Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Analyse van mineralen geproduceerd door hFOB 1.19 en Saos-2 cellen met behulp van Transmissie Electronenmicroscopie met energie dispersieve x-stralen Microanalyse

Published: June 24, 2018 doi: 10.3791/57423
Automatic Translation
1, 1, 2,3,4,5,6, 2,3,4,5,6, 1, 1
1Laboratory of Lipid Biochemistry, Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences, 2Université de Lyon, 3Université Lyon 1, 4L'insitut National des Sciences Appliquées (INSA) de Lyon, 5Ecole Supérieure de Chimie Physique Electronique (CPE) Lyon, 6Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Unité Mixte de Recherche (UMR), L'institut de Chimie et Biochimie Moléculaires et Supramoléculaires (ICBMS)

Summary

We presenteren een protocol om te vergelijken de status van mineralen in blaasjes uitgebracht door twee menselijk bot cellijnen: hFOB 1.19 en Saos-2. Hun mineralisatie profielen werden geanalyseerd door Alizarine Red-S (S-AR) kleuring, ultraviolet (UV) licht visualisatie, Transmissie Electronenmicroscopie (TEM) beeldvorming en energie dispersieve x-stralen Microanalyse (EDX).

Abstract

Deze video presenteert het gebruik van het transmissie-elektronenmicroscopie met energie dispersieve x-stralen Microanalyse (TEM-EDX) te vergelijken de status van mineralen in blaasjes uitgebracht door twee menselijk bot cellijnen: hFOB 1.19 en Saos-2. Deze cellijnen, na behandeling met ascorbinezuur (AA) en β-glycerophosphate (β-GP), ondergaan van volledige osteogenic transdifferentiatie van proliferatie te mineralisatie en produceren van matrix blaasjes (MVs) die leiden tot apatiet nucleatie in de extracellulaire matrix (ECM).

Gebaseerd op Alizarine Red-S (S-AR) kleuring en analyse van de samenstelling van mineralen in cel lysates met behulp van ultraviolet (UV) licht of blaasjes met behulp van TEM imaging gevolgd door EDX kwantificatie en ion mapping, we kunnen afleiden dat Osteosarcoom Saos-2 en osteoblastic hFOB 1.19 cellen onthullen verschillende mineralisatie profielen. Saos-2 cellen efficiënter dan hFOB 1.19 cellen mineralize en produceren van grotere minerale afzettingen die zijn niet zichtbaar onder UV-licht, maar zijn vergelijkbaar met hydroxyapatiet (HA) in dat ze meer Ca en F vervangingen hebben.

De resultaten verkregen met behulp van deze technieken kunnen we concluderen dat het proces van mineralisatie afhankelijk van het celtype verschilt. Wij stellen voor dat, op het cellulaire niveau, de herkomst en eigenschappen van blaasjes vooraf het type van mineralen bepalen.

Introduction

Bot is een soort bindweefsel bestaat uit twee delen: organische (cellen en collageenvezels) en mineralen (calcium en fosfaat verbindingen). De belangrijkste minerale componenten in botten zijn apatites1. Verschillende soorten mineralisatie-bevoegde cellen in bot (botcellen), tanden (odontoblasts) en kraakbeen (chondrocyten) regelen de eerste stappen van mineralisatie door de productie van eiwitten van de extracellulaire matrix (ECM) en het vrijgeven van matrix blaasjes (MVs) (Figuur 1). MVs zijn 100-300 nm diameter blaasjes die zich ophopen van calcium en fosfaat te vergemakkelijken apatiet nucleatie en vervolgens binden aan collageen2,3. Vervolgens desintegreren MVs om apatites aan het extracellulaire medium vrij te geven. De apatites blijven groeien in het contact met de collageenvezels en vormen de bot-matrix. De mineralisatie is opgelopen door de constante aanvoer van Pik en Ca2 + in het extracellulaire medium. Sommige onlangs gepubliceerde gegevens ondersteunen onze model4,5. Zachte weefsels doen niet mineralize onder fysiologische omstandigheden. Ectopische verkalking kan zich echter voordoen onder pathologische omstandigheden zoals vasculaire verkalking3. Vasculaire cellen die het osteoblast fenotype verwerven kunnen produceren MVs dat induceren nucleatie van apatites en initiëren van mineralisatie in de mediale en intima lagen van de wand van de bloedvaten. Sinds ectopische verkalking lijken op normale endochondral mineralisatie3, inzicht in de moleculaire mechanismen van mineralisatie van ossaal cellen en chondrocyten dienen enkele aanwijzingen op ectopische verkalking van de zachte weefsels die gevormd.

De ontwikkeling van het skelet weefsels wordt geregeld door verschillende enzymen, groeifactoren, en initiatiefnemers of remmers van mineralisatie. De antagonistische actie van weefsel-nonspecific alkalisch fosfatase (TNAP) (Figuur 1) en ectonucleotide pyrophosphatase/fosfodiësterase ik (NPP1), samen met ankyrin (ANK), besturingselementen concentratie van de anorganische pyrofosfaat (PPik) 6. PPik, een krachtige remmer van HA formatie, is gehydrolyseerd door TNAP; NPP1 ontstabiel nucleotide trifosfaat tot PPik terwijl ANK uitvoer PPik uit de cel aan de ECM. De Pi/PPi verhouding kan reguleren apatiet vorming7,8 met mogelijke gevolgen van de pathologische9.

De MV membraan is verrijkt met ion vervoer eiwitten die het eerste neerslaan van calcium en fosfaat binnen de MVs tijdens de nucleatie (Figuur 1 vergemakkelijken). De fosfaat transporter 1 (PiT) helpt te nemen Pik gegenereerd in de perivesicular ruimte in de MVs10,11. Annexins kan worden betrokken in het bindende en vervoeren van Ca2 + en de biofysische proces waarmee mineralisatie in de MV lumen12,13. Wij keuren de hypothese, eerder voorgesteld voor mineralisatie binnen intracytoplasmatische blaasjes van interne nucleatie van apatiet binnen de MV voordat de vermeerdering in de ECM14,15. In vitro modellering bevestigd de inductie van Ca2 +/Pik complexen vorming in proteoliposomes gemaakt van PS en AnxA516. Dit kan erop duiden dat accumulatie van Ca2 +, Pi, AnxA5 en PS complexen in lipide vlotten van de microvilli-achtige membranesrepresent de nucleatie kern (NC) van apatiet binnen MVs. Annexins en TNAP bezitten ook collageen-bindende capaciteiten die nuttig zijn in het plaatsen van MVs langs collageenvezels en bij het stimuleren van de verspreiding van mineralisatie in de ECM kunnen zijn. Fetuin A en osteopontin (OPN)17, staan bekend als remmers van apatiet formatie die de verspreiding van mineralisatie op de collagene steiger kan vertragen. Nucleatie en vermeerdering zijn verschillende evenementen, de voormalige voorafgaand aan de laatste, en beide relevant kunnen zijn voor het proces van pathologische mineralisatie.

Om te ontdekken hoe de chemie van calciumfosfaat complexen fysiologische mineralisatie en ectopische verkalking kan veranderen, is het noodzakelijk om te identificeren van de mineralen geproduceerd door cellen. Apatites zijn een groep van calcium en fosfaat met mineralen met de algemene crystal eenheid cel Ca formule10(PO4)6X2, waarbij X = Cl, F, OH. Ze worden geclassificeerd als volgt18: fluorapatiet (FA) Ca10(PO4)6F2, chlorapatite (CA) Ca10(PO4)6Cl2 en hydroxyapatiet (HA) Ca10(PO4 )6(OH)2.

De keuze van osteoblast cellijnen voor het opwekken van minerale vorming is van cruciaal belang, aangezien elke cellijn een duidelijk profiel van mineralisatie vertoont. In dit verslag, vergeleken we de nucleatie van mineralen door twee geselecteerde menselijke cel modellen van mineralisatie: osteoblastic hFOB 1.19 cellen en Osteosarcoom Saos-2 cellen. Osteosarcoom-afgeleide cellen worden vaak gebruikt als osteoblastic modellen en Saos-2 cellen zijn de meest volwassen osteoblastic teken19 bewaard terwijl ongedifferentieerde menselijke foetale hFOB cellen veel als een model voor de normale osteoblastic gebruikt worden differentiatie20. Hun mineralisatie profielen werden geanalyseerd door verschillende methoden: Alizarine Red-S (S-AR) kleuring, ultraviolet (UV) licht visualisatie, Transmissie Electronenmicroscopie (TEM) imaging, energie dispersieve x-stralen Microanalyse (EDX) kwantificatie en ion in kaart brengen. Het voordeel van de TEM-EDX over alternatieve technieken die worden gebruikt in eerdere studies is dat het kwantitatieve en kwalitatieve resultaten van ion vervanging in apatiet kristallen4,5,21geeft. Het algemene doel van het gebruik van de TEM-EDX was te vinden van een eenvoudige methode voor beeldbewerking en kwantificering van de verdeling van de Ca, F en Cl-ionen in verschillende mineralen uit verschillende soorten cellen tijdens de verschillende fasen van het proces van mineralisatie. Deze methode is met succes gebruikt, bijvoorbeeld voor het toezicht op de interactie van zink nanodeeltjes met naast elkaar bestaande chemische stoffen en hun gecombineerde effecten op aquatische organismen22. In een andere studie, een koperen photocatalyst op titanium materialen in waterige oplossing werd uitgebreid gekenmerkt door middel van inductief gekoppeld plasma optische-emissiespectrometrie (ICP-OES), N2 physisorption (inzet), XRD, UV-vis DRS, FT-IR, Raman spectroscopie, TEM-EDX en photoelectrochemical metingen23. Ons doel was om te vergelijken van de herkomst en eigenschappen van blaasjes en mineralen in twee cellijnen te begrijpen van het mechanisme waarmee mineralisatie tijdens werden differentiatie.

Figure 1
Figuur 1 . Regeling van de eerste stappen van mineralisatie in werden cellen waarbij de synthese van de extracellulaire matrix (ECM) eiwitten en vrijlating van matrix blaasjes (MVs) van de membraan. MVs accumuleren calcium door de werking van calcium bindende proteïnen, annexins en fosfaat, door de werking van een anorganisch fosfaat transporter (PiT) gevolgd door de activiteit van weefsel aspecifieke alkalisch fosfatase (TNAP), die dephosphorylates PPik om Pik, teneinde apatiet nucleatie. Vervolgens MVs desintegreren en vrij van apatites aan het extracellulaire medium. De mineralisatie is opgelopen door de constante aanvoer van Pik en Ca2 + in de extracellulaire middellange4,5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cultuur en behandeling van de cel

  1. Zet alle noodzakelijke materialen onder de motorkap laminaire flow en steriliseren hen onder UV-licht. De voedingsbodems zijn: een 1:1-mengsel van Ham de F12 en DMEM media met 2.5 mM L-glutamine aangevuld met 100 U/mL penicilline, 100 U/mL streptomycine, 0,3 mg/mL G418 en 10% foetale runderserum (FBS) (v/v) voor menselijke foetus hFOB 1.19 SV40 grote T antigeen transfected Botcellen en McCoy's 5A medium met 1,5 mM L-glutamine aangevuld met 100 U/mL penicilline, 100 U/mL streptomycine en 15% FBS (v/v) voor menselijke Osteosarcoom Saos-2 cellen.
  2. Cultuur hFOB 1.19 cellen bij 34 ° C in een atmosfeer van 5% CO2 en Saos-2 cellen bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2. Overdracht van celculturen, ofwel hFOB-1.19 of Saos-2 cellen, van de incubator de laminaire flow Hood en wijzig het medium in 10 mL verse kweekmedium met FBS.
  3. Incubeer de cellen zonder stimulatoren (rustende cellen) of stimuleren ze met 50 µg/mL ascorbinezuur (AA) gevolgd door 7.5 mM β-Glycerophosphate (β-GP), bereid eerder in ultrazuiver water en gefilterd door 0,22 µm spuit filters. Voeg de stimulatoren van kunststof microcentrifuge buizen op het oppervlak van het kweekmedium. Zachtjes roeren van de cultuur-schotel en incubeer gedurende 7 dagen.

2. opsporing van Calcium mineralen

  1. Wassen van de celculturen met fosfaat Buffer zoutoplossing (PBS: 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM nb2HPO4, 1 mM KH2PO4, pH 7,0).
  2. Voeg 5 mL van 2% (g:100 mL) AR-S in PBS, pH 5.0 en Incubeer de platen gedurende 30 minuten om de mineralen vlek.
  3. 3 keer wassen met PBS. Zorgvuldig PBS toevoegen aan de muur van de schotel, probeer niet te vernietigen de mineralen.
  4. Calcium mineralen onder een omgekeerde lichte Microscoop te observeren en nemen van beelden.

3. visualisatie van sondes onder UV-licht

  1. Behandelen voor cel lysates, celculturen, rusten of gestimuleerd voor 7 dagen, volgens de collagenase spijsvertering protocol24.
  2. Het medium van celculturen verzamelen en wassen van de cellen met PBS.
  3. Het verteren van de cellen met 3 mL 500 U/mL collagenase in een oplossing van 0,25 M sacharose, 0,12 M NaCl, 0,01 M KCl en 0,02 M Tris-HCl buffer, pH 7,45, bij 37 ° C gedurende 3 uur.
  4. Mechanisch schrapen van de cellen, overbrengen naar kunststof microcentrifuge buizen en passeren ze 10 keer een 1 mL 40 U spuit met 0,5 × 16 naald.
  5. Centrifugeer de monsters bij 500 × g gedurende 5 min.
  6. Verwijder het supernatant en Suspendeer de pellet cel in 500 µL van synthetische kraakbeen lymfe (SCL, 100 mM NaCl, 12,7 mM KCl, 0,57 mM MgCl2, 1.83 mM NaHCO3, 0,57 mM NaH2PO4, 5.5 mM D-glucose, sacharose 63 mM, 16,5 mM Hepes, pH 7.4).
  7. Overdracht van het hydroxyapatiet (HA), fluorapatiet (FA) en chlorapatite (CA) poeders van de flessen op de UV-transilluminator met een spatel en gebruik als besturingselementen.
  8. Overdracht van de cel lysates van de plastic buizen met kunststof tips en zorgvuldig plaats op de UV-transilluminator.
  9. Neem beelden onder zichtbaar en UV-licht.

4. voorbereiding van sondes voor TEM-EDX

  1. Voorbereiding van mineralen negatieve kleuring
    1. Opschorten van 2,5 mg van synthetisch geproduceerde HA, CA en FA mineralen25 in 500 µL van gedeïoniseerd water en Incubeer bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2 voor 1 h.
    2. Neem Formvar/Carbon 300 Mesh Ni rasters uit de kist met een antistatische Tang, plaats op een porseleinen multi goed plaat en drop 10 µL van HA, CA en FA schorsingen op de rasters.
    3. Het drogen van de monsters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Voorbereiding van de rust en gestimuleerd cellen voor het insluiten van 26
    1. Medium van de celculturen verzamelen en wassen van de cellen met fysiologische desensibilisatie (PD), medium (125 mM NaCl, 5 mM KCL, 10 mM, NaHCO3, 1 mM KH2PO4, 10 mM glucose, 20 mM HEPES, pH 7.4).
    2. Het herstellen van de cellen met 5 mL van een mengsel van 3% (g:100 mL) paraformaldehyde/1% (g:100 mL) Glutaaraldehyde in 100 mM natrium fosfaatbuffer, pH 7,2, gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder de zuurkast.
    3. Spoel de cellen met 5 mL 100 mM natriumfosfaat buffer en zachtjes de buffer te verwijderen na het wassen.
    4. Postfix in de donkere kamer, de monsters met 2 mL van de 1% (g:100 mL) osmium tetroxide in 100 mM natrium fosfaatbuffer, pH 7,2, gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur onder de zuurkast.
    5. Osmium tetroxide verwijderen en gebruiken.
    6. Wassen van de cellen met 5 mL 100 mM natriumfosfaat buffer.
    7. Vervolgens het uitdrogen van de monsters in 5 mL aliquots van een gesorteerde ethanol oplossing reeks bij kamertemperatuur: 25% (vol.) voor 5 min 50% (vol.) gedurende 10 minuten, 75% (vol.) gedurende 15 minuten, 90% (vol.) voor 20 min. Ten slotte absolute ethanol twee keer toepassen en incubeer gedurende 30 min en 12u.
    8. Mechanisch schrapen van de cellen van de plastic petrischaaltjes voor cultuur, verzamelen in kunststof microcentrifuge buizen en centrifugeren van de monsters bij 130 x g gedurende 1 minuut.
    9. Verwijder het supernatant en opschorten van de cellen in 1 mL van een mengsel van de LR White hars en absolute ethanol op een volumeverhouding 1:2.
    10. Meng goed de inhoud van de glazen buizen voor gebruik en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    11. Centrifugeer de monsters bij 130 x g gedurende 1 minuut.
    12. Verwijder het supernatant en herhaal de vorige stap met behulp van 1 mL van een mengsel van 1:1 van LR White hars en absolute ethanol.
    13. Meng goed en laat 30 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
    14. Centrifugeer de monsters bij 130 x g gedurende 1 minuut.
    15. Verwijder het supernatant.
    16. Ten slotte, voeg 1 mL pure LR wit hars aan de monsters tweemaal en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in plastic buizen.
    17. Plaats 500 µL van elk monster in gelatine capsules.
      Opmerking: De monsters worden aangeduid met behulp van een klein vel papier en een potlood zodat de hars niet van de etiketten vernietigen doet.
    18. Sluit de gelatine capsules, zet hen in kunststof microcentrifuge buizen en centrifugeer bij 130 x g voor 1 min in de rotor van een swing-out.
    19. Verwijder de capsules van de plastic buizen met behulp van een vacuümpomp.
    20. De monsters naar de oven en polymeriseren bij 56 ° C gedurende 48 uur.
    21. Bereid de blokken door hen in de houder montage- en trimmen hen naar de piramide.
    22. Zet de houder in de ultramicrotome, hechten de diamond Ultra 45° mes en vul deze met gedeïoniseerd water; denk er aan het mes van incidentele luchtbellen.
    23. Knip secties (700 Å) met behulp van het mes van de diamant op het gedeïoniseerd waterbad.
    24. De restjes met behulp van boviene wimper en plaats die ze op de glanzende zijde van de Formvar/Carbon 300 mesh Ni raster instellen en droog ze af.
    25. Bereiden van 2,5% (vol.) uranyl acetaat in absolute ethanol in het donker in een zuurkast. Houd de uranyl-acetaat in een container van lood en vergeet niet te halen van het sediment.
    26. Counterstain in de donkere kamer, de rasters van synthetische apatites en celsteekproeven met 2,5% (vol.) uranyl acetaat in ethanol gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur onder de zuurkast.
    27. De rasters in 50% ethanol (door vol.), vervolgens in gedeïoniseerd water wassen en drogen bij kamertemperatuur gedurende 24 uur. Ten slotte zet de rasters in het vak.

5. TEM-EDX analyse

  1. TEM beeldvorming door een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) uitgerust met volledige reeks Energy Dispersive X-ray Microanalyse (EDX) systeem en 11 Megapixel camera
    1. De houder van een beryllium voorbereiden op de waarneming van mineralen en cellen. Antistatische hulpmiddelen gebruiken.
    2. Het paar van schroeven verwijderen en til de beryllium plaat en beryllium wasmachine weg van de rest van de retainer.
    3. Monteer het raster, de glanzende zijde, op de houder.
    4. Zorgvuldig plaatst de beryllium wasmachine en beryllium plaat en schroef de schroeven stevig vast.
    5. Zet de houder in de Vacuuemcel en zet de vacuümpomp.
    6. Zodra een vacuüm is bereikt, zachtjes de houder aansluit op de imaging kamer en inschakelen van de lichtbundel.
    7. Stel de diafragma-parameters van de Microscoop op de fluorescerende monitor. Uitvoeren van beeld astigmatisme correctie; instellen van de zoom, focus en frame; en nemen van beelden van de TEM bij een vergroting van 50, 000 X.
  2. STAM beeldvorming en X-ray Microanalyse spectrale en compositorische p.a.
    1. De energie dispersieve x-stralen (EDX) detector invoegen de scannen imaging zaal van de transmissie-elektronenmicroscopie (STEM).
    2. De scherpte van de afbeelding in de focus-modus instellen.
    3. STAM beelden nemen bij een vergroting van 15 000 X.
    4. Selecteer een punt in de steekproef voor X-ray Microanalyse en verzamelen van spectra.
    5. Verkrijgen van gegevens langs de optelling van alle atoommassa voor alle elementen van het periodiek in de steekproef (als 100%) en de inhoud van de geselecteerde elementen betekenende: Ca, F, Cl en P (in atomaire %). Vervolgens berekenen de ratio's van Ca, F of Cl tot P voor elk monster.
  3. Ion toewijzing
    1. Selecteer elementen zoals calcium, fluor, chloor en fosfor ion toewijzing maken en uitvoeren van EDX kaarten van de geselecteerde elementen in de monsters.
    2. Verkrijgen van gegevens door aan te geven van de lokalisatie van de geanalyseerde elementen: Ca, F, Cl en P (in atomaire %) en de co lokalisatie (in %) van de Ca, F of Cl met P voor elk monster te berekenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TEM-EDX zorgt voor de beeldvorming in vitro van matrix blaasjes (MVs) uitgebracht door mineralizing cellen en mineralen geproduceerd door MVs. de resultaten verkregen met behulp van deze techniek laten zien dat het proces van mineralisatie anders kan gaan in verschillende soorten cellen. De twee cellijnen ontvangen dezelfde osteoblastic transdifferentiatie behandeling, maar gestimuleerd Saos-2 cellen gemineraliseerde efficiënter dan hFOB 1.19 botcellen, zoals blijkt uit de AR-S kleuring (Figuur 2). Dit kan te wijten zijn aan de meer volwassen osteoblast fenotype van Saos-2 cellen19 in vergelijking met hFOB 1.19 cellen20. De visualisatie van de monsters met behulp van een UV transilluminator maakte duidelijk dat alleen fluorapatites kan worden waargenomen onder UV-licht (Figuur 3). TEM afbeeldingen aangegeven dat gestimuleerd Saos-2 cellen meer blaasjes met mineralen in vergelijking met gestimuleerd hFOB cellen of produceren met de rust van de Saos-2 cellen (Figuur 4, linker- en middelste panelen). Synthetische apatites hebben verschillende vormen van de mineralen (Figuur 4, rechter paneel). TEM beelden bleek de aanwezigheid van blaasjes in hFOB 1.19 en Saos-2 cellen onder het rusten en voorwaarden (Figuur 5, deelvenster links) gestimuleerd. Op EDX ion maps, rode punten geven aan calcium, groene punten tonen fosfor en blauwe punten wijzen op de fluor distributies (Figuur 5, middelste deelvenster). Gestimuleerd is, er een sterke overlapping tussen calcium en fosfor distributies in blaasjes geproduceerd door Saos-2 cellen en tussen fluor en fosfor in blaasjes geproduceerd door hFOB 1.19 cellen (Figuur 5, rechter paneel).

Figure 2
Figuur 2 . AR-S kleuring van mineralen (rood) geproduceerd door hFOB 1.19 (bovenste deelvenster) en Saos-2 (onderste paneel) cellen ofwel rust (R) of na 7 dagen na stimulatie met AA en β-GP (S). Bar: 25 µm. Een typisch resultaat met n = 3 wordt gepresenteerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 . Visible (bovenste deelvenster) (middelste deelvenster) UV licht visualisatie van synthetische HA, CA en FA mineralen en mineralen geproduceerd door hFOB 1.19 (onderste linker paneel) en Saos-2 (onderste juiste paneel) cellen ofwel rust (R) of na 7 dagen na stimulatie met AA en β-GP (S) . Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 4
Figuur 4 . TEM beelden van blaasjes en mineralen geproduceerd door hFOB 1.19 (linkerdeel) en Saos-2 (middelste deelvenster) cellen ofwel rust (R) of na 7 dagen na stimulatie met AA en β-GP (S). Synthetische HA, CA en FA mineralen worden weergegeven als besturingselementen (rechtervenster). Bar: wit 500 nm, zwart 250 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 5
Figuur 5 . TEM beelden (linkerdeelvenster) van hFOB 1.19 en Saos-2 cellen ofwel rust (R) of na 7 dagen na stimulatie met AA en β-GP (S). Ion kaarten voor Ca (rood), Cl (geel), F (blauw) en P (groen) van EDX (middelste deelvenster). Co lokalisatie van elementen (rechtervenster): kalk (Ca), fosfor, fluor aan fosfor (F), of chloor aan fosfor (Cl) werd gekwantificeerd op basis van de kaarten van EDX. Bar: 500 nm. Drie onafhankelijke experimenten voor beide cellijnen werden uitgevoerd. Tien foto's van elke variant (rusten en gestimuleerd) werden genomen, dan van 2 tot en met 6 van hen werden geselecteerd voor de verdere berekening van element mede lokalisatie. Een typisch resultaat is voorgesteld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In het huidige document, beschreven we de protocollen voor AR-S kleuring, UV licht identificatie van fluorapatiet en TEM-EDX in vitro beeldvorming van MVs uitgebracht door mineralizing cellen en mineralen geproduceerd door MVs. Het is mogelijk om alle methodes hierboven vermeld door sommige gemeenschappelijke stappen voor probleemoplossing te volgen. Met het oog op een optimale resultaten, moeten verschillende kritische stappen zorgvuldig worden uitgevoerd. Eerst, is het beter om toe te voegen AA (die is zuur) gevolgd door β-GP (die is basisch) voor het behoud van de pH 7.4 van het kweekmedium. Ten tweede, na AR-S kleuring, de gekleurde kalkaanslag zijn zeer kwetsbaar en de cellen moeten gewassen worden met grote zorg om te voorkomen dat de vernietiging van de kristallen op het toevoegen van PBS. Ten derde, houd altijd de uranyl-acetaat in een container van lood en doen niet halen van het sediment, omdat alleen de verdunde breuk moet worden gebruikt voor fixatie. Ten vierde, onthoud dat AA en uranyl acetaat zijn licht gevoelig en moeten worden behandeld in de donkere kamer. Ten vijfde moet het mengsel van LR wit met absolute ethanol ruim vóór worden toegevoegd aan de monsters worden gemengd. Ten zesde moeten de monsters in gelatine capsules worden aangeduid met behulp van een klein vel papier en een potlood zodat de hars niet van de etiketten vernietigen doet. Zevende, het blad van de diamant mes moet zorgvuldig worden gereinigd van alle luchtbellen. In de achtste, monsters moeten worden geplaatst voorzichtig de glanzende zijde van het raster waar de film Formvar/Carbon is gelegen. Negende, plaats juist het punt op welke X-ray Microanalyse en ion toewijzing wordt uitgevoerd bij de TEM-opname te beperken van mogelijke problemen met apatiet erkenning.

Hoewel het voorgestelde protocol bleek te zijn meest gunstige in onze experimenteel ontwerp, is het mogelijk om aanpassen aan verschillende doelen. Net als bij elke andere techniek, heeft deze ook zijn beperkingen. Additionele technieken, zoals FTIR, moeten worden toegepast om te bevestigen of verifiëren van het bestaan van de verkregen verhouding van de onderzochte elementen8,12,26. De methode van de TEM-EDX hier gepresenteerd is een aanzienlijke verbetering ten opzichte van de bestaande methode, die is een combinatie van micro Raman-gebaseerde toewijzing en chemometric methoden en is vergelijkbaar met de beeldvorming van zilveren nanodeeltjes (AgNPs) distributie naar verschillende oppervlakken van minerale en het mechanisme van hun moleculaire interacties21. Raman gebaseerde imaging is getest op twee minerale modellen (macro - en micro-formaat). Raman kaarten gemaakt van n = 600-900 spectra voor elk monster/besturingselement werden geanalyseerd door Vespucci software en de resultaten werden bevestigd via andere methoden zoals ICP-OES, AFM en SEM-EDX. Onze TEM-EDX kaarten bestaande uit n = 30 frames en n = 6 spectra voor elk monster/besturingselement waren ook geanalyseerd door de Microanalyse Suite software, en de resultaten werden bevestigd via andere methoden zoals FTIR, FM, TEM, SPM en 3D topografische AFM4 , 5. de voorgestelde TEM-EDX belichten, zoals Raman gebaseerde imaging, vereist slechts minimale monstervoorbereiding Super-Sensitive, niet-invasieve en kosteneffectief is en kan worden uitgebreid tot andere systemen die relevant zijn voor de menselijke omgeving.

De gepresenteerde techniek kan worden gebruikt in een breed terrein van onderzoek in de toekomst. Het kan worden gewijzigd voor het onderzoek van verschillende natuurlijke en synthetische apatites. Het kan ook worden aangepast aan de protocollen van experimenten met biologische en chemische sondes. Alle elementen uit het periodiek systeem kunnen bovendien worden geanalyseerd om te visualiseren van niet alleen de morfologie van mineralen, maar ook veranderingen in de samenstelling van de ion en vervangingen. Ion exchange in apatites is een bekende procedure voor biomedische toepassing27. Een mogelijke fysiologische factor die bepaalt de Ca, F en Cl-ionen of Sr, Mg, Mn en Zn metaalion vervanging in de HA tijdens minerale formatie, die een keerpunt tussen fysiologische en pathologische mineralisatie, mogelijk de Pi/PPi verhouding7. Indien correct toegepast, deze techniek maakt het mogelijk voor het uitvoeren van de toewijzing van meerdere elementen van dezelfde cellulaire, vesiculaire of minerale regio meerdere keren in een rij.

In de afgelopen jaren is veel vooruitgang geboekt aangaande de mechanismen van bot mineralisatie28,29,30,31,32,33. We beseften dat verschillende cellijnen verschillende profielen van blaasjes en minerale vorming wellicht. In dit verband we twee menselijke cellijnen geselecteerd: osteoblastic hFOB 1.19 Osteosarcoom Saos-2, die ondergaan vult osteogenic transdifferentiatie van proliferatie te mineralisatie en produceren van MVs die leiden apatiet nucleatie in ECM 34 tot , 35.

AR-S kleuring van kalkaanslag geopenbaard dat gestimuleerd Saos-2 cellen anders dan hFOB 1.19 botcellen gemineraliseerde. Dit was gecorreleerd met de productie van mineralen door Saos-2 cellen die niet detecteerbaar onder UV-licht in tegenstelling tot degenen geproduceerd door hFOB 1.19 cellen waren. Onze TEM-EDX-gegevens bleek dat de mineralen in blaasjes van Saos-2 cellen geproduceerd vergelijkbaar met synthetische HA als gevolg van de overlap tussen calcium en fosfor distributies. De overlap tussen fluor en fosfor distributies in blaasjes uit hFOB 1.19 cellen aangegeven in tegenstelling de vorming van andere soorten mineralen naast apatites.

Kortom, onze bevindingen wijzen erop dat de blaasjes belangrijke determinanten van minerale nucleatie, vooral op het cellulaire niveau5,25 zijn. Bovendien zijn onze gegevens in overeenstemming met een eerder theorie dat MVs kunnen worden beschouwd als een gespecialiseerde vorm van microvesicles die kunnen beginnen mineralisatie zowel binnen als buiten de cel4. De vergelijking van blaasjes Saos-2 cellen, die mineralize efficiënter, verlost en blaasjes vrijgelaten uit hFOB 1.19 cellen met behulp van de microanalytical methode van de TEM-EDX ondersteunt de hypothese dat MVs mineraal gevulde blaasjes. Dit laat open de vraag of de aanwezigheid van MVs is vereist voor het opwekken van apatiet nucleatie en hoe dit fysiologische tot pathologische mineralisatie kan veranderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen conflict van belang hebben.

Acknowledgments

MK en ASK handmatige bewerkingen uitgevoerd en LB bereid tekeningen en maakte de film. ASK schreef het manuscript, LB schreef het script en MK bereid de tabel. SM, RB en SP lezen kritisch in de tabel, het script en het manuscript. De auteurs bedank Hanna Chomontowska voor haar uitstekende hulp bij ultramicrotomie evenals Szymon Suski en Henryk Bilski voor hun uitstekende hulp bij de analyse van de TEM-EDX. De auteurs bedank dr Patrick Groves voor professionele Engelstalige correctie en Barbara Sobiak voor het opnemen van de instructies.

Dit werk werd gesteund door grant N N401 140639 van het Poolse ministerie van Wetenschappen en hoger onderwijs te stellen vragen, door subsidies van de National Science Centre, Polen 2016/23/N/NZ4/03313 LB en 2016/23/N/NZ1/02449 te MK, EU KP7 Project BIOIMAGINE : BIO-IMAGing in onderzoek, innovatie en onderwijs, GA nr. 264173, en door de wettelijke middelen van het Nencki Institute of Experimental Biology, Poolse Academie van Wetenschappen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture PAA E15-813 1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium PAA E82312-0025 for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin) Sigma P0781-100ML 100 U/mL each
G-418 Sigma 68168 0.3 mg/mL
FBS Gibco 10270 10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA Sigma A-5960 50 µg/mL
ß-GP Sigma G9422-100G 7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel Bio-Rad 130-0420 for HA
FA synthesized by us
CA synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture Sigma S7907/S8282 0.1 M, pH 7.2
PBS pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS Sigma A5533-25G 0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA Sigma C2674 500 U/mL
SCL buffer prepared by us
Deionized wather produced by us
Ethanol POCh BA6480111 absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol Polysciences Inc. 21447-25 0.25 g/10 mL
PD medium pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde) Sigma 158127/G-6257 3%:1%
Post-fixation OsO4 Sigma 75633 1%
LR White resin in ethanol Polysciences Inc. 17411-MUNC 500g 1:2, 1:1, 100%
Acetone CHEMPUR 111024800 pure
Tool
Cryogenic vials Corning Inc. 430487 1.2 mL
Plastic Petri culture dishes Falcon 353003 100 mm
Plastic tubes Falcon 352096 and 352070 15 and 50 mL
Serological pipettes Falcon and VWR 357521 and 612-3700 1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes Sigma Z688312 and Z628034 1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips VWR 613-0364, 613-0239 and 613-1050 0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks Light Labs A-7055-Z, A-7053-C green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save Thermo Scientific Co. KS12 HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell Thermo Scientific Co. 150 34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood POLON WCS-2 for TEM stainings
Glass bottles SIMAX 1632414501050 and 1632414501100 50 and 100 mL
Quartz glass tubes SIMAX 638422010100 Ø 10 mm, L 100 mm
Pump IBS Integra Biosciences VACUSAFE comfort for vacuum
Oven Memmert UNE 400 56°C
Porcelain multi-well plate Rosenthal technik 229/12 12 wells
Glass beakers SIMAX 632417010025 25 mL
Glass bottles Pocord DIN22 10 mL
Plastic box Agar Scientific Ltd. for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules Agar Scientific Ltd. G3741 size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box Agar Scientific Ltd. S162N3 film on the shiny side
Silicon cell scraper Sigma SIAL0010-100EA size 1.8/25 cm
Syringe with needle BogMark 007 syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe Chirana CH005L 5 mL
Centrifuge MPW Medical Instruments MPW-350R 130 x g and 500 x g
UV transluminator UVP M-20 for visible and UV light
Ultramicrotome LKB NOVA 700Å sections
Block holder LKB E6711 round shape
Diamond knife DiATOME Ultra 45° size 3
Eyelash holder bovine, prepared by us
Forceps ROTH 2855.1 antistatic for grids
Spatulas set ROTH E286.1 antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope Zeiss with Canon AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9 Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses Nikon Nikon D7100
Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D
Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G
Nikkor AF 28 mm f/2.8D 		for movie recordings
Microphone MXL Mics Tempo for voice recordings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. Bone structure and function. Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).
  2. Anderson, H. C. Molecular biology of matrix vesicles. Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).
  3. Anderson, H. C. Matrix vesicles and calcification. Curr Rheumatol. 5 (3), 222-226 (2003).
  4. Bolean, M., Simão, A. M. S., Barioni, M. B., Favarin, B. Z., Sebinelli, H. G., Veschi, E. A., Janku, T. A. B., Bottini, M., Hoylaerts, M. F., Itri, R., Millán, J. L., Ciancaglini, P. Biophysical aspects of biomineralization. Biophys Rev. 9 (5), 747-760 (2017).
  5. Bottini, M., Mebarek, S., Anderson, K. L., Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Simão, A. M. S., Bolean, M., Ciancaglini, P., Bandorowicz Pikula, J., Pikula, S., Magne, D., Volkmann, N., Hanein, D., Millán, J. L., Buchet, R. Matrix vesicles from chondrocytes and osteoblasts: Their biogenesis, properties, functions and biomimetic models. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 532-546 (2018).
  6. Hessle, L., Johnson, K. A., Anderson, H. C., Narisawa, S., Sali, A., Goding, J. W., Terkeltaub, R., Millan, J. L. Tissue-nonspecific alkaline phosphatase and plasma cell membrane glycoprotein-1 are central antagonistic regulators of bone mineralization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (14), 9445-9449 (2002).
  7. Garimella, R., Bi, X., Anderson, H. C., Camacho, N. P. Nature of phosphate substrate as a major determinant of mineral type formed in matrix vesicle-mediated in vitro mineralization: An FTIR imaging study. Bone. 38 (6), 811-817 (2006).
  8. Thouverey, C., Bechkoff, G., Pikula, S., Buchet, R. Inorganic pyrophosphate as a regulator of hydroxyapatite or calcium pyrophosphate dihydrate mineral deposition by matrix vesicles. Osteoarthr. Cartil. 17, 64-72 (2009).
  9. Terkeltaub, R. A. Inorganic pyrophosphate generation and disposition in pathophysiology. Am. J. Phys. 281 (1), 1-11 (2001).
  10. Guicheux, J., Palmer, G., Shukunami, C., Hiraki, Y., Bonjour, J. P., Caverzasio, J. A novel in vitro culture system for analysis of functional role of phosphate transport in endochondral ossification. Bone. 27 (1), 69-74 (2000).
  11. Yadav, M. C., Bottini, M., Cory, E., Bhattacharya, K., Kuss, P., Narisawa, S., Sah, R. L., Beck, L., Fadeel, B., Farquharson, C., Millán, J. L. Skeletal mineralization deficits and impaired biogenesis and function of chondrocyte-derived matrix vesicles in Phospho1(-/-) and Phospho1/Pi t1 double-knockout mice. J. Bone Miner. Res. 31 (6), 1275-1286 (2016).
  12. Thouverey, C., Malinowska, A., Balcerzak, M., Strzelecka-Kiliszek, A., Buchet, R., Dadlez, M., Pikula, S. Proteomic characterization of biogenesis and functions of matrix vesicles released from mineralizing human osteoblast-like cells. J. Proteome. 74 (7), 1123-1134 (2011).
  13. Wang, W., Xu, J., Kirsch, T. Annexin-mediated Ca2+ influx regulates growth plate chondrocyte maturation and apoptosis. J. Biol. Chem. 278 (6), 3762-3769 (2003).
  14. Nollet, M., Santucci-Darmanin, S., Breuil, V., et al. Autophagy in osteoblasts is involved in mineralization and bone homeostasis. Autophagy. 10 (11), 1965-1977 (2014).
  15. Boonrungsiman, S., Gentleman, E., Carzaniga, R., Evans, N. D., McComb, D. W., Porter, A. E., Stevens, M. M. The role of intracellular calcium phosphate in osteoblast-mediated bone apatite formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 14170-14175 (2012).
  16. Genge, B. R., Wu, L. N., Wuthier, R. E. In vitro modeling of matrix vesicle nucleation: synergistic stimulation of mineral formation by annexin A5 and phosphatidylserine. J. Biol. Chem. 282 (36), 26035-26045 (2007).
  17. Jahnen-Dechent, W., Schäfer, B., Ketteler, M., McKee, M. D. Mineral chaperones: a role for fetuin-A and osteopontin in the inhibition and regression of pathologic calcification. J. Mol. Med. (Berl). 86 (4), 379-389 (2008).
  18. Suchanek, W., Yoshimura, M. Processing and properties of hydroxyapatite-based biomaterials for use as hard tissue replacement implants. J. Miner. Res. 13 (1), 94-117 (1998).
  19. Pautke, C., Schieker, M., Tischer, T., Kolk, A., Neth, P., Mutschler, W., Milz, S. Characterization of osteosarcoma cell lines MG-63, Saos-2 and U-2 OS in comparison to human osteoblasts. Anticancer Res. 24 (6), 3743-3748 (2004).
  20. Yen, M. -L., Chien, C. -C., Chiu, I. -M., Huang, H. -I., Chen, Y. -C., Hu, H. -I., Yen, B. L. Multilineage differentiation and characterization of the human fetal osteoblastic 1.19 cell line: a possible in vitro model of human mesenchymal progenitors. Stem Cells. 25 (1), 125-131 (2007).
  21. Brittle, S. W., Foose, D. P., O'Neil, K. A., Sikon, J. M., Johnson, J. K., Stahler, A. C., Ryan, J. D., Higgins, S. R., Sizemore, I. E. A raman-based imaging method for characterizing the molecular adsorption and spatial distribution of silver nanoparticles to hydrated mineral surfaces. Environ Sci Technol. , (2018).
  22. Liu, N., Wang, Y., Ge, F., Liu, S., Xiao, H. Antagonistic effect of nano-ZnO and cetyltrimethyl ammonium chloride on the growth of Chlorella vulgaris: Dissolution and accumulation of nano-ZnO. Chemosphere. 196, 566-574 (2018).
  23. Tasbihi, M., Kočì, K., Troppová, I., Edelmannová, M., Reli, M., Čapek, L., Schomäcker, R. Photocatalytic reduction of carbon dioxide over Cu/TiO2 photocatalysts. Environ Sci Pollut Res Int. , (2017).
  24. Chen, N. X., O'Neill, K. D., Chen, X., Moe, S. M. Annexin-Mediated Matrix Vesicle Calcification in Vascular Smooth Muscle Cells. J. Bone Miner. Res. 23 (11), 1798-1805 (2008).
  25. Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S. Characteristics of minerals in vesicles produced by human osteoblasts hFOB 1.19 and osteosarcoma Saos-2 cells stimulated for mineralization. J. Inorg. Bioch. 171, 100-107 (2017).
  26. Thouverey, C., Strzelecka-Kiliszek, A., Balcerzak, M., Buchet, R., Pikula, S. Matrix vesicles originate from apical membranę microvilli of mineralizing osteoblast-like Saos-2 cells. J. Cell. Biochem. 106 (1), 127-138 (2009).
  27. Cazalbou, S., Eichert, D., Ranz, X., Drouet, C., Combes, C., Harmand, M. F., Rey, C. Ion exchanges in apatites for biomedical application. J. Mater. Sci. Mater. Med. 16 (5), 405-409 (2005).
  28. Kraus, D. Consolidated data analysis and presentation using an open-source add-in for the Microsoft Excel® spreadsheet software. Med. Writ. 23 (1), 25-28 (2014).
  29. Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annu. Rev. Genet. 43, 119-142 (2009).
  30. Bonucci, E. Bone mineralization. Front. Biosci. 17, 100-128 (2012).
  31. Veis, A., Dorvee, J. R. Biomineralization mechanisms: A new paradigm for crystal nucleation in organic matrices. Calcif. Tissue Int. 93 (4), 307-315 (2013).
  32. Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A., Sone, E. D. In vitro models of collagen biomineralization. J. Struct. Biol. 183 (2), 258-269 (2013).
  33. Alliston, T. Biological regulation of bone quality. Curr. Osteoporos. Rep. 12 (3), 366-375 (2014).
  34. Wang, W., Kirsch, T. Retinoic acid stimulates annexin-mediated growth plate chondrocyte mineralization. J. Cell Biol. 157 (6), 1061-1069 (2002).
  35. Wang, W., Xu, J., Kirsh, T. Annexin V and terminal differentiation of growth plate chondrocytes. Exp. Cell Res. 305 (1), 156-165 (2005).

Tags

Chemie kwestie 136 mineralen blaasjes botcellen Osteosarcoom UV-licht TEM-EDX
Analyse van mineralen geproduceerd door hFOB 1.19 en Saos-2 cellen met behulp van Transmissie Electronenmicroscopie met energie dispersieve x-stralen Microanalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bozycki, L., Komiazyk, M., Mebarek,… More

Bozycki, L., Komiazyk, M., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S., Strzelecka-Kiliszek, A. Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis. J. Vis. Exp. (136), e57423, doi:10.3791/57423 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter