Summary
Este artigo descreve um método de microarray de proteína simples para perfilação humorais respostas imunes a um painel de 7-plex de altamente purificado antígenos de Clostridium difficile em soros humanos. O protocolo pode ser estendido para a determinação de respostas de anticorpos específicos em preparações de imunoglobulina intravenosa policlonal.
Abstract
Nós fornecemos uma visão detalhada de um ensaio de microarray de romance da elevado-produção de proteínas para a determinação de antiníveis de anticorpos deClostridium difficile em soros humanos e em preparações separadas de polyclonal imunoglobulina intravenosa (IVIg). O protocolo descreve as etapas metodológicas envolvidas na preparação de amostra, impressão de matrizes, procedimento de ensaio e análise de dados. Além disso, este protocolo pode ser desenvolvido para incorporar diversas amostras clínicas incluindo plasma e sobrenadantes. Mostramos como proteína microarray pode ser usado para determinar uma combinação de isotipo (IgG, IgA, IgM), subclasse (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), e anticorpos específicos de estirpe altamente purificado toda c. difficile toxinas A e B (toxinotype-0, estirpe VPI ribotype 10463, 087), toxina B de uma c. difficile toxina B-somente expressando estirpe (CCUG 20309), uma forma de precursor de um fragmento B da toxina binária, pCDTb, proteínas de toda a superfície da camada de ribotype específicos (SLPs; 001, 002, 027) e controle de proteínas (tétano tetânico e Candida albicans). Durante o experimento, microarrays são analisados com soros de indivíduos com infecção por c. difficile (CDI), os indivíduos com fibrose cística (CF), sem diarreia, controles saudáveis (HC) e de indivíduos pré e post-IVIg terapia para o tratamento de transtorno de imunodeficiência combinada, CDI e polyradiculopathy desmielinizante inflamatória crônica. Encontramos diferenças significativas de eficácias de neutralização de toxina e níveis de anticorpos específicos de multi-isotipo entre grupos de pacientes, preparações comerciais de IVIg e sera antes e após a administração IVIg. Além disso, há uma correlação significativa entre microarray e ensaio imunoenzimático (ELISA) para os níveis de IgG antitoxina em amostras de soro. Estes resultados sugerem que microarray pode se tornar uma ferramenta promissora para o perfilamento respostas de anticorpos para antígenos de c nos seres humanos infectados ou vacinados. Com mais refinamento de painéis de antígeno e uma redução nos custos de produção, prevemos que tecnologia microarray pode ajudar a otimizar e selecione as imunoterapias mais clinicamente útil para c. difficile infecção de forma paciente específico.
Introduction
Este protocolo descreve o desenvolvimento e validação de um ensaio de microarray de proteína romance e personalizado para a deteção e a quantificação semi da estirpe bacteriana e respostas específicas do isotipo do anticorpo aos antígenos de c. difficile . Utilizamos com êxito o nosso c. difficile-ensaio de microarray específico como uma nova ferramenta promissora para a Bioanálise composicional de conteúdo de anticorpos específicos no soro dos doentes1,2, preparações de IVIg3, e identificação das especificidades de anticorpos que correlacionam com resultados pobres em CDI4. Demonstramos como amostras de soro biobanked e preparações comerciais de IVIg podem ser analisadas em slides de microarray, permitindo alta qualidade reprodutível caracterização das respostas de anticorpos específicos do patógeno c. difficile neste ensaio.
Muitas crianças saudáveis e adultos têm anticorpos IgG e IgA detectável soro c. difficile toxinas A e B5,6. Estes são pensados para surgir na sequência de exposição transitória durante a infância e após a exposição a c. difficile na idade adulta. Por esta razão, IVIg policlonal tem sido utilizado off-label para tratar recorrentes e fulminante CDI7,8,9. No entanto, seu papel definitivo e modo de ação ainda não está claro. Vários estudos têm mostrado que a resposta imune humoral a c. difficile toxinas desempenha um papel na apresentação da doença e dos resultados. Especificamente, pacientes assintomáticos mostram uma aumento anti-toxina IgG A concentração sérica comparada aos pacientes que desenvolvem doença sintomática10. Relatou-se uma associação demonstrável para títulos de IgG A anti-toxina medianos e mortalidade 30 dias11. Vários relatórios também revelaram uma associação com uma proteção contra a recorrência e anticorpo respostas a toxina A, B e vários antígenos não-toxina (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD e proteínas da camada superficial (SLPs))12,13 , 14 , 15. estas observações têm estimulado o desenvolvimento da primeira imunoterapia passiva droga alvo c. difficile toxina B (bezlotuxumab), que recentemente foi aprovado pelo Food e Drug Administration e os medicamentos Europeu Agência para a prevenção da recorrente CDI16. Estratégias de vacinação usando toxinas inactivadas ou fragmentos de toxina recombinante também estão atualmente sob desenvolvimento17,18,19. Estas novas abordagens terapêuticas, sem dúvida, irão estimular a exigência de avaliação humorais respostas imunes aos antígenos múltiplos em tamanhos de amostra grande.
Hoje, há uma notável falta de ensaios comercialmente disponíveis de alta produtividade capaz de avaliar simultaneamente a estirpe bacteriana e respostas específicas do isotipo do anticorpo aos antígenos de c. difficile . Há uma necessidade não atendida de desenvolver tais ensaios para facilitar os esforços de investigação futuras e aplicações clínicas. Os microarrays da proteína são um método para imobilizar um grande número de proteínas purificadas individualmente como uma matriz espacialmente organizada de pontos sobre uma superfície com base em slide microscópica por meio de um sistema robótico, que pode ser um contato20 ou um contato não- 21. ferramenta da impressão. As manchas podem representar misturas complexas como lisados celulares, anticorpos, tecido homogenates, proteínas endógenas ou recombinantes ou peptídeos, fluidos corporais ou drogas22,23.
Tecnologia de microarray de proteína oferece vantagens distintas sobre ELISA in-house padrão técnicas, que tem sido tradicionalmente usadas para avaliar as respostas de anticorpos dec. difficile anti. Estes incluem um aumento da capacidade para a detecção de uma gama de multi-específicas do isotipo anticorpos contra um painel mais amplo de alvos de proteína, requisitos de volume reduzido de antígenos, amostras e reagentes e a capacidade avançada de incorporar uma maior número de repetições de técnicas, além de controle de qualidade interno múltiplo (QC) mede1. Microarrays são, portanto, mais sensíveis, precisos e reprodutíveis e têm uma maior gama dinâmica. Esses fatores tornam microarrays uma alternativa mais barata e potencialmente favorável para ELISA para a detecção em larga escala de proteínas conhecidas. No entanto, as desvantagens da tecnologia microarray resultam principalmente os grandes custos adiantados associados com o estabelecimento de um painel de antígenos altamente purificados e criação de plataforma tecnológica.
Os microarrays da proteína têm sido extensivamente usados nas últimas duas décadas como ferramenta de pesquisa básica e diagnóstico em aplicações clínicas. Aplicações específicas incluem a expressão da proteína de perfil, o estudo das relações de enzima-substrato, triagem de biomarcador, análise das interações do anfitrião-micróbio e criação de perfil de anticorpo especificidade23,24, 25de27,,26,28. Muitos novo patógeno/antígeno da proteína microarrays foram estabelecidos, incluindo malária (Plasmodium)29, HIV-130, gripe31, síndrome respiratória aguda grave (SARS)32, febre hemorrágica viral33 , herpesviruses,34e tuberculose35.
O presente protocolo refere-se ao estabelecimento de um fácil funcionamento C. difficile antígeno reativa microarray do ensaio, que permite a quantificação, precisa e específica de multi-isotype e respostas de anticorpos específicos de estirpe de C. difficile antígenos em soros e policlonal IVIg. Neste documento, que incluem resultados representativos referentes a um desempenho aceitável do microarray quando comparado com ELISA, bem como a precisão do ensaio e a reprodutibilidade perfis. Este ensaio poderia ser desenvolvido para o perfil de outras amostras clínicas e define um novo padrão para a investigação sobre a base molecular do CDI.
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Protocol
1. preparar um prato de Microarray
- Diluir a antígenos de c. difficile com um buffer de impressão [PBS-Tween-trealose (50mm)] para a concentração ideal (que foi predefinida antes de executar o paciente sera): toxina um (200 µ g/mL) e toxina B (100 µ g/mL), pCDTb (200 µ g/mL) e purificado nativo SLPs todo derivado ribotypes 001, 002 e 027 (200 µ g/mL).
Nota: Toxina B foi obtida uma toxina B-expressando estirpe CCUG 20309 (90 µ g/mL).- Dilua os controles positivos, lysates de c. albicanse toxoide tetânico com o buffer de impressão de 100 µ g/mL. Finalmente, dilua a imunoglobulina humana purificada, combinando o isotipo do anticorpo testado em série, começando com 50 µ g/mL em 10 diluições no buffer de impressão para criar uma curva de calibração.
- Transferi 10 µ l de diluições no buffer de impressão em uma placa de 384.
- Cubra o prato com um selo de placa e centrifugar 300 x g por 5 min.
2. impressão matrizes com um robô contato
- Calor o pino de silício usando o queimador de gás portátil 3 x 2 s e enxaguar em água limpa 3 x 3 s cada.
- Coloque a placa de microarray dentro do cartucho de carregamento da arrayer.
- Coloque as lâminas de aminosilane sobre a bandeja de slide.
Nota: O tabuleiro de slide pode segurar 27 slides: três linhas de nove slides. Os slides estão dispostos em orientação retrato, a partir do lado esquerdo da linha de fundo e o resto dos espaços são cobertos com slides em branco para garantir que todos os furos da bandeja de slide são cobertos.- Pressione Okey e verifique se um vácuo foi ligado e todos os slides são seguros. Deixe os slides no ambiente úmido pelo menos 1h antes de iniciar a impressão.
Nota: Os slides aminosilane são fornecidos em uma bolsa selada com dessecante. Uma vez aberto, qualquer slides não utilizadas devem ser imediatamente devolvidos exsicador para armazenamento até a data de validade.
- Pressione Okey e verifique se um vácuo foi ligado e todos os slides são seguros. Deixe os slides no ambiente úmido pelo menos 1h antes de iniciar a impressão.
- Configure o programa de impressão adequado para imprimir antígenos do Clostridium difficile . Lançamento da suíte de aplicativos de TAS e abra o arquivo de parâmetros de execução necessários cópia do diretório 'My Gridding de pistas'. Selecione o arquivo de Clostridium difficile para imprimir todos os antígenos de Clostridium difficile em quadruplicado.
- Após a clicando duas vezes no ícone do MicroArray na janela principal, uma janela com três guias aparecerá chamado 'parâmetros de MicroArraying'. As três guias são a "Fonte", "Destino" e "Opções". Na guia "Fonte" mostra detalhes do número de amostras utilizadas na placa de microarray. Na guia "Alvo" mostra detalhes de como os slides estão a ser carregado, onde a matriz deve ser impresso no slide e editar o layout do slide (16 subarray formatos). Na guia "Opções" mostra detalhes do protocolo de lavagem e ferramenta a ser usada, por exemplo. lavar depois de cada amostra concluída. Limpe o pino de silício entre amostras para evitar qualquer contaminação cruzada entre amostras diferentes.
- As opções de programação estão localizadas em Opções > Preferências executar na barra de ferramentas TAS Application Suite. Existem 9 abas para trabalhar através desta seção e como você uma guia completo mover para o próximo, clicando sobre ela. Clicar o botão "Okey" irá levá-lo fora "Preferências de execução". Na aba "Geral" das preferências do"Run", há um número de caixas de seleção disponíveis sob esta secção relativa à como o instrumento irá se comportar quando um programa é iniciado. Marque a caixa "Banho Prime antes início de execução", todas as estações de lavagem três passará por uma sequência de escorva curto antes do início da execução. Marque a caixa "Lavar no início da corrida", a ferramenta de pin será lavada antes de visitar a primeira fonte. Verifique a caixa de "Lavagem final de execução", a ferramenta de pin será lavada após a última fonte de visita. O usuário pode definir o número de ciclos de lavagem. Na aba "Clima" das preferências do"Run", comece a humidificação. A configuração que usamos são os seguintes: começar a taxa de 55%, execute alvo umidade 60%, umidade mínima de 55%, taxa de 55%. Não comece a correr até que chegou-se a umidade do alvo, caso contrário as manchas serão o tamanho errado e a biblioteca evaporará rapidamente.
- Na barra do menu de TAS, clique o botão verde e vá. Começar a correr e periodicamente observar o arrayer durante a tiragem ser certos tudo é Okey.
Nota: Isto permite a análise de 15 amostras em paralelo em cada slide como um subarray é usado como um controle negativo. O design de subarrays é determinado pelo número das proteínas (antígenos) impressos e o número do impresso biológico Replica.
Nota: Após a impressão de cada amostra, a cabeça se move em direção os banhos de lavagem para permitir que múltiplos mergulhando do pino dois banhos de lavagem com água destilada e 0,002% Tween 20 para 1.5 s em cada banho, seguido de enxaguar o pino com água ultra-pura e secagem o pino na a estação de lavagem de 4 s.
3. armazenamento das matrizes
- Manter os slides impressos armazenados durante a noite à temperatura ambiente no exsicador.
Nota: Os slides impressos podem ser armazenados por até uma semana.
4. matriz de sondagem
- Coloque cuidadosamente slides impressos em um suporte de corrediça de formato 16 câmaras multi bem.
Nota: As câmaras, tendo uma profundidade de aproximadamente 7,5 mm, proporcionam uma superfície generosa à relação do volume para facilitar a mistura e etapas de lavagem. - Permitir que todos os reagentes aquecer a temperatura ambiente antes do uso. A menos que especificado de outra forma, execute todas as etapas a seguir à temperatura ambiente.
- Adicione 100 µ l de filtrado tween 5% albumina de soro bovino (BSAT; use um filtro de seringa 0,2 µm) para cada bloco, cobrir os slides e incube-os com agitação por 1h.
- Lave os slides 5 x 1 min cada em 120 µ l de tampão fosfato salino com Tween 20 (PBST; 0,1% Tween) por alvéolo com agitação. Não deixe os slides dessecar.
- Descongelar as amostras de soro no gelo por 20 min e diluir cada amostra com um diluente de anticorpo comercialmente disponível com fundo reduzindo o componente (ver Tabela de materiais).
- Otimize a diluição das amostras de soro, de acordo com a imunoglobulina testada conforme mostrado na tabela 2.
- Transferir 100 µ l das amostras de soro diluído para todos os blocos, exceto um, que será usado como um controle negativo; a este bairro, adicione 100 µ l de diluente de anticorpo só. Incube as lâminas com agitação suave por 1h.
- Lave os slides 5 x 3 min cada em 120 µ l de PBST (0.1% Tween) por alvéolo com agitação.
- Adicione 100 µ l de um biotinilado de anti-humano cabra diluído com diluente de anticorpo.
- Otimize a diluição do anticorpo secundário de acordo com a imunoglobulina testado conforme descrito na tabela 2. Cobrir os slides e incube-os com agitação suave por 1h.
- Lave os slides 5 x 3 min cada em 120 µ l de PBST por alvéolo com agitação.
- Adicione 100 µ l de estreptavidina Cy5 para cada bloco diluído a 1: 2000 em 5% BSA. Cobrir os slides com papel alumínio para protegê-los de luz, enquanto a agitação por 15 min com agitação suave.
- Lave os slides 5 x 1 min cada em 120 µ l de PBST por alvéolo com agitação, seguido por 2 lavagens de 1 min cada em PBS apenas com agitação.
- Gire as lâminas durante 5 min à 300 g x para secá-las.
- Mantenha os slides em uma caixa escura para transporte e armazenamento à temperatura ambiente.
- Proceda para digitalizar as matrizes imediatamente para garantir a consistência do sinal após a sondagem.
Nota: No entanto, sondados slides podem ser armazenados no escuro e digitalizados dentro de uma semana de sondagem.
5. as matrizes de digitalização
- Ligue o scanner a laser (ver Tabela de materiais) 30 min antes da digitalização para aquecer o laser. Carregar o software do scanner e conectar o computador ao scanner.
- Coloque um slide com o lado impresso face para cima no scanner até o jogo de luz fica verde.
- Pressione o botão de configurações e ajustar as configurações a seguir ao digitalizar slides da seguinte forma: modo Scan, mediana; Aquisição, 635 Modo de aquisição, Manual; Ganho, 20; Poder, baixo; Tipo de slide, Slide sem rótulo; Foco, foco automático. Desativar a rolagem automática e definir Barcode Reading Pixel tamanho 10 e 35 Scan.
- Salve as imagens resultantes como cinza de 16 bits vários formato de imagem TIFF. Pressione o botão de Importação de grade e selecione a lista matriz apropriada.
Nota: A lista de matriz descreve o tamanho e a posição de subarrays e os nomes das substâncias impressos associados com cada recurso-indicador.- Alinhe a grade para as manchas no slide.
- Analise as imagens pressionando o botão de processo de quantificação para medir as intensidades do sinal de fluorescência de cada ponto e salvar os resultados em um formato de texto chamado GenePix resultados (GPR).
Nota: O arquivo GPR contém as variáveis de localização e identificação dos alvos do antígeno na matriz e também a intensidade da fluorescência mediano e o fundo local que representa a ligação do anticorpo sinal valores de cada ponto.
6. análise de dados
- Calcule a mediana para as repetições de cada antigénio após subtracção de fundo usando um software de análise de microarray gratuito chamado analisador de fase reversa proteína matriz (RPPA), um módulo dentro a linguagem estatística R em CRAN36.
- Traçar a curva padrão e interpolar os sinais de cada antígeno em relação a curva de imunoglobulina padrão usando gráficos científicos comercial e software de estatísticas (ver Tabela de materiais) para calcular os níveis de anticorpos.
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Representative Results
A Figura 1 ilustra um fluxograma descrevendo as etapas principais no protocolo descrito. A Figura 2 mostra testes de correlação de Spearman demonstrando acordo significativo entre microarray e ELISA IgG e IgA antitoxina A e B os níveis no paciente teste sera. A Figura 3 mostra diferencial IgG e IgA de anticorpo-classe respostas de anticorpos específicos para A toxina, toxina B e toxina binária (pCDTb) em pacientes com FC sem diarreia, CDI pacientes com diarreia e no HC. A Figura 4 mostra a antitoxina de c. difficile , neutralizando as respostas de anticorpos em soros de pacientes. A Figura 5 mostra a reatividade imune (contra c. difficile toxinas e SLPs) e efeito neutralizante (contra c. difficile toxinas) de IVIg. A Figura 6 mostra a reatividade imune (contra c. difficile toxinas e SLPs) e efeito neutralizante (contra c. difficile toxinas) do paciente sera pré e post-IVIg administração. A tabela 1 mostra aceitáveis intra e inter assay coeficientes de variabilidade de microarray usando soros teste. A tabela 2 ilustra uma lista de imunoglobulinas utilizado neste estudo com concentrações relevantes de proteínas purified, bem como diluições otimizadas para soros e anticorpos secundários.
Figura 1 : Visão geral das principais etapas envolvidas no protocolo de microarray. O primeiro passo é a preparação dos antígenos e controles. As diluições da amostra subsequentes são transferidas para uma placa 384 em prontidão para impressão em quadruplicates sobre as guias de aminosilane. Após secagem e bloqueio de slides, as matrizes são incubadas com o soro dos doentes. Depois de lavar ainda mais, a imunoglobulina anti-humana biotinilado (Ig) do isotipo especificado é adicionada. Após a lavagem final e as etapas de secagem, os slides são digitalizados e as resultantes imagens processadas com um software de análise de imagem de microarray. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Correlação entre os resultados de ELISA e de microarray. O coeficiente de correlação de Spearman foi utilizado para avaliar o nível de acordo entre as duas plataformas. Ao comparar o desempenho de microarray com um ensaio in-house imunoenzimático (ELISA), A. um bom coeficiente de correlação foi observado para a toxina A (r = 0.7051; P < 0,0001), B. e moderadamente boa correlação para toxina B (r = 0.5809; P < 0,0001). O protocolo completo de ELISA foi detalhada em outro lugar37. Esta figura foi reimpresso de Negm et al 1 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: respostas específicas do isotipo do anticorpo Clostridium difficile toxinas. Esta imagem semeia os soro anti-toxina IgG e IgA respostas (toxinotype-0, estirpe VPI 10463, ribotype 087; toxina A 200 µ g/ml, toxina B a 100 µ g/mL), toxina B (c. difficile toxina B-produzindo tensão CCUG 20309; toxina B 90 µ g/ml) e a forma de precursor de um B fragmento de toxina binária, pCDTb (200 µ g/mL), em pacientes com fibrose cística (CF), sem diarreia, pacientes com infecção por c. difficile (CDI) com diarreia e em controles saudáveis (HC). A diluição do soro para IgG e IgA são 1: 500 e 1: 100, respectivamente. As diferenças entre os grupos foram avaliadas usando o teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste post hoc de Dunn para várias respostas. Comparado com o HC (n = 17) e os pacientes com CDI sintomático (n = 16), os pacientes adultos de CF (n = 16) apresentaram níveis significativamente mais elevados de soro de IgA antitoxina A e níveis de B; ≤0.05 P . O mesmo padrão prevaleceu para IgG, exceto que não houve diferença nos níveis A IgG antitoxinas entre os grupos. As parcelas caixa e whisker representam a mediana, intervalo e quartis. P ≤0.0001; P ≤0.01; ≤0.05 P . Os sinais padronizados são normalizados para a curva padrão de imunoglobulina. Esta figura foi reimpresso de Monaghan et al 2 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: eficácias de anticorpo neutralizando a c. difficile toxinas A e B, no soro dos pacientes. Esta figura mostra o anticorpo neutralizante protetora (NAb) respostas para c. difficile toxinas A e B [toxinotype 0, estirpe VPI 10463, ribotype 087, usado na dose letal 50% (DL50)] no sera (diluição 1: 100; toxina A 2,5 ng/mL, toxina B 0,5 ng/mL) do HC , os pacientes com FC sem diarreia e os pacientes com CDI com diarreia. Os soros de pacientes com FC exibiram significativamente mais fortes respostas NAb anti-toxina protetoras, em comparação com o sera o HC (toxinas A e B) e de pacientes com CDI (toxina). As diferenças entre os grupos foram avaliadas usando o teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste post hoc de Dunn para várias respostas. As parcelas caixa e whisker representam a mediana, intervalo e quartis. P ≤0.01; ≤0.05 P . Esta figura foi reimpresso de Monaghan et al 2 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Reatividade imune e neutralizar o efeito de IVIg para antígenos de c . R. esta imagem mostra a reatividade de multi-isotipo anticorpos específicos para antígenos de c. difficile em preparações comerciais de imunoglobulina intravenosa (IVIg). O mapa de calor ilustra os níveis de isotipos de anticorpos específicos (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2 e IgM) em três preparações comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais) contra antígenos de c. difficile sete [toxina um (200 µ g /mL), toxina B (100 µ g/mL), pCDTb (200 µ g/mL), toxina B (CCUG 20309; 90 µ g/mL) e proteínas de camada (SLPs) 001, 002 e 027 (todas de 200 µ g/mL) de superfície] usando tecnologia microarray de proteína. O código de cores do mapa calor é a seguinte: verde (baixo), a intensidade de sinal vermelho (alta). Os valores de sinal representados na escala de cor para o mapa de calor são log2-transformado a partir de unidades arbitrárias de fluorescência (AFU). Por favor nota que o AFU mais recentemente foi substituído pelo descritor padronizado sinaliza2. Os totais isotipos IgG, IgG1 e IgG2 deram as maiores reatividades ligação contra a toxina A, toxina B, toxina binária (pCDTb) e toxina B (CCUG 20309). B. estes gráficos mostram a eficácia de neutralização do IVIg contra o nativo c. difficile toda as toxinas A e B. Eles dão o percentual do efeito protetor da neutralização de produtos comerciais de IVIg contra c. difficile toxinas A e B. Cada parcela representa a mediana dos experimentos triplicadas na diluição de 1: 100. Preparação de IVIg 1 exibe o menor efeito protetor em relação às preparações de IVIg 2 e 3, particularmente contra a toxina r. * * * P ≤0.0001; P ≤0.05 (análise de variância One-Way). Esta figura foi modificada de Negm et al 3 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Reatividade imune e neutralizar o efeito do soro do paciente aos antígenos de c. difficile . R. esta figura mostra uma comparação de reatividades de anticorpos contra as proteínas c. difficile no soro dos pacientes antes e após a infusão de IVIg. O mapa de calor ilustra o nível de expressão dos isotipos (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2 e IgM) em amostras de soro em sete pacientes, antes e após a infusão de IVIg contra antígenos de c. difficile sete [toxina um (200 µ g/mL), a toxina B (100 µ g / mL), pCDTb (200 µ g/mL), toxina B (CCUG 20309; 90 µ g/mL) e SLPs 001, 002 e 027 (todas de 200 µ g/mL)] usando tecnologia microarray de proteína. O código de cores do mapa calor é a seguinte: verde (baixo), a intensidade de sinal vermelho (alta). Os valores de sinal representados na escala de cor para o mapa de calor são log2-transformado a partir da AFU. Por favor, note que o AFU mais recentemente tem sido substituído por sinais padronizados2. Houve um aperfeiçoamento pós-infusão das reatividades IgG, IgG1, IgG2 e IgG3 totais a toxina toxina B e pCDTb. B. esta imagem mostra as respostas de IgG a toxina A, toxina B e toxina binária (pCDTb), pré e post-IVIg administração. Os níveis de IgG totais contra todas as toxinas aumentam de forma significativa após a administração de IVIg (usando o teste de Wilcoxon rank-assinado). Cada parcela representa a mediana das experiências triplicadas em 01:10 diluição. C. estes gráficos mostram o efeito de neutralização contra nativos c. difficile toxinas A e B após a administração de IVIg. Uma comparação do pré e pós-infusão atividades de anticorpos neutralizantes mostra um efeito de protecção reforçado após as infusões de IVIg contra o nativo c. difficile toxinas A e B. Cada parcela representa a mediana das experiências triplicadas em 01:10 diluição. Observou-se um aumento significativo do efeito protetor contra as toxinas A e B na infusão de soros de doentes testados post-IVIg (usando o teste de Wilcoxon rank-assinado). Esta figura foi reimpresso de Negm et al. 3 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reprodutibilidade | Toxina A | Toxina B | SLP001 | SLP002 | SLP027 | Toxina B CCUG 20309 | b pCDT |
| Intraensaio | 7,70% | 6,40% | 7,40% | 5.10% | 7,60% | 7% | 3,70% |
| Inter-ensaio | 9.10% | 9.10% | 7,40% | 11,20% | 12,8 | 9,70% | 12,50% |
Tabela 1: precisão intra-ensaio e inter-ensaio de Microarray 1. Microarray intra e inter assay variabilities foram calculadas utilizando o sera de 7 pacientes. Amostras idênticas foram doseadas em cada um dos dois slides em dois pontos de tempo independentes. Todos os antígenos (n = 7 teste e n = 2 controles) foram vistos em repetições de cinco em cada matriz.
| Concentração da proteína purificada | Diluição do soro | Diluição de anticorpo secundário | |
| IgG | 50 μg/ml | 1/500 | 1/20000 |
| IgG1 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgG2 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/10000 |
| IgG3 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgG4 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgA | 50 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgA1 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/10000 |
| IgA2 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgM | 50 μg/ml | 1/500 | 1/20000 |
Tabela 2: lista de imunoglobulinas utilizado neste estudo. Os Igs são mostrados com as concentrações de proteína purificada relevantes (µ g/mL) e diluições de soro e anticorpos secundários.
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Discussion
Neste protocolo, mostramos que microarray é uma plataforma adequada para definir humorais respostas imunes aos antígenos de proteína c. difficile em soros de doentes (figuras 3 e 6) e preparações comerciais de IVIg (Figura 5). Nós também têm demonstrado que a técnica de microarray executa bem em comparação com o ELISA convencional (Figura 2) e mostra excelente reprodutibilidade, com intra e inter assay variabilities caindo dentro de limites aceitáveis de precisão ( Tabela 1).
Passos críticos:
Um número de passos críticos deve ser seguido durante a criação de qualquer plataforma de microarray de sucesso do antígeno. Inicialmente, é extremamente importante executar experiências QC. Nas experiências de QC, devem ser avaliados diferentes parâmetros, tais como a seleção da química de superfície adequada, buffers de impressão, buffers de bloqueio, as diluições de amostras de soro e os anticorpos secundários. Estas experiências devem ser realizadas com o objetivo de fornecer uma técnica confiável e bem validados38,39.
A seleção de um processo de imobilização de proteína adequada é um dos passos mais importantes na análise de microarray, para garantir um desempenho de alta qualidade dos slides aminosilane testado, como visto neste estudo. É fundamental observar a morfologia local regular e circular, intensidade de sinal elevado e específico e um fundo claro. Outro fator que afetam o desempenho de microarray é o buffer de impressão, que é igualmente importante para alcançar a desejado química de superfície para produzir spots uniformes e regulares no slide.
É importante selecionar as configurações corretas para impressão, que permitirá o tamanho ideal e a forma de um ponto a ser impresso. Por exemplo, o nível de umidade deve ser mantido ao redor 55% durante a impressão, porque sem umidade é aumentada a taxa de evaporação na câmara de microarray e menos pontos são impressos.
Emperramento da proteína não-específicos é um fator adicional que afectam a fundo e sinais especiais; Portanto, a seleção apropriada de um tampão de bloqueio poderia reduzir qualquer inespecificas, levando a melhorou a sensibilidade e a precisão dos dados matriz39.
Modificações e solução de problemas:
Antígenos e amostras de soro devem ser aliquotadas e armazenado em pequenos tubos de armazenamento no congelador até o uso, o que ajuda a evitar repetido vários ciclos de gelo-degelo, que podem deteriorar-se a força do sinal da matriz. Para aumentar as chances de uma experiência bem sucedida, todos os reagentes devem ser preparados frescos e ser filtrados. Limpeza do arrayer antes da impressão e verificando que as configurações são necessárias. Além disso, o titular de slide deve ser mantido limpo para minimizar o ruído de fundo.
Limitações:
O aplicativo de microarrays da proteína atualmente é dificultado pela demanda rigorosa na química de superfície na fabricação de microarray de proteína. Aqui a grande variação nas propriedades físicas e químicas das moléculas de proteína exige costume-design exclusiva química de superfície para diferentes classes de moléculas de proteína e anticorpos40. Outros desafios técnicos que a implementação generalizada de tal tecnologia incluem a necessidade de caros equipamentos especializados e software com Banco-espaço alocado, bem como a consideração de encargos de manutenção, análise de dados complexos, parente quantificação da proteína e criticamente acesso aos antígenos purificados.
Importância do método em relação a métodos existentes/alternativa:
Tecnologia microarray é similar em princípio ao ELISA, Meso escala descoberta ou imunoensaios Luminex, mas é personalizável, pode ser ampliada para atingir o poder estatístico, baseia-se na única microlitro quantidades de amostras preciosas e tem a capacidade de soros de tela para múltiplos reatividades de proteína. Portanto, é particularmente adequado para os bancos de soro em grande escala, histórico e descoberta de biomarker e triagem.
Futuras aplicações ou indicações do método:
Os esforços futuros serão direcionados no sentido de otimizar o ensaio para outras amostras (sobrenadantes de células), usando o ensaio como uma ferramenta de prognóstica para o paciente, estratificação, externamente Validando biomarcadores potenciais usando grandes coortes de forma duplo-cego, e prevendo e otimizando a resposta à imunoterapia (mAb, vacinas). No futuro, a tecnologia microarray pode ser usada em um ambiente hospitalar, como uma ferramenta de diagnóstico útil ou para monitorar um plano de tratamento de drogas durante um período de tempo.
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa Hermes Ola Negm e Tanya Monaghan e através de financiamento separado do centro de doenças digestivas de Nottingham e a NIHR Nottingham digestivo doenças Biomedical Research Centre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobotics MicroGrid II arrayer | Digilab, Malborough, MA, USA | N/A | Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides. |
| Scanner InnoScan 710. | Innopsys | N/A | A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction. |
| MAPIX software version 7.2.0 | Innopsys | N/A | Measure signal intensities of the spots. |
| Silicon contact pin | Parallel Synthesis Technologies | SMT-P75 | Print the samples onto the slides. |
| Thermo Scientific Nalgene Desiccator | Thermo Scientific | 41102426 | To store the new and printed slides. |
| 384-well plate | Genetix | X7022UN | To prepare the antigens. |
| Plate cover | Sigma Aldrich, UK | CLS6570-100EA | To reduce evaporation of the samples. |
| Aminosilane slides | Schott, Germany | 1064875 | The slide of choice for printing the antigens. |
| Slide holders | GraceBio Labs, USA | 204862 | Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells . |
| Candida albicans lysate | NIBSC | PR-BA117-S | Positive control |
| Tetanus Toxoid | Athens Research and Technology | 04/150 | Positive control |
| Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707 | Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-1 | Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-2 | Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-3 | Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-4 | Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma. |
| Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701 | Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-1M | Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-2M | Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma. |
| Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090713 | Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma. |
| Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific | Vector Labs | BA-3080 | Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9052-08 | Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT | Southern Biotec | 9060-08 | Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9210-08 | Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT | Southern Biotec | 9190-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - Biotinylated | Vector Labs | BA-3030 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA1-BIOT | Southern Biotec | 9130-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA2-BIOT | Southern Biotec | 9140-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgM-BIOT | Southern Biotec | 9020-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| 0.2 mm syringe filter | Thermo scientific | 723-2520 | Filter the 5% BSA. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, UK | A7284 | Use 5% BSA for blocking the slides. |
| Antibody diluent | Dako, UK | S3022 | To dilute the serum and the secondary antibody. |
| Streptavidin Cy5 | eBioscience | SA1011 | Detection of the immune reaction. |
| Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb | University of Bath | NA | Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70) |
| Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins | Dublin City University | NA | |
| Vigam (IVIg preparation 1) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Privigen (IVIg preparation 2) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Intratect (IVIg preparation 3) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A |
References
- Negm, O. H., et al. Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).
- Monaghan, T. M., et al. High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection. Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).
- Negm, O. H., et al. Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration. Clinical & Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).
- Monaghan, T., et al. OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection. Gut. 66, Suppl. 2 31 (2017).
- Bacon, A. E. Immunoglobulin G directed against toxins A and B of Clostridium difficile in the general population and patients with antibiotic-associated diarrhea. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 18 (4), 205-209 (1994).
- Viscidi, R., et al. Serum antibody response to toxins A and B of Clostridium difficile. The Journal of Infectious Diseases. 148 (1), 93-100 (1983).
- Salcedo, J., et al. Intravenous immunoglobulin therapy for severe Clostridium difficile colitis. Gut. 41 (3), 366-370 (1997).
- Abougergi, M. S., Kwon, J. H. Intravenous immunoglobulin for the treatment of Clostridium difficile infection: a review. Digestive Diseases and Sciences. 56 (1), 19-26 (2011).
- Shah, N., Shaaban, H., Spira, R., Slim, J., Boghossian, J. Intravenous immunoglobulin in the treatment of severe Clostridium difficile colitis. Journal of Global Infectious Diseases. 6 (2), 82-85 (2014).
- Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A. The New England Journal of Medicine. 342 (6), 390-397 (2000).
- Solomon, K., et al. Mortality in patients with Clostridium difficile infection correlates with host pro-inflammatory and humoral immune responses. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 9 1453-1460 (2013).
- Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea. Lancet. 357 (9251), 189-193 (2001).
- Leav, B. A., et al. Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium difficile infection (CDI). Vaccine. 28 (4), 965-969 (2010).
- Drudy, D., et al. Human antibody response to surface layer proteins in Clostridium difficile infection. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 41 (3), 237-242 (2004).
- Bauer, M. P., Nibbering, P. H., Poxton, I. R., Kuijper, E. J., van Dissel, J. T. Humoral immune response as predictor of recurrence in Clostridium difficile infection. Clinical Microbiology and Infection. 20 (12), 1323-1328 (2014).
- Wilcox, M. H., et al. Bezlotoxumab for prevention of recurrent Clostridium difficile infection. The New England Journal of Medicine. 376 (4), 305-317 (2017).
- Leuzzi, R., Adamo, R., Scarselli, M. Vaccines against Clostridium difficile. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 10 (6), 1466-1477 (2014).
- Ghose, C., Kelly, C. P. The prospect for vaccines to prevent Clostridium difficile infection. Infectious Disease Clinics of North America. 29 (1), 145-162 (2015).
- Henderson, M., Bragg, A., Fahim, G., Shah, M., Hermes-DeSantis, E. R. A review of the safety and efficacy of vaccines as prophylaxis for Clostridium difficile infections. Vaccines. 5 (3), Basel. (2017).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Delehanty, J. B., Ligler, F. S. Method for printing functional protein microarrays. BioTechniques. 34 (2), 380-385 (2003).
- Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 27 (Unit 27) 21 (2013).
- Huang, Y., Zhu, H. Protein array-based approaches for biomarker discovery in cancer. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 15 (2), 73-81 (2017).
- Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
- Bacarese-Hamilton, T., Mezzasoma, L., Ardizzoni, A., Bistoni, F., Crisanti, A. Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays. Journal of Applied Microbiology. 96 (1), 10-17 (2004).
- Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).
- Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection. Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).
- Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 30, 21-27 (2016).
- Crompton, P. D., et al. A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6958-6963 (2010).
- Khodakov, D. A., et al. An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV. BioTechniques. 44 (2), 241-246 (2008).
- Ryabinin, V. A., et al. Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus. PLoS One. 6 (4), 17529 (2011).
- Zhu, H., et al. Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).
- Cleton, N. B., et al. Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers. PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580 (2015).
- Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies. PLoS One. 8 (9), 73842 (2013).
- Zhou, F., et al. Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection. Scientific Reports. 5, 15349 (2015).
- Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data. Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).
- Monaghan, T. M., et al. Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis. PLoS One. 8 (9), 74452 (2013).
- Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. Current microarray surface chemistries. Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).
- Wellhausen, R., Seitz, H. Facing current quantification challenges in protein microarrays. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, article ID 831347 (2012).
- Guo, A., Zhu, X. -Y. The critical role of surface chemistry in protein microarrays. Functional Protein Microarrays in Drug Discovery. , CRC Press. Boca Raton. (2007).
