Summary
腫瘍細胞の同所性頭蓋内注入は、脳腫瘍生物学、進行、進化、および治療反応を研究するがん研究に使用されています。リアルタイム生体イメージングと定量腫瘍の臨床神経膠芽腫モデルで質量を提供する蛍光分子腫瘍異種移植片のトモグラフィーをご紹介します。
Abstract
腫瘍はがん細胞の腫瘍を形成できる質量。細胞の発癌性の決定に広く使用されているアプローチは、がん細胞を免疫不全マウスに皮下注射して後表示されるなり、触知腫瘤の測定です。癌細胞の同所性同種注射は最もよく研究されている腫瘍の起源のティッシュのような微小環境に異種移植の導入を目指してください。脳癌研究では、脳のユニークな微小環境で腫瘍の形成および分析を許可する癌細胞の頭蓋内注入が必要です。頭蓋内の異種移植片の生体内イメージングはしみ込んでがんマウスの腫瘍を瞬時に監視します。ここで脳腫瘍異種移植片の蛍光分子トモグラフィー (FMT) の使用を報告します。がん細胞はまず赤外線蛍光タンパク質近く増殖型、免疫不全のマウスの脳に注入し。動物は時間の長時間にわたる腫瘤について定量的な情報を取得するスキャンします。費用対効果、再現性、および信頼性の高い各マウス内腫瘍負担定量化を可能セルがあらかじめラベルします。画像処理基板を注入する必要性を排除し、したがって、動物のストレスを軽減しました。このアプローチの限界は非常に小さい固まり; が検出できないことによって表されるただし、他の技術より大きい固まりのためのより良い解像度があります。薬物治療の有効性または神経膠腫細胞と患者由来サンプルの遺伝的変化の評価に適用できます。
Introduction
がんは、先進国の人間の病気関係した死の主要な原因のひとつです。新しい治療法は、非常に高い死者、早急に必要。膠 (GBM) は、脳腫瘍、脳腫瘍、間質、および免疫細胞の異種個体集団から成る非常に致死的なタイプです。米国の中央脳腫瘍レジストリによると悪性と非悪性脳腫瘍の発生率は 10万人あたり約 22 例です。約 11,000 の新しいケースは、2017年1米国で診断されると予想されます。
前臨床試験は、薬物、プロシージャ、または人間でテスト前に効果を発揮する治療法の可能性を調査します。前臨床試験において最も早い所ステップの 1 つはひと異種移植モデルとして定義されている、ホストの有機体の移植癌細胞を用いた薬物治療の分子標的を見つけることです。頭蓋内脳腫瘍 xenograft モデル患者由来の異種移植片 (PDXs) を使用して、このコンテキスト内で脳腫瘍生物学、進行、進化、および治療反応の研究し、バイオ マーカーの開発、最近では薬物に広く使用されています。スクリーニング、およびパーソナライズされた医学2,3,4。
最も手頃な価格で非侵襲的体内イメージング手法頭蓋内の異種移植片を監視するための 1 つは生物発光イメージング (結合)5,6,7,8です。ただし、いくつかのバリの制限、基板管理、可用性、酵素安定性と光焼入れおよび集録9イメージング中に散乱します。ここでは、イメージング法の臨床神経膠芽腫モデルを監視する別の方法として赤外線 FMT を報告します。(今後 FP720 と呼ぶ) 近赤外蛍光タンパク質 iRFP72010,11を表現するこの方法、信号集録と頭蓋内注入 PDXs の定量化、または turboFP635 (今後は FP635 と呼ぶ)FMT のイメージング システムで実行されます。FMT の技術を使用して、同所性同種腫瘍ができる生体内での前に、中に、または治療後で監視臨床観測のための非侵襲的、基板無料かつ定量的に。
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Protocol
実験動物や感染性病原体、癌細胞のヘッジホッグ レンチなどの使用制度バイオ セーフティ委員会、制度上のアニマル ・ ケアのプログラムによって事前の承認が必要です。カリフォルニア大学サンディエゴ校 (UCSD) の動物のケアのガイドラインをこのプロトコルに従います。
1. FP635 や FP720 構築と神経膠芽腫細胞の分類
- 生産し、Tiscorniaらによって記述されたプロトコルに従ってレンチ ウイルスを浄化12
- DMEM プラス 10% 牛胎児血清 (FBS) 15 cm 皿; 悪性グリオーマ細胞株から文化約 2.0 × 106セルDMEM に文化 2.0 × 106ひと膠芽腫患者由来 (PDX GBM) 球または/B27 F12 1:1 媒体がひと遺伝子組換え上皮成長因子 (EGF; 20 ng/mL) と FGF のプラス補足 (10 ng/mL) T75 フラスコ。
- 37 ° C、5% CO2、および相対湿度 100% のすべてのセルを維持します。
- 細胞を分離します。
- 神経膠腫細胞のため: プレートから上澄みを除去し、神経膠腫細胞をトリプシン 1 X の 3-5 mL を追加します。
- GBM の球: 15 mL チューブに細胞をピペットで細胞を収集します。
- 5 分間室温で卓上遠心分離機を使用して 200 x g で糸球体基底膜球スピンダウンします。
- 上澄みを除去し、細胞剥離液の 3-5 mL を追加します。
- 10-15 分の 37 ° C ですべてのセルを孵化させなさい。
- 慎重を上下に数回ピペッティングにより細胞を分離 (球および神経膠腫細胞が完了していることを確認解離) とスピン ・ ダウン 5 分 200 x g で。
- 上澄みを除去し、上下に数回ピペッティングで 5 mL の培地で細胞を再懸濁します。、トリパン ブルー色素排除によって細胞の生存率を決定します。
- 板 1.0 x 106 10 cm 皿に標的細胞のピペッティングによる媒体の 5 ml。
- レンチ ウイルス感染 (MOI) 5 Tiscorniaらによって、前述の多様性で蛍光蛋白質を表現するとセルを変換します。12 37 ° c. で孵化させなさいと
- 24 h 後導入された細胞からメディアを取り出して、新鮮な培地 5 mL を追加し、37 ° C でさらに 48 時間インキュベート
- 1.4-1.6 の手順に記載されている培養細胞に感染細胞を切り離します。スピン ・ ダウン 5 分 200 x g でセルと並べ替えのソリューションの 500 μ L で再懸濁します (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1 %fbs)。
- FACS チューブに細胞懸濁液をピペットします。共同 1 μ L/ml の 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 塩酸死んだ細胞を除外する細胞を染色します。流れの cytometer ゲートを設定するために必要なネガティブ コントロール (非導入細胞と非導入細胞 DAPI 染色/)。
- Basu et al.による記述で並べ替えのソリューション、蛍光/正負 DAPI セルに並べ替える13、15 mL の円錐管に並べ替えられた細胞を収集。
- 5 分間 200 x g で並べ替えられた細胞をスピン、上澄みを除去し、培養液 5 mL で再懸濁します。ピペッティングで 10 cm 皿に並べ替えられた細胞を播きます。37 ° C 少なくとも 48-72 時間インキュベートします。
- セルを解離によって並べ替えセルを展開手順 1.4-1.6 と生体内で実験のため複数の料理にメッキします。
注: 細胞選別調製および精製の詳細についてを参照してください Basu et al.13
2. 頭蓋内注入 iRFP タグ膠芽腫細胞免疫不全マウス
メモ: 手術を開始する前に、手術室とツールがプロシージャのためにきれいであることを確認してください。4-5 週齢と頭蓋内注射用 17-19 g の間免疫不全無胸腺裸 (Foxn1nu) ・ オスかメスのマウスを使用します。到着後、手術前に、少なくとも 3 日間動物を収納する必要があります。
- セル準備
- 収穫し単一細胞懸濁液 (手順 1.4 1.6) に蛍光陽性神経膠腫細胞を分離し、2-5 μ L の PBS 動物ごとの注入量で 0.5 または 1.0 x 10 の6細胞を再懸濁します。氷の上を 1.5 mL 遠心チューブに細胞懸濁液をピペットします。
- 麻酔の準備と管理
- ケタミン (100 mg/kg) とマウスの体重の 20 グラムあたりキシラジン (10 mg/kg) を含む食塩液 200 μ L を準備します。動物の重量を量るし、麻酔の適切な投与量を計算します。
- 麻酔の腹腔内注射を提供し、脱水症状を防ぐために目に眼軟膏を適用します。この手順の詳細については、キャスリーンのらを参照してください。14位 37 ° C で予め温めておいた水熱パッドの動物
- 動物が 5-10 分以内に通常麻酔下つま先ピンチ応答 (ペダル反射) を監視することによってことを確認します。
- 頭蓋内注入
- 5 μ L をロード ハミルトン注射器 (針鈍チップ) 細胞懸濁液とプローブ ホルダーにマウント。
- 小さな動物の定位脳手術フレーム内にマウスを置くし、耳バーとパルミチン酸セチルらによって記述されている詳細を以下切歯アダプターを使用して頭を修正15
- 70% エタノール、betadine ソリューションで頭を駆除します。完了を確認、手術部位は滅菌します。小さなメスを用いて中央切開を行い、皮膚や結合組織を分離します。
- ハミルトン シリンジをマニピュレーターを使用して前のポイントに配置します。
- 前の点からプローブ ホルダー 1.0 mm 前後と 2.0 mm 外側を移動します。この位置を鉛筆でマークします。
- この場所で慎重に穴を作る頭蓋骨のマイクロモータの手持ち型のドリルで血管が見えるようになるまで、下方のわずかな圧力を適用することによって。くも膜膜と脳実質を中断しません。
- バリの穴に針を導入し、3.0 mm 軟膜の表面下を進めます。
- (2-5 μ l) と電動固定装置用インジェクターを使用してインジェクションの流量 (1 μ L/分) を設定または手動で注入を行います。
- 注入後に、1.0 mm 1 分毎に昇順で徐々 に針を除去し、70% エタノールを注射部位をきれい。
- すぐ皮膚創傷外科ステープルまたは縫合 (ステッチとも呼ばれます) することによって、キャスリーンのらを参照してください。詳細については、 14 。
- 動物の回復
- 動物を水熱パッド (37 ° C) に転送し、完全復旧まで体温、呼吸数、心拍数を監視します。標準プロトコルごとの鎮痛を管理します。
注: 定位の手順の詳細については、外科および座標を参照してくださいその他レポート5,14,15。
- 動物を水熱パッド (37 ° C) に転送し、完全復旧まで体温、呼吸数、心拍数を監視します。標準プロトコルごとの鎮痛を管理します。
3. FMT イメージング
注: 実験の目的によると、iRFP タグ膠芽腫細胞がすることができます監視体内の前に、中、または治療後。目的をイメージング、イソフルラン誘導室を用いた動物の麻酔、スキャンと FMT イメージャのドッキング ステーションのイメージの中にイメージングのカセットで維持します。
- ケージとイソフルラン誘導室の場所から動物を削除します。商工会議所を閉じ、酸素の流れと 3-5% に気化器をオンにします。
- 動物の監視完全に麻酔がかかるまで通常 1-2 分無意識内で動物がない外部刺激に応答します。
- 商工会議所から麻酔下の動物を取り出し、下向き動物を配置することによって続いてヘッド アダプターを最初に配置することによって画像のカセットに動物を入れてください。頭がカセットの中心にあることを確認します。
- カセットのトップ プレート上に配置、17 mm までの調整ノブを締めます。
- 一度はセキュリティで保護された動物は、イメージングのカセット、カセットをイソフルラン麻酔動物を保つためにポンプでくまれるところ FMT イメージャの内部のドッキング ステーションに挿入すると、画像に進みます。
- イメージャーとアナライザーのソフトウェアを実行するには、ソフトウェアのアイコンをダブルクリックします。
- 「実験タブ」ウィンドウで「データベース」、「研究グループ」を選択します。
- 「スキャン」タブ「ウィンドウに移動し、「テーマの選択」をクリックして、イメージ選択します。また、「レーザー チャンネル」パネルでレーザー チャネルをを選択します。FP635 ラベル セルの"レーザー チャネル 635 nm"を選択し、FP720 ラベル セル「チャネルは 680 nm レーザー」を選択します。
- 「スキャン タブ」ウィンドウの「キャプチャ」オプションをクリックして、イメージを取得します。次に、クリックして通常 20-25 同側のソース内のソース場所の決定数をキャプチャしたイメージのスキャン フィールドをドラッグ スキャン フィールドを調整します。
- 「復興キューに追加」オプション オンに、「スキャン タブ」ウィンドウで"スキャン"をヒット。
- スキャンが完了するまで待ってから、ドッキング ステーションからイメージングのカセットを取り外します。
- カセットの上部プレートを取り外し、ケージに動物の背中を置きます。
- 動物の残りの部分について、手順 3.1 3.12。
4. 画像解析
- 撮像素子とアナライザーのソフトウェアから「解析タブ」ウィンドウを選択します。
- データセットと「分析タブ」ウィンドウの「データセットの選択」パネルに「+」ボタンをクリックすると、分析する対象を読み込みます。
- 「解析タブ」ウィンドウでイメージがロードされると、"分析タブ"ウィンドウの左上隅にある楕円形アイコンを選択して利益 (率 ROI) 分析の領域を実行します。
- 「統計データ」パネルで"分析タブ"ウィンドウの「しきい値」列を右クリックしてゼロしきい値を調整。
- 「統計データ」パネルの合計値は、マウス脳に注入蛍光タグ膠芽腫細胞から信号を表します。
- 動物の残りの部分について 4.2 4.4 の手順を繰り返します。ロードまたはクリックして新しい件名を削除する、「+」または「−」ボタン、「分析タブ」ウィンドウの「データセットの選択」パネルで、それぞれ。
メモ: FMT イメージングとソフトウェアの操作の詳細については、参照してください20 。
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Representative Results
神経膠芽腫細胞の U87EGFRvIII (U87 細胞発現 EGF 受容体変形 III) ステップ 1.2 によると培養しました。レンチ ウイルスは制作され、1.1 のステップによると精製します。ウイルス濃度は p24 によって決定された elisa 法。セルが 1.8 のステップに従って赤外線蛍光タンパク質を運ぶレンチ ウイルスで導入しました。FP72010,11をエンコーディング プラスミドが博士 v.v. Verkhusha によって提供された親切と FP635 ベクトルは商業ベンダーから購入。標的細胞は、FACS のトップの 10% 最も蛍光細胞集団 (図 1 a) を豊かにするソートを考えられました。蛍光信号を増やしている蛍光断層撮影システムの感度を向上させます。同所性同種移植前に細胞を蛍光標識の信号の強度を検証するため、FMT イメージャの幻のカセットを使用しました。具体的には、U87EGFRvIII TurboFP635 と U87EGFRvIII iRFP720 セル、トリプシンと 1 × 105, 1 x 106、解離と 1 x 10 の7セルはそれぞれの氷冷 PBS 100 μ L で再停止されるられ、分析されました。FMT イメージャは、4 チャンネルの検出: 635 nm、680 nm、750 nm と 780 nm。遠赤外線チャンネル 750 nm と 780 nm は近赤外蛍光タンパク質を使用 (データは示されていない) からこのような波長で放出がないためこの分析に適しておりません。したがって、我々 は 635 で発光信号を分析 nm および 680 nm。図 1で報告は、蛍光信号両方の FP635 のイメージと強度の定量化 (図 1 b, C) と FP720 (図 1E)、細胞数が増加するとそれに比例して増加します。FP635 の排出量が表示される注記のうち、635 nm チャネルではなく、680 nm チャンネル。FP720 の排出量が表示される一方、635 nm チャネルではなく 680 nm チャンネルで。これは、これら候補者蛍光タンパク質研究セルの 2 つの人口が分類することができるし、同時に 2 つの赤外線蛍光ラベルの近くを使用して監視に適した。
U87EGFRvIII 細胞赤外蛍光タンパク質近く付いた同所性同種注入と体内の腫瘍成長監視のために使用された、に従って手順 2.1 2.4。種類の異なるがん細胞の腫瘍の成長の違いを除外するのには、同じセル行、すなわちU87EGFRvIII、異なる蛍光タグでラベルを使いました。マウスは、U87EGFRvIII TurboFP635 セル、U87EGFRvIII iRFP720 セル、または 2 つのセルラインの等しい組み合わせ (1:1) を注入しました。PBS の 5 μ L のボリュームで 5 x 10 の5セルの合計は 4-5 週間に頭蓋内定位システムとハミルトンの注射器、次手順 2.3 2.4 を使用して古い免疫不全無胸腺ヌードマウスを注入しました。麻酔は、ケタミン ・ キシラジンの腹腔内注入によって達成されました。動物は、水熱パッドを使用してインジェクションの中で保温され、苦痛の兆候をチェックします。腫瘍生着と成長し、FMT イメージング システムによって監視されました。スキャン セッション中にマウスでは 3% イソフルラン室 (ステップ 3.1 3.12) を用いた麻酔が一時的に。マウス、イメージングのカセットに配置されカメラをスキャン レーザー内部をイメージします。それぞれのマウスは、635 を使用してスキャンされた nm および 680 nm チャンネル。時間をかけて記録された信号の定量化とマウスが機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) のガイドラインによると神経学的症状の発症で安楽死されました。U87EGFRvIII TurboFP635 発光信号 635 nm チャンネルで明らかにされた図 2Aに示されるように、最小限のバック グラウンド信号は 680 nm チャンネル (図 2 b, C) に記録されました。一方、635 nm チャンネル (図 2 D-F) で少し背景を示す 680 nm チャンネルで出力 U87EGFRvIII iRFP720 細胞。最後に、U87EGFRvIII TurboFP635 細胞と U87EGFRvIII iRFP720 の 1:1 の混合投与マウスは実験 (図 2-私) の期間の両方のチャネルに増加する信号を示した。これらのデータを示す癌細胞の人口のデュアル生体内イメージング用赤外線蛍光蛋白質を利用することが可能です。データも異なる蛍光タンパク質のシグナルの放出での異なる強度をあることを示します。ここでは、FP720 信号強度は FP635、非侵襲的モニタリング設定でがん細胞のより小さい人口を検出感度の向上とよりも優れていた。
前臨床モデルの癌関連遺伝子のサイレンシングの効果は、このプロトコルの研究も可能です。この目標に向けて、GBM 球 (GSC23 および GSC11) 培養 (ステップ 1.2)、FP720-レンチ ウイルス (ステップ 1.8) で導入しました。FP720 を発現する細胞は、FACS 1.11 1.13 の手順で前述のように並べ替えをだった。FP720 標識細胞はレンチ ウイルス エンコーディング shRNA DAXX (shDaxx、) や慣性モーメント 516shRNA コントロール (shLuc) をターゲットと共同導入された.細胞培養 5 日間、単一細胞懸濁液に解離し、1 x 10 の6セルが頭蓋内注射 3 μ L の PBS で再停止されます。逆のトランスクリプションの量的なポリメラーゼ連鎖反応 (RT qPCR) GSC23 でターゲット DAXX shRNA の有効性が確認された (図 3 a) と GSC11 (図 3)。GBM iRFP720/shRNA 細胞は免疫不全マウスにおける線条体に 2.3 2.4 の手順に従って改良注入しました。神経学的徴候の認められた動物と、異種移植片の相対的な蛍光信号は 3.1 4.6 の手順に従って定量化解析ソフトウェアを用いた FMT イメージング システムによって分析されました。FMT の代表的な画像、マウス shDAXX/GBM - 球 shControl を注入した動物との比較にしみ込んで減少蛍光信号を示す (図 3 bと図 2 D) 確認両方の GBM 球モデルの私たち以前検索16 DAXX阻害が臨床神経膠芽腫モデルにおける腫瘍増殖を抑制します。
図 1: ファントム ・ FACS 解析用セルを使用して標準的な曲線です。(A) 代表的な FACS ヒストグラムの FP720- と FP635-U87EGFRvIII 発現細胞 (左し、右のパネルで、それぞれ)。神経膠腫細胞の赤外蛍光タンパク質をエンコードするレンチ ウイルスに感染していた、FASC 並べ替え FP720 または FP635 蛋白質の最高の表現を豊かにします。代表的な画像は、幻のカセットを使用して細胞懸濁液を U87EGFRvIII TurboFP635 (B) と U87EGFRvIII iRFP720 (D) の撮像素子とアナライザーのソフトウェアから取得されます。上部のパネルは、680 nm のチャネルで 635 nm チャンネルと下部パネルで信号を表します。セルの増加数は信号の可視化の増加に対応しました。U87EGFRvIII TurboFP635 (C) と U87EGFRvIII iRFP720 (E) の信号定量化細胞 635 nm および 680 nm チャンネル。相対的な蛍光ユニットは、カラー バーに表示されます。誤差範囲は、細胞懸濁液あたり 3 種類のスキャンから S.E.M. を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: U87EGFRvIII を用いた脳腫瘍異種移植モデル細胞でスキャンの異なるチャネル。635 の蛍光信号の代表的な画像 nm と頭蓋内 U87EGFRvIII turboFP635 (A)、U87EGFRvIII iRFP720 (D) U87EGFRvIII iRFP720 のミックス組み合わせ (1:1) と注入した動物から 680 nm チャンネル。U87EGFRvIII turboFP635 細胞 (G)。画像は、最初のスキャン後 5 日目に買収されました。(B, E, H)信号強度は 5 日間の期間にわたって各マウスの監視します。各マウスは、635 nm チャンネル (青い棒)、635 nm チャンネル (赤いバー) をスキャンしました。バーの明るい色のカラー スキャンと暗い影の 1 日目は 5 日目を表すを表す。(C F、私)(青) の 635 nm チャネルからの信号強度の直接比較を示す相対的な蛍光定量と 680 nm チャンネル (赤) マウスの全体のコホートで。相対的な蛍光ユニットは、カラー バーに表示されます。データは、3 の異なる動物から標準偏差と平均値を表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 臨床神経膠芽腫でのジーンサイレンシング モデル FMT を使用します。GSC23 の RT qPCR によるDAXXの遺伝子発現解析 (A) と GSC11 (C) 神経膠腫患者由来細胞で導入したターゲット DAXX (shDaxx) または shRNA レンチ ウイルス エンコード Shrna コントロール (shLuc) や FP720。がんの 680 nm チャンネルの蛍光信号の代表的なイメージにしみ込んで GSC23 iRFP720 (B) と GSC11 iRFP720 (D) 患者由来細胞を移植したマウス。強い蛍光シグナルは shRNA DAXX (shDaxx) (パネルの下部) で移植したマウスと比較して注入した shRNA コントロール (shLuc) (パネルの上部) 動物で認められたDAXX阻害が腫瘍を抑制することを示す蛍光分子法による臨床神経膠腫モデルの成長。相対的な蛍光ユニットは、カラー バーに表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
癌は癌研究で広く使用されているし、定評のイメージング技術の数が開発されている: バリ;磁気共鳴画像 (MRI);陽電子放射断層撮影 (PET) 計算された断層撮影 (CT);FMT。これらのアプローチの各客室には長所と短所が最終的に提供される情報の種類とお互いを補完します。最も一般的に使用される、生体内イメージング技術の 1 つはバリ5,6,7,8です。バリと FMT 両方細胞工学 (ルシフェラーゼ酵素または赤外線蛍光タンパク質) の遺伝子発現に影響を与えることができますが必要です。バリは小さな腫瘤のより敏感な体内では 10-12 分; ディストリビューションの最大に達する基板 (ルシフェリン) の腹腔内投与を必要があります。しかし、焼入れと買収、イメージング中に散乱光し、基板のクリアランスが頻繁に発生する9。FMT は、代わりに、動物に任意の追加基板の管理を必要としないし、その信号が安定しており、時間や酵素の安定性に依存しません。さらに、FMT、同じ実験条件で使用する場合に、再現性のある半定量的なデータがご利用いただけます。バリと FMT の両方空間解像度を提供していません。ただし、この問題 CT スキャン アドレスでこれらの方法を結合します。
CT スキャンは、その信号と交差動物の体、身体構造を特定するに理想的な光子の減衰を測定します。しかし、小さな頭蓋内腫瘍の検出を妨げる可能性、軟部組織コントラストはこのアプローチ17,18の制限です。CT の追加 1 つの欠点は、放射線や造影剤、ターゲット細胞の分子の変化を引き起こすことができますの使用です。CT スキャンはブドウ糖アナログ、フルオロデオキシグル コース18F-FDG; のような放射性標識トレーサーを使用するペットと併用できます。しかし、これは小動物のいくつかの生理学的プロセスを妨害することも。対照的に、FMT は腫瘍を測定する任意の挿入された基板を必要はありません質量とそれは腫瘍の代謝、炎症、血管新生、アポトーシスおよびバイオ マーカーの蛍光に分類された19を使用して他のマーカーを測定することが可能。
全体的にみて、最も便利で多機能な生体内イメージング手法の一つは MRI です。MRI のマイナーな制限は、低取得時間、ペットより低い感度いくつか楽器関連バリエーション18,20で見つけることが。
ここでは、前臨床神経膠芽腫モデルの代替法として FMT 方式を報告する.赤外蛍光タンパク質 (図 1 a-E) を用いて標的細胞の分類の事前と免疫不全動物におけるリーリンをスキャンは、蛍光断層イメージング システムで実現できます。我々 は臨床神経膠芽腫モデルの代替法として FMT メソッドを報告しました。この方法で基板無料かつ非侵襲的に画像を適用、低ストレス環境に動物を保持および深部組織定量化することができます (図 2 a-私図 3 a, B) を実行します。このプロトコルは脳腫瘍16、新しい治療上のターゲットを識別するために、新しい druggable 代謝分子22を調査する臨床神経膠腫モデル21、組合せ治療の効果を研究に適用できます。エピジェネティックな経路23、または新しい抗癌剤放射線治療 (未発表データ) との組み合わせで、他の臨床研究に適用されます。また提案するここで使用、デュアル生体内でイメージ投射アプローチとして FMT のとき 2 つ共存も違うが、腫瘍細胞集団は、分析します。
FMT いくつかの制限考慮する必要があります、自動蛍光信号と干渉することができますいくつかの臓器から生成されたなど。たとえば、マウスの脾と肝生成自動蛍光 680 nm チャネルではなく、635 で nm。したがって、これらの器官を含む FMT 関連実験プロシージャは FP635 のような他の赤外線蛍光蛋白質を使用して実行する必要があります。昔は裸foxn1-蛍光信号記録で干渉を避けるために裸のマウスの変異マウスのモデルを使用する必要がある場合は、動物の興味の領域を剃ることをお勧めします。さらに、このアプローチは、非常に小さな腫瘤の検出にも制限されます。腫瘍として信号対雑音比を向上させる私たちの経験では質量が大きく、マウスで任意の神経学的症状の発症前に、まだ。実際には、以前実験注入がん PDXs では、腫瘍の負担や薬の管理のための21のための苦痛の兆候もなくマウスで少なくとも 2 週間の薬の処方の時に腫瘍を検出することができました。最終的には、各細胞株と細胞数の積極性は各実験の長さを調べます。データは、信号 (図 1 b-E) とセルの個数と腫瘍量と信号 (図 2) の線形比例関係を表示します。しかし、異なる細胞株および赤外線タンパク質質量とセル数腫瘍の一般的な信号相関を適用できません。セルの行/赤外線蛍光タンパク質の組み合わせごとに信号は経験的に決定する必要があります。さらに、ファントム (図 1 b, D) を用いた細胞の解析から得られる信号に対応していない信号頭蓋内の異種移植片からマウスの頭蓋骨による信号の減衰が発生します。
閾値のイメージャーとアナライザーのソフトウェアを許可します。我々 はここで、しきい値を使用していない、真の信号の存在下で再構成を排除する傾向にあるバック グラウンド ノイズを与える注入セルなし動物をスキャンします。いくつかの要因は、異種の信号強度に影響を及ぼすし、考慮に保管する必要があります: 各赤外蛍光タンパク質が異なる発光スペクトルと強度、FP720 されて最も蛍光蛋白質の実験用10 の 1 つ ,11;各セルラインは豊富なけれども限られた、従って得られる最大蛍光に影響を及ぼすタンパク質の生産量のことができます。最後に、FMT イメージャ特定化合物の内部標準的なカーブでセットアップされている、したがって、どの化合物が最も近い発光スペクトルを考慮する重要です赤外蛍光タンパク質の細胞をラベルするために使用します。、忍、赤外線蛋白質8,9の過剰発現による潜在的な細胞毒性を決定することをお勧めします。さらに、我々 お勧めします少なくとも 8 実験グループごとのマウスのコホートを使用してデータおよびマウス、手術やがん細胞移植の可変性のための損失が発生します。それにもかかわらず、これは研究に統計的有意性を追加します。直列 1 日以上の動物のコホートをスキャンし、イメージングのカセット深さの変化から、同時に電波を分析するをお勧めしますまた、蛍光信号再構成が最終的な信号の定量化と干渉する可能性があります。この問題を解決するには、アナライザ ソフトウェアは、軽微な変更 (通常から高いと非常に高い)、レーザー強度で我々 の経験で最終的な結果が劇的に異なるではないが。費用対効果に関する最後の注意点は、ことができます、購入やメンテナンスのコストを負担する別の研究所の間でコア楽器として FMT イメージング システムを簡単に共有できることです。結論としては、FMT は、生体内で腫瘍の成長の実験と臨床評価は、簡単かつ信頼性の高い貴重なリソースです。
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Disclosures
著者は利益相反行為を宣言しません。
Acknowledgments
GBM PDX 神経幹細胞の博士フレデリック ・ ラング、MD アンダーソンがんセンターに感謝いたします。この作品は、敗戦 GBM 研究共同、腫瘍社会脳国家 (フランク フルナリ) R01 NS080939 (フランク フルナリ)、ジェームス s. マクドネル財団 (フランク フルナリ); の子会社によって支えられました。ホルヘ ・ ベニテスに支えられ賞アメリカの脳腫瘍連合 (ABTA) からは。シロ Zanca はアメリカ イタリア語がん財団特別研究員奨学金によって部分的に支えられました。フランク フルナリ癌研究所から給与とその他のサポートを受け取ります。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose | HyClone/GE | SH30022.1 | |
| DMEM/F12 1:1 | Gibco | 11320-082 | |
| FBS | HyClone/GE | SH30071.03 | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| Trypsin | HyClone/GE | SH30236.01 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| human recombinant EGF | Stemcell Technologies | 2633 | |
| human recombinant FGF | Stemcell Technologies | 2634 | |
| DPBS | Corning | 21-031-00 | |
| FACS tubes | Falcon | 352235 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Blasticidin | ThermoFisher Scientific | A1113903 | |
| p24 ELISA | Clontech | 632200 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Ketamine | Zoetis | NADA 043-403 | Controlled substance |
| Ointment | Dechron | NDC 17033-211-38 | |
| Absorbable suture | CpMedical | VQ392 | |
| 5 ul syringe | Hamilton | 26200-U | Catalog number as sold by Sigma-Aldrich |
| Cell Sorter | Sony | SH8007 | |
| Mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Motorized stereotaxic injector | Stoelting | 53311 | |
| Micromotor hand-held drill | Foredom | K1070 | |
| Mouse warming pad | Ken Scientific Corporation | TP-22G | |
| Fluorescence Tomography System | PerkinElmer | FMT 2500 XL | |
| TrueQuant Imaging Software | Perkin Elmer | 7005319 | |
| Ultra-centrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | 392049 | |
| Tissue Culture 100mm Dishes | Olympus Plastics | 25-202 | |
| Tissue Culture 150mm Dishes | Olympus Plastics | 25-203 | |
| Tissue Culture Flasks T75 | Corning | 430720U | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430290 | |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Centrifuge Avanti J-20 | Beckman Coulter | J320XP-IM-5 | |
| Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL | Beckman Coulter | 326819 | |
| Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 (Homozygous) | Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required. |
References
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