Summary
Dit artikel bevat een beschrijving van een eenvoudige eiwit microarray methode voor profilering humorale immuunreacties aan een 7-plex panel van sterk gezuiverd Clostridium difficile antigenen in menselijke sera. Het protocol kan worden uitgebreid voor de bepaling van specifieke antilichaam reacties in preparaten van polyklonale intraveneuze immunoglobuline.
Abstract
Wij bieden een gedetailleerd overzicht van een nieuwe high-throughput eiwit microarray test voor de bepaling van anti -Clostridium difficile antilichaam niveaus in menselijke sera en in afzonderlijke preparaten van polyklonale intraveneuze immunoglobuline (IVIg). Het protocol beschrijft de methodologische stappen die betrokken zijn bij de bereiding van de monsters, afdrukken van matrices, assay procedure en data-analyse. Bovendien, kan dit protocol verder worden ontwikkeld om te nemen van uiteenlopende klinische monsters, met inbegrip van plasma en supernatant van cultuur van de cel. We laten zien hoe eiwit microarray kan worden gebruikt om te bepalen van een combinatie van isotype (IgG, IgA, IgM), subklasse (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), en stam-specifieke antilichamen tegen sterk gezuiverd hele C. difficile toxines A en B (toxinotype 0, stam VPI 10463, ribotype 087), toxine B van een C. difficile toxine-B-only waarin stam (CCUG 20309), een vorm van de voorloper van een B-fragment van binaire toxine, pCDTb, ribotype-specifieke hele toplaag eiwitten (SLPs; 001, 002, 027), en de controle van eiwitten (tetanus tetanustoxoïd en Candida albicans). Tijdens het experiment zijn microarrays gesondeerd met sera uit individuen met C. difficile infectie (CDI), mensen met cystic fibrosis (CF) zonder diarree, gezonde controles (HC), en individuen pre en post-IVIg therapie voor de behandeling van chronische inflammatoire demyeliniserende polyradiculopathy, CDI en gecombineerde immunodeficiëntie stoornis. We ondervinden aanzienlijke verschillen in toxine neutralisatie efficacies en multi-isotype specifiek antilichaam niveaus tussen patiëntengroepen, commerciële preparaten van IVIg, en sera vóór en volgende IVIg administratie. Ook is er een significante correlatie tussen microarray en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) voor antitoxine IgG niveaus in serummonsters. Deze resultaten suggereren dat microarray een veelbelovend instrument voor profiling van antilichaam reacties op C.difficile antigenen in gevaccineerde of besmette mensen zou kunnen worden. Met de verdere verfijning van antigeen panelen en een afname van de productiekosten verwachten we dat microarray technologie helpen kan optimaliseren en selecteer de klinisch meest nuttige immuuntherapie voor C. difficile -infectie in een patiënt-specifieke wijze.
Introduction
Dit protocol beschrijft de ontwikkeling en validatie van een nieuwe en aangepaste eiwit microarray assay voor het opsporen en semi-kwantificering van bacteriële stam en isotype-specifieke antilichaam reacties op C. difficile antigenen. Wij gebruiken met succes onze C. difficile-specifieke microarray assay als een veelbelovend nieuw hulpmiddel voor de compositorische bioanalyse van specifieke antilichaam inhoud in patiënt sera1,2, bereidingen van IVIg3, en identificatie van specifieke kenmerken van antilichaam die met de slechte resultaten in de CDI4 correleren. We laten zien hoe biobanked serummonsters en commerciële preparaten van IVIg kunnen worden geanalyseerd op microarray dia's, waardoor hoge kwaliteit reproduceerbaar profilering van C. difficile pathogeen-specifieke antilichaam reacties in deze test.
Veel gezonde kinderen en volwassenen hebben detecteerbare serum IgG- en IgA-antilichamen tegen C. difficile toxines A en B5,6. Deze worden verondersteld te ontstaan naar aanleiding van voorbijgaande blootstelling tijdens kinderschoenen en na blootstelling aan C. difficile in de volwassenheid. Om deze reden polyklonale IVIg is afwijkend gebruikt voor de behandeling van recidiverende zowel fulminant CDI7,8,9. Echter, haar definitieve rol en werkingsmechanisme is onduidelijk. Verschillende studies hebben aangetoond dat de humorale immune reactie op toxines van C. difficile een rol bij ziekte presentatie en resultaat speelt. Specifiek, weergeven asymptomatische patiënten een verhoogde anti-toxine A IgG serumconcentratie vergeleken met patiënten die de ontwikkeling van de symptomatische ziekte10 Een aantoonbare vereniging is gemeld voor de mediane anti-toxine A IgG titers en 30-daagse all-cause mortality11. Verscheidene verslagen is ook gebleken dat een associatie met een bescherming tegen herhaling en antilichaam reacties op het toxine A, B en verschillende niet-toxine antigenen (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD en toplaag eiwitten (SLPs))12,13 , 14 , 15. deze opmerkingen hebben aangespoord de ontwikkeling van de eerste passieve immunotherapie drug-toxine met targeting C. difficile B (bezlotuxumab), dat onlangs is goedgekeurd door de US Food and Drug Administration en het Europees Geneesmiddelenbureau Agentschap voor het voorkomen van terugkerende CDI16. Vaccinatiestrategieën door middel van geïnactiveerd toxines of recombinante toxine fragmenten zijn ook momenteel in ontwikkeling17,18,19. Deze nieuwe therapeutische benaderingen zullen ongetwijfeld het stimuleren van de eis voor de evaluatie van de humorale immuunreacties aan meerdere antigenen in grote steekproeven.
Vandaag, is er een opmerkelijke gebrek verkrijgbare high-throughput assays staat gelijktijdig bacteriële stam en isotype-specifieke antilichaam reacties op C. difficile antigenen. Er is een unmet behoefte aan het ontwikkelen van deze gehaltebepalingen om toekomstige onderzoeksinspanningen en klinische toepassingen te vergemakkelijken. Eiwit microarrays is een methode om grote aantallen van individueel gezuiverd eiwitten als een ruimtelijk georganiseerde matrix van plekken op een microscopische dia gebaseerde oppervlak te immobiliseren met behulp van een robot systeem, dat een contact20 of een contactloze zijn kan gereedschap21afdrukken. De plekken kunnen complexe mengsels zoals cel lysates, antilichamen, weefsel homogenates, endogene of recombinante eiwitten peptiden, lichaamsvloeistoffen of drugs22,23vertegenwoordigen.
Eiwit microarray technologie biedt duidelijke voordelen boven standaard in-house ELISA technieken, die van oudsher gebruikt hebben om te beoordelen van de anti -C. difficile antilichaam reacties. Deze omvatten een grotere capaciteit voor het opsporen van een aantal multi-isotype-specifieke antistoffen tegen een uitgebreidere panel van eiwit doelen, verminderde volume eisen voor antigenen, monsters en reagentia, en een verbeterde mogelijkheid om te integreren in een groter aantal technische replicatieonderzoeken, naast meerdere interne kwaliteitscontrole (QC) meet1. Microarrays zijn daarom meer gevoelige, nauwkeurig en reproduceerbaar en hebben een groter dynamisch bereik. Deze factoren maken microarrays een goedkoper en potentieel gunstige alternatief voor ELISAs voor de grootschalige opsporing van bekende eiwitten. Nadelen van microarray technologie leidt echter tot voornamelijk uit de grote up-front kosten in verband met de oprichting van een panel van hoogst gezuiverde antigenen en het opzetten van het technologische platform.
Eiwit microarrays zijn uitgebreid gebruikt in de afgelopen twee decennia als een onderzoeksinstrument van de diagnostische en fundamenteel in klinische toepassingen. Specifieke toepassingen omvatten eiwit expressie profilering, de studie van enzym-substraat relaties, biomerker screening, analyse van host-microbe interacties, en profiling van antilichaam specificiteit23,24, 25,26,27,28. Veel nieuwe pathogen eiwit/antigeen microarrays zijn vastgesteld, met inbegrip van malaria (Plasmodium)29, HIV-130, influenza31, ernstig acuut respiratoir syndroom (SARS)32, virale hemorragische koorts33 , infectieziekte34en35van de tuberculose.
Dit protocol heeft betrekking op de oprichting van een eenvoudige operationele C. difficile reactieve antigeen microarray assay, waarmee specifieke, nauwkeurige en precieze kwantificering van multi-isotype en stam-specifieke antilichaam reacties op C. difficile antigenen in sera en polyclonal IVIg. Wij zijn hierin, representatieve resultaten met betrekking tot een aanvaardbaar microarray assay prestaties in vergelijking met ELISA evenals assay nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de techniek van profielen. Deze bepaling verder kan worden ontwikkeld om het profiel van andere klinische monsters en zet een nieuwe standaard voor onderzoek naar de moleculaire basis van de CDI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiden van een plaat van Microarray
- C. difficile antigenen met een afdrukken buffer [PBS-Tween-trehalose (50 mM)] op de optimale concentratie (die was vooraf gedefinieerd voordat u de patiënt sera) verdund: toxine een (200 µg/mL) en toxine B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL), en gezuiverde native hele SLPs afgeleid van ribotypes 001, 002 en 027 (200 µg/mL).
Opmerking: Toxine B is verkregen uit een toxine B-uiten stam CCUG 20309 (90 µg/mL).- De positieve controle, lysates van C. albicansen tetanus tetanustoxoïd met de afdrukken buffer bij 100 µg/mL verdund. Ten slotte, Verdun de gezuiverde menselijke immunoglobulin matching van de geteste antilichamenisotype serieel, vanaf 50 µg Mo/mL over 10 verdunningen in de afdrukken buffer te maken van een kalibratiekromme.
- Pipetteer 10 µL van de verdunningen in de afdrukken buffer in een 384-well-plate.
- De afdekplaat met een plaat zegel en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.
2. printen van Arrays met een Contact Robot
- Warmte de pin van de silicium met behulp van de hand-held gasbrander 3 x 2 s en spoel in schoon water 3 x 3 s.
- Plaats de microarray plaat in de cartridge laden van de arrayer.
- De aminosilane dia's op de dia-lade plaatsen.
Opmerking: De lade van de dia kunt houden 27 dia's: drie rijen van negen dia's. De dia's in de afdrukstand staand vanaf de linkerzijde van de onderste rij zijn gerangschikt en de rest van de ruimten zijn bedekt met lege dia's om ervoor te zorgen dat alle gaten in de lade van de dia vallen.- Druk op OK en controleer of een vacuüm is ingeschakeld en alle dia's veilig zijn. Laat de dia's in de vochtige omgeving voor ten minste 1 uur vóór het begin van de afdruk.
Opmerking: De aminosilane dia's worden geleverd in een verzegelde zak met droogmiddel. Eenmaal geopend, moeten elke ongebruikte dia's onmiddellijk worden teruggestuurd naar de exsiccator voor opslag tot de vervaldatum.
- Druk op OK en controleer of een vacuüm is ingeschakeld en alle dia's veilig zijn. Laat de dia's in de vochtige omgeving voor ten minste 1 uur vóór het begin van de afdruk.
- De geschikte afdrukken programma opgezet om af te drukken van Clostridium difficile antigenen. Start de TAS Application Suite en de vereiste parameters voor afdrukken uitvoeren-bestand opent vanuit de map 'My Gridding-Runs'. Selecteer Clostridium difficile -bestand voor het afdrukken van alle de Clostridium difficile -antigenen in viervoud.
- Bij de te dubbelklikken op het pictogram van de MicroArray op het belangrijkste venster verschijnt een venster met drie-tabbed genaamd 'MicroArraying parameters'. De drie tabbladen zijn "Bron", "Target", en "Options." De "Bron" tab geeft details hetaantal monsters in de microarray plaat gebruikt. Het tabblad "Doel" toont de details van hoe de dia's worden geladen moeten, waar de matrix moet worden afgedrukt op de dia en bewerken van de dia-indeling (16 subarray formaten). Het tabblad "Opties" toont de details van het wassen protocol en hulpmiddel om te worden gebruikt, bv. wassen na elke voltooide sample. Reinig de silicium-pin tussen monsters te vermijden kruisbesmetting tussen de verschillende monsters.
- De programmeeropties bevinden zich onder Opties > Voorkeuren op de werkbalk van de TAS Application Suite uitvoeren. Er zijn 9 tabbladen te doorlopen in deze sectie en als u volledige één tab naar de volgende door erop te klikken. Op de de knop "OK" te klikken vindt u uit "Run voorkeuren." In het tabblad "Algemeen" van de "Run voorkeuren" zijn er een aantal selectievakjes beschikbaar onder deze sectie met betrekking tot hoe het instrument zich gedragen zal wanneer een programma wordt gestart. Vink het vakje "Prime Bad aanvang van run", alle drie wassen stations een reeks korte priming vóór de uitvoering begin zal ondergaan. Check het "Wassen aan begin van run" vak de pin tool zal worden gewassen voordat de eerste bron bezoeken. "Wash ultimo run" het selectievakje de pin tool zal worden gewassen na de laatste bron bezoek. De gebruiker kan instellen het aantal wassen cycli. Start de bevochtiging in het tabblad "Klimaat" van de "Run voorkeuren". De instelling die we gebruiken zijn als volgt: start tarief 55%, run rate 55%, minimum vochtigheid 55%, doel vochtigheid 60%. Start de run niet tot de doelgroep vochtigheid is bereikt, anders de vlekken de verkeerde maat zullen en de bibliotheek zal snel verdampen.
- Klik in de menu balk van TAS, op de groene knop Ga. De run start en periodiek observeren de arrayer tijdens de oplage als bepaalde alles is OK.
Opmerking: Dit maakt de analyse van 15 monsters parallel op elke dia, zoals een subarray wordt gebruikt als een negatieve controle. Het ontwerp van subarrays wordt bepaald door het nummer van de afgedrukte eiwitten (antigenen) en het nummer van de afgedrukte biologische repliceert.
Opmerking: Na het afdrukken van elk monster, het hoofd beweegt in de richting de wassen baden om meerdere dompelen van de pin in twee wassen baden met gedestilleerd water en 0.002% Tween 20 voor 1.5 s in elk bad, gevolgd door de pin met ultra pure water spoelen en drogen van de pin in de belangrijkste wash station voor 4 s.
3. opslag van de Arrays
- Houd de afgedrukte dia's 's nachts bewaard bij kamertemperatuur in de exsiccator.
Opmerking: De afgedrukte dia's kunnen worden opgeslagen voor tot een week.
4. array sonderen
- Zorgvuldig plaatst afgedrukte dia's in een dia houder van 16 multi goed kamers formaat.
Opmerking: De kamers, met een diepte van ongeveer 7,5 mm, geven een royale oppervlakte volumeverhouding mengen en wassen stappen te vergemakkelijken. - Toestaan dat alle reagentia opwarmen tot kamertemperatuur vóór gebruik. Tenzij anders is bepaald, voeren de volgende stappen uit bij kamertemperatuur.
- Voeg 100 µL van gefilterde 5% bovien serumalbumine tween (BSAT; gebruik een 0,2 µm spuit filter) elk blokkeren, betrekking hebben op de dia's, en broeden ze met schudden 1 h.
- Wassen van de dia's 5 x 1 min. elk in 120 µL van fosfaatgebufferde zoutoplossing met tween-20 (PBST; 0,1% Tween) per putje met schudden. Laat niet de dia's uitdrogen.
- Ontdooi de serummonsters op ijs gedurende 20 minuten en Verdun elk monster met een commercieel beschikbare antilichaam verdunningsmiddel met achtergrond vermindering van de component (Zie Tabel van materialen).
- Optimaliseer de verdunning van het serummonsters volgens de geteste immunoglobulin zoals weergegeven in tabel 2.
- 100 µL van de serummonsters verdund overbrengen in alle blokken met uitzondering van één, die zal worden gebruikt als een negatieve controle; Voeg 100 µL van antilichaam verdunningsmiddel alleen aan dit blok. Incubeer de dia's met zachte agitatie voor 1 h.
- Wassen van de dia's 5 x 3 minuten, elk in 120 µL van PBST (0,1% Tween) per putje met schudden.
- Voeg 100 µL van een biotinyleerd geit anti-menselijke antilichaam verdund met antilichaam verdunningsmiddel.
- De verdunning van het secundaire antilichaam volgens de geteste immunoglobulin optimaliseren zoals beschreven in tabel 2. Dekking van de dia's en hen met zacht schudden voor 1 h uit te broeden.
- Wassen van de dia's 5 x 3 minuten, elk in PBST 120 µL per putje met schudden.
- Voeg 100 µL van daar Cy5 aan elk blok verdund bij 1:2000 in 5% BSA. Betrekking hebben op de dia's met folie om hen te beschermen tegen licht terwijl schudden voor de 15 min met zachte agitatie.
- De dia's 5 x 1 min. elk in 120 µL van PBST per putje met schudden, wassen, gevolgd door 2 wasbeurten van 1 min in PBS alleen met schudden.
- Draai de dia's gedurende 5 minuten bij 300 x g om ze te drogen.
- Houd de dia's in een donkere kast voor transport en opslag bij kamertemperatuur.
- Ga verder met het scannen van de arrays onmiddellijk om te zorgen voor samenhang van het signaal na indringende.
Opmerking: Echter peilden dia's kunnen worden opgeslagen in het donker en gescand binnen één week na het sonderen.
5. het scannen van de Arrays
- Zet de laserscanner (Zie Tabel van materialen) 30 min voordat u gaat scannen om op te warmen met de laser. Uploaden van software van de scanner en sluit de computer aan op de scanner.
- Een dia met het gezicht van de bedrukte zijde omhoog in de scanner plaatsen totdat het spel lampje stevige groen.
- Druk op de knop instellingen en de volgende instellingen aanpassen bij het scannen van dia's als volgt: scanmodus, mediaan; Verwerving, 635 Overname modus, handboek; Winst, 20; Power, Low; Dia Type, labelloze dia; Focus, autofocus. Automatisch scrollen uit te schakelen en Barcode Reading ingesteld op Pixel grootte 10 en 35 scannen.
- De resulterende afbeeldingen opslaan als 16-bits grayscale meerdere afbeelding TIFF-indeling. Druk op de knop Importeren raster en selecteer de juiste matrix-lijst.
Opmerking: De matrix een overzicht van de grootte en de positie van de subarrays en de namen van de afgedrukte stoffen die zijn gekoppeld aan elke functie-indicator.- Het raster aan de vlekken op de dia uitlijnen
- Het analyseren van de beelden door op de knop van de kwantificering proces voor het meten van de fluorescentie signaal intensiteiten voor elke vlek en de resultaten opslaan in een indeling van de tekst genaamd GenePix resultaten (GPR).
Opmerking: De GPR-bestand bevat de variabelen van het localisatie en identificatie van de antigeen-doelstellingen op de array en ook de intensiteit van de fluorescentie van de mediaan en de lokale achtergrond die de antilichaam binding vertegenwoordigt signaal waarden van elke vlek.
6. de gegevensanalyse
- Bereken de mediaan voor de duplo's van elk antigeen na achtergrond aftrekken met behulp van een gratis microarray analysesoftware genaamd omgekeerde fase eiwit matrix (RPPA) analyzer, een module binnen de R statistische taal op CRAN36.
- De standaard curve uitzetten en interpoleren van de signalen van elk antigeen ten opzichte van de immunoglobuline standaard curve met behulp van commerciële wetenschappelijke grafieken en statistieken software (Zie Tabel of Materials) voor het berekenen van de antilichaam-niveaus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 illustreert een stroomdiagram met een beschrijving van de belangrijkste stappen in het protocol beschreven. Figuur 2 toont Spearman correlatie proeven waarmee belangrijke overeenkomst tussen microarray en ELISA voor IgG- en IgA anti-toxine A en B niveaus in de patiënt testsera is aangetoond. Figuur 3 toont differentiële IgG- en IgA antilichaam-klasse specifiek antilichaam reacties op het toxine A, B-toxine en binaire toxine (pCDTb) in patiënten met CF zonder diarree, CDI patiënten met diarree, en HC. Figuur 4 toont C. difficile antitoxine neutraliserende antilichamen reacties in de patiënt sera. Figuur 5 toont de Immuunreactiviteit (tegen C. difficile toxines en SLPs) en het effect van de neutraliserende (tegen C. difficile toxine) van IVIg. Figuur 6 toont de Immuunreactiviteit (tegen C. difficile toxines en SLPs) en het effect van de neutraliserende (tegen C. difficile toxine) van de patiënt sera pre en post-IVIg administratie. Tabel 1 toont aanvaardbaar intra - en intersite - assay coëfficiënten van variabiliteit van microarray met behulp van de testsera. Tabel 2 toont een lijst van immunoglobulinen gebruikt in deze studie met relevante concentraties van gezuiverde eiwitten evenals geoptimaliseerde verdunningen voor sera en secundaire antilichamen.
Figuur 1 : Algemeen overzicht van de belangrijke stappen die betrokken zijn bij het protocol van microarray. De eerste stap is de voorbereiding van de antigenen en controles. De daaropvolgende monster verdunningen worden overgebracht naar een 384-plaat in gereedheid voor afdrukken in quadruplicates in de aminosilane dia's. Na het drogen en blokkeren van dia's, de arrays worden geïncubeerd met patiënt sera. Na het verder wassen, wordt de biotinyleerd anti-menselijk immunoglobuline (Ig) van de opgegeven isotype toegevoegd. Na de definitieve wassen en drogen stappen, de dia's worden gescand en de resulterende afbeeldingen verwerkt met een software van de analyse van het beeld van microarray. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Correlatie tussen microarray en ELISA resultaten. De Spearman-correlatiecoëfficiënt werd gebruikt ter beoordeling van de mate van overeenstemming tussen de twee platforms. Bij het vergelijken van de prestaties van de microarray met een in-house enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), A. een goede correlatiecoëfficiënt werd waargenomen voor toxine A (r = 0.7051; P < 0.0001), B. en een matig goede correlatie voor toxine B (r = 0.5809; P < 0.0001). Het volledige protocol ELISA is gedetailleerde elders37. Dit cijfer is herdrukt uit Negm et al. 1 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Isotype-specifieke antilichaam reacties op Clostridium difficile toxines. Dit beeld zaait het serum anti-toxine IgG- en IgA Reacties (toxinotype 0, stam VPI 10463, ribotype 087; toxine A bij 200 µg/mL, toxine B bij 100 µg/mL), toxine B (C. difficile toxine B produceren stam CCUG 20309; toxine B bij 90 µg/mL) en de vorm van de voorloper van een B fragment van binaire toxine, pCDTb (200 µg/mL), bij patiënten met cystische fibrose (CF) zonder diarree, patiënten met C. difficile infectie (CDI) met diarree, en in gezonde controles (HC). De serumverdunning voor IgG- en IgA zijn 1:500 en 1:100, respectievelijk. De verschillen tussen de groepen werden geschat aan de hand van de test van Kruskal-Wallis, gevolgd door de post hoc test Dunns voor meerdere antwoorden. In vergelijking met de HC (n = 17) en de patiënten met een symptomatische CDI (n = 16), de volwassen CF-patiënten (n = 16) tentoongesteld aanzienlijk hogere niveaus van serum IgA anti-toxine A en B niveau; P ≤0.05. Hetzelfde patroon heerste voor IgG, behalve dat er geen verschil in de anti-toxine A IgG niveaus tussen de fracties was. De doos en friemeltje percelen vertegenwoordigen de mediaan, het bereik en de kwartielen. P ≤0.0001; P ≤0.01; P ≤0.05. De gestandaardiseerde signalen zijn genormaliseerd naar de standaard curve van immunoglobuline. Dit cijfer is herdrukt uit Monaghan et al. 2 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Neutralizing antilichaam efficacies om C. difficile toxines A en B in patiënten sera. Deze figuur toont de beschermende neutraliserende antilichamen (NAb) Reacties op C. difficile toxines A en B [toxinotype 0, stam VPI 10463, ribotype 087, gebruikt bij een 50% letale dosis (LD50)] in de sera (1:100 verdunning; toxine A 2.5 ng/mL, toxine B 0,5 ng/mL) van de HC , de patiënten met CF zonder diarree, en de patiënten met CDI met diarree. De sera van CF patiënten tentoongesteld aanzienlijk meer beschermende anti-toxine NAb reacties in vergelijking met de sera van de HC (toxines A en B) en van de patiënten met CDI (toxine A). De verschillen tussen de groepen werden geschat aan de hand van de test van Kruskal-Wallis, gevolgd door de post hoc test Dunns voor meerdere antwoorden. De doos en friemeltje percelen vertegenwoordigen de mediaan, het bereik en de kwartielen. P ≤0.01; P ≤0.05. Dit cijfer is herdrukt uit Monaghan et al. 2 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Immuunreactiviteit en effect van IVIg aan C.difficile antigenen te neutraliseren. A. dit beeld toont de reactiviteit van multi-isotype specifieke antilichamen tegen C. difficile antigenen in commerciële intraveneuze immunoglobulin (IVIg) preparaten. De warmte kaart illustreert de niveaus van isotypes van specifieke antilichamen (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2 en IgM) in drie verkrijgbare preparaten (Zie Tabel van materialen) tegen zeven C. difficile antigenen [toxine een (200 µg /mL), toxine B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL), toxine B (CCUG 20309; 90 µg/mL), en laag eiwitten (SLPs) 001, 002 en 027 (alle 200 µg/mL) oppervlakte] met behulp van eiwit microarray technologie. De kleurcode van de warmte-kaart is als volgt: groen (laag) tot rood (hoge) signaal intensiteit. De waarden van de signaal vertegenwoordigd op de kleurenschaal van de voor de warmte-kaart zijn log2-getransformeerd van de willekeurige fluorescentie eenheden (AFU). Neem signalen nota dat er meer recent de AFU is achterhaald door de "descriptor" gestandaardiseerd2. De totale IgG, IgG1 en IgG2 isotypes gaf de hoogste bindende reactivities tegen toxine A, toxine B, binaire toxine (pCDTb), en toxine B (CCUG 20309). B. deze percelen Toon de IVIg neutralisatie werkzaamheid tegen de inheemse C. difficile hele toxines A en B. Ze geven het percentage van het effect van de beschermende neutralisatie van commerciële IVIg producten tegen C. difficile toxine A en B. Ieder waarnemingspunt vertegenwoordigt de mediaan van de drievoudige experimenten bij 1:100 verdunning. IVIg voorbereiding 1 vertoont de laagste beschermend effect ten opzichte van IVIg preparaten 2 en 3, met name tegen toxine A. *** P ≤0.0001; P ≤0.05 (one-way variantie-analyse). Dit cijfer is gewijzigd van Negm et al. 3 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Immuunreactiviteit en effect van patiënt sera aan C. difficile antigenen te neutraliseren. A. dit cijfer geeft een vergelijking van reactivities van de antilichamen tegen C. difficile proteïnen in patiënten sera vóór en na IVIg infusie. De warmte kaart illustreert het niveau van de expressie van de isotypes (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2 en IgM) in serummonsters in zeven patiënten voor en na IVIg infusie tegen zeven C. difficile antigenen [toxine een (200 µg/mL), toxine B (100 µg / mL), pCDTb (200 µg/mL), toxine B (CCUG 20309; 90 µg/mL), en SLPs 001, 002 en 027 (alle 200 µg/mL)] met behulp van eiwit microarray technologie. De kleurcode van de warmte-kaart is als volgt: groen (laag) tot rood (hoge) signaal intensiteit. De waarden van de signaal vertegenwoordigd op de kleurenschaal van de voor de warmte-kaart zijn van de AFU log2-omgezet. Houd er rekening mee dat de AFU recentelijk door gestandaardiseerde signalen2 vervangen is. Er was een verbetering na infusie van de totale IgG, IgG1, IgG2 en IgG3 reactivities toxine A, B-toxine en pCDTb. B. dit beeld toont de IgG-reacties op het toxine A, toxine B, en binaire toxine (pCDTb), pre en post-IVIg administratie. Het totale niveau van de IgG tegen alle toxine tonen een aanzienlijke stijging na de toediening van de IVIg (met de Wilcoxon ondertekend-rank test). Ieder waarnemingspunt vertegenwoordigt de mediaan van de drievoudige experimenten op 1:10 verdunning. C. deze percelen Toon de neutralisatie effect tegen inheemse C. difficile toxines A en B na IVIg toediening. Een vergelijking van pre- en post infusie neutraliserende antilichamen activiteiten blijkt een verbeterd beschermende effect na de IVIg infusions tegen de inheemse C. difficile toxines A en B. Ieder waarnemingspunt vertegenwoordigt de mediaan van de drievoudige experimenten op 1:10 verdunning. Een aanzienlijke toename van de beschermende werking tegen de toxines A en B werd opgemerkt in de patiënt sera getest post-IVIg infusie (met de Wilcoxon ondertekend-rank test). Dit cijfer is herdrukt uit Negm et al. 3 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Reproduceerbaarheid | Toxine A | Toxine B | SLP001 | SLP002 | SLP027 | Toxine B CCUG 20309 | pCDTb |
| Intra-assay | 7,70% | 6,40% | 7,40% | 5.10% | 7.60% | 7% | 3.70% |
| Inter assay | 9.10% | 9.10% | 7,40% | 11,20% | 12,8 | 9,70% | 12,50% |
Tabel 1: Microarray intra-assay en inter assay precisie 1. Microarray intra - en intersite - assay variabiliteiten werden berekend aan de hand van de sera van 7 patiënten. Identieke monsters werden vehiculumcontrolegroep op elk van de twee dia's op twee onafhankelijke tijd punten. Alle antigenen (n = 7 test en n = 2 besturingselementen) werden gespot in duplo's van vijf op elk van de matrices.
| Gezuiverde eiwitconcentratie | Serumverdunning | Secundair antilichaam verdunning | |
| IgG | 50 μg/ml | 1/500 | 1/20000 |
| IgG1 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgG2 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/10000 |
| IgG3 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgG4 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgA | 50 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgA1 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/10000 |
| IgA2 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgM | 50 μg/ml | 1/500 | 1/20000 |
Tabel 2: lijst van immunoglobulinen in deze studie gebruikt. De Igs worden weergegeven met de relevante gezuiverde eiwit concentratie (µg/mL) en verdunningen voor serum en secundaire antilichamen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol hebben we aangetoond dat microarray is een geschikt platform voor het definiëren van humorale immuunreacties aan C. difficile eiwit antigenen patiënt sera (cijfers 3 en 6) en commerciële preparaten van IVIg (Figuur 5). We hebben ook aangetoond dat de techniek van microarray presteert goed vergeleken met conventionele ELISA (Figuur 2) en uitstekende reproduceerbaarheid, toont met intra - en intersite - assay variabiliteiten vallen binnen aanvaardbare grenzen van precisie ( Tabel 1).
Kritische stappen:
Een aantal kritische stappen moet worden gevolgd bij het bouwen van een succesvolle antigeen microarray platform. Aanvankelijk, is het uiterst belangrijk om uit te voeren van de experimenten van QC. De QC-experimenten, moeten verschillende parameters worden geëvalueerd, zoals de selectie van de juiste Oppervlaktechemie afdrukken buffers, blokkerende buffers, verdunningen van het serummonsters en de secundaire antilichamen. Deze experimenten moeten worden uitgevoerd met als doel het leveren van een goed gevalideerde en betrouwbare techniek38,39.
De selectie van een geschikte eiwit immobilisatie proces is een van de belangrijkste stappen in de microarray analyse, om een kwalitatief hoogwaardige uitvoering van de geteste aminosilane dia's, zoals gezien in deze studie. Het is van cruciaal belang te observeren van regelmatige en ronde plek morfologie, hoge en specifieke signaal intensiteit en een duidelijke achtergrond. Een andere factor die van microarray prestaties is de afdrukken buffer, die net zo belangrijk is is om de gewenste Oppervlaktechemie uniform en regelmatig plekken op de dia te produceren.
Het is belangrijk om te selecteren van de juiste instellingen voor afdrukken als dit zal toestaan dat de optimale grootte en de vorm van een plek om te worden afgedrukt. Bijvoorbeeld, moet de vochtigheidsgraad worden gehandhaafd rond 55% tijdens het afdrukken, omdat zonder vochtigheid het rentetarief van de verdamping in de microarray zaal is verhoogd en minder plekken worden afgedrukt.
Binding aan niet-specifieke eiwitten is een extra factor die de achtergrond en de plek signalen; Daarom kan passende selectie van een buffer met blokkerend elk aspecifieke bindende, wat leidt tot verbeterde gevoeligheid en nauwkeurigheid van de array gegevens39verminderen.
Wijzigingen en probleemoplossing:
Antigenen en serummonsters moeten aliquoted en opgeslagen in kleinere buizen van de opslag in de vriezer tot gebruik, die helpt voorkomen dat herhaald meerdere cycli bevriezen-ontdooien, die de sterkte van het signaal van de matrix kunnen verslechteren. Ter verhoging van de kans op een succesvolle experiment, alle reagentia moeten vers worden bereid en worden gefilterd. Het reinigen van de arrayer voor afdrukken en controleren van dat de instellingen zijn vereist. Bovendien, de houder van de dia moet worden schoongehouden om te minimaliseren van achtergrondgeluiden.
Beperkingen:
De toepassing van eiwit microarrays wordt momenteel gehinderd door de stringente vraag op Oppervlaktechemie in eiwit microarray fabricage. Hier is de grote variatie in de chemische en fysische eigenschappen van eiwitmolecules vereist aangepaste ontwerpt unieke Oppervlaktechemie voor verschillende klassen van eiwitten en antilichaam moleculen40. Andere technische uitdagingen van de wijdverbreide implementatie van dergelijke technologie omvatten de behoefte aan dure gespecialiseerde apparatuur en software met toegewezen Bank-ruimte, evenals de behandeling van complexe gegevensanalyse, onderhoudskosten, relatieve eiwit kwantificering en kritisch toegang tot gezuiverde antigenen.
Betekenis van de methode met betrekking tot bestaande/alternatieve methoden:
Microarray technologie is in principe gelijk aan ELISA, Meso schaal Discovery of Luminex immunoassay, maar is aanpasbaar, kan worden opgeschaald naar het bereiken van statistisch onderscheidingsvermogen, afhankelijk van enige microliter hoeveelheden van kostbare monsters en heeft de mogelijkheid om scherm sera voor meerdere eiwit reactivities. Het is daarom bijzonder geschikt voor grootschalige, historische serum banken en ontdekking van biomarker en screening.
Toekomstige toepassingen en aanwijzigingen van methode:
Toekomstige inspanningen zal worden gericht op het optimaliseren van de assay voor andere monsters (cel supernatant), gebruik van de test als een prognostische gereedschap voor patiënt stratificatie, extern valideren mogelijke biomarkers grote cohorten met een dubbel-blinde fashion, en voorspellen en optimaliseren van reactie op immunotherapie (mAb, vaccins). In de toekomst kan de microarray technologie worden gebruikt in een ziekenhuis als een handig diagnostisch hulpprogramma of volgen van het behandelplan van een drug gedurende een periode van tijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door een Hermes Fellowship aan Ola Negm en Tanya Monaghan en via afzonderlijke financiering van het centrum van Nottingham spijsvertering ziekten en de NIHR Nottingham spijsvertering ziekten Biomedical Research Centre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobotics MicroGrid II arrayer | Digilab, Malborough, MA, USA | N/A | Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides. |
| Scanner InnoScan 710. | Innopsys | N/A | A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction. |
| MAPIX software version 7.2.0 | Innopsys | N/A | Measure signal intensities of the spots. |
| Silicon contact pin | Parallel Synthesis Technologies | SMT-P75 | Print the samples onto the slides. |
| Thermo Scientific Nalgene Desiccator | Thermo Scientific | 41102426 | To store the new and printed slides. |
| 384-well plate | Genetix | X7022UN | To prepare the antigens. |
| Plate cover | Sigma Aldrich, UK | CLS6570-100EA | To reduce evaporation of the samples. |
| Aminosilane slides | Schott, Germany | 1064875 | The slide of choice for printing the antigens. |
| Slide holders | GraceBio Labs, USA | 204862 | Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells . |
| Candida albicans lysate | NIBSC | PR-BA117-S | Positive control |
| Tetanus Toxoid | Athens Research and Technology | 04/150 | Positive control |
| Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707 | Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-1 | Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-2 | Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-3 | Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-4 | Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma. |
| Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701 | Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-1M | Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-2M | Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma. |
| Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090713 | Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma. |
| Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific | Vector Labs | BA-3080 | Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9052-08 | Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT | Southern Biotec | 9060-08 | Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9210-08 | Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT | Southern Biotec | 9190-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - Biotinylated | Vector Labs | BA-3030 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA1-BIOT | Southern Biotec | 9130-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA2-BIOT | Southern Biotec | 9140-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgM-BIOT | Southern Biotec | 9020-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| 0.2 mm syringe filter | Thermo scientific | 723-2520 | Filter the 5% BSA. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, UK | A7284 | Use 5% BSA for blocking the slides. |
| Antibody diluent | Dako, UK | S3022 | To dilute the serum and the secondary antibody. |
| Streptavidin Cy5 | eBioscience | SA1011 | Detection of the immune reaction. |
| Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb | University of Bath | NA | Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70) |
| Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins | Dublin City University | NA | |
| Vigam (IVIg preparation 1) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Privigen (IVIg preparation 2) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Intratect (IVIg preparation 3) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A |
References
- Negm, O. H., et al. Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).
- Monaghan, T. M., et al. High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection. Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).
- Negm, O. H., et al. Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration. Clinical & Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).
- Monaghan, T., et al. OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection. Gut. 66, Suppl. 2 31 (2017).
- Bacon, A. E. Immunoglobulin G directed against toxins A and B of Clostridium difficile in the general population and patients with antibiotic-associated diarrhea. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 18 (4), 205-209 (1994).
- Viscidi, R., et al. Serum antibody response to toxins A and B of Clostridium difficile. The Journal of Infectious Diseases. 148 (1), 93-100 (1983).
- Salcedo, J., et al. Intravenous immunoglobulin therapy for severe Clostridium difficile colitis. Gut. 41 (3), 366-370 (1997).
- Abougergi, M. S., Kwon, J. H. Intravenous immunoglobulin for the treatment of Clostridium difficile infection: a review. Digestive Diseases and Sciences. 56 (1), 19-26 (2011).
- Shah, N., Shaaban, H., Spira, R., Slim, J., Boghossian, J. Intravenous immunoglobulin in the treatment of severe Clostridium difficile colitis. Journal of Global Infectious Diseases. 6 (2), 82-85 (2014).
- Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A. The New England Journal of Medicine. 342 (6), 390-397 (2000).
- Solomon, K., et al. Mortality in patients with Clostridium difficile infection correlates with host pro-inflammatory and humoral immune responses. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 9 1453-1460 (2013).
- Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea. Lancet. 357 (9251), 189-193 (2001).
- Leav, B. A., et al. Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium difficile infection (CDI). Vaccine. 28 (4), 965-969 (2010).
- Drudy, D., et al. Human antibody response to surface layer proteins in Clostridium difficile infection. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 41 (3), 237-242 (2004).
- Bauer, M. P., Nibbering, P. H., Poxton, I. R., Kuijper, E. J., van Dissel, J. T. Humoral immune response as predictor of recurrence in Clostridium difficile infection. Clinical Microbiology and Infection. 20 (12), 1323-1328 (2014).
- Wilcox, M. H., et al. Bezlotoxumab for prevention of recurrent Clostridium difficile infection. The New England Journal of Medicine. 376 (4), 305-317 (2017).
- Leuzzi, R., Adamo, R., Scarselli, M. Vaccines against Clostridium difficile. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 10 (6), 1466-1477 (2014).
- Ghose, C., Kelly, C. P. The prospect for vaccines to prevent Clostridium difficile infection. Infectious Disease Clinics of North America. 29 (1), 145-162 (2015).
- Henderson, M., Bragg, A., Fahim, G., Shah, M., Hermes-DeSantis, E. R. A review of the safety and efficacy of vaccines as prophylaxis for Clostridium difficile infections. Vaccines. 5 (3), Basel. (2017).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Delehanty, J. B., Ligler, F. S. Method for printing functional protein microarrays. BioTechniques. 34 (2), 380-385 (2003).
- Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 27 (Unit 27) 21 (2013).
- Huang, Y., Zhu, H. Protein array-based approaches for biomarker discovery in cancer. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 15 (2), 73-81 (2017).
- Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
- Bacarese-Hamilton, T., Mezzasoma, L., Ardizzoni, A., Bistoni, F., Crisanti, A. Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays. Journal of Applied Microbiology. 96 (1), 10-17 (2004).
- Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).
- Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection. Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).
- Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 30, 21-27 (2016).
- Crompton, P. D., et al. A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6958-6963 (2010).
- Khodakov, D. A., et al. An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV. BioTechniques. 44 (2), 241-246 (2008).
- Ryabinin, V. A., et al. Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus. PLoS One. 6 (4), 17529 (2011).
- Zhu, H., et al. Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).
- Cleton, N. B., et al. Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers. PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580 (2015).
- Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies. PLoS One. 8 (9), 73842 (2013).
- Zhou, F., et al. Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection. Scientific Reports. 5, 15349 (2015).
- Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data. Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).
- Monaghan, T. M., et al. Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis. PLoS One. 8 (9), 74452 (2013).
- Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. Current microarray surface chemistries. Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).
- Wellhausen, R., Seitz, H. Facing current quantification challenges in protein microarrays. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, article ID 831347 (2012).
- Guo, A., Zhu, X. -Y. The critical role of surface chemistry in protein microarrays. Functional Protein Microarrays in Drug Discovery. , CRC Press. Boca Raton. (2007).
