinotype 0, 应变 10463, ribotype 087, 用于50% 致命剂量 (LD50)] 在血清 (1:100 稀释; 毒素 a 2.5 ng/毫升, 毒素 B 0.5 ng/毫升) 从 HC, 患者用 CF 无腹泻, 并与 CDI 的患者腹泻。与 HC (毒素 a 和 B) 的血清和 CDI (毒素 a) 患者相比, CF 患者的血清具有明显增强的保护性抗毒素应答反应。各组之间的差异是用克鲁斯卡尔-沃利斯测试, 其次是邓恩的后检查多项反应。盒和晶须地块代表中值、范围和分位数。** P ≤0.01;* P ≤0.05。这一数字已从莫纳汉等转载。2以允许。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 免疫反应性及丙种球蛋白对梭菌抗原的中和作用。这个图像显示了在商业静脉注射免疫球蛋白 (球蛋白) 制剂中, 多同种特异抗体的反应性.热图显示了特定抗体 isotypes (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2 和 IgM) 的水平在三商业上可利用的准备 (参见材料表) 反对七C. 芽孢杆菌抗原 [毒素 A (200 µg/毫升), 毒素 b (100 µg/毫升), pCDTb (200 µg/毫升), 毒素 B (CCUG 20309; 90 µg/毫升), 和表面层蛋白 (SLPs) 001, 002, 027 (所有200µg/毫升)] 使用蛋白质芯片技术。热图的颜色代码如下: 绿色 (低) 到红色 (高) 信号强度。在热图的色标上表示的信号值是从任意荧光单元 (AFU) log2-transformed 的。请注意, AFU 最近被描述符标准信号2取代。总 IgG、IgG1 和 IgG2 isotypes 对毒素 A、毒素 b、二元毒素 (pCDTb) 和毒素 b (CCUG 20309) 给予了最高的约束力活性。b. 这些地块显示了免疫球蛋白中和对本机C.... ....。它们给出了商业丙种球蛋白产品对甲、乙类芽孢杆菌毒素的保护中和作用的百分比。每个剧情代表三项实验中的中值1:100 稀释。免疫球蛋白制剂1与免疫球蛋白制剂2和3相比, 其保护效果最低, 特别是对毒素 A. ** P ≤0.0001;* P ≤0.05 (单向方差分析)。这个数字已经从 Negm等。3以允许。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 免疫反应性和患者血清中的中和作用对梭菌抗原。a.本图显示了丙种球蛋白输液前后患者血清中活性抗体的比较。热图说明了 isotypes 的表达水平 (IgG, IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA1、IgA2、IgM) 治疗七例七C. 梭菌抗原 [毒素 A (200 µg/毫升), 毒素 B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/毫升), 毒素 B (CCUG 20309; 90 µg/毫升), SLPs 001, 002, 027 (所有200µg/毫升)] 使用蛋白质芯片技术。热图的颜色代码如下: 绿色 (低) 到红色 (高) 信号强度。在热图的颜色刻度上表示的信号值是从 AFU log2-transformed 的。请注意, AFU 最近被标准信号2取代。注射后增强的总 IgG, IgG1, IgG2 和 IgG3 活性毒素 a, 毒素 B 和 pCDTb。b. 此图像显示了对毒素 A、毒素 B 和二进制毒素 (pCDTb)、免疫球蛋白前后的免疫球蛋白的反应。对所有毒素的总 IgG 水平显示, 在免疫球蛋白管理 (使用魏氏有符号秩测试) 后, 显著增加。每个剧情代表三项实验中的中值1:10 稀释。这些地块显示了中和作用对本机C. 梭菌毒素 a 和 B 在免疫球蛋白管理之后治疗前后中和抗体活动的比较表明, 免疫球蛋白注射后, 对本机C.每个剧情代表三项实验中的中值1:10 稀释。在经免疫球蛋白注射后的患者血清中, 对毒素 a 和 B 的保护作用显著增加 (使用魏氏有符号秩试验)。这个数字已经从 Negm 中重印。3以允许。请单击此处查看此图的较大版本.
| 重复 | 毒素 A | 毒素 B | SLP001 | SLP002 | SLP027 | 毒素 B CCUG 20309 | pCDT湾 |
| 内检测 | 7.70% | 6.40% | 7.40% | 5.10% | 7.60% | 7% | 3.70% |
| 间化验 | 9.10% | 9.10% | 7.40% | 11.20% | 12。8 | 9.70% | 12.50% |
表 1: 微阵列内检测和间测定精度1. 用7例患者的血清计算微阵列内和间多变性的含量。在两个独立时间点的两张幻灯片上测定了相同的样本。所有抗原 (n = 7 测试和 n = 2 控制) 被发现了在复制五在每个阵列。
| 纯化蛋白浓度 | 血清稀释 | 二次抗体稀释 | |
| Igg | 50微克/毫升 | 1/500 | 1/20000 |
| IgG1 | 200微克/毫升 | 1/100 | 1/5000 |
| IgG2 | 200微克/毫升 | 1/100 | 1/10000 |
| IgG3 | 200微克/毫升 | 1/100 | 1/5000 |
| IgG4 | 200微克/毫升 | 1/100 | 1/5000 |
| Iga | 50微克/毫升 | 1/100 | 1/5000 |
| IgA1 | 200微克/毫升 | 1/100 | 1/10000 |
| IgA2 | 200微克/毫升 | 1/100 | 1/5000 |
| Igm | 50微克/毫升 | 1/500 | 1/20000 |
表 2:本研究使用的免疫球蛋白清单.Igs 显示与相关的纯化蛋白浓度 (µg/毫升) 和稀释的血清和二级抗体。
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Discussion
在本议定书中, 我们已经表明, 微阵列是一个适当的平台, 以确定体液免疫反应的C. 梭菌蛋白抗原的患者血清 (图3和6) 和商业制剂丙种球蛋白 (图 5)。我们还表明, 微阵列技术表现良好, 当与常规 ELISA (图 2), 并显示优良的重现性, 与内和间化验多变性在可接受的精确度范围内 (表 1)。
关键步骤:
在建立任何成功的抗原微阵列平台时, 必须遵循一些关键步骤。首先, 运行 QC 实验是极其重要的。在 QC 实验中, 应评估不同的参数, 如适当的表面化学选择, 印刷缓冲器, 阻断缓冲器, 血清样品的稀释和二次抗体。这些实验必须进行, 目的是提供一个良好的验证和可靠的技术38,39。
在微阵列分析中, 选择合适的蛋白质固定化过程是最重要的步骤之一, 以确保测试 aminosilane 幻灯片的高质量性能, 如本研究所示。观察规则和圆形光斑形貌, 高、特异性信号强度, 以及清晰的背景是至关重要的。另一个影响微阵列性能的因素是印刷缓冲器, 这同样重要的是要实现所需的表面化学, 以产生均匀和规则点在幻灯片上。
选择正确的打印设置是很重要的, 因为这将允许打印斑点的最佳大小和形状。例如, 在印刷过程中, 湿度水平应该保持在55% 左右, 因为没有湿度, 微阵列中的蒸发速率就会增加, 打印出的斑点也就越少。
非特异蛋白结合是影响背景和斑点信号的附加因素;因此, 适当地选择阻塞缓冲区可以减少任何非特定绑定, 从而提高阵列数据39的灵敏度和准确性。
修改和疑难解答:
抗原和血清样品必须被 aliquoted 和储存在小的储存管在冷藏, 直到使用, 这有助于避免重复多次冻融循环, 这可能会恶化的信号强度的阵列。为了提高实验成功的几率, 必须对所有试剂进行新鲜的准备和过滤。在打印和检查设置之前, 必须清洗机器人。此外, 幻灯片持有人必须保持清洁, 以尽量减少背景噪音。
限制：
蛋白质微阵列在蛋白质芯片制造中的表面化学要求受到严格的限制, 目前已经受到了应用。在这里, 蛋白质分子的化学和物理特性的巨大变化要求为不同类别的蛋白质和抗体分子定制设计独特的表面化学物质40。这种技术的广泛实施所面临的其他技术挑战包括需要昂贵的专门设备和具有分配工作台空间的软件, 以及考虑维修费、复杂的数据分析、相对蛋白质定量化, 以及对纯化抗原的严格获取。
方法对于现有/替代方法的意义:
微阵列技术原则上类似于 ELISA、中尺度发现或 Luminex 免疫, 但可自定义, 可以放大以达到统计功率, 只依靠微升数量的珍贵样品, 并有能力筛查血清用于多种蛋白质活性。因此, 它特别适合于大规模的历史血清银行和生物标志物的发现和筛选。
未来的应用或方法的方向:
未来的努力将致力于优化其他样本 (细胞上清液) 的化验, 使用该化验作为一个预后的工具, 病人分层, 外部验证潜在的生物标志物使用大的群体在双盲的方式, 并预测和优化免疫治疗 (单克隆, 疫苗) 的反应。未来, 微阵列技术可以作为一种有用的诊断工具或在一段时间内监测药物治疗计划, 用于医院设置。
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Disclosures
没有。
Acknowledgments
这项研究得到了爱马仕 Negm 和坦尼娅莫纳汉的支持, 并通过诺丁汉消化系统疾病中心和 NIHR 诺丁汉消化系统疾病生物医学研究中心的单独资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobotics MicroGrid II arrayer | Digilab, Malborough, MA, USA | N/A | Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides. |
| Scanner InnoScan 710. | Innopsys | N/A | A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction. |
| MAPIX software version 7.2.0 | Innopsys | N/A | Measure signal intensities of the spots. |
| Silicon contact pin | Parallel Synthesis Technologies | SMT-P75 | Print the samples onto the slides. |
| Thermo Scientific Nalgene Desiccator | Thermo Scientific | 41102426 | To store the new and printed slides. |
| 384-well plate | Genetix | X7022UN | To prepare the antigens. |
| Plate cover | Sigma Aldrich, UK | CLS6570-100EA | To reduce evaporation of the samples. |
| Aminosilane slides | Schott, Germany | 1064875 | The slide of choice for printing the antigens. |
| Slide holders | GraceBio Labs, USA | 204862 | Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells . |
| Candida albicans lysate | NIBSC | PR-BA117-S | Positive control |
| Tetanus Toxoid | Athens Research and Technology | 04/150 | Positive control |
| Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707 | Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-1 | Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-2 | Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-3 | Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-4 | Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma. |
| Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701 | Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-1M | Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-2M | Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma. |
| Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090713 | Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma. |
| Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific | Vector Labs | BA-3080 | Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9052-08 | Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT | Southern Biotec | 9060-08 | Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9210-08 | Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT | Southern Biotec | 9190-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - Biotinylated | Vector Labs | BA-3030 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA1-BIOT | Southern Biotec | 9130-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA2-BIOT | Southern Biotec | 9140-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgM-BIOT | Southern Biotec | 9020-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| 0.2 mm syringe filter | Thermo scientific | 723-2520 | Filter the 5% BSA. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, UK | A7284 | Use 5% BSA for blocking the slides. |
| Antibody diluent | Dako, UK | S3022 | To dilute the serum and the secondary antibody. |
| Streptavidin Cy5 | eBioscience | SA1011 | Detection of the immune reaction. |
| Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb | University of Bath | NA | Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70) |
| Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins | Dublin City University | NA | |
| Vigam (IVIg preparation 1) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Privigen (IVIg preparation 2) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Intratect (IVIg preparation 3) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A |
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