Fluorescentie moleculaire tomografie voor In Vivo Imaging van Glioblastoma Xenografts
Summary
Orthotopic intracraniële injectie van tumorcellen wordt in kankeronderzoek te bestuderen hersenen tumor biologie, progressie en evolutie therapeutische respons uitgegaan. Hier presenteren we fluorescentie moleculaire tomografie van tumor xenografts, die biedt real-time intravital imaging en kwantificering van een tumor massa in preklinische glioblastoma modellen.
Abstract
Tumorigeniciteit is de mogelijkheid van kankercellen vormen een tumor massa. Een veel gebruikte aanpak om te bepalen of de cellen tumorigene is subcutaan injecteren van immunodeficiëntie muizen met kankercellen en het meten van de massa van de tumor na zichtbaar en voelbaar wordt. Orthotopic injecties van kankercellen streven naar de invoering van de xenograft in de communicatie dat het meest lijkt het weefsel van oorsprong van de tumor worden bestudeerd. Hersenen kankeronderzoek vereist intracraniële injectie van kankercellen om de vorming van de tumor en analyse in de unieke communicatie van de hersenen. De in vivo beeldvorming van intracraniële xenografts controleert onmiddellijk de tumor massa van orthotopically geaccepteerd muizen. Wij rapporteren hier het gebruik van fluorescentie moleculaire tomografie (FMT) van hersenen tumor xenografts. De kankercellen zijn eerste getransduceerde met in de buurt van infrarood fluorescente proteïnen en vervolgens geïnjecteerd in de hersenen van immuungecompromitteerde muizen. De dieren worden vervolgens gescand om kwantitatieve informatie over de tumor massa over een langere periode van tijd. Cel vooraf labeling zorgt voor betrouwbare, rendabele en reproduceerbare kwantificering van de tumor lasten binnen elke muis. Wij geëlimineerd de noodzaak voor het injecteren van imaging substraten en zo verminderd de stress bij de dieren. Een beperking van deze aanpak is vertegenwoordigd door het onvermogen om het detecteren van zeer kleine massa’s; het heeft echter een betere resolutie voor grotere massa dan andere technieken. Het kan worden toegepast om te evalueren van de effectiviteit van een medicamenteuze behandeling of genetische wijzigingen van glioma cellijnen en patiënt afkomstige monsters.
Introduction
Kanker is één van de belangrijkste oorzaken van ziekte-gerelateerde sterfgevallen bij de mens in de geïndustrialiseerde wereld. Nieuwe behandelingen zijn met een extreem hoge dodental, dringend noodzakelijk. Glioblastoma multiforme (GBM) is een uiterst dodelijk soort hersenkanker, samengesteld uit heterogene populaties van tumor, stromale en immuun hersencellen. Volgens het register van de tumor centrale hersenen van de VS is de incidentie van primaire kwaadaardige en niet-kwaadaardige hersentumoren ongeveer 22 gevallen per 100.000. Ongeveer 11.000 nieuwe gevallen worden verwacht te worden gediagnosticeerd in de VS in 20171.
Preklinische studies onderzoeken de waarschijnlijkheid van een drug, procedure of behandeling effectief vóór de test bij de mens. Een van de vroegste stappen van het laboratorium in preklinische studies is het identificeren van potentiële moleculaire targets voor medicamenteuze behandeling met behulp van kankercellen ingeplant in een ontvangende organisme, gedefinieerd als menselijke xenograft modellen. Binnen deze context intracraniële hersenen tumor xenograft modellen met behulp van de patiënt-afgeleide xenografts (PDXs) hebben op grote schaal gebruikt om te bestuderen hersenen tumor biologie, progressie en evolutie therapeutische respons, en meer recentelijk voor biomarkers ontwikkeling, drug screening, en gepersonaliseerde geneeskunde2,3,4.
Een van de meest betaalbare en niet-invasieve in vivo imaging methoden voor het controleren van intracraniële xenografts is de Bioluminescentie imaging (BLI)5,6,7,8. Enkele BLI beperkingen omvatten echter substraat administratie en beschikbaarheid, enzym stabiliteit, en lichte blussen en verstrooiing tijdens imaging overname9. Hier melden we de infrarood FMT als alternatief imaging methode voor het controleren van preklinische glioblastoma modellen. Deze methode, signaal overname en kwantificering van intracranially geïmplanteerde PDXs geven uiting aan een nabij-infrarood fluorescent proteïne iRFP72010,11 (voortaan aangeduid als FP720) of turboFP635 (voortaan aangeduid als FP635), wordt uitgevoerd met een FMT imaging systeem. Met de technologie van FMT de orthotopic tumoren kunnen worden gecontroleerd in vivo vóór, tijdens of na de behandeling, in een niet-invasieve, substraat-vrije en kwantitatieve wijze voor preklinische waarnemingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tumor xenografts zijn uitgebreid gebruikt in kankeronderzoek en een aantal gevestigde beeldvormingstechnieken uitgewerkt: BLI; magnetische resonantie imaging (MRI); positron emissie tomografie (PET), berekend tomografie (CT); FMT. Elk van deze benaderingen komt met voors en tegens, maar uiteindelijk elkaar aanvullen met het type van de verstrekte informatie. Een van de meest gebruikte in vivo imaging technologie is BLI5,,6,,7…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Frederick Lang, MD Anderson Cancer Center voor GBM-PDX-neurospheres. Dit werk werd gesteund door de nederlaag GBM onderzoek samenwerking, een dochteronderneming van National Brain Tumor Society (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), de James S. McDonnell Foundation (Frank Furnari); Jorge Benitez werd ondersteund door een award van de American Brain Tumor Association (ABTA); Ciro Zanca werd gedeeltelijk ondersteund door een Amerikaans-Italiaanse Cancer Foundation postdoc fellowship. Frank Furnari ontvangt salaris en extra ondersteuning van het Ludwig-Instituut voor kankeronderzoek.
Materials
| DMEM/High Glucose | HyClone/GE | SH30022.1 | |
| DMEM/F12 1:1 | Gibco | 11320-082 | |
| FBS | HyClone/GE | SH30071.03 | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| Trypsin | HyClone/GE | SH30236.01 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| human recombinant EGF | Stemcell Technologies | 2633 | |
| human recombinant FGF | Stemcell Technologies | 2634 | |
| DPBS | Corning | 21-031-00 | |
| FACS tubes | Falcon | 352235 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Blasticidin | ThermoFisher Scientific | A1113903 | |
| p24 ELISA | Clontech | 632200 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Ketamine | Zoetis | NADA 043-403 | Controlled substance |
| Ointment | Dechron | NDC 17033-211-38 | |
| Absorbable suture | CpMedical | VQ392 | |
| 5 ul syringe | Hamilton | 26200-U | Catalog number as sold by Sigma-Aldrich |
| Cell Sorter | Sony | SH8007 | |
| Mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Motorized stereotaxic injector | Stoelting | 53311 | |
| Micromotor hand-held drill | Foredom | K1070 | |
| Mouse warming pad | Ken Scientific Corporation | TP-22G | |
| Fluorescence Tomography System | PerkinElmer | FMT 2500 XL | |
| TrueQuant Imaging Software | Perkin Elmer | 7005319 | |
| Ultra-centrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | 392049 | |
| Tissue Culture 100mm Dishes | Olympus Plastics | 25-202 | |
| Tissue Culture 150mm Dishes | Olympus Plastics | 25-203 | |
| Tissue Culture Flasks T75 | Corning | 430720U | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430290 | |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Centrifuge Avanti J-20 | Beckman Coulter | J320XP-IM-5 | |
| Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL | Beckman Coulter | 326819 | |
| Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 (Homozygous) | Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required. |
References
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009-2013. Neuro-Oncology. 18 (suppl_5), v1-v75 (2016).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Stewart, E. L., et al. Clinical Utility of Patient-Derived Xenografts to Determine Biomarkers of Prognosis and Map Resistance Pathways in EGFR-Mutant Lung Adenocarcinoma. Journal of Clinical Oncology. 33 (22), 2472-2480 (2015).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nat Med. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
- Kondo, A., et al. An experimental brainstem tumor model using in vivo bioluminescence imaging in rat. Child’s Nervous System. 25 (5), 527-533 (2009).
- Nyati, S., Young, G., Ross, B. D., Rehemtulla, A., Kozlov, S. V. . ATM Kinase: Methods and Protocols. , 97-111 (2017).
- Kondo, A., et al. Longitudinal assessment of regional directed delivery in a rodent malignant glioma model. J Neurosurg Pediatr. 4 (6), 592-598 (2009).
- Badr, C. E., Badr, C. E. . Bioluminescent Imaging: Methods and Protocols. , 1-18 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat Meth. 10 (8), 751-754 (2013).
- Filonov, G. S., et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotech. 29 (8), 757-761 (2011).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protocols. 1 (1), 241-245 (2006).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
- Benitez, J. A., et al. PTEN regulates glioblastoma oncogenesis through chromatin-associated complexes of DAXX and histone H3.3. Nature Communications. 8, 15223 (2017).
- Kirschner, S., et al. Imaging of Orthotopic Glioblastoma Xenografts in Mice Using a Clinical CT Scanner: Comparison with Micro-CT and Histology. PLOS ONE. 11 (11), e0165994 (2016).
- Mannheim, J. G., et al. Standardization of Small Animal Imaging-Current Status and Future Prospects. Molecular Imaging and Biology. , (2017).
- Engblom, C., et al. Osteoblasts remotely supply lung tumors with cancer-promoting SiglecFhigh neutrophils. Science. 358 (6367), (2017).
- Lauber, D. T., et al. State of the art in vivo imaging techniques for laboratory animals. Laboratory Animals. 51 (5), 465-478 (2017).
- Zanca, C., et al. Glioblastoma cellular cross-talk converges on NF-κB to attenuate EGFR inhibitor sensitivity. Genes & Development. 31 (12), 1212-1227 (2017).
- Villa, G. R., et al. An LXR-Cholesterol Axis Creates a Metabolic Co-Dependency for Brain Cancers. Cancer Cell. 30 (5), 683-693 (2016).
- Liu, F., et al. EGFR Mutation Promotes Glioblastoma through Epigenome and Transcription Factor Network Remodeling. Molecular Cell. 60 (2), 307-318 (2015).
