Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

تحليل المعادن التي تنتجها هفوب 1.19 وسوس-2 الخلايا باستخدام مجهر إلكتروني مع Microanalysis الأشعة السينية المشتتة الطاقة

doi: 10.3791/57423 Published: June 24, 2018

Summary

نقدم بروتوكولا لمقارنة حالة المعادن في حويصلات صدر عن اثنين من خطوط الخلية العظام البشرية: هفوب 1.19 وسوس-2. حللت ملفاتهم التمعدن من الأليزارين الأحمر-S (ع-ق) تلطيخ، الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الخفيفة التصور والتصوير الميكروسكوب الإلكتروني (TEM) الإرسال والطاقة المشتتة الأشعة السينية سليكية (EDX).

Abstract

يعرض هذا الفيديو استخدام مجهر إلكتروني مع الطاقة المشتتة الأشعة السينية سليكية (EDX TEM) مقارنة حالة المعادن في حويصلات صدر عن اثنين من خطوط الخلية العظام البشرية: هفوب 1.19 وساوس-2. هذه خطوط الخلية، بعد العلاج مع حمض الأسكوربيك (أإ)، وبيتا-جليسيروفوسفاتي (β-GP)، الخضوع ترانسديفيرينتييشن أوستيوجينيك كاملة من انتشار التمعدن وتنتج مصفوفة حويصلات (MVs) التي تؤدي إلى نويات الاباتيت في المصفوفة خارج الخلية (ECM).

استناداً إلى تلطيخ الأليزارين الأحمر-S (ع-ق) وتحليل تكوين المعادن في الخلية ليساتيس باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) أو في حويصلات استخدام التصوير تيم تليها كوانتيتيشن EDX وتعيين أيون، يمكننا أن نستنتج أن osteosarcoma سوس-2 وأوستيوبلاستيك خلايا هفوب 1.19 تكشف عن ملامح متميزة من التمعدن. سوس-2 الخلايا طاغية أكثر كفاءة من الخلايا هفوب 1.19 وتنتج الرواسب المعدنية الكبيرة التي لا تظهر تحت الأشعة فوق البنفسجية ولكن تشبه هيدروكسيباتيت (ها) في أن لديهم بدائل أكثر من Ca وو.

النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذه التقنيات تسمح بنا إلى الاستنتاج بأن عملية تمعدن يختلف تبعاً لنوع الخلية. ونحن نقترح أن أصل وخصائص من حويصلات سلفا على المستوى الخلوي، نوع المعادن.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

العظام نوع من النسيج الضام، ويتألف من جزأين: العضوية (خلايا وألياف الكولاجين) والمعدنية (مركبات الكالسيوم والفوسفات). العناصر المعدنية الرئيسية في العظام، أباتيتيس1. أنواع مختلفة من الخلايا المختصة تمعدن في العظام (خلايا الاوستيوبلاستس) والأسنان (أودونتوبلاستس) في الغضروف (تشوندروسيتيس) تنظيم الخطوات الأولية التمعدن بإنتاج بروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) والإفراج عن مصفوفة حويصلات (MVs) (الشكل 1). MVs هي 100-300 نانومتر القطر الحويصلات التي تتراكم الكالسيوم والفوسفات تيسير التنو الاباتيت وربط الكولاجين2،3في وقت لاحق. ثم، تتفكك MVs للإفراج عن أباتيتيس إلى الوسط خارج الخلية. لا تزال أباتيتيس تنمو على اتصال بألياف الكولاجين وتشكل مصفوفة العظام. التمعدن تدعمه إمدادات ثابتة من فأنا و Ca2 + في الوسط خارج الخلية. بعض البيانات المنشورة مؤخرا الدعم لدينا نموذج4،5. لا طاغية الأنسجة الرخوة تحت الظروف الفسيولوجية. ومع ذلك، قد يحدث تكلس حمل خارج الرحم تحت الظروف المرضية مثل تكلس الأوعية الدموية3. يمكن أن تنتج خلايا الأوعية الدموية التي تحصل على النمط الظاهري osteoblast MVs حمل نويات أباتيتيس والشروع في تمعدن في طبقات الجدار الآنسي وإينتيمال من الأوعية الدموية. منذ تكلس حمل خارج الرحم تشبه endochondral العادي التمعدن3، فهم الآليات الجزيئية التمعدن العظمى الخلايا وتشوندروسيتيس ينبغي أن توفر بعض القرائن على حمل خارج الرحم تكلس الأنسجة الرخوة التي شكلت.

وينظم وضع أنسجة الهيكل العظمى الإنزيمات المختلفة، عوامل النمو، والمروجين أو مثبطات التمعدن. إجراءات معادية للأنسجة-غير محددة الفوسفاتيز القلوية (طنب) (الشكل 1) واكتونوكليوتيدي بيروفوسفاتاسي/فوسفوديستريس أنا (NPP1)، جنبا إلى جنب مع أنكيرين (عنك)، يتحكم تركيز بيروفوسفات غير العضوية (PPأنا) 6-PPأنا، مثبط قوية لتشكيل هكتار، وهي تحلل قبل تناب؛ NPP1 هيدروليزيس تريفوسفاتيس النوكليوتيدات لتشكيل PPأنا بينما الصادرات PPأنا عنك الخلية إلى إدارة المحتوى في المؤسسة. قد تنظم نسبة Pi/PPi الاباتيت تشكيل7،8 مع9من النتائج المرضية المحتملة.

هو إثراء الغشاء أم في أيون النقل البروتينات التي تيسر الترسيب الأولية من الكالسيوم والفوسفات داخل MVs أثناء عملية نويات (الشكل 1). نقل الفوسفات 1 (PiT) يساعد على إدماج فأنا ولدت في الفضاء بيريفيسيكولار إلى10،MVs11. يمكن إشراك أنيكسينس في الربط والنقل من Ca2 + وفي العملية الفيزيائية الحيوية التي يبدأ تمعدن في12،التجويف المتوسط13. أننا نفضل الفرضية، اقترح في وقت سابق التمعدن داخل الحويصلات إينتراسيتوبلاسميك من نويات الداخلية من اباتيت داخل MV قبل انتشاره في14،ECM15. وأكد النمذجة في المختبر تحريض Ca2 +/Pأنا مجمعات تشكيل في بروتيوليبوسوميس مصنوعة من PS و AnxA516. قد يشير هذا إلى أن التراكم من Ca2 +, فأنا، تمتلك مجمعات AnxA5 و PS في اطواف الدهن من مثل زغيبات ميمبرانيسريبريسينت لب نويات (NC) الاباتيت داخل ممقابل أنيكسينس وطنب أيضا ملزمة الكولاجين القدرات التي قد تكون مفيدة في وضع MVs على طول ألياف الكولاجين، وتنشيط الدعوة التمعدن في إدارة المحتوى في المؤسسة. أ فتوين وأوستيوبونتين (أوبن)17, معروفة كمثبطات لتشكيل الاباتيت التي قد تبطئ انتشار التمعدن على سقالة collagenous. التنو ونشر الأحداث متميزة، والسابق السابق لهذا الأخير، وكلاهما قد تكون ذات صلة بعملية تمعدن المرضية.

لاكتشاف كيف يمكن تغيير كيمياء مجمعات فوسفات الكالسيوم التمعدن الفسيولوجية وتكلس حمل خارج الرحم، من الضروري تحديد المعادن التي تنتجها الخلايا. أباتيتيس مجموعة من الكالسيوم والفوسفات التي تحتوي على معادن مع كريستال العام وحدة خلية الصيغة Ca104)6X2، حيث X = Cl، واو، أوهايو. كانت تصنف على النحو التالي18: فلوراباتيتي (FA) Ca104)6و2،104) تشلوراباتيتي (CA) Ca6Cl2 وهيدروكسيباتيت (ها) Ca10(ص. ب4 )6(OH)2.

اختيار خطوط الخلايا أوستيوبلاست للحث على تشكيل المعادن حاسم، حيث يسلك كل خط خلية مكانة متميزة التمعدن. في هذا التقرير، قارنا التنو المعادن بنموذجين الخلية البشرية المحددة التمعدن: هفوب أوستيوبلاستيك 1.19 الخلايا والخلايا osteosarcoma ساوس-2. Osteosarcoma المستمدة من الخلايا تستخدم عادة كنماذج أوستيوبلاستيك وخلايا سوس-2 حافظوا على الطابع أوستيوبلاستيك الأكثر نضجاً19 بينما خلايا غير متمايزة هفوب الأجنة البشرية تستخدم على نطاق واسع كنموذج لطبيعية أوستيوبلاستيك 20من التفريق. حللت ملفاتهم التمعدن بأساليب مختلفة: تلطيخ الأليزارين الأحمر-S (ع-ق) والأشعة فوق البنفسجية التصور الضوء (الأشعة فوق البنفسجية) وانتقال تصوير الميكروسكوب الإلكتروني (TEM)، الأشعة السينية المشتتة الطاقة سليكية (EDX) كوانتيتيشن وأيون رسم الخرائط. ميزة ال EDX عبر التقنيات البديلة المستخدمة في الدراسات السابقة أنه يعطي النتائج الكمية والنوعية لاستبدال أيون في الاباتيت بلورات4،5،21. وكان الهدف الشامل المتمثل في استخدام ال EDX للعثور على طريقة بسيطة للتصوير والتحديد الكمي لتوزيع أيونات Ca، و و Cl في المعادن المختلفة من أنواع مختلفة من الخلايا خلال مراحل متميزة من عملية تعدين. هذا الأسلوب قد استخدمت بنجاح، على سبيل المثال، لرصد تفاعل جسيمات نانوية الزنك مع المواد الكيميائية تتعايش وآثارها مجتمعة على الكائنات المائية22. وفي دراسة أخرى، اتسمت فوتوكاتاليست نحاس في مواد التيتانيوم في محلول مائي على نطاق واسع عن طريق قياس الطيف الكتلي بلازما الحث يقترن الانبعاثات الضوئية (برنامج المقارنات الدولية-OES)، فيسيسوربشن N2 (الرهان)، زرد، تجاه الأشعة فوق البنفسجية DRS، قدم الأشعة تحت الحمراء، رامان التحليل الطيفي، وال EDX والفوتوكهروكيميائيه قياسات23. وكان هدفنا المقارنة بين الأصل وخصائص من حويصلات والمعادن في اثنين من خطوط الخلية لفهم الآلية التي يتحكم التمعدن خلال التمايز العظمى.

Figure 1
الشكل 1 . مخطط للخطوات الأولية التمعدن في الخلايا العظمى التي تنطوي على تركيب البروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) والإفراج عن مصفوفة حويصلات (MVs) من الغشاء. MVs تتراكم الكالسيوم من خلال عمل الكالسيوم ملزم البروتينات وأننيكسينس والفوسفات، عن طريق العمل نقل الفوسفات غير العضوي (PiT) متبوعاً بنشاط الأنسجة غير محددة القلوية الفوسفاتيز (تناب)، الذي ديفوسفوريلاتيس PPأنا إلى فأنا، مما ييسر التنو الاباتيت. ثم MVs تتفكك والإفراج عن أباتيتيس إلى الوسط خارج الخلية. هو استمرار التمعدن بإمدادات ثابتة من فأنا و Ca2 + في المتوسط خارج الخلية4،5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1-الخلية الثقافة والعلاج

  1. وضع جميع المواد الضرورية تحت غطاء محرك السيارة الاندفاق الصفحي وتعقيم لهم تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. وسائل الإعلام الثقافة: خليط 1:1 من لحم الخنزير في F12 ودميم وسائل الإعلام مع 2.5 ملم لام الجلوتامين تستكمل مع البنسلين يو/مليلتر 100، 100 ستربتوميسين U/mL، 0.3 ملغ/مل G418 و 10% مصل بقرى الجنين (FBS) (v/v) للجنين البشري هفوب 1.19 SV40 كبيرة تي مستضد transfected خلايا الاوستيوبلاستس، و 5A المتوسطة مكوي مع 1.5 مم L-الجلوتامين تكملة مع 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين يو/مليلتر و 15% 100 FBS (v/v) للخلايا البشرية osteosarcoma سوس-2.
  2. الثقافة خلايا سوس-2 في 37 درجة مئوية في جو من 5% والخلايا هفوب 1.19 في 34 درجة مئوية في جو من 5% أول أكسيد الكربون2 CO2- نقل الثقافات الخلية، أما الخلايا 1.19 أو سوس-2 هفوب، من الحاضنة إلى هود الاندفاق الصفحي وتغيير في المتوسط إلى 10 مل متوسطة ثقافة جديدة مع FBS.
  3. احتضان خلايا دون المنبهات (يستريح الخلايا) أو تحفيز لهم مع 50 ميكروغرام/ملليلتر "حمض الأسكوربيك" (أإ) تليها 7.5 مم β-جليسيروفوسفاتي (β-GP)، أعدت في وقت سابق من الماء عالي النقاوة وتصفيتها من خلال 0.22 ميكرومتر حقنه مرشحات. إضافة المنبهات من أنابيب بلاستيكية ميكروسينتريفوجي على سطح المتوسط الثقافة. بلطف يقلب الطبق الثقافة واحتضان لمدة 7 أيام.

2-الكشف عن المعادن الكالسيوم

  1. أغسل الثقافات الخلية مع "المخزن المؤقت للفوسفات المالحة" (برنامج تلفزيوني: 125 ملم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 10 مم نا2هبو4، 1 مم خ2ص4، ودرجة الحموضة 7.0).
  2. إضافة 5 مل من 2 ٪ (g:100 مل) ع-S في برنامج تلفزيوني، pH 5.0 واحتضان لوحات لمدة 30 دقيقة وصمة عار المعادن.
  3. أغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. بعناية إضافة برنامج تلفزيوني على الحائط صحن، وليس محاولة لتدمير المعادن.
  4. مراقبة المعادن الكالسيوم تحت مجهر خفيفة مقلوب والتقاط صور.

3-تصور تحقيقات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية

  1. للخلية ليساتيس، تعامل الثقافات الخلية، أما الراحة أو تحفز لمدة 7 أيام، وفقا لبروتوكول الهضم كولاجيناز24.
  2. جمع المتوسطة من الثقافات الخلية وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
  3. هضم الخلايا مع 3 مل كولاجيناز U/mL 500 في حل من 0.25 م السكروز، 0.12 متر كلوريد الصوديوم، 0.01 م بوكل، و 0.02 م تريس-HCl العازلة، الأس الهيدروجيني 7.45، في 37 درجة مئوية ح 3.
  4. ميكانيكيا كشط الخلايا وتحويلها إلى أنابيب بلاستيكية ميكروسينتريفوجي وتمرير عليها 10 مرات عن طريق حقنه ش مل 40 1 مع 0.5 × 16 إبرة.
  5. الطرد المركزي في عينات ز × 500 لمدة 5 دقائق.
  6. تجاهل المادة طافية وتعليق بيليه الخلية في 500 ميليلتر الاصطناعية الغضروف الليمفاوية (SCL، 100 ملم كلوريد الصوديوم، عيار 12.7 ملم بوكل، مم 0.57 مجكل2، 1.83 مم ناكو3ملم 0.57 نة2بو4، 5.5 ملم د-الجلوكوز، السكروز 63 ملم، 16.5 ملم حبيس، درجة الحموضة 7.4).
  7. نقل هيدروكسيباتيت (ها)، فلوراباتيتي (اتحاد كرة القدم) ومساحيق تشلوراباتيتي (كاليفورنيا) من الزجاجات على ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية مع ملعقة واستخدامها كعناصر تحكم.
  8. نقل ليساتيس الخلية من أنابيب بلاستيكية مع نصائح البلاستيك ووضع بعناية على ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية.
  9. تأخذ الصور تحت المرئية وفوق البنفسجية الخفيفة.

4-إعداد تحقيقات لل EDX

  1. إعداد المعادن لتلطيخ السلبية
    1. تعليق 2.5 ملغ المنتجة صناعيا هكتار، كاليفورنيا، واتحاد كرة القدم المعادن25 في 500 ميليلتر من المياه واحتضانها في 37 درجة مئوية في جو من 5% CO2 لح 1.
    2. تتخذ الشبكات ني مش 300 فورمفار/الكربون من المربع مع الملقط المكافحة الساكنة، ووضع على لوحة متعددة جيدا خزف وإسقاط 10 ميليلتر من المعلقات هكتار، كاليفورنيا، واتحاد كرة القدم في الشبكات.
    3. الجاف للعينات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. إعداد يستريح وحفز الخلايا لتضمين 26
    1. جمع المتوسطة من الثقافات الخلية وغسل الخلايا مع الحساسية الفسيولوجية (PD) متوسطة (125 ملم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 10 مم NaHCO3، 1 مم خ2ص4، الجلوكوز 10 مم، 20 مم هيبيس، درجة الحموضة 7.4).
    2. إصلاح الخلايا مع 5 مل مزيج جلوتارالديهيدي paraformaldehyde/1% (g:100 مل) (g:100 مل) 3% في 100 ملم فوسفات الصوديوم العازلة، الرقم الهيدروجيني 7.2، عن ح 1 في درجة حرارة الغرفة تحت غطاء الدخان.
    3. تغسل الخلايا مع 5 مل من 100 ملم فوسفات الصوديوم العازلة وإزالة المخزن المؤقت بعد الغسل بلطف.
    4. في غرفة مظلمة، postfix العينات مع 2 مل أكسيد أوزميوم (g:100 مل) 1% في 100 ملم فوسفات الصوديوم العازلة، الرقم الهيدروجيني 7.2، لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت غطاء الدخان.
    5. إزالة أكسيد الازميوم والاستفادة منه.
    6. تغسل الخلايا مع 5 مل من 100 ملم فوسفات الصوديوم العازلة.
    7. ثم يذوي العينات في مختبرين 5 مل من سلسلة الحل الإيثانول متدرج في درجة حرارة الغرفة: 25% (من المجلد) لمدة 5 دقائق، 50% (عن طريق المجلد) لمدة 10 دقائق، 75% (من المجلد) لمدة 15 دقيقة، 90% (بالمجلد) لمدة 20 دقيقة. وأخيراً استخدام الإيثانول المطلقة مرتين واحتضانها ل 30 دقيقة وح 12.
    8. ميكانيكيا تتخلص الخلايا من أطباق بيتري البلاستيك على الثقافة، وجمع في أنابيب بلاستيكية ميكروسينتريفوجي والطرد المركزي العينات من 130 غ س ل 1 دقيقة.
    9. إزالة في supernatants وتعليق الخلايا الموجودة في 1 مل مزيج من راتنج الأبيض LR والايثانول المطلقة بنسبة 1:2 وحدة تخزين.
    10. مزيج جيد من محتوى الأنابيب الزجاجية قبل استعمالها، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    11. الطرد المركزي العينات من 130 غ س ل 1 دقيقة.
    12. إزالة سوبيرناتانتس وكرر الخطوة السابقة باستخدام 1 مل من 1:1 مزيج من راتنج الأبيض LR والايثانول المطلقة.
    13. يخلط جيدا واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    14. الطرد المركزي العينات من 130 غ س ل 1 دقيقة.
    15. قم بإزالة في سوبيرناتانتس.
    16. وأخيراً، أضف 1 مل راتنج LR الأبيض النقي للعينات مرتين واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة في أنابيب بلاستيكية.
    17. وضع 500 ميكروليتر من كل عينة في كبسولات الجيلاتين.
      ملاحظة: تتم تسمية العينات باستخدام ورقة صغيرة من الورق وقلم رصاص حتى لا تدمر الراتنج التسميات.
    18. إغلاق كبسولات الجيلاتين ووضعها في أنابيب بلاستيكية ميكروسينتريفوجي والطرد المركزي في غ س 130 لمدة 1 دقيقة في دوار البديل التدريجي.
    19. إزالة الكبسولات من الأنابيب البلاستيكية باستخدام مضخة فراغ.
    20. نقل العينات إلى الفرن وبلمره في 56 درجة مئوية ح 48.
    21. إعداد الكتل بتصاعد لهم في الحامل والتشذيب لهم للهرم.
    22. وضع الحامل أولتراميكروتومي وإرفاق السكين الترا 45° الماس وملئه بالمياه؛ تذكر أن تقوم بتنظيف الشفرة من فقاعات الهواء عرضية.
    23. ثم قطع المقاطع (700 Å) باستخدام سكين الماس إلى حمام المياه.
    24. مجموعة قصاصات باستخدام جفن الأبقار ومكان لهم على الجانب اللامع من 300 فورمفار/الكربون مش الشبكة ني وتجفيفها.
    25. تحضير خلات اليورانيل 2.5% (من المجلد) في الإيثانول المطلقة في الظلام تحت غطاء دخان. تبقى خلات اليورانيل في حاوية رائدة، وتذكر أن لا تلتقط الرواسب.
    26. في غرفة مظلمة، كونتيرستاين الشبكات أباتيتيس الاصطناعية وعينات الخلايا مع خلات اليورانيل 2.5% (من المجلد) في الإيثانول لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت غطاء الدخان.
    27. غسل الشبكات في الإيثانول 50% (حسب المجلد)، ثم في المياه وجاف في درجة حرارة الغرفة ح 24. وأخيراً، وضع الشبكات في المربع.

5-تيم-EDX التحليل

  1. تيم التصوير بواسطة مجهر إلكترون انتقال (TEM) مجهزة بكامل نطاق "الأشعة السينية المشتتة الطاقة" سليكية نظام (EDX) و 11 ميجا بكسل الكاميرا
    1. إعداد حامل البريليوم للمراقبة للمعادن والخلايا. استخدام أدوات المكافحة الساكنة.
    2. إزالة زوج مسامير ورفع لوحة البريليوم والغسالة البريليوم بعيداً عن بقية التجنيب.
    3. جبل الشبكة، والجانب اللامع، على الحامل.
    4. وضع الغسالة البريليوم والبريليوم لوحة والمسمار مسامير ربط محكم بعناية.
    5. وضع الحامل في فراغ الغرفة وتشغيل مضخة فراغ.
    6. حالما يتحقق من فراغ، برفق إدراج الحامل في قاعة التصوير وقم بتشغيل الحزمة.
    7. على جهاز العرض الفلورسنت، تعيين المعلمات الفتحة من المجهر. إجراء تصحيح الاستجماتيزم الصورة؛ تعيين التكبير، والتركيز، والإطار؛ والتقاط صور تيم في بير 50، 000 X.
  2. وقف التصوير والأشعة السينية سليكية للتحليل الطيفي والتركيبية
    1. إدراج الطاقة المشتتة لكشف "بالأشعة السينية" (EDX) في دائرة التصوير الميكروسكوب الإلكتروني (الجذعية) انتقال المسح الضوئي.
    2. ضبط حدة الصورة في وضع التركيز.
    3. التقاط صور الجذعية في بير 15، 000 X.
    4. حدد نقطة في العينة للأشعة السينية سليكية وجمع الأطياف.
    5. الحصول على البيانات عن طريق جمع كافة الأوزان الذرية لجميع العناصر في الجدول الدوري في العينة (كنسبة 100%)، ومما يدل على المحتوى للعناصر المحددة: كاليفورنيا وو Cl ف (كالذرى %). ثم، حساب نسب Ca أو و Cl إلى ف لكل عينة.
  3. تعيين أيون
    1. قم بتحديد عناصر مثل الكالسيوم والفلور والكلور والفوسفور لجعل التعيين أيون وتنفيذ خرائط EDX للعناصر المحددة في العينات.
    2. الحصول على البيانات التي تشير إلى إضفاء الطابع المحلي على تحليل العناصر: كاليفورنيا وو Cl ف (كالذرى في المائة) وحساب التعريب المشارك (في المائة) من كاليفورنيا، و أو Cl مع ف لكل عينة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تيم EDX يسمح للتصوير في المختبر لمصفوفة حويصلات (MVs) الصادرة عن مينيراليزينج الخلايا والمعادن التي تنتجها ممقابل النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذه التقنية تثبت أنه يمكن المضي في عملية تمعدن بطريقة مختلفة في أنواع مختلفة من الخلايا. خطوط الخلية اثنين تلقي نفس المعاملة ترانسديفيرينتييشن أوستيوبلاستيك، ومع ذلك حفز سوس-2 الخلايا المعادن أكثر كفاءة من هفوب خلايا الاوستيوبلاستس 1.19، كما يدل على ذلك ع دا تلطيخ (الشكل 2). قد يكون هذا بسبب النمط الظاهري osteoblast أكثر نضجاً من سوس-2 الخلايا19 مقارنة ب الخلايا هفوب 1.1920. تصور العينات باستخدام ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية التي من الواضح أنه يمكن ملاحظة فقط فلوراباتيتيس تحت الأشعة فوق البنفسجية (الشكل 3). صور تيم أشارت إلى أن حفز سوس-2 الخلايا تنتج أكثر الحويصلات المحتوية على المعادن مقارنة مع هفوب حفز الخلايا أو مع يستريح سوس-2 الخلايا (الشكل 4، لوحات الأيمن والأيسر). أباتيتيس الاصطناعية بأشكال مختلفة من المعادن (الشكل 4، اللوحة اليمنى). وأظهرت الصور TEM وجود حويصلات في هفوب الخلايا 1.19 وسوس-2 تحت يستريح وحفزت الظروف (الشكل 5، غادر الفريق). على خرائط أيون EDX، وتشير النقاط الحمراء إلى الكالسيوم، وتظهر النقاط الخضراء الفوسفور والنقاط الزرقاء تشير إلى توزيعات فلورين (الشكل 5، الفريق الأوسط). تحت ظروف حفز، هناك تداخل قوي بين توزيعات الكالسيوم والفوسفور في الحويصلات تنتج من خلايا سوس-2 وبين الفلور والفوسفور في الحويصلات التي تنتجها خلايا هفوب 1.19 (الشكل 5، اللوحة اليمنى).

Figure 2
الشكل 2 . ع-S تلطيخ من المعادن (أحمر) التي تنتجها هفوب 1.19 (اللوحة العلوية) والخلايا سوس-2 (أسفل اللوحة) أما يستريح (R) أو بعد 7 أيام تحفيز مع AA و β-سباق الجائزة الكبرى (S)- شريط: 25 ميكرومتر. نتيجة نموذجية مع n = 3 ويرد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . مرئي (اللوحة العلوية) والأشعة فوق البنفسجية (الفريق الأوسط) التصور الخفيفة المعادن هكتار، كاليفورنيا، واتحاد كرة القدم الاصطناعية والمعادن التي تنتجها هفوب 1.19 (اللوحة اليسرى السفلي) والخلايا سوس-2 (أسفل اللوحة اليمنى) أما يستريح (R) أو بعد 7 أيام تحفيز مع AA و β-سباق الجائزة الكبرى (S) . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 4
الشكل 4 . صور ال من حويصلات والمعادن التي تنتجها هفوب 1.19 (اللوحة اليمنى) والخلايا سوس-2 (الفريق الأوسط) أما يستريح (R) أو بعد 7 أيام تحفيز مع AA و β-سباق الجائزة الكبرى (S). المعادن هكتار، كاليفورنيا، واتحاد كرة القدم الاصطناعية تظهر كعناصر تحكم (اللوحة اليمنى)- شريط: أبيض 500 نانومتر، أسود 250 نيوتن متر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 5
الشكل 5 . صور ال (اللوحة اليسرى) هفوب 1.19 وسوس-2 الخلايا أما يستريح (R) أو بعد 7 أيام تحفيز مع AA و β-سباق الجائزة الكبرى (S). خرائط أيون لكاليفورنيا (أحمر)، Cl (أصفر)، و (أزرق) وف (الأخضر) من EDX (الفريق الأوسط). تعريب المشارك من العناصر (اللوحة اليمنى): كانت كمية الكالسيوم إلى الفوسفور (Ca)، الفلور إلى الفوسفور (و)، أو الكلور إلى الفوسفور (Cl) استناداً إلى خرائط EDX. بار: 500 نانومتر. وأجريت ثلاث تجارب مستقلة لكل من خطوط الخلايا. صور عشرة من كل متغير (الراحة وحفز) اتخذت، ثم اختير من 2 إلى 6 منهم كذلك حساب عنصر التعريب المشارك. وتقدم نتيجة نموذجية واحدة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في هذه الورقة، وصفناها البروتوكولات للتلوين، تحديد فلوراباتيتي ضوء الأشعة فوق البنفسجية، ق ع وال EDX في المختبر تصوير MVs صدر عن مينيراليزينج الخلايا والمعادن التي تنتجها MVs. فمن الممكن لمعالجة كافة الأساليب المذكورة أعلاه باتباع بعض خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها الشائعة. وللحصول على أفضل النتائج، ينبغي إجراء العديد من الخطوات الحاسمة بعناية. أولاً، فمن الأفضل إضافة AA (وحمضيه) تليها β-سباق الجائزة الكبرى (والقلوية) للحفاظ على درجة الحموضة 7.4 المتوسط الثقافة. ثانيا، بعد ع دا تلطيخ، رواسب الكالسيوم الملون هشة جداً والخلايا ينبغي غسلها بعناية فائقة لمنع تدمير البلورات عند إضافة برنامج تلفزيوني. ثالثا، دائماً خلات اليورانيل في حاوية الرصاص ولا تلتقط الرواسب لأنه ينبغي أن تستخدم إلا الكسر المخفف للتثبيت. رابعا، تذكر أن خلات اليورانيل و AA هي حساسة للضوء، وينبغي التعامل معها في غرفة مظلمة. خامسا، ينبغي أن تكون مختلطة الخليط من الأبيض LR مع الإيثانول المطلق جيدا قبل إضافتها إلى العينات. سادسا، العينات في كبسولات الجيلاتين يجب أن يكون المسماة باستخدام ورقة صغيرة من الورق وقلم رصاص حتى لا تدمر الراتنج التسميات. سابعا، يجب تنظيف شفرة السكين الماس بعناية من أي فقاعات الهواء. الثامنة، عينات توضع بحذر على الجانب اللامع من الشبكة التي يقع فيها الفيلم فورمفار/الكربون. تاسعا، وضع بشكل صحيح النقطة في مؤتمر الأشعة السينية وأيون التي يتم تنفيذ التعيين في الصورة تيم للحد من المشاكل الممكنة مع الاعتراف الاباتيت.

على الرغم من أن البروتوكول المقدمة تبين أن الأكثر ملائمة في لدينا التصميم التجريبي، فمن الممكن تعديلها لتناسب مختلف الأهداف. كما هو الحال مع أي تقنية أخرى، هذا واحد أيضا لها حدودها. وينبغي تطبيق تقنيات إضافية، مثل فتير، لتأكيد أو للتحقق من وجود نسبة12،،من8عناصر فحص26التي تم الحصول عليها. تيم EDX الطريقة المعروضة هنا هو تحسن كبير فيما يتعلق بالأسلوب الحالي، الذي هو مزيج من أساليب التعيين وتشيموميتريك الصغرى-المستندة إلى رامان ومشابه لتصوير توزيع جسيمات فضة نانوية (أجنبس) على مختلف الأسطح المعدنية والآلية لهذه التفاعلات الجزيئية21. تم اختبار تصوير رامان المستندة على نموذجين المعدنية (الكلي والجزئي-الحجم). خرائط رامان من n = 600-900 الأطياف لكل عينة/مراقبة تم تحليلها بواسطة البرمجيات فسبوتشي وتأكدت النتائج عن طريق وسائل أخرى مثل OES برنامج المقارنات الدولية، وفؤاد، ووزارة شؤون المرأة-EDX. لدينا تيم-EDX خرائط تضم ن = 30 إطارات و n = 6 الأطياف لكل عينة/مراقبة حللت أيضا بالبرمجيات "جناح سليكية"، وتأكدت النتائج عن طريق وسائل أخرى مثل فتير ووزير الخارجية، تيم، SPM و فؤاد طبوغرافية ثلاثية الأبعاد4 , 5-سليكية TEM-EDX المقترحة، مثل التصوير على أساس رامان، يتطلب إعداد نموذج الحد الأدنى فقط، هو فائقة الحساسية وغير الغازية، وفعالة من حيث التكلفة، ويمكن أن تمتد إلى نظم أخرى ذات صلة بالبيئة البشرية.

قد يتم استخدام التقنية المقدمة في مجال واسع من البحوث في المستقبل. فإنه يمكن تعديله للتحقيق في مختلف أباتيتيس الطبيعية والاصطناعية. فإنه يمكن أيضا تعديلها لتناسب بروتوكولات لإجراء تجارب بيولوجية وكيميائية تحقيقات. وعلاوة على ذلك، يمكن تحليل جميع العناصر من الجدول الدوري من أجل تصور ليس فقط مورفولوجية المعادن ولكن أيضا تغييرات في تكوين أيون واستبدال. التبادل الأيوني في أباتيتيس إجراء معروف للتطبيقات الطبية الحيوية27. واحد العوامل الفسيولوجية ممكن يتحكم بأيونات Ca، و و Cl أو استبدال أيون معدني ريال ملغ والمنغنيز والزنك في ها أثناء تشكيل المعادن، وهي نقطة تحول بين تمعدن الفسيولوجية والمرضية، قد يكون/PPiPi نسبة7. إذا ما طبقت بشكل سليم، يسمح هذا الأسلوب للقيام برسم خرائط لعناصر متعددة من نفس المنطقة الخلوية أو حويصلية أو المعدنية عدة مرات في صف واحد.

في السنوات الأخيرة، تم إحراز تقدم كبير بشأن آليات تمعدن العظام28،30،29،31،،من3233. لقد أدركنا أن خطوط الخلايا المختلفة قد يكون لها ملامح متميزة من حويصلات وتشكيل المعادن. وفي هذا الصدد، اخترنا اثنين من خطوط الخلايا البشرية: هفوب أوستيوبلاستيك 1.19 و osteosarcoma سوس-2، التي تخضع لإكمال ترانسديفيرينتييشن أوستيوجينيك من انتشار التمعدن، وتنتج MVs تؤدي إلى نويات الاباتيت في إدارة المحتوى في المؤسسة 34 , 35.

ع-S تلطيخ من رواسب الكالسيوم كشفت أن تحفز سوس-2 الخلايا المعادن بطريقة مختلفة عن خلايا الاوستيوبلاستس هفوب 1.19. وهذا كان يرتبط بإنتاج المعادن بسوس-2 الخلايا التي تم كشفها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية على النقيض من تلك التي تنتجها الخلايا هفوب 1.19. لدينا بيانات ال EDX كشفت أن المعادن التي تنتج في حويصلات الخلايا سوس-2 مماثلة إلى ها الاصطناعية بسبب التداخل في توزيع الكالسيوم والفوسفور. وفي المقابل، أوضحت التداخل في توزيعات الفلورين والفوسفور في حويصلات من الخلايا هفوب 1.19 تكوين أنواع أخرى من المعادن بالإضافة إلى أباتيتيس.

وفي الختام، النتائج التي توصلنا إليها تشير إلى أن الحويصلات هي المحددات الرئيسية التنو المعدنية، لا سيما على المستوى الخلوي5،25. وعلاوة على ذلك لدينا البيانات باﻻتفاق مع نظرية سابقة أنه يمكن اعتبار MVs نموذج متخصصة من ميكروفيسيكليس أن تكون قادراً على بدء تشغيل التمعدن داخل وخارج الخلية4. مقارنة حويصلات أطلق سراحهم من الخلايا ساوس-2، الذي طاغية أكثر كفاءة، وحويصلات أطلق سراحهم من الخلايا هفوب 1.19 باستخدام الأسلوب ميكرواناليتيكال TEM EDX تدعم الفرضية القائلة بأن MVs حويصلات مليئة بالمعادن. وهذا يترك فتح المسألة ما إذا كان يلزم وجود MVs للحث على التنو الاباتيت، وكيفية هذا قد يغير الفسيولوجية التمعدن المرضية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن أي تعارض في المصالح.

Acknowledgments

عضو الكنيست وأطلب إجراء العمليات اليدوية وإعداد الرسومات، وجعلت من الفيلم. اسأل كتب المخطوطة، رطل كتب السيناريو وعضو الكنيست إعداد الجدول. SM، والممولة من الميزانية العادية و SP نقديا قراءة الجدول والبرنامج النصي والمخطوطة. الكتاب يود أن يشكر تشومونتووسكا حنا لها المساعدة الممتازة مع أولتراميكروتومي، فضلا عن سوسكى سزيمون وبيلسكي هنريك لمساعدتهم ممتازة مع تحليل TEM EDX. المؤلف يود أن يشكر الدكتور باتريك بساتين لتصحيح اللغة الإنجليزية المهنية وباربارا سوبياك لتسجيل التعليمات.

هذا العمل كان تدعمها منحة ن N401 140639 من وزارة العلوم والتعليم العالي البولندية لاسال، من المنح المقدمة من المركز الوطني للعلوم، وبولندا عام 2016/23/N/NZ4/03313 رطل و 2016/23/N/NZ1/02449 إلى عضو الكنيست، "الاتحاد الأوروبي FP7 المشروع بيويماجيني" : البولندية بيو-التصوير في بحوث الابتكار والتعليم، والجمعية العامة رقم 264173، وصناديق القانونية من "معهد نينكي للبيولوجيا التجريبية" أكاديمية العلوم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture PAA E15-813 1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium PAA E82312-0025 for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin) Sigma P0781-100ML 100 U/mL each
G-418 Sigma 68168 0.3 mg/mL
FBS Gibco 10270 10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA Sigma A-5960 50 µg/mL
ß-GP Sigma G9422-100G 7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel Bio-Rad 130-0420 for HA
FA synthesized by us
CA synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture Sigma S7907/S8282 0.1 M, pH 7.2
PBS pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS Sigma A5533-25G 0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA Sigma C2674 500 U/mL
SCL buffer prepared by us
Deionized wather produced by us
Ethanol POCh BA6480111 absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol Polysciences Inc. 21447-25 0.25 g/10 mL
PD medium pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde) Sigma 158127/G-6257 3%:1%
Post-fixation OsO4 Sigma 75633 1%
LR White resin in ethanol Polysciences Inc. 17411-MUNC 500g 1:2, 1:1, 100%
Acetone CHEMPUR 111024800 pure
Tool
Cryogenic vials Corning Inc. 430487 1.2 mL
Plastic Petri culture dishes Falcon 353003 100 mm
Plastic tubes Falcon 352096 and 352070 15 and 50 mL
Serological pipettes Falcon and VWR 357521 and 612-3700 1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes Sigma Z688312 and Z628034 1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips VWR 613-0364, 613-0239 and 613-1050 0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks Light Labs A-7055-Z, A-7053-C green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save Thermo Scientific Co. KS12 HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell Thermo Scientific Co. 150 34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood POLON WCS-2 for TEM stainings
Glass bottles SIMAX 1632414501050 and 1632414501100 50 and 100 mL
Quartz glass tubes SIMAX 638422010100 Ø 10 mm, L 100 mm
Pump IBS Integra Biosciences VACUSAFE comfort for vacuum
Oven Memmert UNE 400 56°C
Porcelain multi-well plate Rosenthal technik 229/12 12 wells
Glass beakers SIMAX 632417010025 25 mL
Glass bottles Pocord DIN22 10 mL
Plastic box Agar Scientific Ltd. for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules Agar Scientific Ltd. G3741 size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box Agar Scientific Ltd. S162N3 film on the shiny side
Silicon cell scraper Sigma SIAL0010-100EA size 1.8/25 cm
Syringe with needle BogMark 007 syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe Chirana CH005L 5 mL
Centrifuge MPW Medical Instruments MPW-350R 130 x g and 500 x g
UV transluminator UVP M-20 for visible and UV light
Ultramicrotome LKB NOVA 700Å sections
Block holder LKB E6711 round shape
Diamond knife DiATOME Ultra 45° size 3
Eyelash holder bovine, prepared by us
Forceps ROTH 2855.1 antistatic for grids
Spatulas set ROTH E286.1 antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope Zeiss with Canon AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9 Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses Nikon Nikon D7100
Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D
Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G
Nikkor AF 28 mm f/2.8D
for movie recordings
Microphone MXL Mics Tempo for voice recordings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. Bone structure and function. Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).
  2. Anderson, H. C. Molecular biology of matrix vesicles. Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).
  3. Anderson, H. C. Matrix vesicles and calcification. Curr Rheumatol. 5, (3), 222-226 (2003).
  4. Bolean, M., Simão, A. M. S., Barioni, M. B., Favarin, B. Z., Sebinelli, H. G., Veschi, E. A., Janku, T. A. B., Bottini, M., Hoylaerts, M. F., Itri, R., Millán, J. L., Ciancaglini, P. Biophysical aspects of biomineralization. Biophys Rev. 9, (5), 747-760 (2017).
  5. Bottini, M., Mebarek, S., Anderson, K. L., Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Simão, A. M. S., Bolean, M., Ciancaglini, P., Bandorowicz Pikula, J., Pikula, S., Magne, D., Volkmann, N., Hanein, D., Millán, J. L., Buchet, R. Matrix vesicles from chondrocytes and osteoblasts: Their biogenesis, properties, functions and biomimetic models. Biochim Biophys Acta. 1862, (3), 532-546 (2018).
  6. Hessle, L., Johnson, K. A., Anderson, H. C., Narisawa, S., Sali, A., Goding, J. W., Terkeltaub, R., Millan, J. L. Tissue-nonspecific alkaline phosphatase and plasma cell membrane glycoprotein-1 are central antagonistic regulators of bone mineralization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, (14), 9445-9449 (2002).
  7. Garimella, R., Bi, X., Anderson, H. C., Camacho, N. P. Nature of phosphate substrate as a major determinant of mineral type formed in matrix vesicle-mediated in vitro mineralization: An FTIR imaging study. Bone. 38, (6), 811-817 (2006).
  8. Thouverey, C., Bechkoff, G., Pikula, S., Buchet, R. Inorganic pyrophosphate as a regulator of hydroxyapatite or calcium pyrophosphate dihydrate mineral deposition by matrix vesicles. Osteoarthr. Cartil. 17, 64-72 (2009).
  9. Terkeltaub, R. A. Inorganic pyrophosphate generation and disposition in pathophysiology. Am. J. Phys. 281, (1), 1-11 (2001).
  10. Guicheux, J., Palmer, G., Shukunami, C., Hiraki, Y., Bonjour, J. P., Caverzasio, J. A novel in vitro culture system for analysis of functional role of phosphate transport in endochondral ossification. Bone. 27, (1), 69-74 (2000).
  11. Yadav, M. C., Bottini, M., Cory, E., Bhattacharya, K., Kuss, P., Narisawa, S., Sah, R. L., Beck, L., Fadeel, B., Farquharson, C., Millán, J. L. Skeletal mineralization deficits and impaired biogenesis and function of chondrocyte-derived matrix vesicles in Phospho1(-/-) and Phospho1/Pi t1 double-knockout mice. J. Bone Miner. Res. 31, (6), 1275-1286 (2016).
  12. Thouverey, C., Malinowska, A., Balcerzak, M., Strzelecka-Kiliszek, A., Buchet, R., Dadlez, M., Pikula, S. Proteomic characterization of biogenesis and functions of matrix vesicles released from mineralizing human osteoblast-like cells. J. Proteome. 74, (7), 1123-1134 (2011).
  13. Wang, W., Xu, J., Kirsch, T. Annexin-mediated Ca2+ influx regulates growth plate chondrocyte maturation and apoptosis. J. Biol. Chem. 278, (6), 3762-3769 (2003).
  14. Nollet, M., Santucci-Darmanin, S., Breuil, V., et al. Autophagy in osteoblasts is involved in mineralization and bone homeostasis. Autophagy. 10, (11), 1965-1977 (2014).
  15. Boonrungsiman, S., Gentleman, E., Carzaniga, R., Evans, N. D., McComb, D. W., Porter, A. E., Stevens, M. M. The role of intracellular calcium phosphate in osteoblast-mediated bone apatite formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (35), 14170-14175 (2012).
  16. Genge, B. R., Wu, L. N., Wuthier, R. E. In vitro modeling of matrix vesicle nucleation: synergistic stimulation of mineral formation by annexin A5 and phosphatidylserine. J. Biol. Chem. 282, (36), 26035-26045 (2007).
  17. Jahnen-Dechent, W., Schäfer, B., Ketteler, M., McKee, M. D. Mineral chaperones: a role for fetuin-A and osteopontin in the inhibition and regression of pathologic calcification. J. Mol. Med. (Berl). 86, (4), 379-389 (2008).
  18. Suchanek, W., Yoshimura, M. Processing and properties of hydroxyapatite-based biomaterials for use as hard tissue replacement implants. J. Miner. Res. 13, (1), 94-117 (1998).
  19. Pautke, C., Schieker, M., Tischer, T., Kolk, A., Neth, P., Mutschler, W., Milz, S. Characterization of osteosarcoma cell lines MG-63, Saos-2 and U-2 OS in comparison to human osteoblasts. Anticancer Res. 24, (6), 3743-3748 (2004).
  20. Yen, M. -L., Chien, C. -C., Chiu, I. -M., Huang, H. -I., Chen, Y. -C., Hu, H. -I., Yen, B. L. Multilineage differentiation and characterization of the human fetal osteoblastic 1.19 cell line: a possible in vitro model of human mesenchymal progenitors. Stem Cells. 25, (1), 125-131 (2007).
  21. Brittle, S. W., Foose, D. P., O'Neil, K. A., Sikon, J. M., Johnson, J. K., Stahler, A. C., Ryan, J. D., Higgins, S. R., Sizemore, I. E. A raman-based imaging method for characterizing the molecular adsorption and spatial distribution of silver nanoparticles to hydrated mineral surfaces. Environ Sci Technol. (2018).
  22. Liu, N., Wang, Y., Ge, F., Liu, S., Xiao, H. Antagonistic effect of nano-ZnO and cetyltrimethyl ammonium chloride on the growth of Chlorella vulgaris: Dissolution and accumulation of nano-ZnO. Chemosphere. 196, 566-574 (2018).
  23. Tasbihi, M., Kočì, K., Troppová, I., Edelmannová, M., Reli, M., Čapek, L., Schomäcker, R. Photocatalytic reduction of carbon dioxide over Cu/TiO2 photocatalysts. Environ Sci Pollut Res Int. (2017).
  24. Chen, N. X., O'Neill, K. D., Chen, X., Moe, S. M. Annexin-Mediated Matrix Vesicle Calcification in Vascular Smooth Muscle Cells. J. Bone Miner. Res. 23, (11), 1798-1805 (2008).
  25. Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S. Characteristics of minerals in vesicles produced by human osteoblasts hFOB 1.19 and osteosarcoma Saos-2 cells stimulated for mineralization. J. Inorg. Bioch. 171, 100-107 (2017).
  26. Thouverey, C., Strzelecka-Kiliszek, A., Balcerzak, M., Buchet, R., Pikula, S. Matrix vesicles originate from apical membranę microvilli of mineralizing osteoblast-like Saos-2 cells. J. Cell. Biochem. 106, (1), 127-138 (2009).
  27. Cazalbou, S., Eichert, D., Ranz, X., Drouet, C., Combes, C., Harmand, M. F., Rey, C. Ion exchanges in apatites for biomedical application. J. Mater. Sci. Mater. Med. 16, (5), 405-409 (2005).
  28. Kraus, D. Consolidated data analysis and presentation using an open-source add-in for the Microsoft Excel® spreadsheet software. Med. Writ. 23, (1), 25-28 (2014).
  29. Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annu. Rev. Genet. 43, 119-142 (2009).
  30. Bonucci, E. Bone mineralization. Front. Biosci. 17, 100-128 (2012).
  31. Veis, A., Dorvee, J. R. Biomineralization mechanisms: A new paradigm for crystal nucleation in organic matrices. Calcif. Tissue Int. 93, (4), 307-315 (2013).
  32. Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A., Sone, E. D. In vitro models of collagen biomineralization. J. Struct. Biol. 183, (2), 258-269 (2013).
  33. Alliston, T. Biological regulation of bone quality. Curr. Osteoporos. Rep. 12, (3), 366-375 (2014).
  34. Wang, W., Kirsch, T. Retinoic acid stimulates annexin-mediated growth plate chondrocyte mineralization. J. Cell Biol. 157, (6), 1061-1069 (2002).
  35. Wang, W., Xu, J., Kirsh, T. Annexin V and terminal differentiation of growth plate chondrocytes. Exp. Cell Res. 305, (1), 156-165 (2005).
تحليل المعادن التي تنتجها هفوب 1.19 وسوس-2 الخلايا باستخدام مجهر إلكتروني مع Microanalysis الأشعة السينية المشتتة الطاقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bozycki, L., Komiazyk, M., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S., Strzelecka-Kiliszek, A. Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis. J. Vis. Exp. (136), e57423, doi:10.3791/57423 (2018).More

Bozycki, L., Komiazyk, M., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S., Strzelecka-Kiliszek, A. Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis. J. Vis. Exp. (136), e57423, doi:10.3791/57423 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter