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Chemistry

Analyse der Mineralien von hFOB 1.19 produziert und Saos-2 Zellen mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie mit Energy Dispersive x-ray Mikroanalyse

doi: 10.3791/57423 Published: June 24, 2018

Summary

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um den Zustand der Mineralien in Vesikeln veröffentlicht von zwei menschlichen Knochen Zelllinien zu vergleichen: hFOB 1,19 und Saos-2. Ihre Mineralisierung Profile wurden von Alizarin rot-S (AR-S) Färbung, ultravioletten (UV) Licht Visualisierung, Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM) Bildgebung und Energie dispersiven Röntgen-Mikroanalyse (EDX) analysiert.

Abstract

Dieses Video zeigt die Verwendung von Transmissions-Elektronenmikroskopie mit Energy dispersive x-ray Mikroanalyse (TEM-EDX), den Zustand der Mineralien in Vesikeln veröffentlicht von zwei menschlichen Knochen Zelllinien zu vergleichen: hFOB 1,19 und Saos-2. Diese Zell-Linien, nach der Behandlung mit Ascorbinsäure (AA) und β-glycerophosphat (β-GP), komplette osteogene Transdifferenzierung von Verbreitung, Mineralisierung zu unterziehen und produzieren Matrix Vesikel (MVs), die Apatit Keimbildung bei Auslösen der extrazelluläre Matrix (ECM).

Basierend auf Alizarin rot-S (AR-S) Färbung und Analyse der Zusammensetzung von Mineralien in Zelle Lysates mit ultraviolettem (UV) Licht oder in Vesikeln TEM Bildgebung gefolgt von EDX-Quantifizierung und Ionen-Mapping verwenden, können wir daraus schließen, dass Osteosarkom Saos-2 und osteoblastischen hFOB 1.19 Zellen zeigen unterschiedliche Mineralisierung Profile. Saos-2 Zellen effizienter als hFOB 1.19 Zellen mineralisieren und produzieren größere mineralische Ablagerungen, die nicht unter UV-Licht sichtbar, aber ähneln Hydroxylapatit (HA), dass sie mehr Ca und F Vertretungen haben.

Die erzielten Ergebnisse mit diesen Techniken ermöglichen uns zu dem Schluss, dass der Prozess der Mineralisierung unterscheidet sich je nach Zelltyp. Wir schlagen vor, dass auf zellulärer Ebene, die Herkunft und die Eigenschaften von Vesikeln die Art der Mineralien bestimmen.

Introduction

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Knochen ist eine Art von Bindegewebe besteht aus zwei Teilen: Bio (Zellen und Kollagenfasern) und Mineralien (Calcium und Phosphat-Verbindungen). Die mineralischen Hauptbestandteile in den Knochen sind Apatite1. Verschiedene Arten von Mineralisierung-kompetente Zellen in Knochen (Osteoblasten), Zähne (Odontoblasts) und im Knorpel (Chondrozyten) regulieren die ersten Schritte der Mineralisierung durch Produktion von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) und loslassen matrix Vesikel (MVs) (Abbildung 1). MVs sind 100-300 nm Durchmesser Vesikel, die Calcium- und Phosphatspiegel, die Erleichterung der Apatit Keimbildung zu sammeln und anschließend binden an Kollagen2,3. Dann zerfallen MVs Apatite auf das extrazelluläre Medium lösen. Die Apatite weiterhin in Kontakt mit Kollagenfasern wachsen und bilden der Knochenmatrix. Die Mineralisierung wird durch die konstante Versorgung mit Pich und Ca2 + im extrazellulären Medium getragen. Einige kürzlich veröffentlichten Daten unterstützen unsere Modell-4,-5. Weichteile nicht unter physiologischen Bedingungen mineralisieren. Ektopische Verkalkung kann jedoch unter pathologischen Bedingungen wie Gefäßverkalkung3auftreten. Vaskuläre Zellen, die Osteoblasten Phänotyp erwerben können MVs produzieren, die Keimbildung von Apatite zu induzieren und Mineralisierung in den medialen und Intima Schichten der Wand der Blutgefäße zu initiieren. Seit ektopische Verkalkung ähneln normalen Endochondral Mineralisierung3, Verständnis der molekularen Mechanismen der Mineralisierung der Knochen Zellen und Chondrozyten sollen einige Hinweise auf ektopische Verkalkung der Weichteile, die gebildet.

Die Entwicklung des skelettartigen Gewebe wird durch verschiedene Enzyme, Wachstumsfaktoren und Promotoren oder Inhibitoren der Mineralisierung geregelt. Die Antagonistische Wirkung der Gewebe-unspezifische alkalische Phosphatase (TNAP) (Abbildung 1) und Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase kontrolliert ich (NPP1), zusammen mit Ankyrin (ANK), anorganisches Pyrophosphat (PPich) Konzentration 6. PPich, ein potenter Inhibitor der HA-Formation ist hydrolysiert durch TNAP; NPP1 hydrolysiert Nukleotid Triphosphate um PPich zu bilden, während ANK PPich in das ECM aus der Zelle exportiert. Das Verhältnis von Pi/PPi kann Apatit Bildung7,8 mit möglichen pathologischen folgen9regulieren.

Die MV-Membran ist in Ionen-Transport-Proteine angereichert, die die erste Ausfällung von Kalzium und Phosphat im Inneren der MVs bei der Keimbildung (Abbildung 1) zu erleichtern. Die Phosphat-Transporter 1 (PiT) hilft, um Pich erzeugt im Perivesicular Raum in der MVs10,11zu integrieren. Polymerasen können beteiligt sein, in die Bindung und den Transport von Ca2 + und in den biophysikalischen Prozess, der Mineralisierung in der MV Lumen12,13initiiert. Wir favorisieren die Hypothese vorgeschlagen, für die Mineralisierung innerhalb Intrazytoplasmatische Vesikel des internen Keimbildung von Apatit innerhalb der MV vor ihrer Ausbreitung in der ECM-14,-15. In-vitro- Modellierung bestätigt die Induktion von Ca2 +/ pich komplexe Bildung in Proteoliposomes aus PS und AnxA516hergestellt. Dies kann darauf hindeuten, dass Akkumulation von Ca2 +, Pich, AnxA5 und PS-komplexe in Lipid Rafts der Mikrovilli-wie Membranesrepresent der Keimbildung Kern (NC) Apatit innerhalb MVs. Polymerasen und TNAP besitzen auch Kollagen-Bindung Kapazitäten, die möglicherweise hilfreich bei der Platzierung von MVs entlang Kollagenfasern und bei der Förderung der Ausbreitung von Mineralisierung in der ECM. Fetuin-A und Osteopontin (OPN)17, sind bekannt als Inhibitoren der Apatit-Formation, die die Ausbreitung der Mineralisierung auf dem kollagenen Gerüst verlangsamen kann. Keimbildung und Vermehrung sind unterschiedliche Veranstaltungen, erstere vor dem letzteren, und sowohl für den Prozess der pathologischen Mineralisierung relevant sein können.

Um herauszufinden, wie die Chemie des Calcium-Phosphat-komplexen physiologischen Mineralisierung und ektopische Verkalkung ändern kann, ist es notwendig, die Mineralien produziert von Zellen zu identifizieren. Apatite sind eine Gruppe von Kalzium und Phosphat enthalten Mineralien mit dem allgemeinen Kristall Zelle Formel Ca10(PO4)6X2, wobei X = Cl, F, OH. Sie gelten als18folgt: Fluorapatit (FA) Ca10(PO4)6F2, Chlorapatite (CA) Ca10(PO4)6Cl2 und Hydroxylapatit (HA) Ca10(PO4 ),6(OH)2.

Die Wahl der Osteoblasten Zelllinien induzieren MINERALBILDUNG ist entscheidend, denn jede Zelllinie ein klares Profil der Mineralisierung zeigt. In diesem Bericht verglichen wir die Keimbildung der Mineralien von zwei ausgewählten menschlichen zellmodelle Mineralisierung: osteoblastischen hFOB 1.19 und Osteosarkom Saos-2 Zellen. Osteosarkom-abgeleitete Zellen werden häufig als osteoblastischen Modelle verwendet und Saos-2 Zellen haben die reifsten osteoblastischen Charakter19 beibehalten, während undifferenzierte menschlichen fetalen hFOB Zellen häufig als Modell für normale osteoblastischen verwendet werden Differenzierung-20. Ihre Mineralisierung Profile wurden mit verschiedenen Methoden analysiert: Alizarin rot-S (AR-S) Färbung, ultravioletten (UV) Licht Visualisierung Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM) Bildgebung, Energy dispersive x-ray Mikroanalyse (EDX) Quantifizierung und Ion Mapping. Der Vorteil von TEM-EDX über alternative Techniken verwendet in früheren Studien ist, dass es quantitative und qualitative Ergebnisse der Ionen-Austausch in Apatit Kristalle4,5,21 gibt. Das übergeordnete Ziel der Verwendung von TEM-EDX war, eine einfache Methode für Bildgebung und Quantifizierung der Verteilung von Ca, F und Cl-Ionen in verschiedenen Mineralien aus verschiedenen Arten von Zellen während der Phasen des Prozesses Mineralisierung zu finden. Diese Methode erfolgreich, zum Beispiel dient zur Überwachung der Wechselwirkung von Zink-Nanopartikel mit verschiedenen Chemikalien und ihre kombinierte Wirkung auf Wasserorganismen22. In einer weiteren Studie, ein Kupfer Photocatalyst auf Titan-Materialien in wässriger Lösung ausführlich zeichnete sich durch optische emissionsspektrometrie induktiv gekoppelte Plasma (ICP-OES), N2 Physisorption (BET), XRD, UV-Vis-DRS, FT-IR, Raman Spektroskopie, TEM-EDX und photoelektrochemische Messungen23. Unser Ziel war es, die Herkunft und Eigenschaften der Vesikel und Mineralien in beiden Zelllinien, den Mechanismus zu verstehen, der Mineralisierung im knöchernen Differenzierung steuert zu vergleichen.

Figure 1
Abbildung 1 . Schema der ersten Schritte der Mineralisierung im knöchernen Zellen mit der Synthese von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) und Freisetzung von Matrix Vesikel (MVs) aus der Membran. MVs akkumulieren Kalzium durch die Einwirkung von Kalzium-bindende Proteine, Polymerasen und Phosphat, durch das Wirken des ein anorganisches Phosphat-Transporter (PiT) gefolgt von der Aktivität der Gewebe-unspezifische alkalische Phosphatase (TNAP), dem dephosphorylates PPich Pich, wodurch Apatit Keimbildung. Dann MVs zerfallen und freigeben Apatite auf das extrazelluläre Medium. Die Mineralisierung wird durch die konstante Versorgung mit Pich und Ca2 + in der extrazellulären mittlere4,5getragen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Protocol

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(1) Zell-Kultur und Behandlung

  1. Setzen Sie alle notwendigen Materialien unter der Laminar-Flow-Haube und unter UV-Licht zu sterilisieren. Die Nährmedien sind: eine 1:1 Mischung von Schinken ist F12 und DMEM Medien mit 2,5 mM L-Glutamin ergänzt mit 100 U/mL Penicillin, 100 U/mL Streptomycin, 0,3 mg/mL G418 und 10 % fetalen Bovine Serum (FBS) (V/V) für menschlichen Fötus hFOB 1.19 SV40 große T Antigen transfiziert Osteoblasten und McCoys 5A Medium mit 1,5 mM L-Glutamin ergänzt mit 100 U/mL Penicillin, 100 U/mL Streptomycin und 15 % FBS (V/V) für menschlichen Osteosarkom Saos-2 Zellen.
  2. Kultur hFOB 1.19 bei 34 ° C in einer Atmosphäre von 5 % CO2 und Saos-2 Zellen bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5 % CO2. Zellkulturen, entweder hFOB 1.19 oder Saos-2 Zellen aus dem Inkubator, der Laminar-Flow-Haube zu übertragen und das Medium 10 ml frisches Kulturmedium mit FBS verändern.
  3. Inkubieren Sie Zellen ohne Stimulatoren (ruhende Zellen) oder stimulieren sie mit 50 µg/mL Ascorbinsäure (AA) gefolgt von 7,5 mM β-Glycerophosphat (β-GP), früher in Reinstwasser aufbereitet und durch 0,22 µm Spritze Filter gefiltert. Fügen Sie die Stimulatoren aus Kunststoff Mikrozentrifugenröhrchen auf die Oberfläche des Kulturmediums. Vorsichtig rühren Sie der Kulturschale und inkubieren Sie für 7 Tage.

2. Nachweis von Mineralien Calcium

  1. Waschen Sie die Zellkulturen mit Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS: 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, pH 7,0).
  2. Geben Sie 5 mL 2 % (G:100 mL) AR-S mit PBS-Puffer, pH 5,0 und inkubieren Sie die Platten für 30 min, die Mineralien zu beflecken.
  3. Waschen Sie 3 Mal mit PBS. Vorsichtig die Schale Wand PBS hinzu, versuchen Sie nicht, die Mineralien zu zerstören.
  4. Beobachten Sie Kalzium-Mineralien unter einem invertierten Lichtmikroskop und nehmen Sie Bilder.

(3) Visualisierung der Sonden unter UV-Licht

  1. Für Zelle Lysates behandeln Sie Zellkulturen, entweder ruhen oder angeregt für 7 Tage nach der Kollagenase Verdauung Protokoll24.
  2. Sammeln Sie das Medium aus Zellkulturen und waschen Sie die Zellen mit PBS.
  3. Die Zellen mit 3 mL 500 U/mL Kollagenase in einer Lösung von 0,25 M Saccharose, 0,12 M NaCl 0,01 M KCl und 0,02 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,45, bei 37 ° C für 3 h zu verdauen.
  4. Mechanisch kratzen Sie die Zellen, auf Kunststoff Mikrozentrifugenröhrchen übertragen Sie, und geben sie 10-Mal durch eine 1 mL 40 U Spritze mit 0,5 × 16 Nadel.
  5. Zentrifugieren Sie die Proben bei 500 × g für 5 min.
  6. Den überstand verwerfen und Aussetzen der Zelle Pellet in 500 µL des synthetischen Knorpel Lymphe (SCL, 100 mM NaCl, 12,7 mM KCl, 0,57 mM MgCl2, 1,83 mM Nahco33, 0,57 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-Glucose, Saccharose 63 mM, 16,5 mM Hepes, pH 7.4).
  7. Hydroxylapatit (HA), Fluorapatit (FA) und Chlorapatite (CA) Pulver aus den Flaschen auf dem UV-Transilluminator mit einem Spatel zu übertragen und als Steuerelemente verwenden.
  8. Die Zelle Lysates aus Kunststoffrohren mit Kunststoff-Tipps und sorgfältig auf die UV-Transilluminator.
  9. Bilder unter sichtbar und UV-Licht zu nehmen.

4. Vorbereitung von Proben für TEM-EDX

  1. Vorbereitung von Mineralien für negative Färbung
    1. Synthetisch hergestellte HA, CA und FA Mineralien25 2,5 mg in 500 µL deionisiertes Wasser auszusetzen und Inkubation bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5 % CO2 für 1 h.
    2. Antistatische Pinzetten nehmen Sie Formvar/Carbon 300 Mesh Ni Raster aus der Box mit, auf eine Porzellan-Multi-well-Platte und fallen Sie 10 µL HA, CA und FA Suspensionen auf den Gittern.
    3. Trocknen Sie die Proben für 30 min. bei Zimmertemperatur.
  2. Vorbereitung des Ausruhens und stimuliert die Zellen für die Einbettung von 26
    1. Sammeln Sie Medium aus der Zellkulturen zu und waschen Sie die Zellen mit physiologischen Desensibilisierung (PD) Medium (125 mM NaCl, 5 mM KCL, 10 mM Nahco33, 1 mM KH2PO4, 10 mM Glukose, 20 mM HEPES, pH 7.4).
    2. Befestigen Sie die Zellen mit 5 mL einer Mischung von 3 % (G:100 mL) paraformaldehyde/1% (G:100 mL) Glutaraldehyd in 100 mM Natrium Phosphatpuffer pH 7,2, 1 h bei Raumtemperatur unter dem Abzug.
    3. Waschen Sie die Zellen mit 5 mL 100 mM Natriumphosphat Puffer und entfernen Sie vorsichtig den Puffer nach dem Waschen.
    4. In den dunklen Raum postfix die Proben mit 2 mL von 1 % (G:100 mL) Osmium ausgefällt in 100 mM Natrium Phosphatpuffer pH 7,2, für 20 min bei Raumtemperatur unter dem Abzug.
    5. Entfernen Sie Osmium ausgefällt und nutzen Sie es.
    6. Waschen Sie die Zellen mit 5 mL 100 mM Natriumphosphat Puffer.
    7. Dann pausiert die Proben in 5 mL Aliquots einer abgestuften Ethanol-Lösung-Serie bei Raumtemperatur: 25 % (Vol.) für 5 min, 50 % (Vol.-%) für 10 min, 75 % (Vol.-%) für 15 min, 90 % (Vol.-%) für 20 Minuten. Schließlich verwenden Sie absolute Ethanol zweimal und inkubieren Sie für 30 min. und 12 h.
    8. Mechanisch kratzen Sie die Zellen aus dem Kunststoff Petrischalen Kultur, in Kunststoff Mikrozentrifugenröhrchen sammeln Sie und Zentrifugieren Sie die Proben bei 130 X g für 1 min.
    9. Entfernen Sie die Überstände und hängen Sie die Zellen in 1 mL einer Mischung aus LR White Harz und absoluten Ethanol ein Volumenverhältnis von 1:2.
    10. Den Inhalt der Glasröhren vor Gebrauch gut mischen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    11. Zentrifugieren Sie die Proben bei 130 X g für 1 min.
    12. Entfernen Sie die Überstände und wiederholen Sie den vorherigen Schritt mit 1 mL einer 1:1 Mischung von LR White Harz und absoluten Ethanol.
    13. Gut mischen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    14. Zentrifugieren Sie die Proben bei 130 X g für 1 min.
    15. Entfernen Sie die Überstände.
    16. Schließlich, zweimal den Proben 1 mL reines LR White Harz hinzugefügt und inkubieren Sie für 1 h bei Raumtemperatur in Kunststoffrohren.
    17. Legen Sie 500 µL jeder Probe in Gelatinekapseln.
      Hinweis: Die Proben sind beschriftet mit ein kleines Blatt Papier und einen Stift, damit das Harz nicht die Etiketten zerstört.
    18. Schließen Sie die Gelatinekapseln, in Kunststoff Mikrozentrifugenröhrchen umzusetzen und Zentrifugieren bei 130 X g für 1 min in ein Ausschwenkbares Rotor.
    19. Entfernen Sie die Kapseln aus Kunststoff-Rohre mit Hilfe einer Vakuumpumpe.
    20. Bewegen Sie die Proben in den Ofen und bei 56 ° C für 48 h polymerisieren.
    21. Bereiten Sie die Blöcke durch Montage in die Halterung und Zuschneiden auf die Pyramide.
    22. Den Inhaber in der regungsloses, befestigen Sie das Diamond Ultra 45° Messer und mit entionisiertem Wasser füllen; Denken Sie daran, die Klinge aus zufälligen Luftblasen zu reinigen.
    23. Dann schneiden Sie Abschnitte (700 Å) mit dem Diamant-Messer auf die deionisiertes Wasserbad.
    24. Legen Sie die Reste mit bovine Wimpern und Ort, wo sie auf die glänzende Seite des Formvar/Carbon 300 mesh Ni Raster und trocknen.
    25. Bereiten Sie 2,5 % (Vol.-%) Uranyl Acetat in absoluten Ethanol im Dunkeln unter einer Abzugshaube. Halten Sie das Uranyl-Acetat in einem Lead-Container und erinnere mich nicht, das Sediment abholen.
    26. In den dunklen Raum counterstain die Netze der synthetischen Apatite und Zellproben mit 2,5 % (Vol.-%) Uranyl Acetat in Ethanol für 20 min bei Raumtemperatur unter dem Abzug.
    27. Die Raster in 50 % igem Ethanol (Vol.-%), dann in entionisiertem Wasser waschen und Trocknen bei Raumtemperatur für 24 h. Schließlich legte die Gitter in das Feld ein.

(5) TEM-EDX-Analyse

  1. TEM Bildgebung durch ein Transmissionselektronenmikroskop (TEM) ausgestattet mit Vollsortiment Energy Dispersive x-ray Mikroanalyse (EDX) System und 11-Megapixel-Kamera
    1. Bereiten Sie einen Beryllium-Halter für die Beobachtung von Mineralien und Zellen. Verwenden Sie antistatische Werkzeuge.
    2. Entfernen Sie die beiden Schrauben und heben Sie die Beryllium-Platte und Beryllium Scheibe Weg vom Rest der Halterung.
    3. Raster, glänzende Seite oben, an der Halterung anbringen.
    4. Setzen Sie die Beryllium Waschmaschine und Beryllium Platte vorsichtig und Schrauben Sie die Befestigungsschrauben fest.
    5. Setzen Sie den Halter in die Vakuumkammer und schalten Sie die Vakuumpumpe.
    6. Sobald ein Vakuum erreicht ist, sanft legen Sie den Halter in der bildgebenden Kammer und schalten Sie den Strahl.
    7. Stellen Sie auf dem fluoreszierenden Monitor die Blende-Parameter des Mikroskops. Durchführen Sie Astigmatismus Bildkorrektur; Stellen Sie den Zoom, Fokus und Rahmen; und nehmen TEM Bilder bei einer Vergrößerung von 50, 000 X.
  2. STEM Bildgebung und Röntgen-Mikroanalyse für die Spektral und kompositorische Analyse
    1. Der Scan Elektronenmikroskopie (STEM) bildgebende transmissionskammer Energy dispersive x-ray (EDX) Detektor einfügen.
    2. Stellen Sie die Schärfe des Bildes in den Fokus-Modus.
    3. Nehmen Sie Stamm Bilder bei einer Vergrößerung von 15, 000 X.
    4. Wählen Sie einen Punkt in der Probe für die Röntgen-Mikroanalyse und sammeln Sie Spektren zu.
    5. Daten zu erhalten, durch die Zusammenfassung aller Atomgewichte für alle Elemente des Periodensystems in der Probe (als 100 %) und den Inhalt der ausgewählten Elemente anzeigt: Ca, Cl, F und P (als Atom-%). Berechnen Sie das Verhältnis von Ca, F oder Cl p für jede Probe.
  3. Ionen-Zuordnung
    1. Wählen Sie Elemente wie Calcium, Fluor, Chlor und Phosphor Ionen-Mapping und durchführen EDX-Karten der ausgewählten Elemente in den Proben.
    2. Daten zu erhalten, indem Sie die Lokalisierung der analysierten Elemente angeben: Ca, Cl, F und P (als Atom-%) und die Co Lokalisierung (in %) von Ca, F oder Cl mit P für jede Probe zu berechnen.

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Representative Results

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TEM-EDX erlaubt, für die in-vitro- Bildgebung der Matrix Vesikel (MVs) durch Mineralisierung Zellen freigesetzt und Mineralien produziert von MVs. die Ergebnisse mit diesem Verfahren zeigen, dass der Prozess der Mineralisierung kann abgewichen in verschiedenen Arten von Zellen. Die beiden Zelllinien erhielt die gleiche osteoblastischen Transdifferenzierung Behandlung, noch stimulierte Saos-2 Zellen mineralisierten effizienter als hFOB 1,19 Osteoblasten, wie AR-S belegt Färbung (Abbildung 2). Dies kann aufgrund der reiferen Osteoblasten Phänotyp von Saos-2 Zellen19 im Vergleich zu hFOB 1.19 Zellen20sein. Die Visualisierung von Proben mit einem UV-Transilluminator machte deutlich, dass nur Fluorapatites unter UV-Licht (Abbildung 3) beobachtet werden kann. TEM-Bilder zeigten, dass stimulierte Saos-2-Zellen mehr Bläschen produzieren, enthält Mineralien, die im Vergleich zu stimuliert hFOB Zellen oder mit ruhenden Saos-2 Zellen (Abbildung 4, linken und mittleren Platten). Synthetische Apatite haben unterschiedliche Formen von Mineralien (Abbildung 4, rechts). TEM Bilder zeigte die Anwesenheit von Vesikeln in hFOB 1,19 und Saos-2 Zellen unter ruhen und Bedingungen (Abbildung 5, Links Panel) angeregt. Auf EDX Ionen-Karten rote Punkte zeigen Kalzium, grüne Punkte zeigen, dass Phosphor und blauen Punkte verweisen auf die Fluor-Verteilungen (Abbildung 5, mittleren Bereich). Stimulierten Bedingungen gibt es eine starke Überschneidung zwischen Kalzium und Phosphor Verteilungen in Vesikeln produziert von Saos-2 Zellen und zwischen Fluor und Phosphor in Vesikeln von hFOB 1.19 Zellen (Abbildung 5, rechts) produziert.

Figure 2
Abbildung 2 . AR-S Färbung von Mineralien (rot) von hFOB 1.19 (obere Abdeckung) produziert und Saos-2 (Bodenplatte) Zellen entweder ruhen (R) oder nach 7 Tagen Stimulation mit AA und β-GP (S). Bar: 25 µm. Ein typisches Ergebnis mit n = 3 präsentiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 . (Obere Abdeckung) sichtbar und UV (mittlere Panel) Licht Visualisierung von synthetischen HA, CA und FA Mineralien und Mineralien von hFOB 1.19 (unten links) und Saos-2 (untere rechte Abbildung) Zellen entweder ruhen (R) oder nach 7 Tagen Stimulation mit AA und β-GP (S) . Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 4
Abbildung 4 . TEM Bilder von Vesikeln und Mineralien von hFOB 1.19 (linken) produziert und Saos-2 (mittlere Panel) Zellen entweder ruhen (R) oder nach 7 Tagen Stimulation mit AA und β-GP (S). Synthetische HA, CA und FA Mineralien als Steuerelemente (Rechte Abbildung) angezeigt werden. Bar: weiß 500 nm, schwarz 250 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 5
Abbildung 5 . TEM Bilder (linken) hFOB 1.19 und Saos-2 Zellen entweder ruhen (R) oder nach 7 Tagen Stimulation mit AA und β-GP (S). Ion Karten für Ca (rot), Cl (gelb), F (blau) und P (grün) von EDX (mittleren Bereich). Co Lokalisierung von Elementen (Rechte Abbildung): Kalzium zu Phosphor (Ca), Fluor, Phosphor (F) oder Chlor zu Phosphor (Cl) wurde auf Basis der EDX-Karten quantifiziert. Bar: 500 nm. Drei unabhängige Experimente für beide Zelllinien wurden durchgeführt. Zehn Bilder aus jeder Variante (Rast- und stimuliert) wurden dann von 2 bis 6 davon wurden für die weitere Berechnung der Co Lokalisierung Element ausgewählt. Ein typisches Ergebnis präsentiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

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Discussion

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In der aktuellen Zeitung beschrieben wir die Protokolle für AR-S Färbung, UV Licht Identifizierung von Fluorapatit und TEM-EDX in Vitro Imaging von MVs durch Mineralisierung Zellen freigesetzt und Mineralien produziert von MVs. Es ist möglich, alle Methoden, die oben genannten folgen einige allgemeine Schritte zur Problembehandlung. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollten mehrere kritische Schritte sorgfältig durchgeführt werden. Erstens ist es besser, hinzuzufügen, dass AA (das saure) gefolgt von β-GP (die alkalischen) um den pH-Wert 7,4 des Kulturmediums zu bewahren. Zweitens nach AR-S Färbung, die gefärbten Kalkablagerungen sind sehr empfindlich und die Zellen gewaschen werden mit großer Sorgfalt um Zerstörung der Kristalle auf Hinzufügen von PBS zu verhindern. Drittens, immer das Uranyl-Acetat in einem Lead-Container und nicht abholen das Sediment da nur der verdünnte Anteil zur Fixierung verwendet werden soll. Viertens: nicht vergessen Sie, dass AA und Uranyl-Acetat sind lichtempfindlich und sollte behandelt werden, in den dunklen Raum. Fünftens sollte die Mischung von LR weiß mit absoluten Ethanol gemischt werden, gut bevor Sie die Beispiele hinzugefügt. Sechstens: sollten die Proben in Gelatinekapseln mit ein kleines Blatt Papier und einen Stift, damit das Harz nicht die Etiketten zerstören beschriftet werden. Siebtens: sollte die Klinge des Messers Diamant aus Luftblasen sorgfältig zu reinigen. Achtens sollten Proben vorsichtig platziert werden auf die glänzende Seite des Gitters wo befindet sich der Formvar/Carbon-Film. Neunte, korrekt positionieren Sie den Punkt bei dem Röntgen-Mikroanalyse, den und Ionen-Zuordnung bei der TEM-Bild, mögliche Probleme mit Apatit Anerkennung zu begrenzen durchgeführt wird.

Obwohl die vorgestellte Protokoll erwies sich günstigste in unserem experimentellen Design als, ist es möglich zu ändern, um verschiedene Ziele zu passen. Wie mit keiner anderen Technik, hat dieser auch seine Grenzen. Zusätzliche Techniken, wie FTIR, sollte angewendet werden, um zu bestätigen, oder überprüfen das Vorhandensein des erhaltenen Verhältnisses der untersuchten Elemente8,12,26. Die hier vorgestellte TEM-EDX-Methode ist eine deutliche Verbesserung in Bezug auf die bestehende Methode, die ist eine Kombination aus Mikro-Raman-basierte Mapping und chemometrische Methoden und ist vergleichbar mit Bildgebung von Silber-Nanopartikeln (AgNPs) Verteilung auf verschiedene Oberflächen aus mineralischen und den Mechanismus ihrer molekularen Wechselwirkungen21. Raman-basierte Bildgebung wurde auf zwei mineralische Modelle (Makro - und Mikro-Größe) getestet. Raman Landkarten von n = 600-900 Spektren für jedes Beispielsteuerelement wurden durch Vespucci Software analysiert und die Ergebnisse wurden über andere Methoden wie z. B. ICP-OES, AFM und SEM-EDX bestätigt. Unsere TEM-EDX Karten bestehend aus n = 30 Frames und n = 6 Spektren für jedes Beispielsteuerelement wurden auch durch die Mikroanalyse Suite Software analysiert und die Ergebnisse, über andere Methoden wie FTIR, FM, TEM, SPM und 3D topografische AFM4 bestätigt wurden , 5. vorgeschlagene TEM-EDX-Mikroanalyse, wie Raman-basierte Bildgebung erfordert nur minimalen Probenvorbereitung, ist super-empfindlich, nicht-invasive und kostengünstigen und zu anderen Systemen relevant für die Umwelt des Menschen verlängert werden.

Die vorgestellte Technik könnte in der Zukunft in ein weites Feld der Forschung verwendet werden. Er kann für die Untersuchung der verschiedenen natürlichen und synthetischen Apatite geändert werden. Es kann auch sein angepasst die Protokolle der Experimente mit biologischen und chemischen Sonden. Darüber hinaus können alle Elemente aus dem Periodensystem analysiert werden, um nicht nur die Morphologie der Mineralien, sondern auch Veränderungen in ihren Ionen-Zusammensetzung und Substitutionen sichtbar zu machen. Ionenaustausch in Apatite ist ein bekanntes Verfahren für biomedizinische Anwendung27. Eine mögliche physiologische Faktor, der steuert Ca, F und Cl-Ionen oder Sr, Mg, Mn und Zn Metall-Ionen-Austausch in der HA bei der Mineralbildung, die einen Wendepunkt zwischen physiologischen und pathologischen Mineralisierung ist, möglicherweise die PiPPi Verhältnis7. Wenn richtig angewandt, erlaubt diese Technik für die Zuordnung von mehreren Elementen der gleichen zellulären, vesikuläre oder mineralischen Region mehrmals hintereinander ausführen.

In den letzten Jahren wurde viel Fortschritte über die Mechanismen der Knochen Mineralisierung28,29,30,31,32,33. Wir erkannten, dass verschiedene Zelllinien unterschiedliche Profile von Vesikeln und Mineralbildung haben können. In diesem Zusammenhang haben wir zwei humanen Zelllinien ausgewählt: osteoblastischen hFOB 1.19 und Osteosarkom Saos-2, die durchlaufen runden osteogene Transdifferenzierung von Verbreitung, Mineralisierung und produzieren MVs, die Apatit Keimbildung im ECM 34 auslösen , 35.

AR-S Färbung von Kalkablagerungen ergab, dass anders als hFOB 1.19 Osteoblasten stimulierte Saos-2 Zellen mineralisiert. Dies korrelierte mit der Produktion von Mineralien durch Saos-2 Zellen, die unter UV-Licht im Gegensatz zu denen von hFOB 1.19 Zellen produziert nicht nachweisbar waren. Unsere TEM-EDX-Daten ergab, dass die Mineralien in Vesikeln von Saos-2 Zellen produziert synthetische HA aufgrund der Überlappung in Kalzium und Phosphor Distributionen ähnelten. Im Gegensatz dazu die Überlappung in Fluor und Phosphor Distributionen in Vesikeln aus hFOB 1.19 Zellen angegeben die Bildung von anderen Arten von Mineralien neben Apatite.

Zusammenfassend zufolge unsere Erkenntnisse die Vesikel sind wichtige Determinanten der mineralischen Keimbildung, vor allem auf der zellulären Ebene5,25. Außerdem sind unsere Daten in Übereinstimmung mit eine frühere Theorie, dass MVs als eine spezielle Form des Microvesicles angesehen werden können, die Mineralisierung sowohl innerhalb als auch außerhalb der Zelle4starten können. Der Vergleich der Vesikel veröffentlicht von Saos-2 Zellen, die effizienter mineralisieren und Bläschen befreit hFOB 1.19 Zellen mit der TEM-EDX mikroanalytische Methode unterstützt die Hypothese, dass MVs Mineral-gefüllte Bläschen sind. Dies lässt die Frage offen ob das Vorhandensein von MVs erforderlich ist, induzieren Apatit Keimbildung und wie diese physiologischen, pathologischen Mineralisierung verändern kann.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenskonflikt.

Acknowledgments

MK und ASK manuelle Operationen durchgeführt und LB Zeichnungen vorbereitet und den Film gemacht. ASK schrieb das Manuskript LB schrieb das Drehbuch und MK vorbereitet in der Tabelle. SM, RB und SP lesen kritisch der Tabelle, die Schrift und das Manuskript. Die Autoren möchte Hanna Chomontowska für ihre hervorragende Unterstützung mit ultramicrotomy und Szymon Suski sowie Henryk Bilski für ihre hervorragende Unterstützung mit TEM-EDX-Analyse danken. Die Autoren möchte Dr. Patrick Groves für professionelle Englisch Korrektur und Barbara Sobiak zur Erfassung der Anweisungen zu danken.

Diese Arbeit wurde von Grant N N401 140639 aus dem polnischen Ministerium für Wissenschaft und Hochschulwesen, ASK, durch Zuschüsse aus dem National Science Centre, Polen 2016/23/N/NZ4/03313 LB und 2016/23/N/NZ1/02449, MK, EU FP7 Projekt BIOIMAGINE unterstützt. : BIO-IMAGing in Forschung, INnovation und Bildung, GA Nr. 264173, und durch die gesetzlichen Mittel von der Nencki Instituts für Experimentelle Biologie, Polnische Akademie der Wissenschaften.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture PAA E15-813 1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium PAA E82312-0025 for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin) Sigma P0781-100ML 100 U/mL each
G-418 Sigma 68168 0.3 mg/mL
FBS Gibco 10270 10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA Sigma A-5960 50 µg/mL
ß-GP Sigma G9422-100G 7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel Bio-Rad 130-0420 for HA
FA synthesized by us
CA synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture Sigma S7907/S8282 0.1 M, pH 7.2
PBS pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS Sigma A5533-25G 0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA Sigma C2674 500 U/mL
SCL buffer prepared by us
Deionized wather produced by us
Ethanol POCh BA6480111 absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol Polysciences Inc. 21447-25 0.25 g/10 mL
PD medium pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde) Sigma 158127/G-6257 3%:1%
Post-fixation OsO4 Sigma 75633 1%
LR White resin in ethanol Polysciences Inc. 17411-MUNC 500g 1:2, 1:1, 100%
Acetone CHEMPUR 111024800 pure
Tool
Cryogenic vials Corning Inc. 430487 1.2 mL
Plastic Petri culture dishes Falcon 353003 100 mm
Plastic tubes Falcon 352096 and 352070 15 and 50 mL
Serological pipettes Falcon and VWR 357521 and 612-3700 1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes Sigma Z688312 and Z628034 1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips VWR 613-0364, 613-0239 and 613-1050 0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks Light Labs A-7055-Z, A-7053-C green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save Thermo Scientific Co. KS12 HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell Thermo Scientific Co. 150 34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood POLON WCS-2 for TEM stainings
Glass bottles SIMAX 1632414501050 and 1632414501100 50 and 100 mL
Quartz glass tubes SIMAX 638422010100 Ø 10 mm, L 100 mm
Pump IBS Integra Biosciences VACUSAFE comfort for vacuum
Oven Memmert UNE 400 56°C
Porcelain multi-well plate Rosenthal technik 229/12 12 wells
Glass beakers SIMAX 632417010025 25 mL
Glass bottles Pocord DIN22 10 mL
Plastic box Agar Scientific Ltd. for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules Agar Scientific Ltd. G3741 size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box Agar Scientific Ltd. S162N3 film on the shiny side
Silicon cell scraper Sigma SIAL0010-100EA size 1.8/25 cm
Syringe with needle BogMark 007 syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe Chirana CH005L 5 mL
Centrifuge MPW Medical Instruments MPW-350R 130 x g and 500 x g
UV transluminator UVP M-20 for visible and UV light
Ultramicrotome LKB NOVA 700Å sections
Block holder LKB E6711 round shape
Diamond knife DiATOME Ultra 45° size 3
Eyelash holder bovine, prepared by us
Forceps ROTH 2855.1 antistatic for grids
Spatulas set ROTH E286.1 antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope Zeiss with Canon AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9 Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses Nikon Nikon D7100
Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D
Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G
Nikkor AF 28 mm f/2.8D
for movie recordings
Microphone MXL Mics Tempo for voice recordings

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References

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Analyse der Mineralien von hFOB 1.19 produziert und Saos-2 Zellen mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie mit Energy Dispersive x-ray Mikroanalyse
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Bozycki, L., Komiazyk, M., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S., Strzelecka-Kiliszek, A. Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis. J. Vis. Exp. (136), e57423, doi:10.3791/57423 (2018).More

Bozycki, L., Komiazyk, M., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S., Strzelecka-Kiliszek, A. Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis. J. Vis. Exp. (136), e57423, doi:10.3791/57423 (2018).

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