Summary
Orthotopic iniezione intracranico delle cellule del tumore è stato utilizzato nella ricerca sul cancro per studiare la biologia del tumore di cervello, la progressione, evoluzione e risposta terapeutica. Qui presentiamo la tomografia molecolare fluorescenza degli xenotrapianti del tumore, che fornisce in tempo reale videomicroscopia imaging e quantificazione di un tumore di massa in modelli preclinici di glioblastoma.
Abstract
Carcinogenicità è la capacità delle cellule tumorali di formare un tumore massa. Un approccio ampiamente utilizzato per determinare se le cellule sono cancerogene è iniettare per via sottocutanea topi immunodeficienti con le cellule tumorali e misurando la massa tumorale dopo diventa visibile e palpabile. Orthotopic iniezioni di cellule tumorali mirano a introdurre xenotrapianto nel microambiente che assomiglia maggiormente il tessuto di origine del tumore in fase di studio. Ricerca sul cancro cervello richiede intracranica iniezione delle cellule tumorali per consentire la formazione del tumore e l'analisi nel microambiente unico del cervello. L'imaging in vivo degli xenotrapianti intracranici controlla istantaneamente la massa di tumore dei topi orthotopically innestate. Qui segnaliamo l'uso di fluorescenza molecolare tomografia (FMT) di xenotrapianti del tumore di cervello. Le cellule tumorali sono in primo luogo trasdotte con vicino infrarosse proteine fluorescenti e poi iniettate nel cervello di topi immunocompromessi. Gli animali vengono poi analizzati per ottenere informazioni quantitative circa la massa di tumore per un periodo prolungato di tempo. Cellula pre-etichettatura consente la quantificazione costo effettiva, riproducibile e affidabile del carico del tumore all'interno di ogni mouse. Abbiamo eliminato la necessità di iniettare imaging substrati e riducendo lo stress sugli animali. Una limitazione di questo approccio è rappresentata dall'incapacità di rilevare le masse molto piccole; Tuttavia, esso ha una migliore risoluzione per più grandi masse rispetto ad altre tecniche. Può essere applicato per valutare l'efficacia di un trattamento farmacologico o alterazioni genetiche di linee cellulari di glioma e campioni paziente.
Introduction
Il cancro è una delle principali cause di decessi per malattia in esseri umani nel mondo industrializzato. Con un altissimo numero di morti, nuovi trattamenti sono urgentemente necessari. Multiforme di glioblastoma (GBM) è un tipo estremamente letale di cancro al cervello, composto da popolazioni eterogenee delle cellule stromal ed immuni del tumore, di cervello. Secondo la registrazione del tumore di cervello centrale degli Stati Uniti, l'incidenza dei tumori cerebrali primari maligne e benigne è circa 22 casi per 100.000. Circa 11.000 nuovi casi dovrebbero essere diagnosticati negli USA nel 20171.
Gli studi preclinici indagare la probabilità di una droga, procedura o trattamento per essere efficace prima della prova in esseri umani. Uno dei primi passi di laboratorio negli studi preclinici è identificazione di potenziali bersagli molecolari per il trattamento farmacologico tramite cellule tumorali impiantate in un organismo ospite, definito come modelli di xenotrapianto umano. In questo contesto, i modelli di xenotrapianto del tumore cerebrale intracranica utilizzando xenotrapianti paziente-derivati (PDXs) sono stati ampiamente usati per studiare la biologia del tumore di cervello, la progressione, evoluzione e risposta terapeutica e più recentemente per lo sviluppo di biomarcatori, droga screening e personalizzata medicina2,3,4.
Uno dei più accessibili e non invasiva in vivo imaging metodi per monitorare gli xenotrapianti intracranici è bioluminescenza imaging (BLI)5,6,7,8. Tuttavia, alcune limitazioni di BLI includono amministrazione di substrato e disponibilità, stabilità enzimatica e luce tempra e dispersione durante imaging acquisizione9. Qui segnaliamo l'infrarosso FMT in alternativa metodo per monitorare i modelli preclinici di glioblastoma di imaging. In questo metodo, l'acquisizione del segnale e la quantificazione di PDXs intracranially impiantati, che esprime una proteina fluorescente vicino infrarosso iRFP72010,11 (d'ora in poi definito come FP720) o turboFP635 (d'ora in poi definito come FP635), viene eseguita con un sistema di imaging di FMT. Utilizzando la tecnologia FMT, orthotopic i tumori possono essere monitorati in vivo prima, durante o dopo il trattamento, in modo non invasivo, privo di substrato e quantitativo per osservazioni precliniche.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
L'uso di animali di ricerca sperimentale e agenti infettivi, quali lentivirus trasduce le cellule tumorali, richiedono la previa approvazione dal programma istituzionale cura degli animali e dal Comitato istituzionale biosicurezza. Questo protocollo segue le indicazioni di cura degli animali dell'Università della California di San Diego (UCSD).
1. etichettatura delle cellule di Glioblastoma con FP635 o costrutto FP720
- Produrre e purificare lentivirus secondo il protocollo descritto da Tiscornia et al. 12
- Circa 2.0 x 106 cellule da una linea di cellule di glioma umano DMEM con 10% siero bovino fetale (FBS) in un piatto di 15 cm; o cultura 2.0 x 106 glioblastoma umano paziente-derivato (GBM-PDX) sfere con DMEM/F12 1:1 medium con B27 supplemento più umano ricombinante fattore di crescita epidermico (EGF; 20 ng/mL) e FGF (10 ng/mL) in un matraccio da T75.
- Mantenere tutte le celle a 37 ° C, 5% CO2e 100% di umidità relativa.
- Dissociare le cellule.
- Per le cellule di glioma: rimuovere il surnatante delle placche e l'aggiunta di 3-5 mL di tripsina 1 X per le cellule di glioma.
- Per il GBM sfere: raccogliere le cellule pipettando le cellule in una provetta da 15 mL.
- Rotazione verso il basso le sfere GBM a 200 x g per 5 min utilizzando una centrifuga da tavolo a temperatura ambiente.
- Rimuovere il supernatante e aggiungere 3-5 mL di soluzione di distacco delle cellule.
- Incubare tutte le celle a 37 ° C per 10-15 min.
- Attentamente dissociare le cellule pipettando su e giù per diverse volte (accertarsi che siano completate le cellule di glioma e sfere dissociato) e spin giù a 200 x g per 5 min.
- Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule con 5 mL di terreno pipettando su e giù più volte. Determinare l'attuabilità delle cellule dall'esclusione del blu di trypan.
- Piastra di 1.0 x 106 delle cellule bersaglio in un piatto di 10 cm con 5 mL di terreno di pipettaggio.
- Trasducono cellule con lentivirus che esprimono le proteine fluorescenti alle molteplicità di infezione (MOI) 5 come è descritto da Tiscornia et al. 12 e incubare a 37 ° C.
- Dopo 24 h, rimuovere il supporto dalle cellule trasdotte, aggiungere 5 mL di terreno nuovo e incubare per altre 48 ore a 37 ° C.
- Dissociare le cellule infette in sospensione unicellulare come descritto nei passaggi 1.4-1.6. Rotazione verso il basso le cellule a 200 x g per 5 min e risospendere in 500 µ l di soluzione di ordinamento (tampone fosfato salino (PBS) con 1% FBS).
- Dispensare la sospensione delle cellule in provetta di FACS. Co-macchia le celle con 1 µ l/mL di 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dicloridrato di escludere le cellule morte. Controlli negativi sono necessari per impostare le porte di cytometer di flusso (cellule non trasdotte e cellule non trasdotte / DAPI macchiato).
- Ordinare le cellule fluorescenti-positivo/DAPI-negativo in ordinamento soluzione, come descritto da Basu et al. 13e raccogliere le cellule ordinate in una provetta conica da 15 mL.
- Rotazione verso il basso le cellule ordinate a 200 x g per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere in 5 mL di terreno di coltura. Seme le cellule ordinate in un piatto di 10 cm di pipettaggio. Incubare a 37 ° C per almeno 48-72 h.
- Espandere le cellule ordinate dissociando le cellule come segue: 1.4-1.6 e placcatura in più piatti per gli esperimenti in vivo .
Nota: Per ulteriori dettagli sulla cella ordinamento preparazione e purificazione, vedere Basu et al. 13
2. iniezione intracranico delle cellule di Glioblastoma iRFP-etichetta in topi immunodeficienti
Nota: Prima di iniziare l'intervento chirurgico, assicurarsi che la sala operatoria e gli strumenti sono puliti per la procedura. Utilizzare immunodeficienti topi nudi athymic (Foxn1nu) maschi o femminili, tra 4-5 settimane vecchie e 17-19 g per iniezioni intracraniche. Gli animali devono essere alloggiati per almeno 3 giorni dopo l'arrivo e prima della chirurgia.
- Preparazione delle cellule
- Raccolto e dissociare fluorescente positiva-glioma cellule in sospensione unicellulare (passaggi 1.4-1.6) e risospendere 0.5 o 1.0 x 106 cellule in 2-5 µ l di PBS per iniezione per animale. Dispensare la sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e posto sul ghiaccio.
- Amministrazione e preparazione di anestesia
- Preparare 200 µ l di soluzione fisiologica contenente ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) per 20 grammi di peso corporeo del mouse. Pesare gli animali e calcolare la dose appropriata di anestesia.
- Fornire un'iniezione intraperitoneale dell'anestesia e applicare unguento oftalmico agli occhi per prevenire la disidratazione. Per maggiori dettagli su questa operazione, vedere Kathleen et al. 14 Place l'animale su un pad termico acqua pre-riscaldata a 37 ° C.
- Controllare che gli animali sono anestetizzati dal monitoraggio della risposta di pizzico di punta (pedale reflex), di solito entro 5-10 min.
- Intracranica iniezione
- Caricare un 5 µ l siringa Hamilton (ago a punta smussata) con sospensione cellulare e montare nel porta-sonda.
- Posizionare il mouse in una piccola cornice stereotassica animale e fissate la testa utilizzando le barre di orecchio e l'adattatore di incisivo seguendo i dettagli descritti da Cetin et al. 15
- Disinfettare la testa con soluzione 70% di etanolo e betadine. Assicurarsi che è completato il sito chirurgico sterile. Eseguire un'incisione centrale con un piccolo bisturi e separare la pelle e i tessuti connettivi.
- Posizionare la siringa Hamilton sul punto di bregma utilizzando il micromanipolatore.
- Spostare la sonda titolare 1,0 mm anteroposteriore e 2.0 mm laterale dal punto di bregma. Segnare con una matita la posizione.
- In questa posizione, attentamente fare un buco nel cranio con un trapano portatile micromotore da esercitando una leggera pressione verso il basso fino a quando i vasi sanguigni diventano visibili. Non interrompere il parenchima aracnoide mater e cervello.
- Introdurre l'ago nel foro della bava e avanzare 3,0 mm sotto la superficie pial.
- Impostare il volume (2-5 µ l) e portata (1 µ l/min) di iniezione utilizzando un iniettore stereotassica motorizzato o eseguire manualmente l'iniezione.
- Dopo l'iniezione, rimuovere l'ago gradualmente salendo 1,0 mm ogni 1 min e pulire il sito di iniezione con etanolo al 70%.
- Nelle vicinanze la pelle ferita con graffette chirurgiche o facendo le suture chirurgiche (spesso denominate punti di sutura) e vedere Kathleen et al. 14 per maggiori dettagli.
- Recupero degli animali
- Trasferire l'animale a un pad termico acqua (37 ° C) e monitorare la temperatura corporea, frequenza respiratoria e frequenza cardiaca, fino al recupero completo. Amministrare l'analgesia per protocolli standard.
Nota: Per ulteriori informazioni sulla procedura stereotassica, chirurgia e coordinate, vedere altri rapporti5,14,15.
- Trasferire l'animale a un pad termico acqua (37 ° C) e monitorare la temperatura corporea, frequenza respiratoria e frequenza cardiaca, fino al recupero completo. Amministrare l'analgesia per protocolli standard.
3. FMT Imaging
Nota: Secondo lo scopo sperimentale, il glioblastoma iRFP-etichettate le cellule possono essere monitorati in vivo prima, durante o dopo il trattamento. Per scopo di imaging, anestetizzare gli animali utilizzando una camera di induzione di isoflurano, mantenere in una cassetta di formazione immagine durante la scansione e immagine nell'alloggiamento del dispositivo di imaging FMT.
- Rimuovere l'animale dalla gabbia e posto nella camera di induzione di isoflurane. Chiudere la camera e attivare il flusso di ossigeno e vaporizzatore per 3-5%.
- Monitorare l'animale fino a quando esso è completamente anestetizzato, solitamente entro 1-2 min inconscio animali non devono rispondere agli stimoli esterni.
- Rimuovere l'animale anestetizzato dalla camera e mettere l'animale nella cassetta imaging inserendo l'adattatore testa in primo luogo, seguita dall'immissione dell'animale rivolto verso il basso. Assicurarsi che la testa si trova nel centro della cassetta.
- Mettere la piastra superiore della cassetta e serrare le manopole di regolazione fino a 17 mm.
- Una volta che l'animale è sicuro nella cassetta di imaging, procedere all'imaging di avere inserito la cartuccia nell'alloggiamento interno del dispositivo di imaging FMT, dove l'isoflurano è pompato per tenere l'animale anestetizzato.
- Eseguire il software imager e analizzatore facendo doppio clic sull'icona del software.
- Nella finestra "Scheda sperimentale", selezionare il "Database" e "Gruppo di studio".
- Passare alla finestra "Scheda scansione" e selezionare l'oggetto immagine facendo clic su "Seleziona il soggetto". Inoltre, è possibile selezionare il canale di laser nel pannello "Canale Laser". Per le cellule FP635-etichetta, selezionare "laser canale 635 nm" e per le cellule FP720-labeled, selezionare "canale 680 nm del laser".
- Acquisire un'immagine facendo clic sull'opzione "Cattura" nella finestra "Scheda di scansione". Quindi, regolare il campo di scansione facendo clic e trascinando il campo di scansione dell'immagine acquisita a un determinato numero di posizioni di origine, solitamente entro 20-25 fonti per il lato ipsilateral.
- Selezionare l'opzione "Aggiungi alla coda di ricostruzione" e colpire "Scan" nella finestra "Scheda di scansione".
- Attendere fino a quando la scansione è completata e quindi rimuovere la cassetta imaging dalla docking station.
- Rimuovere la piastra superiore della cassetta e posto sul retro degli animali in gabbia.
- Ripetere i passaggi 3.1-3.12 per il resto degli animali.
4. image Analysis
- Dal software imager e analizzatore, selezionare la finestra "Scheda di analisi".
- Caricare il dataset e il soggetto per analizzare facendo clic sul pulsante "+" nel pannello "Dataset selezione" della finestra "Scheda di analisi".
- Una volta che l'immagine è stata caricata nella finestra "Scheda di analisi", è possibile eseguire la regione di analisi di interesse (ROI) selezionando l'icona dell'elissoide, situato nell'angolo superiore sinistro della finestra "Scheda di analisi".
- Regolare la soglia a zero nel pannello "dati statistici" facendo clic con il pulsante destro del mouse su colonna "soglia" nella finestra "Scheda di analisi".
- Il valore totale nel pannello "Dati statistici" rappresenta il segnale dalle cellule fluorescenti-etichetta glioblastoma impiantate nel cervello del topo.
- Ripetere i passaggi da 4.2-4.4 per il resto degli animali. Caricare o rimuovere un nuovo soggetto cliccando il "+" o "−" pulsante, rispettivamente, nel pannello "Dataset selezione" della finestra "Scheda di analisi".
Nota: Per ulteriori informazioni sul FMT imaging e il funzionamento del software, vedere20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
U87EGFRvIII di cellule di glioblastoma (cellule U87 che sovraesprimono la variante del recettore di EGF III) sono state coltivate secondo il punto 1.2. Lentivirus è stato prodotto e purificato secondo punto 1.1. La concentrazione virale è stata determinata da p24 analisi di ELISA. Le cellule sono state trasdotte con lentivirus portando a infrarossi proteine fluorescenti secondo punto 1.8. Il plasmide codifica FP72010,11 è stato gentilmente fornito da Dr. V.V. Verkhusha e il vettore di FP635 è stato acquistato da un fornitore commerciale. Cellule bersaglio erano FACS ordinati per arricchire per la popolazione delle cellule fluorescente più di 10% superiore (Figura 1A). Aumentando il segnale fluorescente migliora la sensibilità dell'apparato di tomografia di fluorescenza. Per convalidare l'intensità dei segnali delle cellule fluorescente etichettati prima dell'impianto ortotopico, abbiamo usato la cassetta fantasma del dispositivo di imaging FMT. In particolare, U87EGFRvIII-TurboFP635 e U87EGFRvIII-iRFP720 cellule fossero dissociate con tripsina e 1 x 105, 1x106, e 1 x 107 cellule sono stati risospesi in 100 µ l di PBS freddo ghiaccio, rispettivamente e analizzate. L'imager FMT consente un rilevamento a 4 canali: 635 nm, 680 nm, 750 nm e 780 nm. Lontano infrarosso canali 750 nm e 780 nm non sono adatti per questa analisi, perché non c'è nessuna emissione a tali lunghezze d'onda dalle proteine fluorescenti vicino infrarosso usate (dati non mostrati). Di conseguenza, abbiamo analizzato i segnali di emissione a 635 nm e 680 nm. Riportati nella Figura 1, il fluorescente segnale immagine e intensità quantificazione per entrambi FP635 (Figura 1B, C) e FP720 (Figura 1, E), che aumenta proporzionalmente l'aumentare del numero di cellulare. Di nota, l'emissione per FP635 è visibile nel canale 635 nm, ma non nel canale 680 nm. Al contrario, l'emissione per FP720 è visibile nel canale di 680 nm, ma non nel canale 635 nm. Questo rende queste due proteine fluorescenti candidato adatte per studi dove due popolazioni delle cellule possono essere etichettati e monitorati contemporaneamente utilizzando due vicino infrarosse etichette fluorescenti.
U87EGFRvIII cellule identificate con vicino infrarosse proteine fluorescenti sono stati poi utilizzati per orthotopic iniezione e in vivo del tumore crescita monitoraggio, come descritto nei passi 2.1-2.4. Abbiamo usato la stessa linea cellulare, cioè, U87EGFRvIII, etichettata con tag fluorescenti differenti, per escludere tumore crescita differenza tra tipi di cellule tumorali differenti. I topi sono stati iniettati con cellule U87EGFRvIII-TurboFP635, U87EGFRvIII-iRFP720 cellule o una combinazione uguale (1:1) delle varietà di cellula due. Un totale di 5 x 105 celle in un volume di 5 µ l di PBS sono state iniettate intracranially in 4-5 settimane vecchio immunocompromessi nudi athymic usando un sistema stereotactic e una siringa Hamilton, seguenti passaggi 2.3-2.4. L'anestesia è stata compiuta tramite l'iniezione intraperitoneale di chetamina/xilazina. Gli animali erano tenuti caldi in tutta l'iniezione utilizzando un pad termico acqua e controllati per eventuali segni di afflizione. Crescita e l'attecchimento del tumore poi è stata monitorata da FMT sistema di imaging. Durante le sessioni di scansione, i topi sono stati temporaneamente anestetizzati utilizzando una camera di isoflurane 3% (passaggi 3.1-3.12). I topi sono stati poi collocati in una cassetta di imaging e ripreso all'interno della macchina fotografica di scansione laser. Ogni mouse è stato digitalizzato utilizzando il 635 nm e 680 nm canali. La quantificazione di segnale è stata registrata nel corso del tempo e topi sono stati sacrificati al momento della comparsa dei sintomi neurologici, secondo le linee guida istituzionali Animal Care ed uso Committee (IACUC). Come indicato in Figura 2A, U87EGFRvIII-TurboFP635 emissione segnale era evidente nel canale 635 nm e fondo minimo segnale è stato registrato nel canale 680 nm (figure 2B, C). Al contrario, le cellule U87EGFRvIII-iRFP720 emesse nel canale nm 680 risultati poco sfondo nel canale 635 nm (figure 2D–F). Infine, topi iniettati con un mix 1:1 di U87EGFRvIII-TurboFP635 e U87EGFRvIII-iRFP720 cellule ha mostrato il segnale aumentato in entrambi i canali per tutta la durata dell'esperimento (figure 2–io). Questi dati mostrano che è possibile utilizzare le proteine fluorescenti a infrarossi per dual in vivo imaging di popolazioni di cellule di cancro. I dati indicano anche che diverse proteine fluorescenti hanno una diversa intensità in loro emissione del segnale. Qui, l'intensità del segnale FP720 era superiore a FP635, con aumento della sensibilità nel rilevare le più piccole popolazioni di cellule tumorali in un ambiente di monitoraggio non invasivo.
Gli effetti del silenziamento genico dei geni legati al cancro sulla carcinogenicità nei modelli preclinici possono anche essere studio con questo protocollo. Per questo scopo, GBM-sfere (GSC23 e GSC11) sono stata coltivata (punto 1.2) e trasdotte con FP720-lentivirus (passo 1,8). Le cellule che esprimono FP720 erano ordinati come descritto in precedenza nei passaggi 1.11-1.13 FACS. FP720-labeled cellule erano co-trasdotte con codifica lentivirali shRNA targeting DAXX (shDaxx), o controllo di shRNA (shLuc) a MOI 516. Le cellule sono state coltivate per 5 giorni, dissociato in una sospensione di singola cellula, e 1 x 106 celle sono stati risospesi in 3 µ l di PBS per iniezione intracranica. L'efficacia di shRNA targeting DAXX è stata confermata da reazione a catena della polimerasi quantitativa trascrizione inversa (RT-qPCR) in GSC23 (Figura 3A) e GSC11 (Figura 3). Cellule di GBM-iRFP720/shRNA stereotactically sono state iniettate nel corpo striato di topi immunodeficienti, secondo passi 2.3-2.4. Gli animali sono stati osservati per segni neurologici e il segnale di fluorescenza relativa di xenotrapianti sono stati analizzati tramite il sistema di imaging FMT, quantificato utilizzando software di analisi, secondo passi 3.1-4.6. Immagini rappresentative di FMT Visualizza un segnale di fluorescenza di diminuzione in topi innestati con shDAXX/GBM-sfere in confronto agli animali impiantati con shControl (Figura 3B e Figura 2D) per entrambi i modelli GBM-sfere, confermando la nostra precedente di individuazione16 che l'inibizione di DAXX reprime la crescita tumorale in modelli preclinici di glioblastoma.
Figura 1: curve Standard usando le cellule per phantom e analisi al FACS. (A), FACS rappresentativi istogrammi di FP720 - e FP635-U87EGFRvIII che esprimono le cellule (destra e sinistra pannello, rispettivamente). Cellule del glioma sono state infettate con lentivirus codifica proteine fluorescenti a raggi infrarossi e FASC ordinati per arricchire per la massima espressione delle proteine FP720 o FP635. Immagini rappresentative ottenuti dal software imager e analizzatore di U87EGFRvIII-TurboFP635 (B) e (D) U87EGFRvIII-iRFP720 sospensioni cellulari utilizzando la cassetta del fantasma. Pannelli superiori rappresentano il segnale nei 635 pannelli nm canale e inferiore nel canale di 680 nm. Aumentare nella cella numero ha corrisposto ad un aumento nella visualizzazione del segnale. Quantificazione del segnale di U87EGFRvIII-TurboFP635 (C) e U87EGFRvIII-iRFP720 (E) cellule nel 635 nm e 680 nm canali. Fluorescenza relativa unità sono indicate nella barra colore. Barre di errore rappresentano s.e.m. da 3 diverse scansioni per sospensione cellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: modello di xenotrapianto di tumore cerebrale utilizzando U87EGFRvIII cellule digitalizzati in diversi canali. Immagini rappresentative del segnale fluorescente nel 635 nm e 680 nm canali da animali intracranially impiantati con una combinazione di miscela (1:1) di U87EGFRvIII-iRFP720, U87EGFRvIII-iRFP720 (D) e U87EGFRvIII-turboFP635 (A): Cellule di U87EGFRvIII-turboFP635 (G). Immagini sono state acquisite al giorno 5 dopo la prima scansione. (B, E, H) Segnale di monitoraggio dell'intensità per ogni mouse per un periodo di 5 giorni. Ogni mouse è stato digitalizzato nel canale 635 nm (barre blu) e nel canale 635 nm (barre rosse). La tonalità più chiara della barra di colore rappresenta giorno 1 di scansione e le tonalità più scura rappresenta il giorno 5. (C, F, I) Quantificazione relativa fluorescenza mostrando un confronto diretto dell'intensità del segnale dal canale 635 nm (blu) e 680 nm canale (rosso) nell'intera coorte dei topi. Fluorescenza relativa unità sono indicate nella barra colore. I dati mostrano i valori medi con deviazione standard da 3 animali diversi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: silenziamento genico nel glioblastoma preclinico modelli utilizzando FMT. Analisi dell'espressione genica di DAXX di RT-qPCR in GSC23 (A) e GSC11 (C) cellule del paziente-derivati glioma trasdotte con shRNA con codifica lentivirus targeting DAXX (shDaxx) o shRNA controllo (shLuc) e FP720. Immagini rappresentative del segnale fluorescente dal canale di 680 nm di orthotopically engrafted topi impiantati con GSC23-iRFP720 (B) e cellule paziente-GSC11-iRFP720 (D). Segnale forte fluorescenza è osservato in animali impiantati con shRNA controllo (shLuc) (parte superiore del pannello) in confronto ai topi impiantati con shRNA-DAXX (shDaxx) (parte inferiore del pannello), che indica che l'inibizione di DAXX sopprime il tumore crescita nei modelli preclinici glioma determinato tramite tomografia molecolare di fluorescenza. Fluorescenza relativa unità sono indicate nella barra colore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gli xenotrapianti del tumore sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca sul cancro ed è stato sviluppato un numero di consolidate tecniche di imaging: BLI; risonanza magnetica (MRI); tomografia a emissione di positroni (PET), computata tomografia (CT); FMT. Ciascuno di questi approcci è dotato di Pro e contro, ma in definitiva completano a vicenda con il tipo di informazioni fornite. Uno del più comunemente usato in vivo tecnologia di imaging è BLI5,6,7,8. BLI e FMT entrambi richiedono ingegneria cellulare (con luciferasi enzimi o proteine fluorescenti a infrarossi) che possa influenzare l'espressione genica. BLI è più sensibile per le masse piccolo tumore ma richiede l'iniezione intraperitoneale di un substrato (luciferina), che raggiunge la massima distribuzione del corpo in 10-12 min; ma leggera tempra e dispersione durante l'acquisizione di imaging, e liquidazione di substrato si verificano frequentemente9. FMT, invece, non necessita di qualsiasi amministrazione ulteriori substrato per gli animali e il segnale è stabile e indipendente di tempo o enzima stabilità. Inoltre, FMT, quando utilizzato nelle stesse condizioni sperimentali, offre dati semi-quantitativa riproducibili. BLI e FMT entrambi non offrono risoluzione spaziale; Tuttavia, accoppiamento questi metodi con indirizzi di esplorazione di CT di questo problema.
Un'esplorazione di CT misura l'attenuazione di fotoni quando il segnale attraversa il corpo di un animale ed è ideale per identificare le strutture del corpo. Tuttavia, il contrasto dei tessuti molli, che potrebbe interferire con il rilevamento di un piccolo tumore intracranico, è una limitazione di questo approccio17,18. Uno svantaggio ulteriore di CT è l'uso di radiazioni e mezzi di contrasto, che può indurre cambiamenti molecolari nelle celle di destinazione. Un'esplorazione di CT può essere combinata con PET, che utilizza traccianti radioattivi come il glucosio analogico, del fluorodeoxyglucose 18F-FDG; ma questo può anche interferire con alcuni processi fisiologici nei piccoli animali. Al contrario, FMT non ha bisogno di alcun substrato iniettato per misurare il tumore massa ed è possibile misurare il metabolismo del tumore, infiammazione, angiogenesi, apoptosi e altri marcatori utilizzando fluorescente identificati biomarcatori19.
Nel complesso una delle tecniche più utili e versatili per l'imaging in vivo è la risonanza magnetica. Minori limitazioni del MRI possono essere trovati nel tempo di acquisizione basso, minore sensibilità al PET e alcune variazioni relative strumento18,20.
Qui, segnaliamo il metodo FMT come metodo alternativo per modelli preclinici di glioblastoma. Pre-etichettatura delle cellule bersaglio con proteine fluorescenti a infrarossi (Figura 1A–E) e post-impianto in animali immunocompromessi la scansione si ottengono con un sistema di imaging tomografia di fluorescenza. Abbiamo segnalato il metodo FMT come metodo alternativo per modelli preclinici di glioblastoma. Con questo metodo imaging viene applicato in modo non invasivo e privo di substrato, gli animali sono tenuti in un ambiente basso stress e connettivali quantificazione può essere eseguita (Figura 2A–io, Figura 3A, B). Questo protocollo può essere applicato per studiare l'efficacia di trattamenti combinatoriale di modelli preclinici glioma21, per identificare nuovi bersagli terapeutici per i tumori di cervello16e per studiare nuove molecole metaboliche trattabili22, meccanismi epigenetici23, o nuovi agenti chemioterapici in combinazione con la radioterapia (dati non pubblicati) e applicato ad altri studi preclinici. Proponiamo anche qui l'uso di FMT come un dual in vivo imaging approccio, quando due co-esistenti, ma diversi, popolazioni delle cellule del tumore sono pensate per essere analizzati.
Alcune limitazioni con FMT devono essere prese in considerazione, come auto-generato da alcuni organi che possono interferire con il segnale di fluorescenza. Ad esempio, murine della milza e fegato emettono fluorescenza auto nel canale di 680 nm ma non a 635 nm. Quindi, FMT-relative procedure sperimentali che coinvolgono questi organi devono essere condotte utilizzando altre proteine fluorescenti a raggi infrarossi, come FP635. Abbiamo usato nudo foxn1-mutato topi nudi per evitare interferenze nella registrazione del segnale di fluorescenza; Se un modello di mouse diverso deve essere utilizzato, è consigliabile Radere l'area di interesse degli animali. Inoltre, questo approccio è anche limitato nel rilevare masse tumorali molto piccole. Nella nostra esperienza, il rapporto segnale-rumore migliora come il tumore massa diventa più grande, ancora prima della comparsa di qualsiasi sintomo neurologico nei topi. Infatti, in esperimenti precedenti condotti su orthotopically iniettato PDXs, siamo stati in grado di rilevare tumori durante un regime farmacologico per almeno 2 settimane nei topi senza alcun segno di disagio a causa di tumore onere o droga amministrazione21. In definitiva, l'aggressività di ogni linea cellulare e il numero di cellule iniettate determinerà la durata di ogni esperimento. I dati mostrano una relazione lineare proporzionale tra il numero di cellule e di segnale (Figura 1B–E) e il tumore massa e segnale (Figura 2); ma una correlazione generale segnale tra tumore massa e numero di cellule non può essere applicata attraverso diverse linee cellulari e proteine a infrarossi. Il segnale per ogni combinazione di proteina fluorescente linea/infrarossi cella deve essere determinato empiricamente. Inoltre, il segnale ottenuto dall'analisi delle celle utilizzando il fantasma (Figura 1B, D) non corrisponde al segnale da xenotrapianti intracranici come un'attenuazione di segnale si verifica a causa del cranio del mouse.
Il software imager e analizzatore di consentire per la soglia. Anche se non abbiamo usato nessuna soglia qui, scansione animali senza qualsiasi cellule impiantati dà il rumore di fondo che tende ad essere eliminato da ricostruzione in presenza di un vero segnale. Alcuni fattori influenzano l'intensità del segnale di xenotrapianto e devono essere tenuti in considerazione: ogni proteina fluorescente a raggi infrarossi ha diverso spettro di emissione e intensità, con FP720 essendo una delle proteine più fluorescente utilizzate sperimentalmente10 ,11; ogni linea cellulare tiene conto una quantità abbondante, ancora limitata, di produzione di proteine, influenzando così la fluorescenza massima ottenibile. Infine, l'imager FMT è configurato con curve interne standard per composti specifici, pertanto, è importante considerare quale composto ha lo spettro di emissione più vicino alla proteina fluorescente a raggi infrarossi usata per etichettare le cellule. Sebbene ben tollerato, è consigliabile per determinare potenziali effetti citotossici mediati dalla sovraespressione di proteine a infrarossi8,9. Inoltre, si consiglia di utilizzare gruppi di topi di almeno 8 per ogni gruppo sperimentale, come potrebbe verificarsi una perdita di dati e topi, a causa di intervento chirurgico o variabilità nel engraftment delle cellule di cancro, Tuttavia, questo aggiunge significato statistico allo studio. Si consiglia inoltre di serialmente scansione la coorte degli animali per più di un giorno e analizzare l'emissione di segnale allo stesso tempo, da variazioni nella profondità cassetta imaging e ricostruzione del segnale fluorescente potrebbe interferire con la quantificazione del segnale finale. Per risolvere questo problema, il software analizzatore permette modifiche minori nell'intensità del laser (da normale a elevata e molto elevata), anche se nella nostra esperienza il risultato finale non è drammaticamente diverso. Una nota finale per quanto riguarda il rapporto costo-efficacia è che il FMT sistema di imaging possa essere facilmente condivisi come strumento principale tra diversi laboratori, che aiuta a coprire i costi di acquisto e la manutenzione. In conclusione, il FMT è una risorsa preziosa che rende valutazione sperimentale e preclinici in vivo di sviluppo del tumore, facile e affidabile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interessi.
Acknowledgments
Si ringrazia il Dr. Frederick Lang, MD Anderson Cancer Center per GBM-PDX neurosfere. Questo lavoro è stato supportato dalla sconfitta GBM ricerca collaborativa, una sussidiaria della National cervello tumore Society (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), James S. McDonnell Foundation (Frank Furnari); Jorge Benitez è stato sostenuto da un premio dall'American cervello tumore Association (ABTA); Ciro Zanca parzialmente è stato supportato da una borsa di ricerca post-dottorato American-Italian Cancer Foundation. Frank Furnari riceve stipendio e ulteriore supporto del Ludwig Institute for Cancer Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose | HyClone/GE | SH30022.1 | |
| DMEM/F12 1:1 | Gibco | 11320-082 | |
| FBS | HyClone/GE | SH30071.03 | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| Trypsin | HyClone/GE | SH30236.01 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| human recombinant EGF | Stemcell Technologies | 2633 | |
| human recombinant FGF | Stemcell Technologies | 2634 | |
| DPBS | Corning | 21-031-00 | |
| FACS tubes | Falcon | 352235 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Blasticidin | ThermoFisher Scientific | A1113903 | |
| p24 ELISA | Clontech | 632200 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Ketamine | Zoetis | NADA 043-403 | Controlled substance |
| Ointment | Dechron | NDC 17033-211-38 | |
| Absorbable suture | CpMedical | VQ392 | |
| 5 ul syringe | Hamilton | 26200-U | Catalog number as sold by Sigma-Aldrich |
| Cell Sorter | Sony | SH8007 | |
| Mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Motorized stereotaxic injector | Stoelting | 53311 | |
| Micromotor hand-held drill | Foredom | K1070 | |
| Mouse warming pad | Ken Scientific Corporation | TP-22G | |
| Fluorescence Tomography System | PerkinElmer | FMT 2500 XL | |
| TrueQuant Imaging Software | Perkin Elmer | 7005319 | |
| Ultra-centrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | 392049 | |
| Tissue Culture 100mm Dishes | Olympus Plastics | 25-202 | |
| Tissue Culture 150mm Dishes | Olympus Plastics | 25-203 | |
| Tissue Culture Flasks T75 | Corning | 430720U | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430290 | |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Centrifuge Avanti J-20 | Beckman Coulter | J320XP-IM-5 | |
| Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL | Beckman Coulter | 326819 | |
| Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 (Homozygous) | Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required. |
References
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009-2013. Neuro-Oncology. 18 (suppl_5), v1-v75 (2016).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Stewart, E. L., et al. Clinical Utility of Patient-Derived Xenografts to Determine Biomarkers of Prognosis and Map Resistance Pathways in EGFR-Mutant Lung Adenocarcinoma. Journal of Clinical Oncology. 33 (22), 2472-2480 (2015).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nat Med. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
- Kondo, A., et al. An experimental brainstem tumor model using in vivo bioluminescence imaging in rat. Child's Nervous System. 25 (5), 527-533 (2009).
- Nyati, S., Young, G., Ross, B. D., Rehemtulla, A. ATM Kinase: Methods and Protocols. Kozlov, S. V. , Springer. New York. 97-111 (2017).
- Kondo, A., et al. Longitudinal assessment of regional directed delivery in a rodent malignant glioma model. J Neurosurg Pediatr. 4 (6), 592-598 (2009).
- Badr, C. E. Bioluminescent Imaging: Methods and Protocols. Badr, C. E. , Humana Press. 1-18 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat Meth. 10 (8), 751-754 (2013).
- Filonov, G. S., et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotech. 29 (8), 757-761 (2011).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protocols. 1 (1), 241-245 (2006).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
- Benitez, J. A., et al. PTEN regulates glioblastoma oncogenesis through chromatin-associated complexes of DAXX and histone H3.3. Nature Communications. 8, 15223 (2017).
- Kirschner, S., et al. Imaging of Orthotopic Glioblastoma Xenografts in Mice Using a Clinical CT Scanner: Comparison with Micro-CT and Histology. PLOS ONE. 11 (11), e0165994 (2016).
- Mannheim, J. G., et al. Standardization of Small Animal Imaging-Current Status and Future Prospects. Molecular Imaging and Biology. , (2017).
- Engblom, C., et al. Osteoblasts remotely supply lung tumors with cancer-promoting SiglecFhigh neutrophils. Science. 358 (6367), (2017).
- Lauber, D. T., et al. State of the art in vivo imaging techniques for laboratory animals. Laboratory Animals. 51 (5), 465-478 (2017).
- Zanca, C., et al. Glioblastoma cellular cross-talk converges on NF-κB to attenuate EGFR inhibitor sensitivity. Genes & Development. 31 (12), 1212-1227 (2017).
- Villa, G. R., et al. An LXR-Cholesterol Axis Creates a Metabolic Co-Dependency for Brain Cancers. Cancer Cell. 30 (5), 683-693 (2016).
- Liu, F., et al. EGFR Mutation Promotes Glioblastoma through Epigenome and Transcription Factor Network Remodeling. Molecular Cell. 60 (2), 307-318 (2015).
