Summary
Burada bir widefield yüksek-içerik analizi sistemi (WHCAS) kullanarak slaytlarda fluorescently etiketli dokuların otomatik bölümleme için bir protokol açıklayın. Bu iletişim kuralının Nefelometri biyolojik bilimler, tıbbi mühendislik ve Sağlık Bilimleri de dahil olmak üzere biyolojik dokularda floresan işaretleri içeren herhangi bir alanda geniş kapsamlı uygulamalar vardır.
Abstract
Slayt tarama otomatik ve segmentasyon dokuların fluorescently etiketli tüm slaytları veya büyük doku bölümleri analiz etmek için en etkili yoludur. Ne yazık ki, pek çok araştırmacı zaman ve kaynak geliştirme ve iş akışları yalnızca kendi deneyleri için uygun olan en iyi duruma getirme büyük miktarda harcama. Bu makalede, biz bu widefield yüksek-içerik analizi sistemine (WHCAS) erişim ile ilişkili yazılımı bulunan önceden inşa edilmiş modüller içinde özelleştirme seçenekleri ile slayt monte edilmiş herhangi bir doku görüntü için kullanılan bir iletişim kuralı tanımlamak. Özgün olarak slayt tarama için amaçlanan, bu makalede ayrıntılı adımları ilişkili yazılım ithal WHCAS Albümdeki tarama slayt alma olanağı olun. Bu örnekte, beyin tümörü slaytları otomatik ayrılmasını gösterdi ama herhangi bir fluorescently etiketli nükleer veya sitoplazmik işaretçisi otomatik ayrılmasını mümkündür. Ayrıca, protein yerelleştirme/translocation, hücresel proliferasyonu/canlılık/Apoptozis ve çalıştırılabilir angiogenez deneyleri de dahil olmak üzere diğer nicel yazılım modülleri çeşitli vardır. Bu teknik araştırmacılar zaman ve emek tasarrufu ve slayt analiz için otomatik bir iletişim kuralı oluşturun.
Introduction
Slaytlarda fluorescently etiketli dokuların doğru ve hassas Nefelometri çok bilimsel alanda çok aranan bir tekniktir. Ancak, araştırmacılar genellikle el ile numune saymak veya bunu başarmak için ezoterik otomatik teknikleri geliştirmek zaman önemli miktarda harcama. Burada, otomatik slayt tarama ve Nefelometri donmuş insan beyin tümörü bölümlerde örnek olarak doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ile bir WHCAS ve onun ilişkili yazılım kullanarak hücre için bir protokol sağlar. İlişkili yazılım farklılaşma hücre türleri1,2,3,4,5, için sayma neurite çıkıntı dahili özelleştirilebilir modülleri çeşitli teklifler 6. bu yöntem amacı araştırmacılar görüntülerini almak ve herhangi bir slayt monte edilmiş dokular fluorescently etiketli varlıklarda quantitate için bir başlangıç bitiş, kolayca tekrarlanabilir protokol sağlamaktır.
Bu protokol için WHCAS esas olarak bir slayt bağdaştırıcısı ve temel tarama7 slayt için kullanılabilir olmasına rağmen plakalar ilişkili yazılım üzerinde daha sonraki analiz için görüntüleme için kullanılır. Dikkat et kayma kalibrasyon satın alan, uygun dergi seçimi, özel loadouts oluşturulması ve ürün temsilcileri ile bir irtibat olduğu için gerekli görüntü slaytlara engelleyici. Edebiyat bir özel slayt görüntüleme ve analiz cihazları8, satın alma yerine, daha geniş vücuttaki bu yazılım erişimi olan bir önceki teknolojik rapor slaytlar WHCAS tamamen9resim alma atlatılabilirdi. Görüntü edinme veya görüntü farklı platformlarda çözümlemesini her ile diğer uyumlu olduğundan emin olmak için fazladan iş gerektirir.
Görüntü yakalama için WHCAS ve onun bilgisayar yazılımı kullanma yeteneğini arama veya bir iş akışı yabancı bu araçlar geliştirme gereksiz komplikasyonları önlemek olacaktır. Bu makalede, slaydı bir tabak gibi davranarak bir düşük büyütme genel bakış tarama ve karşılık gelen yüksek büyütme görüntüler oluşturmak için gereken adımları ve çoklu dalga boyu hücre puanlama segmentasyon modülü kullanılarak daha sonraki analizler için izin ver WHCAS repurposing. Görüntüleri üzerinde WHCAS elde bir kez algoritmaları veya çok adımlı sayım protokolleri10,11 geliştirmek gerek yok çünkü bu kolayca kullanılabilir iletişim kuralı alternatif teknikleri üzerinde bir avantaj sağlar. Bu iletişim kuralı bir Nefelometri tekniği en iyi duruma getirmek için gereken süreyi azaltır, daha hassas12 ' dir ve elle sayım daha verimli ve WHCAS kullanımını en üst düzeye çıkarır. Görüntüleme ve çözümleme slaytlar üzerindeki herhangi bir fluorescently etiketli dokuların sağlar beri bu protokolü yaygın olarak ve kolayca kullanılabilir.
Protocol
Tümör örnekler yerel kurumsal inceleme kurulu ve Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve ulusal düzenlemelere uygun şekilde yapılan protokol uyarınca elde edilmiştir. WHCAS ve ilişkili yazılımının bu makalede kullanılan Malzemeler tablolistelenir.
1. günlük içe aktarma
- İlişkili yazılımını açın.
- Download Malzeme tablobelirtilen günlük maiyet.
- Günlük, başlık ana menüsünde tıklatarak uygun dizinine günlük paketine aktarmak Alma günlüğü Süiti...seçip Al' ı tıklatarak.
2. tarama için önceki oluşturma ayarlarını alma
- Plaka satın alma yapısı iletişim kutusunda objektif ve kamera sekmesini seçin 4 X büyütme, kamera binning olarak 1 ve 2 olarak kazanç olarak gidin.
- Giriş şekil 1a Ayarları sekmesi plaka-Slidescanningaltında.
Not: Bu ayarları görüntülemek ve ilâ 3 slaytlar gezinmek kullanıcı izin vermek için yaratılmıştır. Her slayt gezinme için 3 bitişik kuyu içine bölünmüş ve 'görselleştirme dokusu dilimlerin veya hücrelerin canlı'. - Siteleri ziyaret etmek sekmesini kuyuları düzgün siteleri ile doldurun.
- Plaka alt ayarlarını düzenle...'ı tıklatın ve şekil 1Badımında görüntülenen değerleri girin.
- Edinme döngü sekmesi altında önizleme taraması için istenen dalga boyu (Bu örnekte herhangi bir nükleer leke) girin. İçin belgili tanımlık en iyi kontrast ve görüntü tabanlı odaklanarak, en parlak floresan sinyal (örneğin, sık sık bir nükleer leke) kullanın.
Not: Bu arka plana göre yüksek bir kontrast sağlar beri nükleer bir leke gibi parlak bir leke ile doku boyama önerilir. Sadece bu yardım örnek konumda, ancak birden fazla fluorophore aşağıdaki yüksek büyütme edinme Imaging zaman en parlak renk görüntüleme ofset diğer renklerin temel için kullanılacak. - Gölgelendirme düzeltme görüntüleri birleştirmek için plaka satın alma modunu etkinleştirin.
- Ayar A. bu ayarları Kaydet
3. yüksek büyütme oranında slayt edinme için ayarlar oluşturma
- Plaka satın alma Kur iletişim kutusunda, objektif ve kamera sekmesini Select 40 X büyütme, kamera (en yüksek dijital çözünürlük için) binning olarak 1 ve 2 (sinyal ve görüntü parlaklığını artırmak için) kazanç olarak gitmek.
Not: Daha düşük bir objektif büyütme ayarı kullanılabilir ancak yazarlar insan microglia ve Çoklu dalga boyu hücre puanlama modülü kullanılarak Beyin tümör dokusunda makrofaj analizi için en uygun ayarı için 40 X bulundu. - Plaka-Slidescanning ve Plaka alt ayarlarını düzenle... sekmeleri ile aynı ayarı için A için tüm ayarları sağlamak (bkz. Adım 2).
- Elde edilen görüntüler net değilse kuyu derinliği, plaka yüksekliğive Plaka alt ayarları odağı ayarlamak için değiştirin. Hala odağı ile ilgili bir sorun varsa lazer görüntü kurtarma ile otomatik odaklama seçenekleri bölümünde seçin.
- Edinme döngü sekmesi altında dalga boylarında örnek mevcut sayısını girin. Lazer tabanlı odaklanarak etkinleştirmek ve yansıma tabanlı (satın alma veya lazer kurtarması için) odaklanarak etkinleştirmek seçeneklere bakın.
- Otofokus sekmesinde, plaka ve iyi alt üzerindeseçin.
- Günlükler sekmesinde Engelle zaman uyumsuz donanım hamle de seçili kontrol ettikten Şekil 2' de gösterildiği gibi seçenekleri seçin.
- Ayar B. bu ayarları Kaydet
4. Widefield yüksek-içerik analizi sistemini içinde slayt yerleştirme
- Ana Menüiçin F4 tuşuna basın. Tarama slaytseçin. Açık kapı – çıkarma slaytı tıklatın ve slaytları ve (ilâ üç slayt tutabilir) slayt bağdaştırıcısı (şekil 3A ve 3B) WHCAS koyun. Slayt aşağı bakacak şekilde coverslip ve yan tarafındaki slayt bağdaştırıcısı (şekil 3A) girinti etiketi ile gelecek şekilde yönlendirin.
Not: Bu deneyde kullanılan slaytlar standart 25 x 75 x 1 mm'lik slaytlar vardı. - Kapıyı kapat-yük slayt'ıtıklatın.
5. bir önizleme taraması edinme
- Eleme başlığı altında plaka satın alma ve kontrol... ve Plaka satın alma Kur... seçin ve ayarı A. yüklemek
- Wells gezilecek sekmesinde de üzerinde farenin sağ düğmesini kullanarak örnek içeren için hareket. Hücreleri bulunmaktadır kadar canlı görüntü yakalama ile farklı sitelere siteleri ziyaret etmek sekmesi altında taşıyın. El ile örnek üzerinde odaklanmak veya otofokuskullanın. Snap görüntüyü yakalamak için kullanın.
Not: Örnek ile daha fazla yer ve iyi sitelere uygun bulmak kolaydır (bkz. Adım 2.3). - Ana menüsünde, Önizleme slaytlarıseçin.
- Otomatik olarak beliren iletişim kutusunda, kaç slaytlar taranacak gidiyoruz yansıtan seçeneğini seçin. Bir slayt bir anda tarama. OKtuşuna basın. 4 X büyütme seçin. OKtuşuna basın. Coverslip (0,17 mm) aşağı slayt yönlendirme (kullanım bir düzeltme yaka farklı coverslip kalınlığı kullandıysanız) seçin. OKtuşuna basın. Devam' ı tıklatın.
Not: Kullanıcı 2 veya daha fazla slayt önizleme taramalarda elde etmek isterse, karşılık gelen yüksek büyütme resim edinme önce ayrı ayrı açılacak her önizleme tarama vardır. - Slayt yük tarama ayarıaltında satın alma ayarları ve kalibrasyonlar kutuları kontrol emin olun. İptaldüğmesini tıklatın. Ne zaman Slayt ayarları tarama kutusu görüntülenir, Devam Et'iseçin.
- Slayt tarama iletişim kutusu göründüğünde, şekil 4A-4 Cönerilen ayarları. Ne zaman tamamlanmak yakın seçin.
Not: binning ve kamera çekim hızı azalan kamera artan daha hızlı tarama, sırasıyla, dolayısıyla azalan görüntü kalitesi daha düşük dijital çözünürlük ve dinamik alan de olsa neden olur. Düzeltme gölgelendirme Tekdüzen bir yoğunluk arasında bir tek görüş alanı sağlayacaktır. Donanım ve görüntü otofokus dönerek tarama odakta olmakla birlikte tarama aşağı yavaş olacaktır sağlayacaktır. Zaman tasarrufu için bu düzeltme ve donanım ve görüntü otofokus kapalı düşük büyütme tarama elde ederken gölgelendirme var ama bu seçeneklerin olması için adım 6 yüksek büyütme görüntüleme sırasında açık tavsiye edilir. Düşük büyütme tarama çözünürlüğü yüksek büyütme tarama çözünürlüğünü etkilemez. - Veri tarama slayt için bir dizin seçin. Tamam' ı tıklatın. Dosya için bir ad girin. Tamam' ı tıklatın.
- Çizmek bölge iletişim kutusu otomatik olarak görüntülenir. Dikdörtgen Aracı (şekil 5A) şekil 5Biçinde gösterildiği gibi tüm önizleme tarama bölgeyi seçmek için kullanın. Devam' ı tıklatın.
- Kurulum tamamlandı iletişim kutusu görüntülenir. Devamseçin.
Not: Önizleme slayt tarama şimdi başlayacak. - Önizleme tamamlandığında Tarama tamamlandı iletişim kutusu görünür. Devamseçin. Önizleme tarama pencereyi kapatmak etmeyin (Bu örnekte DAPI inceden inceye gözden geçirmek pencere; bkz: şekil 6).
Not: Kurulum ve düşük büyütme tarama satın alma işlemi yaklaşık 20 dk sürer. Sonraki yüksek büyütme resim satın alma zaman yanı sıra pozlama süreleri her kanal için seçilen site sayısı bağlı olacaktır.
6. yüksek büyütme tarama
- B.bir ayarlama yük
- Hangi kuyu yansıması olduğunu belirlemek. Wells gezilecek sekmesinde de üzerinde farenin sağ düğmesini kullanarak örnek içeren için hareket.
Not: Bu teknik burada de 1 Imaging tarafından gösterilmiştir. - Hücreleri veya doku bulunana kadar Live özelliği ile farklı sitelere ziyaret sitelere sekmesi altında taşıyın. El ile örnek üzerinde odaklanmak veya otofokuskullanın. Snap görüntüyü yakalamak için kullanın.
Not: yüksek büyütme oranında örnek bulunmasına yardım etmek için plaka edinme ve denetim iletişim kutusu otofokus Eğer örnek bulmak için 100 µm yerden 5 adım boyuta ayarlamak için kullanın. - W1 DAPI sekmesinde Otomatik açığa' ni tıklatın. Plaka satın alma Snap - DAPI görüntü net olduğundan emin olun.
- Ana menü altında aşağı açılır ortaya çıkarmak için Journal ' ı tıklatın. Günlük... Çalıştır' ı seçin.
- Başlatmak için Slayt bölge satın alma kurulum günlüğü çift tıklatın. Kurulum slayt bölge satın alma iletişim kutusu göründüğünde, Devam Et'iseçin.
- Talimat, düzgün düşük-büyütme slayt görüntüsü seçmek için DAPI tarama seçin. OKtuşuna basın. Benzer şekilde, plaka satın alma Snap - plaka satın alma ek için sorulduğunda DAPI vurgulayın. Tamam' ı tıklatın.
- Yaratmak ya da yük bölgeleri kutusu göründüğünde, DAPI tarama (şekil 6) üzerinde ilgi (a) region(s) seçmek için Dikdörtgen aracını kullanın. Devamtuşuna basın.
Not: 40 X, seçilebilen maksimum 45 sütuna göre 35 satır alandır. Birden çok bölge ilgi seçtiyseniz, bölgeler kutusunun en büyük alana sahip boyutlandırılır. Kutuları yeniden boyutlandırma sonra yeniden konumlandırılmış. - Hayır Yük bölgeleri iletişim kutusunun altında seçin.
Not: Evet seçerek yükler önceden faiz yerleri aynı bölge ile bölgeler slaytların toplu işlemler için kaydedilmiş. - Konum belirleyici aracını kullanarak, ilgi en büyük bölge vurgulayın ve Bölge seçin iletişim kutusunda altında devam tuşuna basın. Onayla bölgeleri kutusu görüntülendiğinde, Devam Et'iseçin. Bölge Bölgeler Kaydet iletişim kutusu görüntülendiğinde kurtarılması gereken karar verin.
- Sonraki iletişim kutusunda, Site aralığı, çakışma veya % 10 üst üstegörüntüdeki sonuçları döşeli, seçmek kullanıcı sağlar. Bir seçenek belirleyin ve Tamam' ı tıklatın. Yazarlar döşeliaçmadı.
- Şimdi üç iletişim kutusu görünür. Kurulum tamamlandı kutusunda devambasarak göz ardı edilemez. Edinme sitesi kurulumu için 40 X kutusu (şekil 7A) geçici o ne kadar çok sütun ve satırları Plaka satın alma yapısı kutusu (şekil 7B) girilmesi gerekir beri şu an için açık tutun. Görüntülenen WellPositions kutusunda (şekil 7C) alt sol köşedeki görüntüleme süresi için açık tutun.
- Plaka satın alma yapısı kutusunda altında Kuyu ziyaret içinönceden seçilmiş faiz bölgelerinde aynı sayıda wells olması gerekir (Şekil 7 d) vurgulanır.
Not: Yazarlar bu iletişim kuralı için en çok dokuz slayt başına faiz bölgelerinde geliştirdi. Eğer daha fazla var, sadece faiz bölgelerinde sayısını yansıtması için plaka - SlideScanning sekmesinde satır veya sütun sayısını artırmak. Bu kuyu dağınık şekilde faiz herhangi bir şekilde bölgelerinde konumunu temsil etmemektedir ama uygun vurgulanan (sol) olması gerekir. - Plaka satın alma yapısı kutusunda ziyaret sitelere sekmesini gidin önerilen sütunlar ve satırlar (şekil 7B) girin. Kiremit siteleriöğesini tıklatmayı unutmayın.
- Örnek içeren siteleri bulma tahmin ortadan kaldırmak için sahne ilgi bölge önceden seçilmiş konumlandırmak için Özet sekmesinin altındaki Plaka elde basın. Hücreleri içeren bir site kamera tava sonra İptal resim alma durdurmak için alt sağ köşede tıklayın. Sahne alanı olduğundan artık emin olun örnek üzerinde bulunan.
- Bir odaklı ve yüksek dinamik alan görüntü elde emin olmak için dalga boyu ayarlarını en iyi duruma getirme. Ne zaman memnun, Özet sekmesini ve Elde plakaüzerinde tıklatın.
7. görüntü analizi
- İstenen özel modülü seçin.
Not: Beyin tümörü slaytları otomatik bir segment göstermek için Çoklu dalga boyu hücre puanlama modülü yazarlar açmadı. - Tüm sitelerde analizler. Analiz parametrelerini birçok slaytlar için aynıysa analiz Sonrası edinme sekmesinin altındaki Plaka satın alma yapısı kutusunda dahil edilebilir.
- Çözümleme işlemi bittiğinde, kötü görüntü kalitesi sonuçları önyargı değil herhangi bir yer hariç. Bu analizin amacı olduğu microglia ve tümör parankimi makrofajlar ölçmek için faiz tümör örnek kenarları içinde bölgeyi seçin. Ayrıca, odak dışında ve/veya doku kıvrımlar veya kabarcıklar ve gözyaşları doku içeren siteleri hariç. Bir gösteri için Temsilcisi sonuçlarıgörürsünüz. Alternatif olarak, her site bağlı olarak hangi sitelerin çoğu dışlanacak lazer yansıması bir eşik olarak genliği için oluşturulan lazer odak puanı kullanın (eşik özelleştirilebilir ve çekim hızı gibi parametreleri bağlıdır ve kullandığı ortam türü).
Not: Yüksek büyütme görüntüleri özellikle büyük kan damarları ve nekroz, alanları gibi yapıların gerekirse dışarıda bırakın olanak sağlar. Sadece bu da hiperhücre gibi ilgi alanları dahil etmek mümkündür. Bu şekilde, özgüllük ve analizleri doğruluğunu artırılabilir.
Representative Results
Belgili tanımlık imge-ebilmek var olmak görüş içinde belgili tanımlık WHCAS bilgisayar yazılımı. Şekil 8 faiz tanımlanmış bölge içerisindeki tüm sitelerin yüksek büyütme küçük gösterir. (Örnekler şekil 8 ve 9 şekil, düşük ve yüksek büyütmede sırasıyla gösterilir) çözümlemesinde dışlanması gereken olanları belirlemek için her siteye gözden geçirin. Örneğin, Site 149 (Þekil 9A) odak dışında Site 219 kabarcıklar (şekil 9B) vardır, ve Site 54 kat (şekil 9C) içerir ve çıkarılmalıdır. 10-%15 yansıma tüm sitelerin dışlamak için normaldir. Sağlanan örnekte %15,3 sitelerin bırakıldı (25/300 vardı kabarcıkları, 17/300 odak dışında 3/300 katlanmış ve 1/300 kenarında). Şekil 10A (karşılık gelen düşük büyütme küçük resmini şekil 8' de gösterilen) analiz için seçilmiş temsili bir görüntüdür. Burada, karşılık gelen bindirmeleri çoklu dalga boyu hücre puanlama modülü tarafından oluşturulan Site 59, yazarların özelliklerine göre özelleştirilmiş üzerinde gerçekleştirilen otomatik bölümleme sonuçlarını göstermek (çekirdeklerin en küçük genişlik 2.5 µm, en fazla genişlik = 7,5 µm, = ve yerel arka plan yukarıda yoğunluğu = 35 graylevels; CD11b-pozitif hücrelerinin en küçük Genişlik 4 µm, en fazla genişlik = = 18 alan lekeli µm, en az 15 µm2ve yerel arka plan yukarıda yoğunluğu = 310 graylevels; = ve CD45 pozitif hücrelerinin en küçük Genişlik 4 µm, en fazla genişlik = = 18 alan lekeli µm, en az 15 µm2ve yerel arka plan yukarıda yoğunluğu = 50 graylevels =). Segmentasyon, nicel veri oran her işaretçisi için olumlu boyama hücre takip (6.2 %5.1 ± ve 3.8 ± %2.1 CD11b+ ve CD45+ hücreleri, sırasıyla), her iki işaretleyiciyi (3,5 ± %2.1 CD11b+CD45+ hücreleri), hiçbir işaretleri (86,6 ± %9.0 CD11b-CD45- hücreleri; Şekil 10B), alan lekeli anlama (40.0 ± 9.2 µm ve 36.7 ± 7,6 µm CD11b,+ ve CD45+ hücreleri, sırasıyla; Şekil 10C) ve demek floresan yoğunluğu (408.9 ± 40.3 göreli Floresans birimleri ve 373.9 ± 38,1 göreli Floresans adet CD11b+ ve CD45+ hücreleri, sırasıyla; Şekil 10D.) elde edilebilir.
Şekil 1: Slayt edinme düşük büyütmede için ayarlar. A. bu görüntü plaka ayarlarını görüntüler. B. burada, plaka alt ayarları görüntülenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: ayarları slayt satın alma yüksek büyütmede. Bu rakam uygun dergi seçimi görüntüler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: nasıl slaytları slayt adaptörü kullanarak yüklemek için gösteri. A. slayt coverslip aşağı slayt bağdaştırıcısı çentik tarafında etiketle yerleştirilir. B. slayt bağdaştırıcı widefield yüksek-içerik analizi sisteme yüklenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Önizleme slayt ayarlar. A. bu rakam satın alma parametrelerini görüntüler. B. burada, Hoescht/DAPI dalga boyu ayarlarına ilişkin değerleri görüntülenir. C. bu resimde günlük ayarlarını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: bir slayt bölgesi çizim. A. dikdörtgen aracı (diğer çizim araçları kullanılamaz) önizleme tarama alanını seçin ve DAPI Ultrasonda bölgeleri ilgi oluşturmak için kullanılır. B. deniz mavisi anahat bu şekilde nasıl slayt (etiket dahil olmak üzere) tüm alanı seçilmelidir gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: Önizleme taraması ilgi bölgeleri oluşturma. Önizleme veya DAPI inceden inceye gözden geçirmek tüm slayt alanını temsil eder. Bu örnekte, üç seri beyin doku bölümleri (katı beyaz dikdörtgen anahatlar) vardır. Bu bölümler yukarıdaki alana slaytta yer alan dairesel etiketleri temsil eder. Farklı bölüm düzenlemeler faiz bölgelerinde sonraki seçim sınırı. İlgi bu belirli örnekte bölge bir kesik çizgili beyaz dikdörtgen anahat ile gösterilir. Scalebar = 1 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: yüksek büyütme için temel windows Image acquisition. A. Alım sitesi Kur pencere kaç sütunları ve satırları ilgi region(s) içinde olduğunu gösterecektir. B. sütunları doğru sayıda sağlamak ve şekil 7A içinde belirtilen satır plaka satın alma Kur kutusuna girilir ve siteleri döşenir. C. boş olsa bile WellPositions pencere resim alma süresince açık tutmak gereklidir. D. faiz bölgelerinde uygun sayıda vurgulanmış olmalıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: temsili resim bölgenin ilgi. Her site bölgesi faiz bileşik bir küçük resmi görüntülenir. (Kırmızı kutuları ile işaretlenmiş) dışlanmıştır temsilcisi siteleri ve (yeşil bir kutu ile işaretlenmiş) dahil bir siteye örnek daha yüksek büyütme oranında gösterilir. Bu analiz için yeterli kalitede olduğundan emin olmak için her siteye incelemek için tavsiye edilir. Scalebar = 1 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 9: örnekleri analiz dışlanması gereken sitelerin. A. insan beyin tümörü bölümleri CD11b (yeşil) ve CD45 (kırmızı), microglia ve makrofajlar işaretleri lekeli. Bu görüntü odak dışında ve analizinden hariç. B. baloncuklar son tahlilde hariç bu resim mevcut. C. Bu site analiz kat doku nedeniyle bırakıldı. Ölçek çubukları 20 µm. çoğu Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 10: temsilcisi görüntüler ve analiz. A. her görüntü bindirmeleri otomatik bölümleme sonuçlarını temsil eden yanında görüntülenir. Yerleşimi, çekirdek beyaz görüntülenir ve olumlu lekeli hücreleri yeşil CD11b ve kırmızı için CD45 için gösterilir. Yetersiz kalite siteleri analiz hariç ve tüm kalan siteleri, Bsonuçları birleştirerek sonra. hücre her işaretçisi için olumlu lekeli ve işbirliği her iki işaretler için Cetiketli her sitede toplam sayısı ortalama oranlarda. ortalama alan ve Dlekeli. ortalama hücre yoğunluğu grafiksel olarak temsil. RFU = göreli Floresans birimleri. Verileri ortalama ± standart sapma ifade edilir. Ölçek çubukları 20 µm. çoğu Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Biyolojik bilim araştırma etkinliğini engelleyen ortak bir sorun hala fluorescently etiketli dokuların tarafsız, doğru ve kesin miktar ve kendi yapıları içinde için protokoller gelişmedir. Önemli miktarda zaman ve çaba bir kez onlar görüntüsü doku slaytlar analiz etmek için yollar bulmak doğru yönlendirilir. Birçok mevcut yöntemleri algoritmaları kullanıcıların programları12,13,14içinde yeniden oluşturmak sağlar. Bu yöntemler kabul edilebilir, ama kolayca ve hızlı bir şekilde bir bütünsel resim alma ve Çözümleme Protokolü kullanıcı erişimi bir WHCAS varsa kurmak kullanıcı sağlar bu raporu önem taşıyor. Örneğin, hücre tiplerinin ayırt etmek ve birden fazla yapıları ve süreçleri, hücre döngüsü analizi ve nükleer translocation, ölçmek deneyleri zaten ilişkili yazılım mevcuttur.
Kurulum birkaç kritik adımları içerir. İlk olarak, bir tabak sanki gibi slaydın kayma parametreleri tanımlanır. İkinci olarak, bir düşük büyütme genel bakış tarama faiz bölgelerinde yüksek büyütme görüntüleme için seçileceği oluşturulur. Son olarak, doğruluk ve sonraki analizlerin duyarlığını etkileyen siteler hariç tutulur. Bu tekniğin büyük sınırlama onun uygulanabilirliği kullanıcının erişim için bir WHCAS sahip olup olmadığını bağlıdır. Ancak, yüksek-içeriği analiz sistemleri için artan ihtiyaç ile birçok kurum bunlar rekabet15kalmak için onların araştırmacılar için sağlıyor. Doku bölümler aynı kalınlığı varken sorun giderme en çok gereklidir. Birden çok bölge ilgi seçtiyseniz, süre diğer-ecek değil bazı odak olacaktır. İdeal olarak, kesit sırasında kullanıcı homojen örnekleri oluşturmak için dikkat çekmek. Ancak, örnekleri tutarsız varsa, odak için kullanılan nükleer leke dalga boyu (veya kullanıcının en parlak fluorophore) odaklı ayarlamalara gidilmesi her odak bölge ilgi ve görüş her alan için bile. Diğer dalga boylarında sadece nükleer leke dalga boyu mahsup edilir gibi sadece bu dalga boyu uygulayabilecek ihtiyacı var.
Bu raporda, biz ayrıntılı nasıl tarama ve bir WHCAS ve ilişkili yazılım kullanarak slaytları analiz için. Çoklu dalga boyu hücre puanlama modülü fluorescently etiketi olan herhangi bir nükleer veya sitoplazmik işaretleri otomatik olarak saymak kullanıcı sağlar. Odak ayarlarını yaparak ve genişlik ve yansıma doku modülü özelleştirmek için alanı gibi hücresel özelliklerini tanımlayan sonra daha fazla kullanıcının araya girmesi görüntülü slayt ve nicel veri elde etmek için gerek yoktur. Bir anda en çok üç slayt yansıması ve ilgi birden fazla bölgesini tanımlanabilir. Slaytlar analiz etmek gerekir WHCAS kullanıcılar özelleştirilebilir, çok amaçlı, yararlanmak bu protokolü sağlar küçük hiçbir optimizasyonu gerektirir ve histolojik dokusu analizini içeren herhangi bir projelerde gelecekte uygulanacak iş akışları otomatik.
Disclosures
Yazarlar bu el yazması bulunmaksýzýn hiçbir mali çıkarları var ve ifşa etmek başka bir şey yok.
Acknowledgments
Bu proje bir hibe Kanada Sağlık Araştırma enstitüleri ve Alberta yeniliklerin - sağlık çözümleri/Alberta kanser Vakfı tarafından finanse edildi. Yazarlar rejenerasyon birim Nörobiyoloji çekirdek tesiste Vakfı bunun üzerine WHCAS tarama slaytta mümkün yapıldı ve ürünlerin yaratıcısı binada Paula Gedraitis çalışmalarını kendi ekipman kullanımı için kabul etmek istiyorum Bu makalede, moleküler aygıt belirtilen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageXpress MicroXLS | Molecular Devices | NA | Apparatus for image acquisition |
| MetaXpress 5.1 | Molecular Devices | NA | Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system). |
| Slide adapter | Molecular Devices | NA | Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL |
| Slide_Region_Acquisition_revA.jzp | Molecular Devices | NA | The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative |
| Slide_Region_Acquisition _Setup.JNL |
Molecular Devices | NA | Select this journal in Step 6.6. |
References
- Hua, Y., Shun, T. Y., Strock, C. J., Johnston, P. A. High-content positional biosensor screening assay for compounds to prevent or disrupt androgen receptor and transcriptional intermediary factor 2 protein-protein interactions. Assay and Drug Development Technologies. 12 (7), 395-418 (2014).
- Rishal, I., et al. WIS-NeuroMath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes. Developmental Neurobiology. 73 (3), 247-256 (2013).
- Kanungo, J., Lantz, S., Paule, M. G. In vivo imaging and quantitative analysis of changes in axon length using transgenic zebrafish embryos. Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 618-623 (2011).
- Schurmann, C., et al. Analyzing illumina gene expression microarray data from different tissues: methodological aspects of data analysis in the MetaXpress Consortium. PLoS ONE. 7 (12), e50938 (2012).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. Journal of Visualized Experiments. (40), e1900 (2010).
- Bravo-San Pedro, J. M., et al. High-throughput quantification of GFP-LC3+ dots by automated fluorescence microscopy. Methods in Enzymology. , 71-86 (2017).
- Gedraitis, P. Slide Region Acquisition Journal Suite. , Available from: http://metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide (2013).
- Varga, V. S., et al. Automated multichannel fluorescent whole slide imaging and its application for cytometry. Cytometry Part A. 75 (12), 1020-1030 (2009).
- Narayan, P. J., et al. Assessing fibrinogen extravasation into Alzheimer's disease brain using high-content screening of brain tissue microarrays. Journal of Neuroscience Methods. 247, 41-49 (2015).
- Du, Y., Budman, H. M., Duever, T. A. Segmentation and quantitative analysis of apoptosis of Chinese hamster ovary cells from fluorescence microscopy images. Microscopy and Microanalysis. 23 (3), 569-583 (2017).
- Mueller, J. L., et al. Quantitative segmentation of fluorescence microscopy images of heterogeneous tissue: application to the detection of residual disease in tumor margins. PLoS One. 8 (6), e66198 (2013).
- Donnelly, D. J., Gensel, J. C., Ankeny, D. P., van Rooijen, N., Popovich, P. G. An efficient and reproducible method for quantifying macrophages in different experimental models of central nervous system pathology. Journal of Neuroscience Methods. 181 (1), 36-44 (2009).
- Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PLoS One. 7 (2), e31814 (2012).
- Fish, K. N., Sweet, R. A., Deo, A. J., Lewis, D. A. An automated segmentation methodology for quantifying immunoreactive puncta number and fluorescence intensity in tissue sections. Brain Research. 1240, 62-72 (2008).
- Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (9), 870-876 (2009).
