Fluorescens molekylär tomografi för In Vivo Imaging av Glioblastoma xenograft
Summary
Ortotop intrakraniell injektion av tumörceller har använts inom cancerforskningen för att studera hjärnan tumörbiologi, progression, evolution och terapeutiskt svar. Här presenterar vi fluorescens molekylär tomografi av tumör xenograft, vilket ger realtid intravital avbildning och kvantifiering av en tumör massa i prekliniska glioblastoma modeller.
Abstract
Tumorigenicitetsprov är möjligheten av cancerceller att bilda en tumör massa. En allmänt använd metod att avgöra om cellerna är tumörframkallande är genom att injicera nedsatt immunförsvar möss subkutant med cancerceller och mäta tumör massan efter det blir synlig och påtaglig. Ortotop injektioner av cancerceller syftar till att införa xenograft i den närmiljön som mest liknar vävnaden av beskärningen av tumören som studeras. Brain cancerforskning kräver intrakraniell injektion av cancerceller för att tillåta den tumörbildning och analys i den unika närmiljön i hjärnan. Av in-vivo imaging av intrakraniell xenograft övervakar omedelbart tumör massa orthotopically rekonstituerades möss. Här rapporterar vi användningen av fluorescens molekylär tomografi (FMT) av hjärnan tumören xenograft. Cancercellerna är först sensorik med nära infraröd fluorescerande proteiner och injiceras sedan i hjärnan hos immunsupprimerade möss. Djuren är sedan skannas för kvantitativ information om tumören massan över en längre tidsperiod. Cell före märkning möjliggör kostnadseffektiva, reproducerbar och tillförlitlig kvantifiering av tumör bördan inom varje mus. Vi eliminerade behovet av injicera imaging substrat, och därmed minskat belastningen på djuren. En begränsning av detta synsätt är representerat av oförmåga att upptäcka mycket små massorna; Det har dock bättre upplösning för större samlas än andra tekniker. Det kan användas för att utvärdera effekten av en läkemedelsbehandling eller genetiska förändringar av gliom cellinjer och patientderiverade prover.
Introduction
Cancer är en av de ledande orsakerna till sjukdom-relaterade dödsfall hos människor i den industrialiserade världen. Med en extremt hög dödssiffran är nya behandlingar angeläget. Glioblastoma multiforme (GBM) är en extremt dödliga typ av hjärncancer, sammansatt av heterogena populationer av tumör, stromaceller och immun hjärnceller. Enligt centralhjärnan tumören registret av USA är förekomsten av primära maligna och icke-maligna hjärntumörer cirka 22 fall per 100 000. Cirka 11.000 nya fall förväntas diagnostiseras i USA i 20171.
Prekliniska studier undersöka sannolikheten för att en drog, förfarande eller behandling är effektiv före provning hos människor. En av de tidigaste laboratorium stegen i prekliniska studier är att identifiera potentiella molekylära mål för läkemedelsbehandling med hjälp av cancerceller som implanteras i en värdorganism, definieras som människors xenograft-modeller. I detta sammanhang har intrakraniell hjärnan tumören xenograft-modeller patientderiverade xenograft (PDXs) använts i stor utsträckning att studera hjärnan tumörbiologi, progression, evolution och terapeutiskt svar, och mer nyligen för biomarkörer utveckling, drog screening och personlig medicin2,3,4.
En av de mest prisvärda och icke-invasiv i vivo imaging metoder för att övervaka intrakraniell xenograft är Mareld imaging (BLI)5,6,7,8. Men inkluderar vissa BLI begränsningar substrat administration och tillgänglighet, enzym stabilitet, och ljus snabbkylning och spridning under imaging förvärv9. Här rapporterar vi det infraröda FMT alternativt imaging metod för att övervaka prekliniska glioblastoma modeller. I denna metod, signal förvärv och kvantifiering av intracranially implanterade PDXs, uttrycker en nära-infraröd fluorescerande protein iRFP72010,11 (som hädanefter kallas FP720) eller turboFP635 (hädanefter kallas FP635), utförs med en FMT imaging system. Använda tekniken för FMT, övervakade den ortotop tumörer kan vara i vivo före, under eller efter behandling, i en icke-invasiv, substrat-fri och kvantitativa sätt för prekliniska observationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tumör xenograft har använts flitigt i cancerforskning och ett antal väletablerade bildgivande tekniker har utvecklats: BLI; magnetisk resonanstomografi (MRT); positron emissions tomografi (PET), beräknade datortomografi (CT); FMT. Alla dessa metoder kommer med för- och nackdelar, men i slutändan kompletterar varandra med typ av information som tillhandahålls. En av de vanligaste i vivo imaging teknik är BLI5,6,7…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Frederick Lang, MD Anderson Cancercenter för GBM-PDX neurospheres. Detta arbete stöds av de nederlag GBM forskning Collaborative, ett dotterbolag till National hjärnan tumören Society (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), James S. McDonnell Foundation (Frank Furnari); Jorge Benitez stöddes av en utmärkelse från den amerikanska hjärnan tumören Association (ABTA); Ciro Zanca stöddes delvis av ett amerikansk-italienska Cancer Foundation postdoc-stipendium. Frank Furnari får lön och ytterligare stöd från Ludwiginstitutet för cancerforskning.
Materials
| DMEM/High Glucose | HyClone/GE | SH30022.1 | |
| DMEM/F12 1:1 | Gibco | 11320-082 | |
| FBS | HyClone/GE | SH30071.03 | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| Trypsin | HyClone/GE | SH30236.01 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| human recombinant EGF | Stemcell Technologies | 2633 | |
| human recombinant FGF | Stemcell Technologies | 2634 | |
| DPBS | Corning | 21-031-00 | |
| FACS tubes | Falcon | 352235 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Blasticidin | ThermoFisher Scientific | A1113903 | |
| p24 ELISA | Clontech | 632200 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Ketamine | Zoetis | NADA 043-403 | Controlled substance |
| Ointment | Dechron | NDC 17033-211-38 | |
| Absorbable suture | CpMedical | VQ392 | |
| 5 ul syringe | Hamilton | 26200-U | Catalog number as sold by Sigma-Aldrich |
| Cell Sorter | Sony | SH8007 | |
| Mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Motorized stereotaxic injector | Stoelting | 53311 | |
| Micromotor hand-held drill | Foredom | K1070 | |
| Mouse warming pad | Ken Scientific Corporation | TP-22G | |
| Fluorescence Tomography System | PerkinElmer | FMT 2500 XL | |
| TrueQuant Imaging Software | Perkin Elmer | 7005319 | |
| Ultra-centrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | 392049 | |
| Tissue Culture 100mm Dishes | Olympus Plastics | 25-202 | |
| Tissue Culture 150mm Dishes | Olympus Plastics | 25-203 | |
| Tissue Culture Flasks T75 | Corning | 430720U | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430290 | |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Centrifuge Avanti J-20 | Beckman Coulter | J320XP-IM-5 | |
| Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL | Beckman Coulter | 326819 | |
| Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 (Homozygous) | Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required. |
References
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009-2013. Neuro-Oncology. 18 (suppl_5), v1-v75 (2016).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Stewart, E. L., et al. Clinical Utility of Patient-Derived Xenografts to Determine Biomarkers of Prognosis and Map Resistance Pathways in EGFR-Mutant Lung Adenocarcinoma. Journal of Clinical Oncology. 33 (22), 2472-2480 (2015).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nat Med. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
- Kondo, A., et al. An experimental brainstem tumor model using in vivo bioluminescence imaging in rat. Child’s Nervous System. 25 (5), 527-533 (2009).
- Nyati, S., Young, G., Ross, B. D., Rehemtulla, A., Kozlov, S. V. . ATM Kinase: Methods and Protocols. , 97-111 (2017).
- Kondo, A., et al. Longitudinal assessment of regional directed delivery in a rodent malignant glioma model. J Neurosurg Pediatr. 4 (6), 592-598 (2009).
- Badr, C. E., Badr, C. E. . Bioluminescent Imaging: Methods and Protocols. , 1-18 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat Meth. 10 (8), 751-754 (2013).
- Filonov, G. S., et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotech. 29 (8), 757-761 (2011).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protocols. 1 (1), 241-245 (2006).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
- Benitez, J. A., et al. PTEN regulates glioblastoma oncogenesis through chromatin-associated complexes of DAXX and histone H3.3. Nature Communications. 8, 15223 (2017).
- Kirschner, S., et al. Imaging of Orthotopic Glioblastoma Xenografts in Mice Using a Clinical CT Scanner: Comparison with Micro-CT and Histology. PLOS ONE. 11 (11), e0165994 (2016).
- Mannheim, J. G., et al. Standardization of Small Animal Imaging-Current Status and Future Prospects. Molecular Imaging and Biology. , (2017).
- Engblom, C., et al. Osteoblasts remotely supply lung tumors with cancer-promoting SiglecFhigh neutrophils. Science. 358 (6367), (2017).
- Lauber, D. T., et al. State of the art in vivo imaging techniques for laboratory animals. Laboratory Animals. 51 (5), 465-478 (2017).
- Zanca, C., et al. Glioblastoma cellular cross-talk converges on NF-κB to attenuate EGFR inhibitor sensitivity. Genes & Development. 31 (12), 1212-1227 (2017).
- Villa, G. R., et al. An LXR-Cholesterol Axis Creates a Metabolic Co-Dependency for Brain Cancers. Cancer Cell. 30 (5), 683-693 (2016).
- Liu, F., et al. EGFR Mutation Promotes Glioblastoma through Epigenome and Transcription Factor Network Remodeling. Molecular Cell. 60 (2), 307-318 (2015).
