Summary
Эта статья описывает метод простой протеина microarray для профилирования гуморального иммунного ответа группе 7-plex высоко очищенный Clostridium difficile антигенов в человеческой сыворотки. Протокол может быть продлено определение специфического антитела ответов в подготовке поликлональных внутривенного иммуноглобулина.
Abstract
Мы предоставляем подробный обзор assay microarray романный протеин высокой пропускной способностью для определения анти -Clostridium difficile уровни антител в человеческой сыворотки и отдельных препаратов поликлональных внутривенного иммуноглобулина (IVIg). Протокол описывает методологические этапы подготовки проб, печать массивов, процедуры анализа и анализа данных. Кроме того этот протокол может быть дальнейшее развитие для включения различных клинических образцов, включая плазмы и клеточной supernatants культуры. Мы покажем, как microarray протеина может использоваться для определения сочетания изотипа (IgG, IgA, IgM), подкласс (IgG1 IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), и штамм специфических антител к высоко очищенный целый C. difficile токсинов A и B (toxinotype 0, штамм ВПИ 10463, ribotype-087), токсин B от C. difficile токсин B-только выражая штамм (CCUG 20309), предшественник формы фрагмента B бинарный токсин, pCDTb, ribotype специфических всей поверхности слой белков (SLPs; 001, 002, 027) и контролировать белков (столбняка Анатоксин и Candida albicans). В ходе эксперимента, microarrays проверяются с сывороток от физических лиц с C. difficile инфекции (CDI), лица с кистозный фиброз (CF) без диареи, здоровые элементы (HC) и от частных лиц до и пост IVIg терапии для лечение CDI, комбинированного иммунодефицита расстройства и хронических воспалительных демиелинизирующих polyradiculopathy. Мы сталкиваемся с существенные различия между группами пациентов, коммерческие препараты IVIg, и сера до и следующие внутривенное узкоспециализированного нейтрализации токсинов и multi изотип специфическое антитело уровней. Кроме того существует существенная корреляция между microarray и энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) для уровней IgG антитоксин в образцах сыворотки. Эти результаты показывают, что microarray может стать перспективным средством для профилирования антитела ответы на антигены C.difficile прививку или инфицированных людей. С дальнейшего уточнения антигена панелей и снижением издержек производства мы ожидаем, что технология microarray дна может помочь оптимизировать и выберите наиболее клинически полезным immunotherapies C. difficile инфицирования пациента конкретным образом.
Introduction
Этот протокол описывает разработки и проверки assay microarray Роман и индивидуальных белков для обнаружения и полу количественной оценки бактериальный штамм и антителом изотипа конкретных ответов на антигены C. difficile . Мы успешно используем наши C. difficile-assay microarray конкретные как перспективный новый инструмент для композиционных bioanalysis специфическое антитело содержание пациента сыворотки1,2, подготовка IVIg3, и выявление особенностей антитела, которые коррелируют с неблагоприятные исходы в CDI4. Мы демонстрируем, как образцы сыворотки biobanked и коммерческие препараты IVIg могут быть проанализированы на microarray слайды, позволяя высокое качество воспроизводимых профилирование C. difficile возбудителя специфические антитела ответов в этот assay.
Многие здоровые дети и взрослые имеют обнаружить сыворотке антител IgG и IgA C. difficile токсинов A и B5,6. Считается, что они возникают после временной экспозиции во время младенчества и после воздействия C. difficile в зрелом возрасте. По этой причине был поликлональных IVIg используется для лечения как периодических, так и молниеносный CDI7,8,9-лейбл. Однако его окончательного роль и режим действий остается неясным. Несколько исследований показали, что гуморального иммунного ответа на C. difficile токсинов играет роль в болезни презентации и результат. В частности бессимптомных больных показывают увеличение сыворотка анти-токсин IgG концентрации по сравнению с пациентами, которые разрабатывают симптоматической болезни10. Очевидном Ассоциация сообщила средний анти-токсин IgG титры и смертности от всех причин 30-день11. Несколько докладов также показали связь с защитой от повторения и антитела ответы на токсин A, B и несколько не токсин антигены (Cwp66, Cwp84, Флик, FliD и поверхностный слой белки (SLPs))12,13 , 14 , 15. Эти соображения стимулировали развитие первая пассивная иммунотерапия наркотиков таргетинга C. difficile токсин B (bezlotuxumab), который недавно был одобрен в США продуктов питания и медикаментов и европейские лекарства Агентство по предотвращению периодических CDI16. Стратегии вакцинации с использованием рекомбинантного токсин фрагменты или инактивированные токсины, также в настоящее время в развитие17,18,19. Эти новые терапевтические подходы, несомненно, будет стимулировать требование для оценки гуморального иммунного ответа на нескольких антигенов в больших выборок.
Сегодня существует заметное отсутствие коммерчески доступных высок объём анализов способны одновременно оценки бактериальный штамм и антителом изотипа конкретные ответы на антигены C. difficile . Есть неудовлетворенные потребности в разработке таких анализов для облегчения будущих исследований и клинического применения. Microarrays протеина являются метод для иммобилизации большое количество индивидуально очищенные белки как пространственно организованный массив пятен на микроскопические поверхность на основе слайдов с помощью робототехнической системы, которая может быть либо контакта20 или не контакт Печать инструмент21. Пятна могут представлять собой сложные смеси, например lysates клетки, антитела, гомогенатах ткани, эндогенного или рекомбинантных белков пептиды, выделениями или наркотиков22,23.
Технология microarray протеина имеет явные преимущества над стандартной внутренней ELISA методы, которые традиционно использовались для оценки анти -C. difficile антитела ответов. К ним относятся расширение возможностей для обнаружения широкий спектр мульти изотип специфических антител против более обширная группа белковых мишеней, сокращение объема требований для антигенов, проб и реагентов и расширение возможностей для включения большего количество технических реплицирует, помимо нескольких внутреннего контроля качества (QC) меры1. Microarrays поэтому более чувствительным, точные и воспроизводимые и имеют больший динамический диапазон. Эти факторы делают microarrays дешевле и потенциально выгодные альтернативы ELISAs для крупномасштабных обнаружения известных белков. Однако недостатки технологии microarray главным образом результатом большой авансовые расходы, связанные с созданием группы высокоочищенных антигенов и создание технологической платформы.
Microarrays протеина широко использовались в последние два десятилетия как средство диагностики и базовые исследования в клинических приложений. Приложения включают в себя выражения протеина профилирования, исследование ферментов субстрат отношения, скрининг биомаркеров, анализ хост микробных взаимодействий и профилирование антитела специфика23,24, 25,26,27,28. Созданы многие новые microarrays белка/антиген возбудителя, в том числе малярией (Plasmodium)29, ВИЧ-130, гриппа31, тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС)32, вирусные геморрагические лихорадки33 , Герпесвирусы34и35туберкулеза.
Настоящий Протокол относится к созданию легко операционных C. difficile реактивной антигена assay microarray, которая позволяет точной, точной и конкретной количественной оценки multi изотип и штамм специфические антитела ответы на C. несговорчивый антигенов в сыворотки и поликлональными IVIg. Здесь мы включить представителя результаты, относящиеся к приемлемым microarray пробирного производительность по сравнению с ELISA, а также анализа точности и воспроизводимости профили. Этот assay может быть дальнейшее развитие для профилирования других клинических образцов и устанавливает новый стандарт для исследований в молекулярные основы CDI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Microarray пластины
- Разбавить C. difficile антигены с буфером печати [PBS-анимации Трегалоза (50 мм)] в оптимальной концентрации, (который был предварительно перед запуском пациента sera): токсин (200 мкг/мл) и токсинном B (100 мкг/мл), pCDTb (200 мкг/мл) и очищенная родной весь SLPs, производный от риботипы 001, 002 и 027 (200 мкг/мл).
Примечание: Токсинного B был получен от токсин B-выражая штамм CCUG 20309 (90 мкг/мл).- Разбавьте позитивные элементы, лизатов C. albicansи столбнячного анатоксина с печати буфера на 100 мкг/мл. Наконец разбавляют очищенного иммуноглобулина человека соответствия протестированных антителом изотипа последовательно, начиная в 50 мкг/мл через 10 разведений в буфере печати для создания калибровочной кривой.
- Передача 10 мкл разведений в буфере печати в 384-ну плиту.
- Крышка с пластины печати и центрифуги на 300 x g за 5 мин.
2. Печать массивы с контактной робот
- Тепла кремния PIN-код, с помощью ручной газовой горелки 3 x 2 s каждый и прополоскать в чистой воде 3 x 3 s.
- Место пластину microarray дна в Загрузка картриджа arrayer.
- Место aminosilane слайды на панели слайдов.
Примечание: Слайд лотка может вместить 27 слайды: три строки девяти слайдов. Слайды расположены в книжной ориентации, начиная с левой стороны в нижней строке, и остальная часть пространства покрыты пустых слайдов для обеспечения охвата всех отверстий на панели слайдов.- Нажмите кнопку ОК и проверьте, что вакуум был включен и все слайды являются безопасными. Оставьте слайды в влажной среде для по крайней мере 1 час перед началом печати.
Примечание: Aminosilane слайды предоставляются в герметичной упаковке с осушителем. После открытия, любые неиспользованные слайды должны быть немедленно возвращаться сушильный шкаф для хранения до истечения срока.
- Нажмите кнопку ОК и проверьте, что вакуум был включен и все слайды являются безопасными. Оставьте слайды в влажной среде для по крайней мере 1 час перед началом печати.
- Настройте программу подходящей печати для печати Clostridium difficile антигены. Запуск ТАС Комплект приложений и откройте файл необходимые параметры печати запуска из каталога «My координатной привязки выполняется». Выберите для печати всех антигенов Clostridium difficile в составленном Clostridium difficile файл.
- После двойного щелчка на значке microarray дна на главном окне называется «MicroArraying параметры» появится окно с тремя вкладками. Три вкладки являются «Источник», «Цель» и «Параметры». Вкладка «Источник» показывает детали, количество проб, используемых в пластину microarray. На вкладке «Мишень» показывает детали как слайды должны быть загружены, где массив должен быть напечатан на слайде и редактировать макет слайда (16 подмассива форматов). На вкладке «Параметры» показывает детали протокола мыть и инструмент будет использоваться например. мыть после каждого завершенного образца. Чистый кремний pin между образцов, чтобы избежать любого загрязнения между различными образцами.
- Возможности программирования расположены в разделе Параметры > выполнить настройки на панели инструментов "ТАС" Комплект приложений. Есть 9 вкладки, чтобы работать через, в этом разделе, и как вы полный одну вкладку перейти к следующей, нажав на него. Нажав кнопку «OK» доставит вас из «Run предпочтения.» На вкладке «Общие» «Run предпочтения» существует ряд флажков в этом разделе, касающиеся как инструмент будет вести себя при запуске программы. Установите флажок «Премьер баня до начала выполнения», все три мойки подвергнутся последовательности коротких грунтовки до начала выполнения. Флажок «Мыть в начале выполнения», инструмент pin будет мыть, прежде чем посетить первый источник. Установите флажок «Стирка в конце выполнения», инструмент pin будет мыть после посещения последний источник. Пользователь может задать количество циклов стирки. В «Климат» на вкладке «Run преференций» начало увлажнения. Мы используем параметр заключаются в следующем: начать курс 55%, запуск скорость 55%, Минимальная влажность 55%, целевой показатель влажности 60%. Не запустить запустить до тех пор, пока влажность цель была достигнута, в противном случае пятна будет неправильный размер и библиотека быстро испарится.
- В меню бар ТАС нажмите зеленую кнопку. Запустить запустить и периодически наблюдать что arrayer во время тиража быть определенные всё ОК.
Примечание: Это позволяет анализ образцов 15 параллельно на каждом слайде, как один из подмассива используется как отрицательный контроль. Дизайн подмассивов определяется количество печатных белки (антигены) и количество печатных биологического реплицирует.
Примечание: После печати каждого образца, голова движется в сторону стиральной ванны разрешить несколько погружения ПИН в две ванны мыть, содержащие дистиллированной воды и 0,002% 20 анимации для 1,5 s в каждой бане следуют ПИН с ультра-чистой водой для ополаскивания и сушки ПИН-кода в Основная стирка станция 4 s.
3. Хранение массивов
- Держите Распечатанные слайды, хранящиеся на ночь при комнатной температуре в эксикаторе.
Примечание: Распечатанные слайды могут храниться до одной недели.
4. массив зондирование
- Осторожно поместите Распечатанные слайды в слайд владельца 16 несколькими хорошо камер формата.
Примечание: Камер, имея глубину приблизительно 7,5 мм, обеспечивают щедрой поверхность соотношение объема для облегчения смешивания и мытье шаги. - Разрешить все реагенты для тёплого к комнатной температуре перед использованием. Если не указано иное, выполните все следующие действия при комнатной температуре.
- 100 мкл отфильтрованных анимации 5% бычьего сывороточного альбумина (BSAT; используйте фильтр шприц 0.2 мкм) для каждого блока, охватывают слайды и инкубировать их встряхивании за 1 ч.
- Мыть слайды 5 x 1 мин в 120 мкл фосфата в буфер солевой с 20 анимации (PBST; 0,1% анимации) за хорошо встряхивании. Не дайте высохнуть слайды.
- Оттепель образцы сыворотки на льду для 20 мин и развести каждого образца с коммерчески доступных антитела разбавителя с фоном, сокращение компонента (см. Таблицу материалы).
- Оптимизируйте разведение образцов сыворотки согласно протестированных иммуноглобулинов, как показано в таблице 2.
- Передачи 100 мкл разбавленного сыворотки образцов для всех блоков, за исключением одного, который будет использоваться в качестве отрицательного контроля; в этот блок только добавьте 100 мкл антител разбавителя. Инкубируйте слайды с нежным агитации за 1 час.
- Вымойте слайды 5 x 3 мин в 120 мкл PBST (0.1% анимации) за хорошо встряхивании.
- 100 мкл антитела анти человека коза биотинилированным разбавленные антитела разбавителя.
- Оптимизируйте разрежения вторичные антитела согласно протестированных иммуноглобулинов, как описано в таблице 2. Обложка слайды и инкубировать их с нежным встряхивания в течение 1 ч.
- Вымойте слайды 5 x 3 мин в 120 мкл PBST за хорошо встряхивании.
- 100 мкл стрептавидина Cy5, для каждого блока, разводят в 1: 2000 в 5% BSA. Обложка слайды с фольгой, чтобы защитить их от света во время встряхивания в течение 15 мин с нежным агитации.
- Вымойте слайды 5 x 1 мин каждый в 120 мкл PBST за хорошо встряхивании, следуют 2 моет 1 мин в PBS только встряхивании.
- Спиновые слайды для 5 мин на 300 x g чтобы высушить их.
- Держите слайды в темной коробке для транспортировки и хранения при комнатной температуре.
- Перейти к сканирования массивы немедленно обеспечить последовательность сигнала после зондирования.
Примечание: Однако, исследуемого слайды можно хранить в темноте и проверены в течение одной недели от зондирования.
5. сканирование массивов
- Включите лазерного сканера (см. Таблицу материалы) 30 мин перед сканированием для разогрева лазера. Загрузить программное обеспечение сканера и подключите компьютер к сканеру.
- Поместите слайд с лицом печатной стороной вверх в сканер, до тех пор, пока игра свет горит немигающим зеленым светом.
- Нажмите кнопку Параметры и настроить следующие параметры при сканировании слайдов следующим: режим сканирования, медиана; Приобретение, 635 только; Приобретение режим, ручной; Прибыль, 20; Мощность, низкая; Тип слайда, неподписанном слайд; Фокус, автоматической фокусировки. Выключить автоматическую прокрутку и равным 10 размер пикселя и сканирования 35 чтение штрих-кодов.
- Сохраните полученные изображения как 16-битные оттенки серого несколько изображений TIFF формат. Нажмите кнопку Импорт сетки и выберите в списке соответствующий массив.
Примечание: Список массива описывает размер и положение подмассивов и имена печатных веществ, связанные с каждой функции индикатор.- Выравнивание сетки пятна на слайде.
- Анализ изображений, нажав на кнопку процесс количественной оценки для измерения интенсивности флуоресценции сигнал каждое пятно и сохранить результаты в текстовом формате под названием GenePix результаты (ППГ).
Примечание: ППГ файл содержит переменные локализации и идентификации целей антигена на массив и сигнал также интенсивности флуоресценции средний и местные фон, представляющий антитела связывая значения каждого пятна.
6. анализ данных
- Вычисление медианы для реплицирует каждого антигена после вычитание фона, используя бесплатный microarray анализ программного обеспечения, называется обратной фазы белка массив (RPPA) анализатор, модуль в рамках Статистический язык R на CRAN36.
- Участок калибровочной кривой и интерполировать сигналы каждого антигена относительно иммуноглобулина калибровочной кривой с помощью коммерческих научных графиков и статистики программное обеспечение (см. Таблицу материалы) для вычисления уровни антител.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 иллюстрирует блок-схемы, описывающие основные шаги в протоколе описаны. Рисунок 2 показывает тестов корреляции Спирмена, демонстрируя значительное соглашение между microarray и ELISA IgG и IgA анти-токсин A и B уровней в сыворотке пациента тест. Рисунок 3 показывает дифференциальной IgG и IgA антитела класса специфическое антитело ответы на токсин A, токсин B и бинарный токсин (pCDTb) у больных с CF без диареи, CDI больных с диареей и в ХК. Рисунок 4 показывает C. difficile антитоксина, нейтрализуя антитело ответы в пациента sera. Рисунок 5 показывает иммунной реактивности (против C. difficile токсинов и SLPs) и нейтрализовать эффект ВВИГ (против C. difficile токсинов). Рисунок 6 показывает иммунной реактивности (против C. difficile токсинов и SLPs) и нейтрализовать эффект пациента сера до и пост-внутривенное (против C. difficile токсинов). В таблице 1 показаны приемлемые внутри и между assay коэффициенты изменчивости microarray дна с помощью теста сера. Таблица 2 иллюстрирует список иммуноглобулинов, используемые в данном исследовании с соответствующими концентрациями очищенных белков, а также оптимизированный разведения сывороток и вторичные антитела.
Рисунок 1 : Общий обзор основных шагов, участвующих в протоколе microarray. Первым шагом является подготовка антигены и элементов управления. Последующие примеры разведений передаются 384-плиты в готовности для печати в quadruplicates на aminosilane слайды. После сушки и блокирование слайдов, массивы инкубируют с пациентами сыворотки. После дальнейших мытья, добавляется биотинилированным античеловеческие иммуноглобулина (Ig) указанного изотипа. После окончательной стирки и сушки шаги слайды, проверяются и результирующего изображения обработаны с программным обеспечением анализа изображений microarray. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Корреляция между microarray и ИФА результаты. Коэффициент корреляции Спирмена была использована для оценки уровня соглашения между этими двумя платформами. При сравнении производительности microarray дна с внутренней энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA), A. для токсин A наблюдался хороший коэффициент корреляции (r = 0.7051; P < 0.0001), Б. и умеренно хорошей корреляции для токсин B (r = 0.5809; P < 0.0001). Полный протокол ELISA был другом подробно37. Эта цифра была перепечатана из Негм и др. 1 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Isotype специфические антитела ответы на Clostridium difficile токсинов. Этот образ сеет сыворотка анти-токсин IgG и IgA ответы (toxinotype 0, штамм VPI 10463, ribotype 087; токсин A на 200 мкг/мл, токсин B в 100 мкг/мл), токсинного B (C. difficile токсин B-производители штамм CCUG 20309; токсин B в 90 мкг/мл) и форма B прекурсоров фрагмент бинарный токсин, pCDTb (200 мкг/мл), у больных с кистозный фиброз (CF) без диареи, больных с инфекцией (CDI) C. difficile с диареей и здоровых элементов управления (HC). Разведении сыворотки для IgG и IgA, 1: 500 и 1: 100, соответственно. Различия между группами были оценены с помощью теста Крускала-Уоллиса, следуют Данн post hoc тест для множественных ответов. По сравнению с HC (n = 17) и у пациентов с симптоматической CDI (n = 16), взрослых CF пациентов (n = 16) выставлены значительно более высокие уровни сыворотки IgA анти-токсин A и B уровнях; P ≤0.05. Тот же шаблон преобладали для IgG, за исключением того, что нет никакой разницы в уровнях IgG анти-токсин между группами. Коробки и столбик участки представляют собой медиану, диапазон и квартили. P ≤0.0001; P ≤0.01; P ≤0.05. Стандартные сигналы нормализуются к стандартной кривой иммуноглобулина. Эта цифра была перепечатана из Монаган и др. 2 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: C. difficile узкоспециализированного Neutralizing антитела к токсинов A и B в пациентов сера. Эта цифра показывает защитный нейтрализуя антитело (NAb) ответы на C. difficile токсинов A и B [toxinotype 0, штамм VPI 10463, ribotype 087, используемые на 50% смертельная доза (ЛД50)] в sera (разбавления 1: 100; токсин 2,5 нг/мл, токсин B 0,5 нг/мл) от ХК , с CF без диареи и пациентам с CDI с поносом. Sera CF пациентов выставлены значительно сильнее защитные анти-токсин NAb ответов по сравнению с sera от HC (токсинов A и B) и у больных с CDI (токсин A). Различия между группами были оценены с помощью теста Крускала-Уоллиса, следуют Данн post hoc тест для множественных ответов. Коробки и столбик участки представляют собой медиану, диапазон и квартили. P ≤0.01; P ≤0.05. Эта цифра была перепечатана из Монаган и др. 2 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Иммунной реактивности организма и нейтрализации эффекта IVIg C.difficile антигены. A. это изображение показывает реактивности multi изотип специфических антител к антигенам C. difficile в коммерческих внутривенного иммуноглобулина (IVIg). Тепловая карта показывает уровни изотипов специфического антитела (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2 и IgM) в трех коммерчески доступных препаратов (см. Таблицу материалы) против семи C. difficile антигены [токсин (200 мкг /ML), токсин B (100 мкг/мл), pCDTb (200 мкг/мл), токсинного B (CCUG 20309; 90 мкг/мл) и поверхности слой белки (SLPs) 001, 002 и 027 (все 200 мкг/мл)] с использованием технологии microarray протеина. Цветовой код тепла карта выглядит следующим образом: зеленый (низкая) интенсивности красного сигнала (высокий). Значения сигнала, представленные на цветовой шкале для тепла карта, log2-трансформированных от произвольного флуоресценции единиц (АФУ). Пожалуйста обратите внимание, что АФУ совсем недавно было заменено дескриптор стандартизированных сигналы2. Общее IgG, IgG1 и IgG2 изотипов дал высокий определено связывание против токсин A, B, бинарный токсин (pCDTb), токсинного и токсинного B (CCUG 20309). Б. Эти участки показывают эффективность нейтрализации IVIg против родной C. difficile весь токсинов A и B. Они дают процент защитные нейтрализации влияния коммерческих продуктов IVIg против C. difficile токсинов A и B. Каждый участок представляет собой медиану тройные экспериментов в разведении 1: 100. IVIg подготовка 1 экспонаты низкая защитный эффект, по сравнению с ВВИГ препаратов 2 и 3, особенно против токсин а. *** P ≤0.0001; P ≤0.05 (односторонний дисперсионный анализ). Эта цифра была изменена от Негм и др. 3 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Иммунной реактивности организма и нейтрализации эффект сыворотки пациента к антигенам C. difficile . A. эта цифра показывает сравнение определено антитела против белков C. difficile в сера пациентов до и после инфузии IVIg. Тепловая карта показывает уровень экспрессии изотипов (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2 и IgM) в образцах сыворотки в семи пациентов до и после инфузии IVIg против семи C. difficile антигены [токсин (200 мкг/мл), токсинного B (100 мкг / Мл), pCDTb (200 мкг/мл), токсинного B (CCUG 20309; 90 мкг/мл) и SLPs 001, 002 и 027 (все 200 мкг/мл)] с использованием технологии microarray протеина. Цветовой код тепла карта выглядит следующим образом: зеленый (низкая) интенсивности красного сигнала (высокий). Значения сигнала, представленные на цветовой шкале для тепла карта, log2-трансформированных от ВСУ. Пожалуйста, обратите внимание, что АФУ совсем недавно были заменены стандартные сигналы2. Там был на повышение после инфузии общее IgG, IgG1, IgG2 и IgG3 определено токсин A, токсин B и pCDTb. Б. это изображение показывает IgG ответы на токсин A, токсин B и бинарный токсин (pCDTb), до и пост-внутривенное. Общий уровень IgG против всех токсинов показывают значительное увеличение после внутривенное (с использованием тест Вилкоксон подписали ранга). Каждый участок представляет собой медиану тройные экспериментов в 1:10 разрежения. C. Эти графики показывают эффект нейтрализации против родной C. difficile токсинов A и B, после внутривенное. Сравнение деятельности до и после инфузии нейтрализующих антител показывает усиленный защитный эффект после прекращения инфузии IVIg против родной C. difficile токсинов A и B. Каждый участок представляет собой медиану тройные экспериментов в 1:10 разрежения. В настой пост IVIg пациента сыворотки испытания (с использованием тест подписали ранг Вилкоксон) было отмечено значительное увеличение защитный эффект против токсинов A и B. Эта цифра была перепечатана из Негм и др. 3 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Воспроизводимость | Токсин A | Токсин B | SLP001 | SLP002 | SLP027 | Токсин CCUG B 20309 | pCDTb |
| Внутри пробирного | 7,70% | 6.40% | 7,40% | 5.10% | 7.60% | 7% | 3,70% |
| Между анализами | 9.10% | 9.10% | 7,40% | 11.20% | 12,8 | 9,70% | 12.50% |
Таблица 1: Microarray интра пробирного и между анализами точности 1. вариативности внутри и между assay microarray дна были рассчитаны с использованием сывороток 7 больных. Идентичных образцов в дубликатах проводили на каждой из двух слайдов в двух независимых время точках. Все антигены (n = 7 тест и n = 2 управления) были замечены в реплицирует пяти на каждый массив.
| Очищенный протеин концентрация | Сыворотка разрежения | Вторичное антитело разрежения | |
| IgG | 50 мкг/мл | 1/500 | 1/20000 |
| IgG1 | 200 мкг/мл | 1/100 | 1/5000 |
| IgG2 | 200 мкг/мл | 1/100 | 1/10000 |
| IgG3 | 200 мкг/мл | 1/100 | 1/5000 |
| IgG4 | 200 мкг/мл | 1/100 | 1/5000 |
| IgA | 50 мкг/мл | 1/100 | 1/5000 |
| IgA1 | 200 мкг/мл | 1/100 | 1/10000 |
| IgA2 | 200 мкг/мл | 1/100 | 1/5000 |
| IgM | 50 мкг/мл | 1/500 | 1/20000 |
Таблица 2: список иммуноглобулинов, используемые в данном исследовании. Igs приводятся с соответствующими очищенный протеин концентрации (мкг/мл) и разведения сыворотки и вторичные антитела.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе мы показали, что microarray является подходящей платформой для определения гуморального иммунного ответа до C. difficile белков антигенов в пациента сыворотки (рисунки 3 и 6) и коммерческие препараты IVIg (рис. 5). Мы также продемонстрировали, что техника microarray выполняет хорошо, когда по сравнению с обычными ELISA (рис. 2) и показывает отличную воспроизводимость, с внутри и между assay вариативности, входящих в приемлемых пределах точности ( Таблица 1).
Важнейшие шаги:
Ряд критических шагов должны соблюдаться при создании microarray платформы любой успешной антигена. Первоначально это чрезвычайно важно для запуска КК экспериментов. В экспериментах КК должны оцениваться различные параметры, такие как выбор соответствующей химии поверхности, печати буферов, блокировки буферов, разведения образцов сыворотки и вторичные антитела. Эти эксперименты должны выполняться с целью доставки хорошо проверенных и надежных техника38,39.
Выбор процесса иммобилизации подходящей белка является одним из наиболее важных шагов в анализе microarray дна, чтобы обеспечить высокое качество протестированных aminosilane слайдов, как видно в этом исследовании. Важно наблюдать регулярные и круговой пятно морфологии, интенсивности сигнала высокой и конкретные и очистить фон. Другим фактором, влияющим на производительность microarray является печати буфер, который является столь же важным для достижения желаемого химии поверхности для создания единой и регулярных пятна на слайде.
Важно выбрать правильные параметры печати, как это позволит оптимальный размер и форма пятна для печати. Например уровень влажности воздуха следует сохранить около 55% во время печати, потому что без влажности увеличивается скорость испарения в зале microarray и печатаются меньше места.
Без каких-либо специфических белков привязка является одним из дополнительных факторов, влияющих на фон и места сигналов; Таким образом выбор соответствующей блокировки буфера может уменьшить любой неспецифичный привязки, приводит к улучшению чувствительность и точность данных массива39.
Модификации и устранения неполадок:
Антигены и образцы сыворотки должны быть aliquoted и хранятся в небольших хранения труб в морозильнике до использования, которая помогает избежать повторяется несколько циклов замораживания оттаивания, которые могут ухудшаться сигнала массива. Чтобы повысить шансы успешного эксперимента, все реагенты должны быть подготовлены свежие и быть отфильтрованы. Очистка arrayer перед печатью и проверки, параметры необходимы. Кроме того слайд владельца должны быть чистыми для сведения к минимуму фоновый шум.
Ограничения:
В настоящее время препятствует применение microarrays протеина строгие спрос на химии поверхности в изготовление microarray протеина. Здесь большие различия в химические и физические свойства молекул белка требует custom Проектирование уникальной химии поверхности для различных классов молекулы протеина и антитела40. Другие технические проблемы, стоящие перед широкое внедрение такой технологии включают в себя необходимость дорогостоящее специализированное оборудование и программное обеспечение с выделенного скамейка пространства, а также рассмотрение эксплуатационные расходы, анализ сложных данных, относительная количественное определение белка и критически доступ к очищенные антигены.
Значение метода в отношении существующих/альтернативные методы:
Технология microarray подобен в принципе ELISA, мезо масштаба обнаружения или иммуноанализа Luminex, но настраиваемый, могут быть расширены для обеспечения статистической мощности, опирается на только микролитр количества ценных образцов и имеет способность экрана сера для нескольких белка определено. Поэтому особенно подходит для крупномасштабных, исторические сыворотки банков и открытия биомаркеров и скрининг.
Будущих приложений или направления метода:
Будущие усилия будут направлены на оптимизацию assay для других образцов (supernatants клетки), используя assay как инструмент прогностические для пациента стратификации, внешне проверки потенциальных биомаркеров, используя большой когорты в моде двойного слепого, и Прогнозирование и оптимизация ответ иммунотерапия (МАБ, вакцины). В будущем в больничных условиях как полезный диагностический инструмент или контролировать план лечения наркотиков в течение времени может использоваться технология microarray.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Гермес стипендий Негм Ola и Таня Монаган и через отдельное финансирование от центра Ноттингема пищеварительной заболеваний и NIHR Ноттингем пищеварительной заболеваний биомедицинских научно-исследовательского центра.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobotics MicroGrid II arrayer | Digilab, Malborough, MA, USA | N/A | Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides. |
| Scanner InnoScan 710. | Innopsys | N/A | A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction. |
| MAPIX software version 7.2.0 | Innopsys | N/A | Measure signal intensities of the spots. |
| Silicon contact pin | Parallel Synthesis Technologies | SMT-P75 | Print the samples onto the slides. |
| Thermo Scientific Nalgene Desiccator | Thermo Scientific | 41102426 | To store the new and printed slides. |
| 384-well plate | Genetix | X7022UN | To prepare the antigens. |
| Plate cover | Sigma Aldrich, UK | CLS6570-100EA | To reduce evaporation of the samples. |
| Aminosilane slides | Schott, Germany | 1064875 | The slide of choice for printing the antigens. |
| Slide holders | GraceBio Labs, USA | 204862 | Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells . |
| Candida albicans lysate | NIBSC | PR-BA117-S | Positive control |
| Tetanus Toxoid | Athens Research and Technology | 04/150 | Positive control |
| Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707 | Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-1 | Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-2 | Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-3 | Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-4 | Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma. |
| Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701 | Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-1M | Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-2M | Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma. |
| Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090713 | Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma. |
| Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific | Vector Labs | BA-3080 | Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9052-08 | Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT | Southern Biotec | 9060-08 | Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9210-08 | Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT | Southern Biotec | 9190-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - Biotinylated | Vector Labs | BA-3030 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA1-BIOT | Southern Biotec | 9130-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA2-BIOT | Southern Biotec | 9140-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgM-BIOT | Southern Biotec | 9020-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| 0.2 mm syringe filter | Thermo scientific | 723-2520 | Filter the 5% BSA. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, UK | A7284 | Use 5% BSA for blocking the slides. |
| Antibody diluent | Dako, UK | S3022 | To dilute the serum and the secondary antibody. |
| Streptavidin Cy5 | eBioscience | SA1011 | Detection of the immune reaction. |
| Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb | University of Bath | NA | Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70) |
| Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins | Dublin City University | NA | |
| Vigam (IVIg preparation 1) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Privigen (IVIg preparation 2) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Intratect (IVIg preparation 3) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A |
References
- Negm, O. H., et al. Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).
- Monaghan, T. M., et al. High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection. Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).
- Negm, O. H., et al. Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration. Clinical & Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).
- Monaghan, T., et al. OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection. Gut. 66, Suppl. 2 31 (2017).
- Bacon, A. E. Immunoglobulin G directed against toxins A and B of Clostridium difficile in the general population and patients with antibiotic-associated diarrhea. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 18 (4), 205-209 (1994).
- Viscidi, R., et al. Serum antibody response to toxins A and B of Clostridium difficile. The Journal of Infectious Diseases. 148 (1), 93-100 (1983).
- Salcedo, J., et al. Intravenous immunoglobulin therapy for severe Clostridium difficile colitis. Gut. 41 (3), 366-370 (1997).
- Abougergi, M. S., Kwon, J. H. Intravenous immunoglobulin for the treatment of Clostridium difficile infection: a review. Digestive Diseases and Sciences. 56 (1), 19-26 (2011).
- Shah, N., Shaaban, H., Spira, R., Slim, J., Boghossian, J. Intravenous immunoglobulin in the treatment of severe Clostridium difficile colitis. Journal of Global Infectious Diseases. 6 (2), 82-85 (2014).
- Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A. The New England Journal of Medicine. 342 (6), 390-397 (2000).
- Solomon, K., et al. Mortality in patients with Clostridium difficile infection correlates with host pro-inflammatory and humoral immune responses. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 9 1453-1460 (2013).
- Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea. Lancet. 357 (9251), 189-193 (2001).
- Leav, B. A., et al. Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium difficile infection (CDI). Vaccine. 28 (4), 965-969 (2010).
- Drudy, D., et al. Human antibody response to surface layer proteins in Clostridium difficile infection. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 41 (3), 237-242 (2004).
- Bauer, M. P., Nibbering, P. H., Poxton, I. R., Kuijper, E. J., van Dissel, J. T. Humoral immune response as predictor of recurrence in Clostridium difficile infection. Clinical Microbiology and Infection. 20 (12), 1323-1328 (2014).
- Wilcox, M. H., et al. Bezlotoxumab for prevention of recurrent Clostridium difficile infection. The New England Journal of Medicine. 376 (4), 305-317 (2017).
- Leuzzi, R., Adamo, R., Scarselli, M. Vaccines against Clostridium difficile. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 10 (6), 1466-1477 (2014).
- Ghose, C., Kelly, C. P. The prospect for vaccines to prevent Clostridium difficile infection. Infectious Disease Clinics of North America. 29 (1), 145-162 (2015).
- Henderson, M., Bragg, A., Fahim, G., Shah, M., Hermes-DeSantis, E. R. A review of the safety and efficacy of vaccines as prophylaxis for Clostridium difficile infections. Vaccines. 5 (3), Basel. (2017).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Delehanty, J. B., Ligler, F. S. Method for printing functional protein microarrays. BioTechniques. 34 (2), 380-385 (2003).
- Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 27 (Unit 27) 21 (2013).
- Huang, Y., Zhu, H. Protein array-based approaches for biomarker discovery in cancer. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 15 (2), 73-81 (2017).
- Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
- Bacarese-Hamilton, T., Mezzasoma, L., Ardizzoni, A., Bistoni, F., Crisanti, A. Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays. Journal of Applied Microbiology. 96 (1), 10-17 (2004).
- Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).
- Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection. Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).
- Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 30, 21-27 (2016).
- Crompton, P. D., et al. A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6958-6963 (2010).
- Khodakov, D. A., et al. An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV. BioTechniques. 44 (2), 241-246 (2008).
- Ryabinin, V. A., et al. Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus. PLoS One. 6 (4), 17529 (2011).
- Zhu, H., et al. Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).
- Cleton, N. B., et al. Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers. PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580 (2015).
- Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies. PLoS One. 8 (9), 73842 (2013).
- Zhou, F., et al. Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection. Scientific Reports. 5, 15349 (2015).
- Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data. Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).
- Monaghan, T. M., et al. Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis. PLoS One. 8 (9), 74452 (2013).
- Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. Current microarray surface chemistries. Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).
- Wellhausen, R., Seitz, H. Facing current quantification challenges in protein microarrays. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, article ID 831347 (2012).
- Guo, A., Zhu, X. -Y. The critical role of surface chemistry in protein microarrays. Functional Protein Microarrays in Drug Discovery. , CRC Press. Boca Raton. (2007).
