Summary
在这里, 我们描述了一个协议, 在幻灯片上使用 widefield 高含量分析系统 (WHCAS) 自动分割荧光标记的组织。该协议在任何领域都有广泛的应用, 包括生物科学、医学工程和健康科学等生物组织中荧光标记的定量。
Abstract
荧光标记组织的自动滑动扫描和分割是分析整张幻灯片或大型组织切片的最有效方法。不幸的是, 许多研究人员花费大量的时间和资源来开发和优化只与他们自己的实验相关的工作流。在本文中, 我们描述了一个协议, 可供那些访问 widefield 高内容分析系统 (WHCAS) 的人用来映像任何幻灯片安装的组织, 并在相关软件中找到预先构建的模块中的自定义选项。本篇文章中详细介绍的步骤并没有用于幻灯片扫描, 因此可以在 WHCAS 中获取可导入到相关软件中的幻灯片扫描图像。在这个例子中, 脑肿瘤切片的自动分割被证明, 但任何荧光标记的核或细胞质标记的自动分割是可能的。此外, 还有多种其他定量的软件模块, 包括蛋白质定位/易位、细胞增殖/生存能力/细胞凋亡和可运行的血管生成的化验。这项技术将节省研究人员的时间和精力, 并创建一个自动的幻灯片分析协议。
Introduction
在许多科学领域中, 荧光标记组织的准确精确定量是一种非常抢手的技术。然而, 研究人员经常手工计数标本或花费大量的时间开发深奥的自动化技术来实现这一点。在此, 我们提供了一个协议, 以自动幻灯片扫描和定量的细胞使用 WHCAS 及其相关软件, 与先天免疫细胞在冷冻人脑肿瘤切片作为一个例子。关联的软件提供了广泛的内置可自定义模块从突起的产生计算到分化的细胞类型1,2,3,4,5,6. 此方法的目的是为研究人员提供一个开始到完成的、易于重现的协议, 以便在任何幻灯片安装的组织中获取和定量荧光标记的实体的图像。
在本协议中, WHCAS 主要用于对相关软件进行后续分析的成像板, 即使幻灯片适配器和幻灯片扫描7的基本知识可用。这是禁止图像幻灯片, 因为仔细的空间校准的采集区域, 选择适当的期刊, 创造量身定做的 loadouts, 并与产品代表的联系是必需的。在更广泛的文学作品中, 代替购买专门的幻灯片成像和分析仪器8, 以前的技术报告可以访问该软件, 绕过了 WHCAS 共9上的幻灯片的图像获取。在不同的平台上进行图像采集或图像分析, 需要额外的工作, 以确保它们彼此兼容。
使用 WHCAS 及其软件进行图像捕获的能力将避免搜索或开发与这些工具不相关的工作流的不必要的复杂性。在本文中, 创建低放大率概述扫描和相应的高放大图像的步骤需要将幻灯片作为一个板块处理, 随后使用多波长单元评分细分模块进行的分析允许重新调整 WHCAS 的用途。这种易于使用的协议比替代技术提供了优势, 因为在 WHCAS 上获取图像后, 无需开发算法或多步骤计数协议10,11 。此协议可减少优化定量技术所需的时间, 更精确的12和效率比手动计数和最大化使用 WHCAS。该协议可以广泛且易于使用, 因为它能够对幻灯片上任何荧光标记的组织进行成像和分析。
Protocol
根据当地机构审查委员会和道德委员会批准的议定书获得肿瘤标本, 并按照国家条例进行。本文中使用的 WHCAS 及其相关软件列在材料表中。
1. 导入日志
- 打开关联的软件。
- 下载材料表中指示的日志套件。
- 单击主菜单标题日记本, 选择导入日记套件., 然后单击导入, 将日志套件导入适当的目录。
2. 创建预览扫描采集设置
- 在车牌采集设置对话框中, 转到目标和照相机选项卡. 选择4X 作为放大倍数, 1 作为照相机 binning, 并且2作为增益。
- 在板-Slidescanning下的图 1A中输入设置。
注意: 已创建这些设置以允许用户查看和浏览多达3张幻灯片。每张幻灯片都分为3个相邻的井, 方便导航和 ' 活 ' 可视化的组织切片或细胞。 - 在要访问的站点选项卡中, 将井与站点统一填充。
- 单击编辑板底设置...并输入图 1B中显示的值。
- 在获取循环选项卡下, 为预览扫描输入所需的波长 (本例中的任何核污点)。为了得到最佳的对比度和基于图像的聚焦, 请使用最亮的荧光信号 (例如, 通常是核污点)。
注意: 建议用明亮的污渍 (如核污点) 染色组织, 因为这提供了与背景相比的高对比度。这不仅有助于在样本位置, 但当成像多个荧光在下面的高放大率采集, 最明亮的颜色将用于基础上的其他颜色的成像偏移。 - 在 "板捕获" 模式下启用底纹校正, 将图像拼接在一起。
- 将这些设置保存为设置 A。
3. 在高放大率下创建幻灯片采集设置
- 在车牌采集设置对话框中, 转到目标和照相机选项卡. 选择40X 作为放大倍数, 1 作为照相机 binning (为最高的数字分辨率) 和2作为增益 (增加图像的信号和亮度)。
注意: 可以使用较低的目标放大设置, 但作者发现40X 是使用多波长细胞评分模块分析脑肿瘤组织中人小胶质细胞和巨噬细胞的最佳设置。 - 确保板-Slidescanning和编辑板底设置的所有设置...选项卡与设置 A (请参见步骤 2) 相同。
- 如果获得的图像不脆, 请更改井深度、板高和板底部设置以调整焦点。如果焦点仍存在问题, 请在自动对焦选项部分中选择具有图像恢复的激光。
- 在获取循环选项卡下, 输入示例中存在的波长数。检查启用基于激光的聚焦和启用基于映像的聚焦 (用于获取或激光恢复)选项。
- 在自动对焦选项卡下, 选择将焦点放在 "板" 和 "底端"。
- 在日志选项卡中, 选择图 2中所示的选项, 确保防止异步硬件移动也被选中。
- 将这些设置保存为设置 B。
4. 将幻灯片放在 Widefield 高内容分析系统中
- 按F4以获取主菜单。选择幻灯片扫描。单击打开门–弹出幻灯片并插入幻灯片和幻灯片适配器 (可容纳多达三张幻灯片) 到 WHCAS (图 3A 和 3B)。将幻灯片定向到向下的盖玻片和幻灯片适配器中凹槽一侧的标签(图 3A)。
注: 本实验中使用的幻灯片是标准的 25 x 75 x 1 mm 幻灯片。 - 单击关闭门–加载幻灯片。
5. 获取预览扫描
- 在筛选标题下, 选择车牌获取和控制...和车牌采集设置. 和加载设置 A。
- 在要访问的水井选项卡下, 使用鼠标上的右键单击按钮, 移动到包含该示例的井中。在要访问的站点选项卡下, 在单元格找到之前, 移动到具有Live图像捕获的不同站点。手动将焦点放在示例上或使用自动对焦。使用快照捕获图像。
注意: 该示例更容易找到更多的站点, 并将站点调整到井 (参见步骤 2.3)。 - 在主菜单上, 选择预览幻灯片。
- 在自动弹出的对话框中, 选择反映要扫描多少张幻灯片的选项。一次扫描一张幻灯片。按确定。选择4X 作为放大倍数。按确定。选择盖玻片 (0.17毫米) 作为幻灯片方向 (如果使用不同的盖玻片粗细, 请使用更正衣领)。按确定。单击继续。
注意: 如果用户希望获取2或更多幻灯片的预览扫描, 则必须在获取相应的高放大图像之前分别打开每个预览扫描。 - 在加载扫描幻灯片设置下, 确保选中购置设置和校准框。按取消。当扫描幻灯片设置框重新出现时, 选择继续。
- 出现扫描幻灯片对话框时, 根据图 4A-4C中的建议调整设置。完成后选择关闭。
注: 增加相机的 binning 和减少相机曝光时间将导致更快的扫描, 虽然在较低的数字分辨率和动态范围, 从而降低图像质量。底纹校正将确保整个单一视野的均匀强度。打开硬件和图像自动对焦将确保扫描处于焦点, 但会减慢扫描速度。为了节省时间, 建议在获取低放大率扫描时有阴影校正和硬件和图像自动对焦, 但在高放大率成像期间为步骤6打开这些选项。低放大率扫描的分辨率不会影响高放大扫描的分辨率。 - 为幻灯片扫描数据选择一个目录。单击确定。输入文件的名称。单击确定。
- 绘图区域对话框将自动显示。使用矩形区域工具 (图 5A) 选择整个预览扫描区域, 如图 5B所示。单击继续。
- 将出现安装完成对话框。选择继续。
注意: 预览幻灯片扫描现在将开始。 - 预览完成后, 将显示扫描完成对话框。选择继续。不要关闭预览扫描窗口 (在此示例中为DAPI 扫描窗口; 请参见图 6)。
注: 安装和低放大扫描采集过程将需要大约20分钟。随后的高放大图像采集时间将取决于所选站点的数量以及每个通道的曝光时间。
6. 高放大率扫描
- 负载设置 B。
- 确定要成像的井。在要访问的水井选项卡下, 使用鼠标上的右键单击按钮, 移动到包含该示例的井中。
注: 这项技术是在这里展示的成像井1。 - 在要访问的站点选项卡下, 使用Live功能移动到不同的站点, 直到单元格或组织位于该位置。手动将焦点放在示例上或使用自动对焦。使用快照捕获图像。
注意: 为了帮助在高放大率下定位样本, 请使用 "车牌采集和控制" 对话框, 从5到100µm 调整步长大小, 以便在自动对焦不能的情况下查找样本。 - 在W1 DAPI选项卡下, 单击自动公开。确保车牌捕获快照 DAPI图像是脆的。
- 在主菜单下, 单击日记本以显示下拉。选择运行日志...。
- 双击幻灯片区域购置设置日志以启动它。当出现安装程序幻灯片区域捕获对话框时, 选择继续。
- 指示时, 正确选择DAPI 扫描以选择低放大率幻灯片图像。按确定。同样地, 当被要求进行车牌采集时, 请突出显示 "DAPI" 单元。单击确定。
- 当出现创建或加载区域框时, 使用矩形区域工具在 DAPI 扫描 (图 6) 上选择 (a) 感兴趣的区域。按继续。
注意: 可在40X 中选择的最大区域为45列, 35 行。如果选择了多个感兴趣区域, 则区域将被调整为具有最大区域的框。可以在调整大小后重新定位这些框。 - 在加载区域对话框下选择否。
注意: 选择是将以前保存的区域加载到与感兴趣位置相同区域的多个幻灯片上。 - 使用定位器工具, 突出显示感兴趣的最大区域, 然后在选择区域对话框下按继续。当出现确认区域框时, 选择继续。确定在出现保存区域对话框时是否需要保存区域。
- 下一个对话框站点间距允许用户选择平铺, 这会导致图像不重叠, 或者10% 重叠。选择一个选项, 然后单击确定。作者选择平铺。
- 三对话框将立即出现。安装完成框可以通过按继续来解除。保留 "40X" 的 "采集站点设置" 框 (图 7A) 现在打开, 因为它明确了需要在车牌采集设置框 (图 7B) 中输入多少列和行。保留显示在图像持续时间左下角的WellPositions框 (图 7C)。
- 在车牌采集设置框中, 在水井访问下, 必须突出显示以前选定的感兴趣区域的相同数量的水井 (图 7D)。
注: 作者为每张幻灯片最多开发了九个感兴趣的区域。如果有更多, 只需增加 "板-SlideScanning " 选项卡中的列或行数, 以反映感兴趣区域的数目。这些井不以任何方式在空间上代表感兴趣区域的位置, 但必须突出显示适当的数字 (左键单击)。 - 在车牌采集设置框中, 转到要访问的站点选项卡. 输入建议的列和行 (图 7B)。请记住单击平铺站点。
- 要消除查找包含该示例的站点的猜测, 请在摘要选项卡下按获取板, 将舞台放置在所选的感兴趣区域中。一旦摄像机在包含单元格的站点上平移, 请按下右下角的取消以停止图像获取。确保舞台现在位于样品上。
- 优化波长设置, 以确保获得聚焦和高动态范围图像。满意时, 单击摘要选项卡和获取板。
7. 图像分析
- 选择所需的自定义模块。
注: 作者选择了多波长细胞评分模块来演示脑肿瘤切片的自动分割。 - 对所有站点运行分析。如果许多幻灯片的分析参数相同, 则可以将分析包括在 "后购置" 选项卡下的 "板购置设置" 框中。
- 完成分析后, 排除任何图像质量较差的站点, 以免对结果产生偏差。由于这一分析的目的是量化小胶质细胞和巨噬菌在肿瘤实质, 选择感兴趣的区域内的肿瘤标本的边缘。此外, 排除不聚焦的部位和/或包含组织褶皱或气泡和眼泪的组织。有关演示, 请参见代表结果。或者, 使用为每个站点生成的激光聚焦评分, 视激光反射的振幅为阈值, 以下是要排除的站点 (阈值是可自定义的, 取决于参数, 如曝光时间和使用的媒体类型)。
注: 高放大图像可以明确排除结构, 如大血管和坏死区, 如有必要。也有可能只包括感兴趣的领域, 如那些 hypercellular。这种方法可以提高分析的特异性和准确性。
Representative Results
这些图像可以在 WHCAS 软件中查看。图 8显示了所定义区域中所有站点的高放大率缩略图。检查每个站点以确定应从分析中排除的那些 (示例在图 8和图 9中分别显示为低和高放大倍数)。例如, 站点149不集中 (图 9A), 站点219有气泡 (图 9B), 站点54包含折叠 (图 9C), 应该排除。这是典型的排除 10-15% 的所有网站映像。在提供的例子中, 15.3% 的站点被排除了 (25/300 有气泡, 17/300 是不集中, 3/300 被折叠, 并且1/300 在边缘)。图 10A是为分析选择的代表性图像 (其相应的低放大率缩略图显示在图 8中)。在这里, 由多波长单元评分模块生成的相应叠加显示了在站点59上进行的自动分割的结果, 根据作者的规格 (原子核最小宽度 = 2.5 µm, 最大宽度 = 7.5 µm,和强度以上的地方背景 = 35 graylevels;CD11b-positive 细胞的最小宽度 = 4 µm, 最大宽度 = 18 µm, 最小染色面积 = 15 µm2, 强度高于局部背景 = 310 graylevels;和 CD45-positive 细胞的最小宽度 = 4 µm, 最大宽度 = 18 µm, 最小染色面积 = 15 µm2, 强度高于本地背景 = 50 graylevels)。分割后, 每个标记的细胞比例的定量数据 (分别为6.2 到5.1% 和 3.8 CD11b+和 CD45+单元格), 两个标记 (3.5 @ 2.1% CD11b+CD45+单元格), 没有标记 (86.6 @ 9.0% CD11b-CD45-单元格;图 10B), 平均染色面积 (40.0 到9.2 µm 和 36.7 CD11b+和 CD45+单元格分别为7.6 µm;图 10C) 和平均值荧光强度 (分别为 CD11b+和 CD45+单元格的 408.9 40.3 相对荧光单元和 373.9 * 38.1 相对荧光单元;图 10D)可以获得。
图 1: 低放大率下的幻灯片获取设置。一个. 此图像显示板块设置。B. 在这里, 显示板底设置。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 高放大率下的幻灯片获取设置.此图显示相应日志的选择。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 演示如何使用幻灯片适配器加载幻灯片.A. 将幻灯片置于幻灯片适配器切口一侧的标签盖玻片下。B. 幻灯片适配器加载到 widefield 高内容分析系统中。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 预览幻灯片设置.A. 此图显示获取的参数。B. 这里, 显示 Hoescht/DAPI 波长设置的值。C. 此图像显示日志设置。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 绘制幻灯片区域.A. 矩形区域工具 (无法使用其他绘图工具) 用于选择预览扫描区域, 并在 DAPI 扫描中创建感兴趣的区域。B. 此图中的蓝绿色轮廓显示应如何选择幻灯片的整个区域 (包括标签)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 在预览扫描中创建感兴趣的区域.预览或 DAPI 扫描表示整个幻灯片区域。在这个例子中, 有三个连续的脑组织部分 (实心白色长方形轮廓)。这些节上方的区域表示幻灯片上的圆形标签。不同的分区安排不会限制随后选择感兴趣的区域。此特定示例中的感兴趣区域显示为一个虚线白色矩形轮廓。比例条 = 1 毫米请单击此处查看此图的较大版本。
图 7: 用于高放大图像获取的基本窗口.A. "购置站点设置" 窗口将显示有多少列和行位于感兴趣的区域内。B. 确保将图 7A中指示的列和行数输入到 "车牌采集设置" 框中, 并平铺这些站点。C. 即使是空白的, 也必须保持 WellPositions 窗口在图像获取的持续时间内打开。D. 必须强调适当的利益区域数目。请单击此处查看此图的较大版本.
图 8: 感兴趣区域的代表性图像.每个站点都可以显示在感兴趣区域的复合缩略图中。已排除的代表站点 (标记为红色框) 和包含站点 (标记为绿色框) 的示例以更高的放大倍数显示。建议检查每个站点, 以确保它具有足够的分析质量。比例条 = 1 毫米请单击此处查看此图的较大版本。
图 9: 应排除在分析之外的站点的示例.A. 人脑肿瘤切片染色的 CD11b (绿色) 和 CD45 (红色), 小胶质细胞和巨噬菌的标记。此图像已不集中, 已被排除在分析之外。B. 此图像中存在气泡, 但最终分析中已排除。C。由于组织中的褶皱, 本网站被排除在分析之外。刻度条为20µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 10: 代表性图像和分析.A. 每个图像都显示在表示自动分割结果的叠加的旁边。在叠加中, 细胞核显示在白色, 正面染色的细胞呈绿色显示为 CD11b 和红色, 用于 CD45。在从分析中排除质量不足的站点后, 将所有剩余站点的结果合并在一起, B。每个站点中为每个标记着色为正数并为两个标记 ( C) 共同标记的单元格总数的平均比例。平均染色区域和D。平均细胞强度以图形方式表示。RFU = 相对荧光单位。数据被表示为平均值, 即标准差。刻度条为20µm.请单击此处查看此图的较大版本.
Discussion
一个普遍的问题仍然阻碍生物科学研究的效率是发展的协议为无偏, 准确, 精确量化的荧光标记组织及其结构内。大量的时间和精力用于寻找方法来分析组织的幻灯片, 一旦他们已经成像。许多现有方法为用户提供了在程序12、13、14中重新创建的算法。这些方法是可以接受的, 但此报告的意义在于, 如果用户能够访问 WHCAS, 则可以轻松快速地建立完整的图像获取和分析协议。例如, 在相关软件中已经有了区分细胞类型和量化多个结构和过程、细胞周期分析和核易位的化验。
安装程序涉及几个关键步骤。首先, 幻灯片的空间参数被定义为, 如果它是一个板块。其次, 创建了低放大率概览扫描, 从中选择感兴趣的区域进行高放大率成像。最后, 排除了影响后续分析的准确性和精确性的站点。此技术的最大限制是它的适用性取决于用户是否可以访问 WHCAS。然而, 随着对高内容分析系统的需求日益增加, 许多机构正在向其研究人员提供这些信息, 以保持竞争力15。当组织切片的厚度不相同时, 通常需要进行故障排除。如果选择了多个感兴趣的区域, 则某些地区将处于焦点, 而其他部分则不会。理想情况下, 在切片过程中, 用户将注意创建均匀的样本。但是, 如果样本不一致, 则重点放在核着色波长 (或用户最亮的荧光) 上, 这是用来聚焦的, 可以对每个焦点以外的区域进行重新调整, 甚至对每个视场进行调整。由于其他波长只是从核着色波长抵消, 只有这种波长需要调整。
在本报告中, 我们详细介绍了如何使用 WHCAS 和相关软件扫描和分析幻灯片。多波长细胞评分模块允许用户自动计数任何荧光标记的核或细胞质标记。在调整焦点设置并定义细胞特征 (如宽度和区域) 以自定义模块到组织成像时, 不再需要用户干预来获取图像幻灯片和量化数据。一次可以拍摄多达三张幻灯片, 可以定义多个感兴趣的区域。此协议允许需要分析幻灯片的 WHCAS 用户利用可自定义的、多用途的自动化工作流, 无需进行优化, 并且可以应用于将来涉及组织组织学分析的任何项目中。
Disclosures
作者对本手稿所描述的产品没有任何财务利益, 也没有其他东西可以透露。
Acknowledgments
该项目由加拿大卫生研究所和艾伯塔省创新保健解决方案/艾伯塔省癌症基金会资助。作者希望认识到神经生物学核心设施中的再生单元使用他们的设备, 宝拉 Gedraitis 在建立 WHCAS 上的滑动扫描的基础上的工作, 以及产品的创造者本文提到的分子器件。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageXpress MicroXLS | Molecular Devices | NA | Apparatus for image acquisition |
| MetaXpress 5.1 | Molecular Devices | NA | Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system). |
| Slide adapter | Molecular Devices | NA | Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL |
| Slide_Region_Acquisition_revA.jzp | Molecular Devices | NA | The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative |
| Slide_Region_Acquisition _Setup.JNL |
Molecular Devices | NA | Select this journal in Step 6.6. |
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