Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Analys av mineraler produceras av hFOB 1.19 och Saos-2 celler använder transmissionselektronmikroskopi med Energy Dispersive X-ray mikroanalys

Published: June 24, 2018 doi: 10.3791/57423
Automatic Translation
1, 1, 2,3,4,5,6, 2,3,4,5,6, 1, 1
1Laboratory of Lipid Biochemistry, Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences, 2Université de Lyon, 3Université Lyon 1, 4L'insitut National des Sciences Appliquées (INSA) de Lyon, 5Ecole Supérieure de Chimie Physique Electronique (CPE) Lyon, 6Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Unité Mixte de Recherche (UMR), L'institut de Chimie et Biochimie Moléculaires et Supramoléculaires (ICBMS)

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att jämföra staten av mineraler i blåsor släpptes av två mänskliga ben cellinjer: hFOB 1.19 och Saos-2. Sina mineralisering profiler analyserades av Alizarin Red-S (AR-S) färgning, ultraviolett (UV) ljus visualisering, överföring elektronmikroskopi (TEM) imaging och energy dispersive X-ray mikroanalys (EDX).

Abstract

Denna video presenterar användning av transmissionselektronmikroskopi med energy dispersive X-ray mikroanalys (TEM-EDX) att jämföra staten av mineraler i blåsor släpptes av två mänskliga ben cellinjer: hFOB 1.19 och Saos-2. Dessa cellinjer, efter behandling med askorbinsyra (AA) och β-glycerofosfat (β-GP), genomgå fullständig osteogent transdifferentiation från spridning till mineralisering och producera matrix blåsor (MVs) som utlöser apatit kärnbildning i den extracellulär matrix (ECM).

Baserat på Alizarin Red-S (AR-S) färgning och analys av sammansättning av mineraler i cell lysates med ultraviolett (UV) ljus eller blåsor med hjälp av TEM imaging följt av EDX kvantifiering och ion kartläggning, vi kan dra slutsatsen att osteosarkom Saos-2 och osteoblastiska hFOB 1.19 celler avslöja distinkta mineralisering profiler. SAOS-2-celler mineralize mer effektivt än hFOB 1.19 celler och producera större mineralfyndigheter som inte är synligt i UV-belysning men liknar hydroxyapatit (HA) att de har mer Ca och F substitutioner.

De resultat som erhålls med hjälp av dessa tekniker tillåter oss att dra slutsatsen att processen för mineralisering skiljer sig beroende på cellen. Vi föreslår att på cellnivå, ursprung och egenskaper av blåsor förutbestämma vilken typ av mineraler.

Introduction

Ben är en typ av bindväv som består av två delar: ekologisk (celler och kollagenfibrer) och mineraler (kalcium och fosfat föreningar). Mineraliska huvudkomponenterna i ben är apatites1. Olika typer av mineralisering-kompetenta celler i skelettet (osteoblaster), tänder (odontoblaster) och brosk (kondrocyter) reglera de första stegen av mineralisering av producerar proteiner av den extracellulär matrixen (ECM) och släppa matris blåsor (MVs) (figur 1). MVs är 100-300 nm diameter blåsor som ackumuleras kalcium och fosfat underlätta apatit kärnbildning och därefter binda till kollagen2,3. Sedan, MVs upplösas för att släppa apatites till extracellulära medium. Apatites fortsätter att växa i kontakt med kollagenfibrer och bilda benmatrix. Mineraliseringen upprätthålls av den konstant tillförselen av Pjag och Ca2 + i det extracellulära mediet. Några nyligen publicerade data stödjer vår modell4,5. Mjuka vävnader inte mineralize under fysiologiska betingelser. Ektopisk förkalkning kan dock inträffa under sjukdomstillstånd såsom vaskulär förkalkning3. Vaskulära celler som förvärvar osteoblast fenotypen kan producera MVs som inducerar kärnbildning av apatites och initiera mineralisering i väggen mediala och intimans lager av blodkärl. Sedan ektopisk förkalkning likna normala endochondral mineralisering3, förstå de molekylära mekanismerna av mineralisering av bendefekter celler och kondrocyter bör ge några ledtrådar om ektopisk förkalkning av mjukvävnad som är bildas.

Utvecklingen av skelettet vävnader regleras av olika enzymer, tillväxtfaktorer, och initiativtagare eller hämmare av mineralisering. Åtgärden antagonistiska vävnad-ospecifik alkaliskt fosfatas (TNAP) (figur 1) och ectonucleotide pyrophosphatase/fosfodiesteras jag (NPP1), tillsammans med ankyrin (ANK), styr oorganisk pyrofosfat (PPjag) koncentration 6. PPjag, en potent hämmare av HA bildandet, hydrolyseras av TNAP; NPP1 hydrolyserar nukleotid trifosfater bildar PPjag medan ANK export PPjag från cellen till ECM. Förhållandet Pi/PPi kan reglera apatit bildandet7,8 med eventuella patologiska konsekvenserna9.

MV membranet är berikad i ion transportproteiner som underlättar inledande utfällning av kalcium och fosfat inuti MVs under processen kärnbildning (figur 1). Fosfat transportören 1 (PiT) hjälper till att införliva Pjag genereras i perivesicular utrymme till MVs10,11. Annexins kan vara inblandade i bindningen och transport av Ca2 + och biofysiska processen som initierar mineralisering i MV lumen12,13. Vi gynnar den hypotesen, föreslog tidigare, för mineralisering inom intracytoplasmatisk blåsor av interna kärnbildning av apatit inuti MV innan dess förökning i ECM14,15. In vitro modellering bekräftade induktion av Ca2 +/Pjag komplex bildande i proteoliposomes gjorda av PS och AnxA516. Detta kan tyda på att ansamling av Ca2 +, Pjag, AnxA5 och PS komplex i lipid rafts av Mikrovilli-liknande membranesrepresent kärnbildning kärnan (NC) i apatite inom MVs. Annexins och TNAP också äger kollagen bindande kapacitet som kan vara till hjälp i att placera MVs längs kollagenfibrer och stimulera spridningen av mineralisering i ECM. Fetuin A och osteopontin (OPN)17, är kända som hämmare av apatit bildandet som kan bromsa förökningen av mineralisering på kollagena schavotten. Kärnbildning och förökning är separata händelser, den förstnämnda som föregår den senare, och båda kan vara relevanta för processen av patologiska mineralisering.

För att upptäcka hur kemin av kalciumfosfat komplex kan ändra fysiologiska mineralisering och ektopisk förkalkning, är det nödvändigt att identifiera de mineraler som produceras av celler. Apatites är en grupp av kalcium och fosfat som innehåller mineraler med den allmänna crystal enhet cell formeln Ca10(PO4)6X2, där X = Cl, F, OH. De klassificeras enligt följande18: Fluorapatit (FA) Ca10(PO4)6F2, chlorapatite (CA) Ca10(PO4)6Cl2 och hydroxyapatit (HA) Ca10(PO4 )6(OH)2.

Valet av osteoblast cellinjer att framkalla mineral bildas är avgörande, eftersom varje cellinje uppvisar en tydlig profil av mineralisering. I detta betänkande, Vi jämförde kärnbildning av mineraler av två valda mänsklig cellmodeller av mineralisering: osteoblastiska hFOB 1.19 och osteosarkom Saos-2 celler. Osteosarkom-derived celler används ofta som osteoblastiska modeller och Saos-2-celler har bevarat de mest mogna osteoblastiska karaktär19 medan odifferentierade mänskliga fostrets hFOB celler används allmänt som en modell för normal osteoblastiska differentiering20. Sina mineralisering profiler analyserades av olika metoder: Alizarin Red-S (AR-S) färgning, ultraviolett (UV) ljus visualisering, överföring elektronmikroskopi (TEM) imaging, energy dispersive X-ray mikroanalys (EDX) kvantifiering och ion kartläggning. Fördelen med TEM-EDX jämfört med alternativa tekniker som används i tidigare studier är att det ger kvantitativa och kvalitativa resultat av ion ersättare i apatite kristaller4,5,21. Det övergripande målet med TEM-EDX var att hitta en enkel metod för avbildning och kvantifiering av fördelningen av Ca, F och Cl-joner i olika mineraler från olika typer av celler under olika faser av processen mineralisering. Denna metod har använts framgångsrikt, till exempel för att övervaka växelverkan av zink nanopartiklar med samtidiga kemikalier och deras kombinerade effekter på vattenlevande organismer22. I en annan studie, en koppar fotokatalysator på titanium material i vattenlösning präglades i stor utsträckning genom induktivt kopplad plasma OEC (ICP-OES), N2 physisorption (insats), XRD, UV-vis DRS, FT-IR, Raman spektroskopi och TEM-EDX photoelectrochemical mätningar23. Vårt syfte var att jämföra ursprung och egenskaper av blåsor och mineraler i två cellinjer att förstå mekanismen som styr mineralisering under bendefekter differentiering.

Figure 1
Figur 1 . Systematiken i de första stegen av mineralisering i bendefekter celler med syntesen av extracellulär matrix (ECM) proteiner och frisättning av matrix blåsor (MVs) från membranet. MVs ackumuleras kalcium genom åtgärder av kalcium bindande proteiner, annexins och fosfat, genom åtgärder av ett oorganiskt fosfat transportör (PiT) följt av aktiviteten av vävnad ospecifika alkaliska fosfataser (TNAP), som defosforylerar PPjag att Pjag, därigenom underlätta apatit kärnbildning. Sedan MVs upplösas och släppa apatites till extracellulära medium. Mineraliseringen upprätthålls av den konstant tillförselen av Pjag och Ca2 + i den extracellulära medium4,5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cell kultur och behandling

  1. Sätta allt nödvändigt material under laminärt flöde huven och sterilisera dem under UV-ljus. Kultur media är: en 1:1 blandning av skinka är F12 och DMEM media med 2,5 mM L-glutamin kompletteras med 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 0,3 mg/mL G418 och 10% fetalt bovint Serum (FBS) (v/v) för mänskliga fostret hFOB 1.19 SV40 stora T-antigen transfekterade osteoblaster och McCoys medium 5A med 1,5 mM L-glutamin kompletteras med 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin och 15% (v/v) FBS för mänskliga osteosarkom Saos-2 celler.
  2. Kultur hFOB 1,19 på 34 ° C i en atmosfär av 5% CO2 och Saos-2 celler vid 37 ° C i en atmosfär av 5% CO2. Överföra cellkulturer, antingen hFOB 1.19 eller Saos-2 celler, från inkubatorn till laminär huven och ändra medium 10 ml av färskt odlingssubstrat med FBS.
  3. Inkubera cellerna utan stimulatorer (vilande celler) eller stimulera dem med 50 µg/mL askorbinsyra (AA) följt av 7.5 mM β-glycerofosfat (β-GP), förberett tidigare i ultrarent vatten och filtreras genom 0,22 µm spruta filter. Lägg till stimulatorer från plast mikrocentrifugrör på ytan av odlingssubstratet. Försiktigt rör kultur skålen och inkubera i 7 dagar.

2. detektion av kalcium mineraler

  1. Tvätta cellkulturer med fosfat buffert saltlösning (PBS: 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, pH 7,0).
  2. Tillsätt 5 mL 2% (g:100 mL) AR-S i PBS, pH 5,0 och inkubera plattorna för 30 min till fläcken mineraler.
  3. Tvätta 3 gånger med PBS. Försiktigt lägga till PBS i skålen väggen, inte försöka förstöra mineraler.
  4. Observera kalcium mineraler under ett inverterat ljusmikroskop och ta bilder.

3. visualisering av sonder i UV-belysning

  1. För cell lysates, behandla cellkulturer, antingen vila eller stimuleras i 7 dagar, enligt kollagenas matsmältningen protokoll24.
  2. Samla in mediet från cellodlingar och tvätta cellerna med PBS.
  3. Smälta cellerna med 3 mL 500 U/mL kollagenas i en lösning av 0,25 M sackaros, 0,12 M NaCl, 0,01 M KCl och 0,02 M Tris / HCl buffert, pH 7,45, vid 37 ° C i 3 h.
  4. Mekaniskt skrapa cellerna, överföra dem till plast mikrocentrifugrör och passera dem 10 gånger genom en 1 mL 40 U spruta med 0.5 × 16 nål.
  5. Centrifugera proverna vid 500 × g i 5 min.
  6. Avlägsna supernatanten och centrifugerade cell i 500 µL av syntetiska brosk lymfan (SCL, 100 mM NaCl, 12,7 mM KCl, 0,57 mM MgCl2, 1,83 mM NaHCO3, 0,57 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-glukos, 63 mM sackaros, 16.5 mM Hepes, pH 7,4).
  7. Överföra hydroxyapatit (HA), Fluorapatit (FA) och chlorapatite (CA) pulver från flaskorna på den UV-transilluminator med en spatel och använda som kontroller.
  8. Överföra den cell lysates från plaströren med plast tips och placera försiktigt på den UV-transilluminator.
  9. Ta bilder under synligt och UV-ljus.

4. beredning av sonder för TEM-EDX

  1. Preparering av mineraler för negativ färgning
    1. Avbryta 2,5 mg syntetiskt framställda HA, CA och FA mineraler25 i 500 µL avjoniserat vatten och inkubera vid 37 ° C i en atmosfär av 5% CO2 för 1 h.
    2. Ta Formvar/Carbon 300 Mesh Ni galler från lådan med antistatiska pincett, på ett porslin flera fat och släpp 10 µL HA, CA och FA suspensioner på gallren.
    3. Torra proverna för 30 min i rumstemperatur.
  2. Beredning av vila och stimulerade celler för inbäddning 26
    1. Samla in medel från cellkulturer och tvätta cellerna med fysiologiska hyposensibilisering (PD) medium (125 mM NaCl, 5 mM KCL, 10 mM NaHCO3, 1 mM KH2PO4, 10 mM glukos, 20 mM HEPES, pH 7,4).
    2. Fixa cellerna med 5 mL av en blandning av 3% (g:100 mL) paraformaldehyde/1% (g:100 mL) glutaraldehyd i 100 mM natriumfosfat buffert, pH 7,2, för 1 h i rumstemperatur under spiskåpa.
    3. Tvätta cellerna med 5 mL 100 mM natriumfosfat buffert och ta försiktigt bort bufferten efter tvätt.
    4. I det mörka rummen, postfix proverna med 2 mL 1% (g:100 mL) osmium vanligtvis i 100 mM natriumfosfat buffert, pH 7,2, i 20 min i rumstemperatur under spiskåpa.
    5. Ta bort osmium vanligtvis och utnyttja den.
    6. Tvätta cellerna med 5 mL 100 mM natrium fosfatbuffert.
    7. Sedan torkar proverna i 5 mL portioner av en graderad etanol lösningen serie i rumstemperatur: 25% (vol.) för 5 min, 50% (vol.) i 10 min, 75% (vol.) för 15 min, 90% (vol.) i 20 min. Slutligen Använd absolut etanol två gånger och inkubera i 30 min och 12 h.
    8. Mekaniskt skrapa cellerna från de kultur Petriskålarna av plast, samla in plast mikrocentrifugrör och centrifugera proverna vid 130 x g i 1 min.
    9. Ta bort supernatanterna och avbryta cellerna i 1 mL av en blandning av LR vit bas och absolut etanol på en volym-förhållande 1:2.
    10. Blanda väl innehållet i glas rören innan användning och inkubera i 30 min i rumstemperatur.
    11. Centrifugera proverna vid 130 x g i 1 min.
    12. Ta bort supernatanterna och upprepa föregående steg med 1 mL av en 1:1 blandning av LR vit harts och absolut etanol.
    13. Blanda väl och inkubera i 30 min i rumstemperatur.
    14. Centrifugera proverna vid 130 x g i 1 min.
    15. Ta bort supernatanterna.
    16. Slutligen tillsätt 1 mL ren LR vit harts prov två gånger och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur i plaströr.
    17. Placera 500 µL av varje prov i gelatinkapslar.
      Obs: Proverna är märkta med en liten pappersark och en penna så att kådan inte förstöra etiketterna.
    18. Stäng gelatinkapslar, sätta dem i plast mikrocentrifugrör och centrifugera 130 x g för 1 min i en swing-out rotor.
    19. Ta bort kapslarna från plaströren med hjälp av en vakuumpump.
    20. Flytta proven till ugnen och polymerisera vid 56 ° C i 48 h.
    21. Förbereda block genom att montera dem i hållaren och beskära dem till pyramiden.
    22. Sätta innehavaren i ultramicrotome, bifoga diamant Ultra 45° kniven och fyll den med avjoniserat vatten. Kom ihåg att rengöra bladet från oförutsedda luftbubblor.
    23. Då skära sektioner (700 Å) med diamond kniven på avjoniserat vattenbadet.
    24. Ange de rester som använder nötkreatur ögonfrans och placera dem på den blanka sidan av Formvar/Carbon 300 mesh Ni rutnätet och torka dem.
    25. Förbereda 2,5% (vol.) uranyl acetat i absolut etanol i mörker under ett dragskåp. Hålla den uranyl acetat i en behållare av bly och kom ihåg att inte plocka upp sediment.
    26. I det mörka rummen, counterstain gallren av syntetiska apatites och cellprover med 2,5% (vol.) uranyl acetat i etanol i 20 min i rumstemperatur under spiskåpa.
    27. Tvätta rutnäten i 50% etanol (enl. vol.), sedan i avjoniserat vatten och torka i rumstemperatur i 24 h. Slutligen, placera stödraster i rutan.

5. TEM-EDX analys

  1. TEM avbildning av ett transmissionselektronmikroskop (TEM) utrustad med komplett utbud Energy Dispersive X-ray mikroanalys (EDX) System och 11 Megapixel Kamera
    1. Förbereda en beryllium hållare för observationen av mineraler och celler. Använda antistatiska verktyg.
    2. Ta bort par av skruvarna och lyft på beryllium plattan och beryllium bricka från resten av hållaren.
    3. Montera den rutnät, blanka sidan upp, på innehavaren.
    4. Noggrant placera beryllium bricka och beryllium plattan och skruva fästskruvarna ordentligt.
    5. Sätta innehavaren i en vakuumkammare och slå på vakuumpumpen.
    6. När ett vakuum uppnås, försiktigt sätt korthållaren i imaging kammaren och slå på balken.
    7. Ställa in bländare parametrar av mikroskopet på fluorescerande monitorn. Utföra astigmatism bildkorrigering; Ange zoom, fokus och ram; och ta TEM bilder vid förstoring 50, 000 X.
  2. STEM imaging och röntgen mikroanalys för spektral och kompositionella analys
    1. Sätt in energy dispersive X-ray (EDX) detektorn i skanning överföring elektronmikroskopi (STEM) imaging kammaren.
    2. Justera skärpan i bilden i fokusläge.
    3. Ta stammen bilder vid förstoring 15, 000 X.
    4. Välj en punkt i stickprovet för röntgen mikroanalys och samla spectra.
    5. Erhålla data genom att summera alla atomic vikter för alla element i det periodiska systemet i provet (som 100%) och betecknar innehållet i markerade element: Ca, F, Cl och P (som Atom %). Sedan beräkna kvoterna av Ca, F eller Cl till P för varje prov.
  3. Ion kartläggning
    1. Välj element såsom kalcium, fluor, klor och fosfor att göra ion kartläggning och utföra EDX kartor över de Markera elementen i proverna.
    2. Erhålla data genom att indikera localizationen av analyserade element: Ca, F, Cl och P (som Atom %) och beräkna samtidig lokalisering (i %) av Ca, F eller Cl med P för varje prov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TEM-EDX möjliggör av in vitro- imaging av matrix blåsor (MVs) utgivet mineraliserande celler och mineraler produceras av MVs. som de resultat som erhålls med hjälp av denna teknik Visa att processen för mineralisering kan gå vidare på olika sätt i olika typer av celler. De två cellinjer fick samma osteoblastiska transdifferentiation behandling, men stimuleras Saos-2-celler mineraliserad mer effektivt än hFOB 1.19 osteoblaster, som framgår av AR-S färgning (figur 2). Detta kan bero på mer mogna osteoblast fenotypen av Saos-2 celler19 i jämförelse med hFOB 1.19 celler20. Visualisering av prover med en UV-transilluminator gjort det klart att endast fluorapatites kan observeras i UV-belysning (figur 3). TEM bilder anges att stimuleras Saos-2-celler producerar fler blåsor som innehåller mineraler jämfört med stimulerad hFOB celler eller med vilmodul Saos-2-celler (figur 4, vänster och mitten paneler). Syntetiska apatites har olika former av mineraler (figur 4, högra panelen). TEM bilder visade förekomst av blåsor i hFOB 1.19 och Saos-2 celler under vila och stimulerat villkor (figur 5, vänster panel). På EDX ion kartor, röda punkter ange kalcium, gröna punkter visar fosfor och blå punkter peka på den fluor distributioner (figur 5, mellersta panelen). Stimulerad villkor finns det en stark överlappning mellan kalcium och fosfor-distributioner i vesiklar som produceras av Saos-2-celler och mellan fluor och fosfor i vesiklar som produceras av hFOB 1.19 celler (figur 5, högra panelen).

Figure 2
Figur 2 . AR-S färgning av mineraler (röd) produceras av hFOB 1.19 (övre panelen) och Saos-2 (nedre panelen) celler antingen vila (R) eller efter 7 dagar efter stimulering med AA och β-GP (S). Bar: 25 µm. Ett typiskt resultat med n = 3 presenteras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Synlig (övre panelen) och UV (mellersta panelen) lätta visualisering av syntetiska HA, CA och FA mineraler och mineraler produceras av hFOB 1.19 (nedre vänstra panelen) och Saos-2 (nedre högra panelen) celler antingen vila (R) eller efter 7 dagar efter stimulering med AA och β-GP (S) . Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 4
Figur 4 . TEM bilder av blåsor och mineraler produceras av hFOB 1.19 (till vänster) och Saos-2 (mellersta panelen) celler antingen vila (R) eller efter 7 dagar efter stimulering med AA och β-GP (S). Syntetiska HA, CA och FA mineraler visas som kontroller (höger panel). Bar: vit 500 nm, svart 250 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 5
Figur 5 . TEM bilder (vänster) av hFOB 1.19 och Saos-2-celler antingen vila (R) eller efter 7 dagar efter stimulering med AA och β-GP (S). Ion kartor för Ca (röd), Cl (gul), F (blå) och P (grön) från EDX (mellersta panelen). Samtidig lokalisering av element (höger panel): kalcium till fosfor (Ca), fluor till fosfor (F) eller klor till fosfor (Cl) kvantifierades baserat på EDX kartorna. Bar: 500 nm. Tre oberoende experimenten för både cellinjer utfördes. Tio bilder från varje variant (vila och stimuleras) togs, då från 2 till 6 av dem valdes ut för vidare beräkning av elementet samtidig lokalisering. En typisk resultatet presenteras. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I det nuvarande papperet, beskrev vi protokollen för AR-S färgning, UV ljus identifiering av Fluorapatit och TEM-EDX in vitro- imaging av MVs släpptes av mineraliserande celler och mineraler produceras av MVs. Det är möjligt att ta itu med alla metoder som nämns ovan genom att följa vissa vanliga felsökningssteg. För att erhålla optimala resultat, bör flera kritiska moment utföras noggrant. Det första är det bättre att lägga AA (som är sura) följt av β-GP (som är basiskt) för att bevara pH 7,4 odlingssubstrat. Andra efter AR-S färgning, de färgade kalkavlagringar är mycket bräcklig och cellerna ska tvättas med stor omsorg att förhindra förstörelsen av kristallerna på lägga till PBS. Tredje, alltid hålla den uranyl acetat i en behållare av bly och inte plocka upp sediment eftersom endast den utspädda fraktionen bör användas för fixering. Fjärde, kom ihåg att AA och uranyl acetat är ljuskänsligt och ska hanteras i det mörka rummen. För det femte ska blandningen av LR vit med absolut etanol blandas väl innan de läggs till proven. Det sjätte borde proverna i gelatinkapslar vara märkt med en liten pappersark och en penna så att kådan inte förstöra etiketterna. Det sjunde bör bladet av diamond kniven rengöras noggrant från eventuella luftbubblor. Åttonde, prover ska placeras försiktigt på den blanka sidan av rutnätet där Formvar/Carbon filmen ligger. Nionde, placera korrekt plats som X-ray mikroanalys och ion kartläggning utförs på TEM bilden att begränsa eventuella problem med apatit erkännande.

Även om protokollet presenterade visade sig vara mest gynnsamma i vår experimentell design, är det möjligt att ändra den för att passa olika mål. Som med någon annan teknik, har detta också sina begränsningar. Ytterligare tekniker, såsom FTIR, bör tillämpas för att bekräfta eller verifiera förekomsten av erhållna kvoten av de undersökta element8,12,26. TEM-EDX metoden presenteras här är en betydande förbättring med avseende på den befintliga metoden, som är en kombination av mikro-Raman-baserade metoder för kartläggning och chemometric och liknar avbildning av Silvernanopartiklar (AgNPs) distribution till olika ytor av mineral och mekanismen för deras molekylära interaktioner21. Raman-baserat imaging har testats på två mineral modeller (makro - och micro-storlek). Raman kartor gjorda av n = 600-900 spectra för varje prov/kontroll analyserades av Vespucci programvara och resultaten bekräftades via andra metoder såsom ICP-OES, AFM och SEM-EDX. Våra TEM-EDX kartor bestående av n = 30 ramar och n = 6 spectra för varje prov/kontroll analyserades också av programmet mikroanalys Suite, och resultaten bekräftades via andra metoder såsom FTIR, FM, TEM, SPM och 3D topografiska AFM4 , 5. den föreslagna TEM-EDX mikroanalys, som Raman-baserat imaging, kräver endast minimal provberedning, är super känslig, icke-invasiv och kostnadseffektiva och kan förlängas till andra system som är relevanta för människors miljö.

Presenterade tekniken kan användas i ett brett fält av forskning i framtiden. Det kan ändras för utredning av olika naturliga och syntetiska apatites. Det kan också justeras för att passa protokoll av experiment med biologiska och kemiska sonder. Dessutom kan alla element från det periodiska systemet analyseras för att visualisera inte bara morfologi av mineraler men också förändringar i deras ion sammansättning och ersättningar. Jonbyte i apatites är en känd procedur för biomedicinska programmet27. En möjlig fysiologisk faktor som styr Ca, F och Cl-joner eller Sr, Mg, Mn och Zn metall Jon byte i HA under mineral-formationen, vilken är en vändpunkt mellan fysiologiska och patologiska mineralisering kan vara den Pi/PPi baserat på7. Om de tillämpas korrekt, möjliggör denna teknik utför mappningen av flera element av samma cellulära, vesikulär eller mineral regionen flera gånger i rad.

Under de senaste åren var mycket framsteg om mekanismerna för ben mineralisering28,29,30,31,32,33. Vi insåg att olika cellinjer kan ha tydliga profiler av blåsor och mineral bildas. I detta sammanhang vi valt två mänskliga cellinjer: osteoblastiska hFOB 1.19 och osteosarkom Saos-2, som genomgår fullständig osteogent transdifferentiation från spridning till mineralisering och producera MVs som utlöser apatit kärnbildning i ECM 34 , 35.

AR-S färgning av kalkavlagringar avslöjade att stimuleras Saos-2-celler mineraliserad olikt än hFOB 1.19 osteoblaster. Detta var korrelerad med produktionen av mineraler genom Saos-2-celler som var omätbara under UV-ljus i kontrast till de som produceras av hFOB 1.19 celler. Våra TEM-EDX data visade att de mineraler som produceras i blåsor av Saos-2-celler var liknande till syntetiska HA överlappningen i kalcium och fosfor-distributioner. Däremot anges överlappningen i fluor och fosfor distributioner i blåsor från hFOB 1.19 celler bildandet av andra typer av mineraler utöver apatites.

Sammanfattningsvis visar våra fynd att blåsor viktiga bestämningsfaktorer av mineral nukleation, särskilt på cellulär nivå5,25. Dessutom är våra data i samförstånd med en tidigare teori att MVs kan betraktas som en specialiserad form av microvesicles som klarar starta mineralisering innanför såväl som utanför den cell4. Jämförelsen av blåsor som släppt från Saos-2-celler, som mineralize mer effektivt, och blåsor som släppt från hFOB 1.19 celler med TEM-EDX microanalytical metoden stöder hypotesen att MVs är mineral-fyllda blåsor. Detta lämnar öppet frågan om förekomsten av MVs krävs att inducera apatit kärnbildning och hur detta kan förändra fysiologiska till patologiska mineralisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har någon intressekonflikt.

Acknowledgments

MK och ASK utfört manuella operationer och LB beredda ritningar och gjorde filmen. ASK skrev manuskriptet, LB skrev manuset och MK beredda tabellen. SM, RB och SP läsa kritiskt tabellen, skriptet och manuskript. Författarna vill tacka Hanna Chomontowska för hennes utmärkta hjälp med ultramicrotomy och Szymon Suski samt Henryk Bilski för deras utmärkta hjälp med TEM-EDX analys. Författarna vill tacka dr Patrick lundar för professionella engelska språket korrigering och Barbara Sobiak för inspelning av instruktionerna.

Detta arbete stöds av grant N N401 140639 från det polska ministeriet för vetenskap och högre utbildning till ASK, med bidrag från de nationella Science Centre, Polen 2016/23/N/NZ4/03313 till LB och 2016/23/N/NZ1/02449 till MK, EU FP7-projektet BIOIMAGINE : BIO-IMAGing i forskning INnovation och utbildning, GA nr 264173, och av de lagstadgade medel av Nencki institut för experimentell biologi, polska vetenskapsakademin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture PAA E15-813 1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium PAA E82312-0025 for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin) Sigma P0781-100ML 100 U/mL each
G-418 Sigma 68168 0.3 mg/mL
FBS Gibco 10270 10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA Sigma A-5960 50 µg/mL
ß-GP Sigma G9422-100G 7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel Bio-Rad 130-0420 for HA
FA synthesized by us
CA synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture Sigma S7907/S8282 0.1 M, pH 7.2
PBS pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS Sigma A5533-25G 0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA Sigma C2674 500 U/mL
SCL buffer prepared by us
Deionized wather produced by us
Ethanol POCh BA6480111 absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol Polysciences Inc. 21447-25 0.25 g/10 mL
PD medium pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde) Sigma 158127/G-6257 3%:1%
Post-fixation OsO4 Sigma 75633 1%
LR White resin in ethanol Polysciences Inc. 17411-MUNC 500g 1:2, 1:1, 100%
Acetone CHEMPUR 111024800 pure
Tool
Cryogenic vials Corning Inc. 430487 1.2 mL
Plastic Petri culture dishes Falcon 353003 100 mm
Plastic tubes Falcon 352096 and 352070 15 and 50 mL
Serological pipettes Falcon and VWR 357521 and 612-3700 1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes Sigma Z688312 and Z628034 1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips VWR 613-0364, 613-0239 and 613-1050 0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks Light Labs A-7055-Z, A-7053-C green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save Thermo Scientific Co. KS12 HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell Thermo Scientific Co. 150 34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood POLON WCS-2 for TEM stainings
Glass bottles SIMAX 1632414501050 and 1632414501100 50 and 100 mL
Quartz glass tubes SIMAX 638422010100 Ø 10 mm, L 100 mm
Pump IBS Integra Biosciences VACUSAFE comfort for vacuum
Oven Memmert UNE 400 56°C
Porcelain multi-well plate Rosenthal technik 229/12 12 wells
Glass beakers SIMAX 632417010025 25 mL
Glass bottles Pocord DIN22 10 mL
Plastic box Agar Scientific Ltd. for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules Agar Scientific Ltd. G3741 size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box Agar Scientific Ltd. S162N3 film on the shiny side
Silicon cell scraper Sigma SIAL0010-100EA size 1.8/25 cm
Syringe with needle BogMark 007 syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe Chirana CH005L 5 mL
Centrifuge MPW Medical Instruments MPW-350R 130 x g and 500 x g
UV transluminator UVP M-20 for visible and UV light
Ultramicrotome LKB NOVA 700Å sections
Block holder LKB E6711 round shape
Diamond knife DiATOME Ultra 45° size 3
Eyelash holder bovine, prepared by us
Forceps ROTH 2855.1 antistatic for grids
Spatulas set ROTH E286.1 antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope Zeiss with Canon AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9 Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses Nikon Nikon D7100
Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D
Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G
Nikkor AF 28 mm f/2.8D 		for movie recordings
Microphone MXL Mics Tempo for voice recordings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. Bone structure and function. Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).
  2. Anderson, H. C. Molecular biology of matrix vesicles. Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).
  3. Anderson, H. C. Matrix vesicles and calcification. Curr Rheumatol. 5 (3), 222-226 (2003).
  4. Bolean, M., Simão, A. M. S., Barioni, M. B., Favarin, B. Z., Sebinelli, H. G., Veschi, E. A., Janku, T. A. B., Bottini, M., Hoylaerts, M. F., Itri, R., Millán, J. L., Ciancaglini, P. Biophysical aspects of biomineralization. Biophys Rev. 9 (5), 747-760 (2017).
  5. Bottini, M., Mebarek, S., Anderson, K. L., Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Simão, A. M. S., Bolean, M., Ciancaglini, P., Bandorowicz Pikula, J., Pikula, S., Magne, D., Volkmann, N., Hanein, D., Millán, J. L., Buchet, R. Matrix vesicles from chondrocytes and osteoblasts: Their biogenesis, properties, functions and biomimetic models. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 532-546 (2018).
  6. Hessle, L., Johnson, K. A., Anderson, H. C., Narisawa, S., Sali, A., Goding, J. W., Terkeltaub, R., Millan, J. L. Tissue-nonspecific alkaline phosphatase and plasma cell membrane glycoprotein-1 are central antagonistic regulators of bone mineralization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (14), 9445-9449 (2002).
  7. Garimella, R., Bi, X., Anderson, H. C., Camacho, N. P. Nature of phosphate substrate as a major determinant of mineral type formed in matrix vesicle-mediated in vitro mineralization: An FTIR imaging study. Bone. 38 (6), 811-817 (2006).
  8. Thouverey, C., Bechkoff, G., Pikula, S., Buchet, R. Inorganic pyrophosphate as a regulator of hydroxyapatite or calcium pyrophosphate dihydrate mineral deposition by matrix vesicles. Osteoarthr. Cartil. 17, 64-72 (2009).
  9. Terkeltaub, R. A. Inorganic pyrophosphate generation and disposition in pathophysiology. Am. J. Phys. 281 (1), 1-11 (2001).
  10. Guicheux, J., Palmer, G., Shukunami, C., Hiraki, Y., Bonjour, J. P., Caverzasio, J. A novel in vitro culture system for analysis of functional role of phosphate transport in endochondral ossification. Bone. 27 (1), 69-74 (2000).
  11. Yadav, M. C., Bottini, M., Cory, E., Bhattacharya, K., Kuss, P., Narisawa, S., Sah, R. L., Beck, L., Fadeel, B., Farquharson, C., Millán, J. L. Skeletal mineralization deficits and impaired biogenesis and function of chondrocyte-derived matrix vesicles in Phospho1(-/-) and Phospho1/Pi t1 double-knockout mice. J. Bone Miner. Res. 31 (6), 1275-1286 (2016).
  12. Thouverey, C., Malinowska, A., Balcerzak, M., Strzelecka-Kiliszek, A., Buchet, R., Dadlez, M., Pikula, S. Proteomic characterization of biogenesis and functions of matrix vesicles released from mineralizing human osteoblast-like cells. J. Proteome. 74 (7), 1123-1134 (2011).
  13. Wang, W., Xu, J., Kirsch, T. Annexin-mediated Ca2+ influx regulates growth plate chondrocyte maturation and apoptosis. J. Biol. Chem. 278 (6), 3762-3769 (2003).
  14. Nollet, M., Santucci-Darmanin, S., Breuil, V., et al. Autophagy in osteoblasts is involved in mineralization and bone homeostasis. Autophagy. 10 (11), 1965-1977 (2014).
  15. Boonrungsiman, S., Gentleman, E., Carzaniga, R., Evans, N. D., McComb, D. W., Porter, A. E., Stevens, M. M. The role of intracellular calcium phosphate in osteoblast-mediated bone apatite formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 14170-14175 (2012).
  16. Genge, B. R., Wu, L. N., Wuthier, R. E. In vitro modeling of matrix vesicle nucleation: synergistic stimulation of mineral formation by annexin A5 and phosphatidylserine. J. Biol. Chem. 282 (36), 26035-26045 (2007).
  17. Jahnen-Dechent, W., Schäfer, B., Ketteler, M., McKee, M. D. Mineral chaperones: a role for fetuin-A and osteopontin in the inhibition and regression of pathologic calcification. J. Mol. Med. (Berl). 86 (4), 379-389 (2008).
  18. Suchanek, W., Yoshimura, M. Processing and properties of hydroxyapatite-based biomaterials for use as hard tissue replacement implants. J. Miner. Res. 13 (1), 94-117 (1998).
  19. Pautke, C., Schieker, M., Tischer, T., Kolk, A., Neth, P., Mutschler, W., Milz, S. Characterization of osteosarcoma cell lines MG-63, Saos-2 and U-2 OS in comparison to human osteoblasts. Anticancer Res. 24 (6), 3743-3748 (2004).
  20. Yen, M. -L., Chien, C. -C., Chiu, I. -M., Huang, H. -I., Chen, Y. -C., Hu, H. -I., Yen, B. L. Multilineage differentiation and characterization of the human fetal osteoblastic 1.19 cell line: a possible in vitro model of human mesenchymal progenitors. Stem Cells. 25 (1), 125-131 (2007).
  21. Brittle, S. W., Foose, D. P., O'Neil, K. A., Sikon, J. M., Johnson, J. K., Stahler, A. C., Ryan, J. D., Higgins, S. R., Sizemore, I. E. A raman-based imaging method for characterizing the molecular adsorption and spatial distribution of silver nanoparticles to hydrated mineral surfaces. Environ Sci Technol. , (2018).
  22. Liu, N., Wang, Y., Ge, F., Liu, S., Xiao, H. Antagonistic effect of nano-ZnO and cetyltrimethyl ammonium chloride on the growth of Chlorella vulgaris: Dissolution and accumulation of nano-ZnO. Chemosphere. 196, 566-574 (2018).
  23. Tasbihi, M., Kočì, K., Troppová, I., Edelmannová, M., Reli, M., Čapek, L., Schomäcker, R. Photocatalytic reduction of carbon dioxide over Cu/TiO2 photocatalysts. Environ Sci Pollut Res Int. , (2017).
  24. Chen, N. X., O'Neill, K. D., Chen, X., Moe, S. M. Annexin-Mediated Matrix Vesicle Calcification in Vascular Smooth Muscle Cells. J. Bone Miner. Res. 23 (11), 1798-1805 (2008).
  25. Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S. Characteristics of minerals in vesicles produced by human osteoblasts hFOB 1.19 and osteosarcoma Saos-2 cells stimulated for mineralization. J. Inorg. Bioch. 171, 100-107 (2017).
  26. Thouverey, C., Strzelecka-Kiliszek, A., Balcerzak, M., Buchet, R., Pikula, S. Matrix vesicles originate from apical membranę microvilli of mineralizing osteoblast-like Saos-2 cells. J. Cell. Biochem. 106 (1), 127-138 (2009).
  27. Cazalbou, S., Eichert, D., Ranz, X., Drouet, C., Combes, C., Harmand, M. F., Rey, C. Ion exchanges in apatites for biomedical application. J. Mater. Sci. Mater. Med. 16 (5), 405-409 (2005).
  28. Kraus, D. Consolidated data analysis and presentation using an open-source add-in for the Microsoft Excel® spreadsheet software. Med. Writ. 23 (1), 25-28 (2014).
  29. Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annu. Rev. Genet. 43, 119-142 (2009).
  30. Bonucci, E. Bone mineralization. Front. Biosci. 17, 100-128 (2012).
  31. Veis, A., Dorvee, J. R. Biomineralization mechanisms: A new paradigm for crystal nucleation in organic matrices. Calcif. Tissue Int. 93 (4), 307-315 (2013).
  32. Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A., Sone, E. D. In vitro models of collagen biomineralization. J. Struct. Biol. 183 (2), 258-269 (2013).
  33. Alliston, T. Biological regulation of bone quality. Curr. Osteoporos. Rep. 12 (3), 366-375 (2014).
  34. Wang, W., Kirsch, T. Retinoic acid stimulates annexin-mediated growth plate chondrocyte mineralization. J. Cell Biol. 157 (6), 1061-1069 (2002).
  35. Wang, W., Xu, J., Kirsh, T. Annexin V and terminal differentiation of growth plate chondrocytes. Exp. Cell Res. 305 (1), 156-165 (2005).

Tags

Kemi fråga 136 mineraler blåsor osteoblaster osteosarkom UV-ljus TEM-EDX
Analys av mineraler produceras av hFOB 1.19 och Saos-2 celler använder transmissionselektronmikroskopi med Energy Dispersive X-ray mikroanalys
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bozycki, L., Komiazyk, M., Mebarek,… More

Bozycki, L., Komiazyk, M., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S., Strzelecka-Kiliszek, A. Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis. J. Vis. Exp. (136), e57423, doi:10.3791/57423 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter