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Cancer Research

ग्लियोब्लास्टोमा Xenografts के Vivo इमेजिंग में के लिए प्रतिदीप्ति आणविक टोमोग्राफी

Published: April 26, 2018 doi: 10.3791/57448
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2,3, 1,2,4
1Ludwig Institute for Cancer Research, 2Moores Cancer Center, School of Medicine, University of California, San Diego, 3Department of Pathology, School of Medicine, University of California, San Diego, 4Department of Medicine, School of Medicine, University of California, San Diego
* These authors contributed equally

Summary

ट्यूमर कोशिकाओं के Orthotopic intracranial इंजेक्शन मस्तिष्क ट्यूमर जीव विज्ञान, प्रगति, विकास, और चिकित्सीय प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए कैंसर अनुसंधान में इस्तेमाल किया गया है । यहां हम ट्यूमर xenografts, जो वास्तविक समय intravital इमेजिंग और नैदानिक ग्लियोब्लास्टोमा मॉडल में एक ट्यूमर द्रव्यमान के ठहराव प्रदान करता है की आणविक टोमोग्राफी प्रतिदीप्ति उपस्थित ।

Abstract

Tumorigenicity कैंसर कोशिकाओं की क्षमता के लिए एक ट्यूमर के रूप में बड़े पैमाने पर है । एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया अगर कोशिकाओं tumorigenic है निर्धारित करने के लिए दृष्टिकोण कैंसर कोशिकाओं के साथ immunodeficient चूहों इंजेक्शन द्वारा है और ट्यूमर द्रव्यमान को मापने के बाद यह दिखाई और स्पष्ट हो जाता है । कैंसर कोशिकाओं के Orthotopic इंजेक्शन microenvironment में xenograft है कि सबसे निकट ट्यूमर की उत्पत्ति के ऊतकों का अध्ययन किया जा रहा है जैसा दिखता है उद्देश्य । ब्रेन कैंसर अनुसंधान कैंसर कोशिकाओं के intracranial इंजेक्शन की आवश्यकता है ट्यूमर गठन और मस्तिष्क के अद्वितीय microenvironment में विश्लेषण की अनुमति है । vivo में इमेजिंग की intracranial xenografts मॉनिटर तत्क्षण orthotopically engrafted चूहों के ट्यूमर द्रव्यमान । यहां हम ब्रेन ट्यूमर xenografts के प्रतिदीप्ति आणविक टोमोग्राफी (FMT) के उपयोग की रिपोर्ट । कैंसर की कोशिकाओं के पास अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ पहले transduced और फिर प्रतिरक्षा चूहों के मस्तिष्क में इंजेक्ट कर रहे हैं । जानवरों तो समय की एक विस्तारित अवधि में ट्यूमर मास के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए स्कैन कर रहे हैं. सेल पूर्व लेबलिंग लागत प्रभावी, reproducible, और प्रत्येक माउस के भीतर ट्यूमर के बोझ के विश्वसनीय ठहराव के लिए अनुमति देता है । हम इमेजिंग सब्सट्रेट इंजेक्शन के लिए की जरूरत को समाप्त, और इस तरह जानवरों पर तनाव कम. इस दृष्टिकोण की एक सीमा बहुत छोटे द्रव्यमान का पता लगाने के लिए अक्षमता द्वारा प्रतिनिधित्व किया है; हालांकि, यह अंय तकनीकों की तुलना में बड़ा जनता के लिए बेहतर संकल्प किया है । यह एक दवा उपचार या तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिका लाइनों और रोगी व्युत्पंन नमूनों की आनुवंशिक परिवर्तन की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

कैंसर एक औद्योगिक दुनिया में मानव में बीमारी से संबंधित मौतों के प्रमुख कारणों में से एक है । एक अत्यंत उच्च मृत्यु टोल के साथ, नए उपचार तत्काल आवश्यक हैं । ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफार्मी (जीबीएम) मस्तिष्क कैंसर का एक अत्यंत घातक प्रकार, मस्तिष्क ट्यूमर, stromal, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की विषम आबादी से बना है । संयुक्त राज्य अमेरिका के केंद्रीय ब्रेन ट्यूमर रजिस्ट्री के अनुसार, प्राथमिक घातक और गैर घातक मस्तिष्क ट्यूमर की घटना १००,००० प्रति लगभग 22 मामलों है । २०१७1में अमरीका में लगभग ११,००० नए मामलों का निदान होने की उम्मीद है ।

पूर्व नैदानिक अध्ययन एक दवा की संभावना की जांच, प्रक्रिया, या उपचार के लिए मानव में परीक्षण से पहले प्रभावी हो । एक प्रारंभिक नैदानिक अध्ययन में प्रयोगशाला चरणों में से एक कैंसर एक मेजबान जीव में प्रत्यारोपित कोशिकाओं का उपयोग करके दवा के इलाज के लिए संभावित आणविक लक्ष्यों की पहचान है, मानव xenograft मॉडल के रूप में परिभाषित किया । इस संदर्भ में, intracranial ब्रेन ट्यूमर xenograft रोगी-व्युत्पंन xenografts (PDXs) का उपयोग कर मॉडल व्यापक रूप से किया गया है मस्तिष्क ट्यूमर जीव विज्ञान, प्रगति, विकास, और चिकित्सीय प्रतिक्रिया का अध्ययन, और अधिक हाल ही में जैव मार्क्स विकास, दवा के लिए स्क्रीनिंग, और निजीकृत चिकित्सा2,3,4।

intracranial xenografts की निगरानी करने के लिए vivo इमेजिंग तरीकों में सबसे सस्ती और गैर इनवेसिव में से एक bioluminescence इमेजिंग (BLI)5,6,7,8है । हालांकि, कुछ BLI सीमाओं सब्सट्रेट प्रशासन और उपलब्धता, एंजाइम स्थिरता, और प्रकाश शमन और इमेजिंग अधिग्रहण9के दौरान बिखरने शामिल हैं । यहाँ हम एक वैकल्पिक इमेजिंग विधि के रूप में अवरक्त FMT की रिपोर्ट करने के लिए नैदानिक ग्लियोब्लास्टोमा मॉडल की निगरानी. इस विधि में, संकेत अधिग्रहण और intracranially प्रत्यारोपित PDXs के ठहराव, एक के पास अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन iRFP72010,11 (इसके बाद के रूप में FP720 के रूप में) या turboFP635 (इसके बाद FP635 के रूप में अवधि के रूप में) व्यक्त, एक FMT इमेजिंग प्रणाली के साथ किया जाता है । FMT प्रौद्योगिकी का उपयोग करना, orthotopic ट्यूमर से पहले, दौरान, या उपचार के बाद, एक गैर इनवेसिव, सब्सट्रेट मुक्त, और मात्रात्मक टिप्पणियों के लिए नैदानिकी तरीके में vivo में निगरानी की जा सकती है.

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Protocol

प्रायोगिक अनुसंधान पशुओं और संक्रामक एजेंटों, जैसे कैंसर कोशिकाओं को transduce करने के लिए lentivirus के उपयोग, संस्थागत पशु देखभाल कार्यक्रम द्वारा और संस्थागत सुरक्षा समिति द्वारा पूर्व अनुमोदन की आवश्यकता है । इस प्रोटोकॉल कैलिफोर्निया सैन डिएगो (UCSD) के विश्वविद्यालय के पशु देखभाल दिशानिर्देश इस प्रकार है ।

1. FP635 या FP720 के साथ ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के लेबल का निर्माण

  1. Tiscornia एट अल द्वारा बताए गए प्रोटोकॉल के अनुसार उत्पादन और शुद्धि lentivirus । 12
  2. संस्कृति लगभग २.० x 106 कोशिकाओं DMEM प्लस के साथ एक मानव तंत्रिकाबंधार्बुद सेल लाइन से 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) एक 15-सेमी डिश में; या संस्कृति २.० x 106 मानव ग्लियोब्लास्टोमा रोगी-व्युत्पंन (जीबीएम-PDX) DMEM/F12 1:1 माध्यम के साथ B27 पूरक प्लस मानव रिकॉमबिनेंट एपिडर्मल वृद्धि कारक के साथ क्षेत्रों (EGF; 20 एनजी/एमएल) और FGF (10 एनजी/एमएल) एक T75 कुप्पी में ।
  3. ३७ ° c, 5% CO2, और १००% सापेक्षिक आर्द्रता पर सभी कक्षों को बनाए रखें ।
  4. कोशिकाओं को अलग कर देना ।
    1. तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं के लिए: प्लेटों से supernatant निकालें और तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं के लिए trypsin 1x के 3-5 मिलीलीटर जोड़ने ।
    2. जीबीएम क्षेत्रों के लिए: एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं pipetting द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा ।
      1. नीचे स्पिन 5 मिनट के लिए २०० x जी में जीबीएम क्षेत्रों के कमरे के तापमान पर एक तालिका के ऊपर केंद्रापसारक का उपयोग कर ।
      2. supernatant निकालें और सेल टुकड़ी समाधान के 3-5 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. 10-15 मिनट के लिए ३७ ° c पर सभी कोशिकाओं को मशीन ।
  5. ध्यान से अलग कर देना कोशिकाओं को ऊपर और नीचे कई बार pipetting द्वारा (सुनिश्चित करें कि क्षेत्रों और तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं असंबद्ध पूरा कर रहे हैं) और 5 मिनट के लिए २०० x g पर नीचे स्पिन ।
  6. supernatant निकालें और कई बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मध्यम की 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को पुनर्स्थगित । trypan नीले अपवर्जन द्वारा सेल व्यवहार्यता का निर्धारण ।
  7. प्लेट १.० x 10 pipetting द्वारा मध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ एक 10-सेमी डिश में लक्ष्य कोशिकाओं के6 ।
  8. Transduce कोशिकाओं lentivirus संक्रमण की बहुलता पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के साथ (MOI) 5 के रूप में Tiscornia एट अल द्वारा वर्णित है । 12 और ३७ ° c पर मशीन ।
  9. 24 घंटे के बाद, transduced कोशिकाओं से मध्यम निकालें, ताजा माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त ४८ एच के लिए मशीन ।
  10. संक्रमित कक्षों को एकल-कक्ष निलंबन में अलग कर देना चरण 1.4-1.6 में वर्णन किया गया है । 5 मिनट के लिए २०० x g पर कोशिकाओं नीचे स्पिन और छंटाई समाधान के ५०० µ l में reसस्पैंड (फॉस्फेट-1% FBS के साथ बफर खारा (पंजाब)) ।
  11. सेल सस्पेंशन को FACS ट्यूबों में पिपेट । सह-दाग कोशिकाओं 1 µ के साथ एल/एमएल के 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dihydrochloride मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए । नकारात्मक नियंत्रणों को प्रवाह cytometer गेट्स (नॉन-transduced कोशिकाओं और गैर-transduced कोशिकाओं/DAPI सना हुआ) को सेट करने के लिए आवश्यक हैं ।
  12. समाधान छंटाई में फ्लोरोसेंट-सकारात्मक/DAPI-नकारात्मक कोशिकाओं, के रूप में बसु एट अल द्वारा वर्णित है । 13, और सॉर्ट की गई कक्षों को 15-मिलीलीटर शंकु ट्यूब में एकत्रित करें ।
  13. 5 मिनट के लिए २०० x g पर सॉर्ट की गई कक्षों को स्पिन करें, supernatant निकालें, और संस्कृति माध्यम के 5 मिलीलीटर में पुनर्स्थगित । pipetting द्वारा 10-सेमी डिश में क्रमबद्ध कोशिकाओं बीज । ३७ डिग्री सेल्सियस से कम 48-72 एच के लिए मशीन ।
  14. dissociating द्वारा क्रमबद्ध कक्षों का विस्तार करें चरण 1.4-1.6 और vivo प्रयोगों में के लिए कई व्यंजन में चढ़ाना के बाद ।
    नोट: सेल छंटाई तैयारी और शुद्धि के बारे में अधिक जानकारी के लिए, बसु एट अल देखें । 13

2. Immunodeficient चूहों में iRFP-tagged ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं का Intracranial इंजेक्शन

नोट: सर्जरी शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि शल्य चिकित्सा कक्ष और उपकरण प्रक्रिया के लिए साफ कर रहे हैं । intracranial इंजेक्शन के लिए 4-5 सप्ताह पुराने और 17-19 ग्राम के बीच immunodeficient athymic न्यूड (Foxn1nu) पुरुष या मादा चूहों का प्रयोग करें । पशु आगमन के बाद और सर्जरी से पहले कम से कम 3 दिनों के लिए घर में होना चाहिए ।

  1. सेल की तैयारी
    1. फसल और अलग कर देना फ्लोरोसेंट सकारात्मक-तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं को एक एकल सेल निलंबन में (1.4-1.6 कदम) और ०.५ या १.० एक्स10 6 कोशिकाओं प्रति पशु इंजेक्शन प्रति पंजाब के 2-5 µ एल में reसस्पेंड । पिपेट में सेल सस्पेंशन को १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूब और बर्फ पर लगाएं ।
  2. संज्ञाहरण तैयारी और प्रशासन
    1. ketamine (१०० मिलीग्राम/किलोग्राम) और xylazine (10 मिलीग्राम/किलोग्राम) के प्रति 20 ग्राम माउस शरीर के वजन युक्त समाधान के २०० µ एल तैयार करें । जानवरों के वजन और संज्ञाहरण की उचित खुराक की गणना ।
    2. संज्ञाहरण के एक intraperitoneal इंजेक्शन प्रदान करें और निर्जलीकरण को रोकने के लिए आंखों के लिए नेत्र मरहम लागू होते हैं । इस चरण के बारे में अधिक जानकारी के लिए देखें कैथलीन एट अल. 14 ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक पूर्व गर्म पानी थर्मल पैड पर पशु प्लेस ।
    3. जानवरों की जांच करें कि पैर की अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया (पेडल पलटा), आमतौर पर 5-10 मिनट के भीतर निगरानी द्वारा anesthetized हैं ।
  3. Intracranial इंजेक्शन
    1. एक 5 µ एल हैमिल्टन सिरिंज (कुंद टिप सुई) सेल निलंबन के साथ लोड और जांच धारक में माउंट ।
    2. एक छोटे जानवर स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में माउस प्लेस और कान सलाखों और Cetin एट अल द्वारा वर्णित विवरण के बाद incisor एडेप्टर का उपयोग कर सिर को ठीक करें । 15
    3. ७०% इथेनॉल और betadine समाधान के साथ सिर को संक्रमित । सुनिश्चित करें कि सर्जिकल साइट पूर्ण बाँझ है । एक छोटे से स्केलपेल के साथ एक मध्यम चीरा प्रदर्शन और त्वचा और संयोजी ऊतकों को अलग ।
    4. micromanipulator का उपयोग कर bregma बिंदु पर हैमिल्टन सिरिंज प्लेस ।
    5. bregma बिंदु से जांच धारक १.० mm anteroposterior और २.० mm पार्श्व हटो । इस स्थिति को पेंसिल से चिह्नित करें ।
    6. इस स्थान पर, ध्यान से खोपड़ी में एक छेद बनाने के साथ एक micromotor हाथ से थोड़ा दबाव नीचे लागू करके ड्रिल आयोजित जब तक रक्त वाहिकाओं दिखाई हो । रेशेदार मेटर और ब्रेन पैरेन्काइमा को बाधित न करें ।
    7. गड़गड़ाहट छेद में सुई परिचय और pial सतह से नीचे ३.० mm अग्रिम ।
    8. एक मोटर चालित stereotaxic इंजेक्टर का उपयोग कर इंजेक्शन की मात्रा (2-5 µ l) और प्रवाह दर (1 µ l/) सेट अप या मैन्युअल इंजेक्शन प्रदर्शन.
    9. इंजेक्शन के बाद, सुई धीरे से निकालें १.० mm हर 1 मिनट आरोही द्वारा और ७०% इथेनॉल के साथ इंजेक्शन साइट साफ ।
    10. शल्य स्टेपल के साथ त्वचा घाव बंद या शल्य टांके बनाने के द्वारा (अक्सर टांके के रूप में जाना जाता है) और कैथलीन एट अल देखें. 14 अधिक विवरण के लिए ।
  4. पशु वसूली
    1. एक पानी थर्मल पैड (३७ ° c) के लिए पशु हस्तांतरण और शरीर का तापमान, श्वसन दर, और दिल की दर की निगरानी, जब तक पूर्ण वसूली । मानक प्रोटोकॉल प्रति analgesia व्यवस्थापन ।
      नोट: स्टीरियोटैक्टिक कार्यविधि, शल्य चिकित्सा और निर्देशांकों के बारे में अधिक जानकारी के लिए, अन्य रिपोर्ट्स5,14,15देखें.

3. FMT इमेजिंग

नोट: प्रयोगात्मक उद्देश्य के अनुसार, iRFP-tagged ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं से पहले, दौरान, या उपचार के बाद vivo में निगरानी की जा सकती है । इमेजिंग प्रयोजन के लिए, anesthetize एक isoflurane प्रेरण चैंबर का उपयोग कर पशुओं, स्कैनिंग के दौरान एक इमेजिंग कैसेट में बनाए रखने, और FMT imager के डॉकिंग स्टेशन में छवि ।

  1. isoflurane प्रेरण कक्ष में पिंजरे और जगह से पशु निकालें । चैंबर बंद करें और ऑक्सीजन प्रवाह और vaporizer पर बारी 3-5% ।
  2. पशु की निगरानी जब तक यह पूरी तरह से anesthetized है, आमतौर पर 1-2 मिनट के भीतर । बेहोश जानवरों बाहरी उत्तेजनाओं का जवाब नहीं होना चाहिए ।
  3. चैंबर से anesthetized जानवर को निकालकर उसमें सिर के एडेप्टर को रखकर इमेजिंग कैसेट में जानवर डाल कर पहले, बाद में पशु का सामना कर नीचे रखकर. सुनिश्चित करें कि सिर कैसेट के केंद्र में स्थित है ।
  4. शीर्ष पर कैसेट के शीर्ष प्लेट प्लेस और 17 मिमी तक समायोजन knobs कस ।
  5. एक बार है कि पशु इमेजिंग कैसेट में सुरक्षित है, FMT imager, जहां isoflurane पशु anesthetized रखने के पंप है के आंतरिक डॉकिंग स्टेशन में कैसेट डालने के द्वारा इमेजिंग के लिए आगे बढ़ना ।
  6. सॉफ़्टवेयर चिह्न डबल-क्लिक करके imager और विश्लेषक सॉफ़्टवेयर चलाएं ।
  7. "प्रायोगिक टैब" विंडो में, "डेटाबेस" और "अध्ययन समूह" का चयन करें ।
  8. "स्कैन टैब" विंडो पर जाएं और "विषय का चयन करें" क्लिक करके छवि के विषय का चयन करें । इसके अलावा, "लेजर चैनल पैनल" में लेजर चैनल का चयन करें । FP635-लेबल वाले कक्षों के लिए, "लेज़र चैनल ६३५ एनएम" का चयन करें, और FP720-लेबल किए गए कक्षों के लिए, "लेज़र चैनल ६८० एनएम" का चयन करें ।
  9. "स्कैन टैब" विंडो में "कैप्चर" विकल्प पर क्लिक करके एक छवि प्राप्त करें । फिर, स्कैन फ़ील्ड पर क्लिक करके और कैप्चर की गई छवि में स्कैन फ़ील्ड खींच कर स्रोत स्थानों की एक निर्धारित संख्या, आमतौर पर ipsilateral पक्ष के लिए 20-25 स्रोतों के भीतर समायोजित करें ।
  10. "पुनर्निर्माण कतार में जोड़ें" विकल्प की जाँच करें और "स्कैन टैब" विंडो में "स्कैन" हिट ।
  11. स्कैनिंग पूरी होने तक प्रतीक्षा करें और फिर डॉकिंग स्टेशन से इमेजिंग कैसेट निकालें ।
  12. कैसेट की ऊपरी प्लेट निकालें और पशु पिंजरे में वापस जगह है ।
  13. बाकी जानवरों के लिए 3.1-3.12 चरणों को दोहराएँ ।

4. छवि विश्लेषण

  1. imager और विश्लेषक सॉफ़्टवेयर से, "विश्लेषण टैब" विंडो का चयन करें ।
  2. डेटासेट और विषय "विश्लेषण टैब" विंडो के "डेटासेट चयन" पैनल में "+" बटन पर क्लिक करके विश्लेषण करने के लिए लोड ।
  3. छवि "विश्लेषण टैब" विंडो में लोड किया गया है के बाद, "विश्लेषण टैब" विंडो के ऊपरी बाएँ कोने में स्थित ellipsoid चिह्न का चयन करके ब्याज (ROI) विश्लेषण का क्षेत्र निष्पादित करें ।
  4. "विश्लेषण टैब" विंडो में "थ्रेशोल्ड" स्तंभ को राइट-क्लिक करके "सांख्यिकीय डेटा" पैनल में शून्य करने के लिए थ्रेशोल्ड समायोजित करें ।
  5. "सांख्यिकीय डेटा पैनल" में कुल मूल्य फ्लोरोसेंट टैग ग्लियोब्लास्टोमा माउस मस्तिष्क में प्रत्यारोपित कोशिकाओं से संकेत का प्रतिनिधित्व करता है ।
  6. बाकी जानवरों के लिए 4.2-4.4 चरणों को दोहराएँ । "विश्लेषण टैब" विंडो के "डेटासेट चयन" पैनल में क्रमशः "+" या "−" बटन पर क्लिक करके कोई नया विषय लोड करें या निकालें ।
    नोट: FMT इमेजिंग और सॉफ़्टवेयर कार्रवाई के बारे में अधिक जानकारी के लिए,20 देखें.

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Representative Results

ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं U87EGFRvIII (U87 कोशिकाओं पर व्यक्त EGF रिसेप्टर संस्करण III) १.२ कदम के अनुसार संस्कृति थे. Lentivirus का उत्पादन किया गया था और १.१ कदम के अनुसार शुद्ध । वायरल एकाग्रता p24 एलिसा विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था । कोशिकाओं को १.८ कदम के अनुसार अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन ले lentivirus के साथ transduced थे । प्लाज्मिड एन्कोडिंग FP72010,11 कृपया डॉ V.V. Verkhusha द्वारा प्रदान की गई थी और FP635 वेक्टर एक वाणिज्यिक विक्रेता से खरीदा गया था. लक्ष्य कोशिकाओं के लिए शीर्ष 10% सबसे फ्लोरोसेंट सेल जनसंख्या (चित्र 1a) के लिए समृद्ध हल FACS थे । फ्लोरोसेंट संकेत बढ़ाने प्रतिदीप्ति टोमोग्राफी प्रणाली की संवेदनशीलता में सुधार । orthotopic आरोपण से पहले फ्लोरोसेंट-लेबल कोशिकाओं के संकेतों की तीव्रता को मान्य करने के लिए, हम FMT imager के प्रेत कैसेट का इस्तेमाल किया. विशेष रूप से, U87EGFRvIII-TurboFP635 और U87EGFRvIII-iRFP720 कोशिकाओं असंबद्ध के साथ trypsin थे, और 1 x 105, 1 x 106, और 1 x 107 कोशिकाओं बर्फ ठंडा पंजाब के १०० µ l में reसस्पैंड किया गया, क्रमशः और विश्लेषण । FMT imager 4 चैनलों में पता लगाने के लिए अनुमति देता है: ६३५ एनएम, ६८० एनएम, ७५० एनएम, और ७८० एनएम । सुदूर इंफ्रारेड चैनल ७५० एनएम और ७८० एनएम इस विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हैं, क्योंकि वहां के पास अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन का इस्तेमाल किया (नहीं दिखाया डेटा) से ऐसी तरंग दैर्ध्य में कोई उत्सर्जन है । इसलिए, हम ६३५ एनएम और ६८० एनएम पर उत्सर्जन संकेतों का विश्लेषण किया । चित्रा 1में रिपोर्ट, फ्लोरोसेंट संकेत छवि और दोनों FP635 के लिए तीव्रता ठहराव (आंकड़ा 1b, सी) और FP720 (चित्रा 1 डी, ई), जो आनुपातिक कोशिका संख्या बढ़ जाती है के रूप में बढ़ जाती है । नोट की, FP635 के लिए उत्सर्जन ६३५ एनएम चैनल में नहीं बल्कि ६८० एनएम चैनल में दिख रहा है । इसके विपरीत, FP720 के लिए उत्सर्जन ६८० एनएम चैनल में नहीं बल्कि ६३५ एनएम चैनल में दिख रहा है । यह इन दो उंमीदवार फ्लोरोसेंट अध्ययन के लिए उपयुक्त प्रोटीन बनाता है जहां कोशिकाओं की दो आबादी और लेबल किया जा सकता है एक साथ निगरानी के पास दो अवरक्त फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग कर ।

U87EGFRvIII कोशिकाओं के पास अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल तो orthotopic इंजेक्शन के लिए और vivo में ट्यूमर के विकास की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया, के रूप में कदम 2.1-2.4 में वर्णित है । हम एक ही सेल लाइन, अर्थात्, U87EGFRvIII, अलग फ्लोरोसेंट टैग के साथ लेबल का इस्तेमाल किया, अलग कैंसर कोशिका प्रकार के बीच ट्यूमर विकास के अंतर को बाहर करने के लिए । चूहों U87EGFRvIII-TurboFP635 कोशिकाओं, U87EGFRvIII-iRFP720 कोशिकाओं, या एक समान संयोजन (1:1) दो कक्ष लाइनों के साथ इंजेक्ट किया गया था । पंजाब के एक 5 µ एल मात्रा में 5 x 105 कोशिकाओं की कुल 4-5 सप्ताह पुराने प्रतिरक्षा athymic नंगा चूहों में intracranially इंजेक्शन थे एक स्टीरियोटैक्टिक प्रणाली और एक हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग कर, कदम 2.3-2.4 के बाद । संज्ञाहरण ketamine/xylazine के intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा पूरा किया गया था । जानवरों एक पानी थर्मल पैड का उपयोग कर इंजेक्शन भर में गर्म रखा गया था और संकट के किसी भी लक्षण के लिए जाँच की । ट्यूमर engraftment और वृद्धि तो FMT इमेजिंग प्रणाली द्वारा निगरानी की गई । स्कैनिंग सत्रों के दौरान, चूहों अस्थायी रूप से एक 3% isoflurane कक्ष का उपयोग कर anesthetized थे (कदम 3.1-3.12). चूहों तो एक इमेजिंग कैसेट में रखा गया था और लेजर स्कैनिंग कैमरे के अंदर छवि । प्रत्येक माउस ६३५ एनएम और ६८० एनएम चैनल का उपयोग कर स्कैन किया गया था । संकेत ठहराव समय के साथ रिकॉर्ड किया गया था और चूहों मस्तिष्क संबंधी लक्षणों की शुरुआत में euthanized थे, संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के दिशा निर्देशों के अनुसार. के रूप में चित्रा 2aमें संकेत दिया, U87EGFRvIII-TurboFP635 उत्सर्जन संकेत ६३५ एनएम चैनल में स्पष्ट था और ंयूनतम पृष्ठभूमि संकेत ६८० एनएम चैनल में दर्ज किया गया था (आंकड़े बी एम, सी) । इसके विपरीत, ६३५ एनएम चैनल में थोड़ा पृष्ठभूमि दिखा ६८० एनएम चैनल में उत्सर्जित U87EGFRvIII-iRFP720 कोशिकाओं (आंकड़े 2d-F) । अंत में, चूहों U87EGFRvIII-TurboFP635 कोशिकाओं के 1:1 मिश्रण के साथ इंजेक्शन और U87EGFRvIII-iRFP720 कोशिकाओं प्रयोग की अवधि के लिए दोनों चैनलों में संकेत बढ़ा दिखाया (आंकड़े 2g-I). इन आंकड़ों से पता चलता है कि यह कैंसर कोशिका आबादी के vivo इमेजिंग में दोहरी के लिए अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करने के लिए संभव है । डेटा भी संकेत मिलता है कि अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन उनके संकेत उत्सर्जन में एक अलग तीव्रता है । यहां, FP720 संकेत तीव्रता FP635 करने के लिए बेहतर था, एक गैर इनवेसिव निगरानी सेटिंग में कैंसर कोशिकाओं के छोटे आबादी का पता लगाने में वृद्धि की संवेदनशीलता के साथ.

नैदानिक मॉडलों में tumorigenicity पर कैंसर संबंधी जीन के जीन मुंह बंद करने के प्रभाव का भी इस प्रोटोकॉल के साथ अध्ययन किया जा सकता है. इस उद्देश्य के लिए, जीबीएम-क्षेत्रों (GSC23 और GSC11) (चरण १.२) और FP720-lentivirus (चरण १.८) के साथ transduced संस्कृति थे । FP720 एक्सप्रेस कक्ष FACS चरण 1.11-1.13 में पहले बताए अनुसार सॉर्ट किए गए थे । FP720-लेबल किए गए कक्ष DAXX 516पर lentivirus-एंकोडिंग shRNA लक्ष्यीकरण shDaxx (shRNA,) या shLuc नियंत्रण (MOI) के साथ सह-transduced थे । कोशिकाओं को 5 दिनों के लिए, एक एकल सेल निलंबन में असंबद्ध, और 1 x 106 कोशिकाओं intracranial इंजेक्शन के लिए पंजाबियों के 3 µ एल में reसस्पैंड किया गया के लिए संस्कृति थे । shRNA लक्ष्यीकरण DAXX की प्रभावकारिता GSC23 (चित्रा 3) और GSC11 (चित्रा 3सी) में रिवर्स प्रतिलेखन मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (RT-qPCR) द्वारा पुष्टि की गई थी । जीबीएम-iRFP720/shRNA कोशिकाओं stereotactically striatum चूहों के immunodeficient में इंजेक्ट किया गया, कदम के अनुसार 2.3-2.4 । पशु स्नायविक लक्षण और xenografts के सापेक्ष प्रतिदीप्ति संकेत के लिए मनाया गया FMT इमेजिंग प्रणाली, quantified विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण किया गया, कदम 3.1-4.6 के अनुसार । FMT के प्रतिनिधि छवियों shDAXX/जीबीएम-shControl के साथ प्रत्यारोपित पशुओं के साथ की तुलना में चूहों engrafted में एक कमी प्रतिदीप्ति संकेत दिखाने के लिए (चित्र बी और चित्रा 2d) दोनों जीबीएम-क्षेत्रों मॉडल के लिए, पुष्टि हमारे पिछले16 ढूंढना है कि DAXX निषेध नैदानिक ग्लियोब्लास्टोमा मॉडल में ट्यूमर वृद्धि दमन ।

Figure 1
चित्र 1: मानक curves प्रेत और FACS विश्लेषण के लिए कोशिकाओं का उपयोग. (क) FP720-और FP635-U87EGFRvIII व्यक्त कोशिकाओं के प्रतिनिधि FACS हिस्टोग्राम (बाएँ और दाएँ पैनल, क्रमशः). तंत्रिकाबंधार्बुद कोशिकाओं को FP720 या FP635 प्रोटीन की उच्चतम अभिव्यक्ति के लिए समृद्ध करने के लिए क्रमबद्ध अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन और FASC एंकोडिंग lentivirus से संक्रमित थे । U87EGFRvIII-TurboFP635 (B) और U87EGFRvIII-iRFP720 (D) सेल के imager और विश्लेषक सॉफ्टवेयर से प्राप्त प्रतिनिधि छवियां प्रेत कैसेट का उपयोग कर निलंबन । ऊपरी पैनलों ६८० एनएम चैनल में ६३५ एनएम चैनल और नीचे पैनलों में संकेत प्रतिनिधित्व करते हैं । संकेत विज़ुअलाइज़ेशन में वृद्धि करने के लिए संगत कक्ष संख्या में वृद्धि । ६३५ एनएम और ६८० एनएम चैनल में U87EGFRvIII-TurboFP635 (सी) और U87EGFRvIII-iRFP720 (ई) कोशिकाओं के सिग्नल ठहराव । सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयां रंग पट्टी में दर्शाई गई हैं । त्रुटि पट्टियां S.E.M. 3 अलग स्कैन प्रति कक्ष निलंबन से प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: विभिन्न चैनलों में स्कैन U87EGFRvIII कोशिकाओं का उपयोग कर मस्तिष्क ट्यूमर xenograft मॉडल. ६३५ एनएम में फ्लोरोसेंट संकेत के प्रतिनिधि छवियों और जानवरों से ६८० एनएम चैनल U87EGFRvIII-turboFP635 (ए), U87EGFRvIII-iRFP720 (डी), और U87EGFRvIII-iRFP720 के मिश्रण संयोजन (1:1) के साथ प्रत्यारोपित intracranially: U87EGFRvIII-turboFP635 कक्ष (G) । छवियां 5 दिन पहले स्कैनिंग के बाद अधिग्रहीत किया गया । (ख, ङ, ज) 5 दिनों की अवधि में प्रत्येक माउस के लिए सिग्नल तीव्रता निगरानी । प्रत्येक माउस ६३५ एनएम चैनल (नीली सलाखों) में और ६३५ एनएम चैनल (लाल सलाखों) में स्कैन किया गया था । बार रंग का सबसे हल्का छाया स्कैनिंग के दिन 1 का प्रतिनिधित्व करता है और अंधेरी छाया दिन 5 का प्रतिनिधित्व करता है । (C, F, I) रिश्तेदार प्रतिदीप्ति ठहराव चूहों के पूरे पलटन में ६३५ एनएम चैनल (ब्लू) और ६८० एनएम चैनल (लाल) से संकेत तीव्रता की एक सीधी तुलना दिखा रहा है । सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयां रंग पट्टी में दर्शाई गई हैं । डेटा 3 अलग जानवरों से मानक विचलन के साथ मतलब मूल्यों को दिखाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: FMT का उपयोग करते हुए नैदानिक ग्लियोब्लास्टोमा मॉडलों में जीन मुंह बंद करने. GSC23 (A) और GSC11 (C) में RT-qPCR द्वारा DAXX की जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण तंत्रिकाबंधार्बुद-एनकोडेड transduced lentivirus (shRNAs) या DAXX नियंत्रण (shDaxx) और shRNA के साथ shLuc रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाएं हैं. orthotopically engrafted चूहों के ६८० एनएम चैनल से फ्लोरोसेंट संकेत के प्रतिनिधि छवियां GSC23-iRFP720 (ख) और GSC11-iRFP720 (घ) रोगी-व्युत्पंन कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित । मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत shRNA नियंत्रण (shLuc) के साथ प्रत्यारोपित पशुओं में मनाया जाता है (पैनल के शीर्ष भाग) shRNA के साथ प्रत्यारोपित चूहों के साथ तुलना में-DAXX (shDaxx) (पैनल के नीचे भाग), यह दर्शाता है कि DAXX निषेध ट्यूमर को दबा प्रतिदीप्ति आणविक टोमोग्राफी द्वारा निर्धारित नैदानिक तंत्रिकाबंधार्बुद मॉडल में वृद्धि. सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयां रंग पट्टी में दर्शाई गई हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

ट्यूमर xenografts बड़े पैमाने पर कैंसर अनुसंधान में इस्तेमाल किया गया है और अच्छी तरह से स्थापित इमेजिंग तकनीक का एक नंबर विकसित किया गया है: BLI; चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई); पोजीट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी), गणना टोमोग्राफी (सीटी); Fmt. इन तरीकों में से प्रत्येक पेशेवरों और विपक्ष के साथ आता है, लेकिन अंततः उपलब्ध कराई गई जानकारी के प्रकार के साथ एक दूसरे के पूरक हैं । vivo इमेजिंग तकनीक में सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाता है BLI5,6,7,8। BLI और FMT दोनों सेल इंजीनियरिंग की आवश्यकता (luciferase एंजाइमों या अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ) कि जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकते हैं । BLI छोटे ट्यूमर जनता के लिए अधिक संवेदनशील है, लेकिन एक सब्सट्रेट (luciferin) के intraperitoneal इंजेक्शन की आवश्यकता है, जो शरीर में 10-12 मिनट में अधिकतम वितरण तक पहुँचता है; लेकिन प्रकाश शमन और इमेजिंग अधिग्रहण के दौरान बिखरने, और सब्सट्रेट निकासी अक्सर होते हैं9. FMT, इसके बजाय, जानवरों के लिए किसी भी अतिरिक्त सब्सट्रेट प्रशासन की आवश्यकता नहीं है और इसके संकेत स्थिर और समय या एंजाइम स्थिरता से स्वतंत्र है. इसके अतिरिक्त, FMT, जब एक ही प्रयोगात्मक शर्तों में इस्तेमाल किया, reproducible अर्द्ध मात्रात्मक डेटा प्रदान करता है । BLI और FMT दोनों स्थानिक संकल्प प्रस्ताव नहीं है; हालांकि, इन विधियों सीटी स्कैन के साथ युग्मन इस समस्या को हल करता है ।

एक सीटी स्कैन फोटॉनों के क्षीणन उपाय जब इसके संकेत एक जानवर के शरीर को पार और यह शरीर संरचनाओं की पहचान करने में आदर्श है । हालांकि, नरम ऊतक इसके विपरीत, जो एक छोटे से intracranial ट्यूमर का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप हो सकता है, इस दृष्टिकोण के लिए एक सीमा है17,18. एक सीटी के अतिरिक्त नुकसान विकिरण और इसके विपरीत मीडिया का उपयोग है, जो लक्ष्य कोशिकाओं में आणविक परिवर्तन पैदा कर सकता है । एक सीटी स्कैन पीईटी के साथ जोड़ा जा सकता है, जो ग्लूकोज एनालॉग की तरह radiolabeled अनुरेखक का उपयोग करता है, fluorodeoxyglucose 18F-FDG; लेकिन यह भी छोटे जानवरों में कुछ शारीरिक प्रक्रियाओं के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । इसके विपरीत, FMT ट्यूमर द्रव्यमान को मापने के लिए किसी भी इंजेक्शन सब्सट्रेट की जरूरत नहीं है और यह ट्यूमर चयापचय, सूजन, angiogenesis, apoptosis, और अन्य मार्करों के लिए उपाय करने के लिए संभव है फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग19.

कुल मिलाकर एक vivo इमेजिंग में के लिए सबसे उपयोगी और बहुमुखी तकनीकों में से एक एमआरआई है । एमआरआई की मामूली सीमाएं कम अधिग्रहण समय में पाया जा सकता है, पालतू जानवर की तुलना में कम संवेदनशीलता, और कुछ उपकरण से संबंधित बदलाव18,20।

यहां, हम FMT विधि के रूप में एक वैकल्पिक पद्धति के लिए नैदानिक ग्लियोब्लास्टोमा मॉडल की रिपोर्ट । अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लक्ष्य कोशिकाओं के पूर्व लेबलिंग (आंकड़ा 1a-ई) और स्कैनिंग के बाद प्रतिरक्षा पशुओं में आरोपण एक प्रतिदीप्ति टोमोग्राफी इमेजिंग प्रणाली के साथ प्राप्त किया जा सकता है । हम FMT विधि के रूप में एक वैकल्पिक विधि के लिए नैदानिक ग्लियोब्लास्टोमा मॉडल की सूचना दी । इस पद्धति इमेजिंग एक सब्सट्रेट मुक्त और गैर इनवेसिव तरीके से लागू किया जाता है के साथ, जानवरों को कम तनाव के माहौल में रखा जाता है, और गहरी ऊतक ठहराव प्रदर्शन किया जा सकता है (चित्र 2a-मैं, चित्रा 3ए, बी). इस प्रोटोकॉल के लिए नैदानिक तंत्रिकाबंधार्बुद मॉडल21में मिश्रित उपचार की प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, मस्तिष्क ट्यूमर के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए16, और नए druggable चयापचय अणुओं की जांच करने के लिए22, epigenetic रास्ते23, या नई रेडियोथेरेपी (अप्रकाशित डेटा) के साथ संयोजन में कीमोथेरेपी एजेंटों, और अंय नैदानिक अध्ययन के लिए आवेदन किया । हम भी यहां प्रस्ताव vivo इमेजिंग दृष्टिकोण में एक दोहरी के रूप में FMT का उपयोग करते हैं, जब दो सह मौजूदा, लेकिन अलग, ट्यूमर कोशिका आबादी का विश्लेषण किया जा करने के लिए होती हैं ।

FMT के साथ कुछ सीमाओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए, जैसे कि संकेत के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कुछ अंगों से उत्पन्न ऑटो-प्रतिदीप्ति के रूप में. उदाहरण के लिए, murine तिल्ली और जिगर ६८० एनएम चैनल में ऑटो प्रतिदीप्ति उत्सर्जन लेकिन ६३५ एनएम पर नहीं । इसलिए, FMT से संबंधित प्रयोगात्मक इन अंगों को शामिल प्रक्रियाओं अंय अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग किया जाना चाहिए, FP635 की तरह । हम प्रतिदीप्ति संकेत रिकॉर्डिंग में हस्तक्षेप से बचने के लिए नग्न foxn1-विरूपांतरित नग्न चूहों का इस्तेमाल किया; एक अलग माउस मॉडल का उपयोग किया जाना चाहिए, तो यह जानवरों के हित के क्षेत्र दाढ़ी के लिए सिफारिश की है । इसके अतिरिक्त, यह दृष्टिकोण भी बहुत छोटे ट्यूमर जनता का पता लगाने में सीमित है । हमारे अनुभव में, संकेत करने वाली शोर अनुपात में सुधार के रूप में ट्यूमर द्रव्यमान बड़ा हो जाता है, अभी तक चूहों में किसी भी स्नायविक लक्षण की शुरुआत से पहले. वास्तव में, पिछले orthotopically इंजेक्शन PDXs पर किए गए प्रयोगों में, हम एक दवा आहार के दौरान चूहों में ट्यूमर बोझ या दवा प्रशासन के कारण संकट के किसी भी हस्ताक्षर के बिना कम से कम 2 सप्ताह के लिए ट्यूमर का पता लगाने के लिए सक्षम थे21. अंत में, प्रत्येक सेल लाइन की आक्रामकता और इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या प्रत्येक प्रयोग की लंबाई निर्धारित करेगा । डेटा कोशिकाओं और संकेत (चित्र 1b-E), और ट्यूमर द्रव्यमान और संकेत (चित्रा 2) की संख्या के बीच एक रैखिक आनुपातिक संबंध दिखाने; लेकिन ट्यूमर द्रव्यमान और कोशिकाओं की संख्या के बीच एक सामांय संकेत सहसंबंध अलग सेल लाइनों और अवरक्त प्रोटीन के पार लागू नहीं किया जा सकता है । प्रत्येक सेल लाइन/अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन संयोजन के लिए संकेत empirically निर्धारित किया जाना चाहिए । इसके अलावा, प्रेत (चित्र 1b, D) का उपयोग कर कोशिकाओं के विश्लेषण से प्राप्त संकेत संकेत में एक क्षीणन के रूप में intracranial xenografts से संकेत के अनुरूप नहीं है माउस की खोपड़ी के कारण होता है ।

imager और विश्लेषक सॉफ्टवेयर थ्रेसहोल्ड के लिए अनुमति देते हैं । हालांकि हम किसी भी दहलीज यहां का उपयोग नहीं किया, किसी भी प्रत्यारोपित कोशिकाओं के बिना जानवरों स्कैनिंग पृष्ठभूमि शोर जो एक सच्चे संकेत की उपस्थिति में पुनर्निर्माण के द्वारा समाप्त हो जाता है देता है । कुछ कारकों xenograft के संकेत तीव्रता को प्रभावित और ध्यान में रखा जाना चाहिए: प्रत्येक अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन अलग उत्सर्जन स्पेक्ट्रम और तीव्रता है, FP720 सबसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रयोग किया जा रहा है में से एक के साथ उपयोग कर10 ,11; प्रत्येक सेल लाइन एक प्रचुर मात्रा में, अभी तक सीमित, प्रोटीन उत्पादन की मात्रा, इस प्रकार अधिकतम प्रतिदीप्ति प्राप्य को प्रभावित करने के लिए अनुमति देता है । अंत में, FMT imager आंतरिक मानक curves के साथ विशिष्ट यौगिकों के लिए सेटअप है, इसलिए, यह महत्वपूर्ण है पर विचार करने के लिए जो यौगिक अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन कोशिकाओं लेबल इस्तेमाल करने के लिए निकटतम उत्सर्जन स्पेक्ट्रम है । हालांकि अच्छी तरह से सहन, यह संभावित साइटोटोक्सिक अवरक्त प्रोटीन8,9के एक्सप्रेस द्वारा मध्यस्थता प्रभाव का निर्धारण करने के लिए सिफारिश की है । इसके अलावा, हम कैंसर कोशिका engraftment में शल्य प्रक्रिया या परिवर्तनशीलता के कारण, डेटा और चूहों की हानि के रूप में, प्रयोगात्मक समूह के प्रति कम से 8 चूहों के साथियों का उपयोग करने की सलाह देते हैं, हो सकता है; बहरहाल, इस अध्ययन के लिए सांख्यिकीय महत्व कहते हैं । हम भी प्रश्नपत्र एक से अधिक दिन के लिए पशु पलटन स्कैन और एक ही समय में संकेत उत्सर्जन का विश्लेषण करने की सिफारिश, इमेजिंग कैसेट गहराई और फ्लोरोसेंट संकेत पुनर्निर्माण में बदलाव के बाद से अंतिम संकेत ठहराव के साथ हस्तक्षेप हो सकता है । इस मुद्दे को हल करने के लिए, विश्लेषक सॉफ्टवेयर लेजर तीव्रता में मामूली परिवर्तन के लिए अनुमति देता है (सामांय से उच्च और बहुत उच्च), हालांकि हमारे अनुभव में अंतिम परिणाम नाटकीय रूप से अलग नहीं है । एक अंतिम नोट लागत प्रभावशीलता के बारे में है कि FMT इमेजिंग प्रणाली को आसानी से विभिंन प्रयोगशालाओं, जो अपनी खरीद और रखरखाव लागत में मदद करता है के बीच एक मुख्य साधन के रूप में साझा किया जा सकता है । अंत में, FMT एक मूल्यवान संसाधन है कि vivo ट्यूमर विकास आसान और विश्वसनीय में प्रयोगात्मक और नैदानिक मूल्यांकन करता है ।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं की घोषणा ।

Acknowledgments

हम डॉ फ्रेडरिक लैंग, एमडी एंडरसन कैंसर केंद्र जीबीएम-PDX neurospheres के लिए धंयवाद । यह काम हार जीबीएम अनुसंधान सहयोगी, राष्ट्रीय ब्रेन ट्यूमर सोसायटी की एक सहायक (फ्रैंक Furnari), R01-NS080939 (फ्रैंक Furnari), जेंस एस मैकडोनल फाउंडेशन (फ्रैंक Furnari) द्वारा समर्थित किया गया था; जॉर्ज Benitez अमेरिकी ब्रेन ट्यूमर एसोसिएशन (ABTA) से एक पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था; सिरो Zanca आंशिक रूप से एक अमेरिकी इतालवी कैंसर फाउंडेशन postdoctoral रिसर्च फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था । फ्रैंक Furnari कैंसर अनुसंधान के लिए लुडविग संस्थान से वेतन और अतिरिक्त सहायता प्राप्त करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/High Glucose  HyClone/GE SH30022.1
DMEM/F12 1:1  Gibco 11320-082
FBS HyClone/GE SH30071.03
Accutase Innovative cell technologies AT-104
Trypsin HyClone/GE SH30236.01
B27 supplement Gibco 17504044
human recombinant EGF  Stemcell Technologies 2633
human recombinant FGF Stemcell Technologies 2634
DPBS Corning 21-031-00
FACS tubes Falcon 352235
DAPI ThermoFisher Scientific 62248
Blasticidin ThermoFisher Scientific A1113903
p24 ELISA  Clontech 632200
Xylazine Akorn NDC 59399-110-20
Ketamine Zoetis NADA 043-403 Controlled substance
Ointment Dechron NDC 17033-211-38
Absorbable suture CpMedical VQ392
5 ul syringe Hamilton 26200-U Catalog number as sold by Sigma-Aldrich
Cell Sorter Sony SH8007
Mouse stereotaxic frame  Stoelting 51730
Motorized stereotaxic injector Stoelting 53311
Micromotor hand-held drill Foredom K1070
Mouse warming pad  Ken Scientific Corporation TP-22G
Fluorescence Tomography System  PerkinElmer FMT 2500 XL
TrueQuant Imaging Software  Perkin Elmer  7005319
Ultra-centrifuge Optima L-80 XP Beckman Coulter 392049
Tissue Culture 100mm Dishes Olympus Plastics 25-202
Tissue Culture 150mm Dishes Olympus Plastics 25-203
Tissue Culture Flasks T75 Corning 430720U
50 mL conical tubes Corning 430290
15 mL conical tubes Olympus Plastics 28-101
Centrifuge Avanti J-20 Beckman Coulter J320XP-IM-5
Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL Beckman Coulter 326819
Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm Beckman Coulter 326823
Athymic nude mice Charles River Laboratories Strain Code  490 (Homozygous) Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required.   

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १३४ प्रतिदीप्ति आणविक टोमोग्राफी (FMT) vivo में इमेजिंग ट्यूमर विविधता ग्लियोब्लास्टोमा intracranial orthotopic xenograft ऑप्टिकल इमेजिंग
ग्लियोब्लास्टोमा Xenografts के <em>Vivo इमेजिंग में</em> के लिए प्रतिदीप्ति आणविक टोमोग्राफी
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Benitez, J. A., Zanca, C., Ma, J.,… More

Benitez, J. A., Zanca, C., Ma, J., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts. J. Vis. Exp. (134), e57448, doi:10.3791/57448 (2018).

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